JP2002521025A - 増殖因子のＴＧＦ−βファミリーのメンバーを使用する、生殖系列幹細胞の維持および増殖のための方法。 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 増殖因子のＴＧＦ−βファミリー、特に骨形成性タンパク質（ＢＭＰ）−２／４ホモログｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ（ｄｐｐ）は、生殖系列幹細胞を維持し、かつそれらの分裂を促進するために特異的に必要とされる。ｄｐｐの過剰発現は、生殖系列幹細胞の分化をブロックする。ｄｐｐまたはそのレセプターｓａｘｏｐｈｏｎｅにおける変異は、幹細胞の損失を加速し、そして幹細胞の分裂を遅延させる。ｄｐｐシグナル伝達は、生殖系列幹細胞によって直接的に受け取られ、それによってｄｐｐシグナル伝達は、生殖系列幹細胞増殖を制御するニッチの規定を補助する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の背景） （１．発明の分野） 本発明は、トランスフォーミング増殖因子βファミリーのメンバー、ならびに
細胞分裂、細胞の生存、および細胞運命の特異性のそれらの調節に関する。具体
的には、本発明は、骨形成性タンパク質（ＢＭＰ）−２／４ホモログｄｅｃａｐ
ｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ（ｄｐｐ）および幹細胞の維持におけるその役割に関する
。例えば、維持および生殖系列幹細胞の分裂の制御のためのｄｐｐベースの方法
、ならびに生殖系列幹細胞の増殖を制御するニッチ（ｎｉｃｈｅ）を規定するた
めのｄｐｐベースの方法が、開示される。さらに、本発明は、卵巣腫瘍発生のモ
デルを提供する。本発明はさらに、インビボにおいて未分化段階にて、またはイ
ンビトロで培養することによって、幹細胞を増殖させるためのｄｐｐベースの方
法に関する。

【０００２】 （２．関連分野の記述） 連続的な細胞の代謝回転を経る多くの成体組織において、幹細胞の集団は、失
われた細胞を置換することを担う。増殖および新形成を制御する際のそれらの中
心的な役割のために、幹細胞の機能を調節する機構は、非常に興味深い（Ｐｏｔ
ｔｅｒおよびＬｏｆｆｌｅｒ、１９９０；ＤｏｅおよびＳｐａｎａ、１９９５；
Ｌｉｎ、１９９７；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９９７によって概説される）。幹細
胞の分裂を維持し、かつ幹細胞の娘細胞の分化を調節する２つの機構が、提唱さ
れている：内在性因子および細胞外シグナル。非対称的に局在した内在性因子は
、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ胚における神経芽細胞の娘細胞の運命を特異的に補助す
る（ＤｏｅおよびＳｐａｎａ、１９９５）。細胞表面会合リガンドおよび拡散可
能な因子によって媒介される周囲の細胞からの細胞外シグナルが、頻繁に関与す
る（ＰｏｔｔｅｒおよびＬｏｅｆｆｌｅｒ、１９９０；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１
９９７）。これらの因子のうちのいくつかの同定は、ある型の幹細胞をインビト
ロで培養することを可能にする。

【０００３】 Ｄｒｏｓｐｈｉｌａ卵巣は、成体の寿命のほどんとの間に活性を保持している
、幹細胞の２つの別個の群を研究するための優れた系を示す（Ｓｐｒａｄｌｉｎ
ｇら、１９９７によって概説される）。成体の卵巣は、生殖系列および体細胞性
幹細胞（ｓｏｍａｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）が位置する、先端にて胚腺を各
々有する１４〜１６の卵巣小管を含む。胚腺の前端に位置する、２または３の生
殖系列幹細胞は、非対称に分裂して、卵巣小管における全ての生殖系列細胞を生
じる（ＷｉｅｓｃｈａｕｓおよびＳｚａｂａｄ、１９７９；Ｌｉｎ（１９９７）
によって概説される）。嚢胞芽細胞（ｃｙｓｔｏｂｌａｓｔ）として既知の幹細
胞の娘細胞は、４回の同調化した分裂を経て、２、４、８、および最終的には１
６の相互連絡された嚢胞細胞（ｃｙｓｔｏｃｙｔｅ）の群である、卵胞の前駆体
を生じる（ｄｅ Ｃｕｅｖａｓら、１９９７によって概説される）。胚腺の中間
に存在する２つの体細胞性幹細胞は、全ての体細胞性卵胞細胞を生じる（Ｍａｒ
ｇｏｌｉｓおよびＳｐｒａｄｌｉｎｇ、１９９５）；精巣におけるそれらの等価
体は、嚢胞（ｃｙｓｔ）前駆細胞である。３つの型の有糸分裂的に静止している
体細胞は、幹細胞の近傍に位置する：終糸細胞（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｆｉｌａｍ
ｅｎｔ ｃｅｌｌ）およびキャップ細胞（ｃａｐ ｃｅｌｌ）は、生殖系列の幹
細胞と接触し、一方、鞘内細胞（ｉｎｎｅｒ ｓｈｅａｔｈ ｃｅｌｌ）は、よ
り後方に位置し、そして両方の体細胞型と接触する。

【０００４】 生殖系列幹細胞の分裂は、固有の機構を含むことが既知である。この分裂およ
び引き続く嚢胞細胞の分裂は、膜骨格タンパク質（例えば、α−スペクトリンお
よびｈｕ−ｌｉ ｔａｉ ｓｈａｏ（ｈｔｓ）によりコードされるアデューシン
ホモログ）に富むフソーム（ｆｕｓｏｍｅ）の分離に起因して、物理的に等価で
はない（ｄｅ Ｃｕｅｖａｓら、１９９７によって概説される）。幹細胞に特徴
的な丸いフソーム（すなわち、「スペクトルソーム（ｓｐｅｃｔｒｏｓｏｍｅ）
」）は、嚢胞発生の進行として形状を変化させ、異なる段階での嚢胞が同定され
ることを可能にする。ｂａｇ ｏｆ ｍａｒｂｌｅｓ（ｂａｍ）遺伝子は、幹細
胞の娘細胞中でのみ高度に発現される（ＭｃＫｅａｒｉｎおよびＳｐｒａｄｌｉ
ｎｇ、１９９０）。嚢胞芽細胞中のＢａｍタンパク質の損失は、それらの分化を
妨げ、生殖系列の腫瘍を形成させる（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａにおける「腫瘍」は
、増殖している細胞の大きな塊であり、この用語は、これらの細胞が癌性である
ことを暗示しない）。翻訳レギュレーターをコードする遺伝子ｐｕｍｉｌｉｏ（
ｐｕｍ）およびｎａｎｏｓ（ｎｏｓ）はまた、生殖系列幹細胞の形成および維持
に有用な役割を果たす（ＬｉｎおよびＳｐｒａｄｌｉｎｇ、１９９７；Ｆｏｒｂ
ｅｓおよびＬｅｈｍａｎｎ、１９９８）。

【０００５】 幹細胞の増殖を制御する細胞内シグナルについては、あまり知られていない。
２つの重要なシグナル伝達分子であるＨｅｄｇｅｈｏｇ（Ｈｈ）およびＷｉｎｇ
ｌｅｓｓ（Ｗｇ）（Ｐｅｒｒｉｍｏｎ、１９９５；ＣａｄｉｇａｎおよびＮｕｓ
ｓｅ、１９９７によって概説される）は、終糸細胞およびキャップ細胞において
発現される（Ｆｏｒｂｅｓら、１９９６ａおよび１９９６ｂ）。Ｈｈシグナル伝
達は、卵胞細胞（ｆｏｌｌｉｃｌｅ ｃｅｌｌ）の増殖および分化に重要である
が、これは、本発明がなされた時点に、体細胞性幹細胞またはそれらの娘細胞が
調節されるか否かを決定されていなかった（Ｆｏｒｂｅｓら、１９９６ａおよび
１９９６ｂ）。生殖系列におけるこれらのシグナルの役割は、なおあまり明確で
はない。なぜなら、ｈｈの異所性発現は、生殖系列幹細胞の機能を妨げないよう
であるからである（Ｆｏｒｂｅｓら、１９９６ａ）。

【０００６】 トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）ファミリーのメンバー（ＴＧ
Ｆ−β、アクチビン、および骨形成性タンパク質（ＢＭＰ）を含む）は、広汎な
範囲の細胞応答（細胞分裂、生存、および細胞運命の特異性の調節を含む）を誘
発する（Ｍａｓｓａｇｕｅら、１９９６；Ｈｏｇａｎ、１９９６ａによって概説
される）。ＴＧＦ−βは、インビトロ培養物またはインビボ異所性発現のいずれ
かによってアッセイされたのと同様に、幹細胞の増殖を抑制することが以前に同
定された（ＰｏｔｔｅｒおよびＬｅｏｆｆｌｅｒ、１９９０；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ
ら、１９９７）。マウスにおけるＢＭＰ−４およびそのレセプターＭＢＰＲの不
活化は、ホモ接合性変異体の胚性致死を生じる（Ｗｉｎｎｉｅｒら、１９９５；
Ｍｉｓｈｉｎａら、１９９５）が、幹細胞に対する効果は、配慮されていない。

【０００７】 同様に、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａにおいて脊椎動物ＢＭＰ−２／４ホモログをコ
ードするｄｐｐは、局所シグナル、ならびに細胞増殖および細胞運命の決定を調
節することによって、初期胚および成体付属体をパターン化する長距離モルフォ
ゲン（ｍｏｒｐｈｏｇｅｎ）として機能する（Ｐａｄｇｅｔｔら、１９８７；Ｌ
ａｗｒｅｎｃｅおよびＳｔｒｕｈｌ、１９９６によって概説される）。ｄｐｐは
、卵胞細胞の前方サブセット中に発現され、そして卵子発生の後期段階中の卵形
状および極性を確立するために必要とされる（Ｔｗｏｍｂｌｙら、１９９６）。
しかし、幹細胞の分化を引き起こす代わりの、それらの維持および増殖における
ｄｐｐの効果は以前に示されていない。

【０００８】 ｄｐｐシグナル伝達経路における主要な関連物が、同定されている：ｓａｘｏ
ｐｈｏｎｅ（ｓａｘ）およびｔｈｉｃｋ ｖｅｉｎ（ｔｋｖ）は、Ｉ型セリン／
トレオニンキナーゼ膜貫通レセプターをコードし、一方、ｐｕｎｔは、ＩＩ型セ
リン／トレオニンキナーゼ膜貫通レセプターをコードする（Ｂｒｕｍｍｅｌら、
１９９４；Ｎｅｌｌｅｎら、１９９４；Ｐｅｎｔｏｎら、１９９４；Ｘｉｅら、
１９９４；Ｒｕｂｅｒｔｅら、１９９５；Ｌｅｔｓｏｕら、１９９５）。ｍｏｔ
ｈｅｒｓ ａｇａｉｎｓｔ ｄｐｐ（ｍａｄ）、Ｍｅｄｅａ（Ｍｅｄ）、および
Ｄａｕｇｈｔｅｒｓ ａｇａｉｎｓｔ ｄｐｐ（Ｄａｄ）は、総称してＳｍａｄ
ｓとして公知である保存されたＴＧＦ−βトランスデューサーのファミリーをコ
ードする（Ｓｅｋｅｌｓｋｙら、１９９５；Ｔｓｕｎｅｉｚｕｍｉら、１９９７
；Ｈｕｄｓｏｎら、１９９８；Ｗｉｓｏｔｚｋｅｙら、１９９８；Ｄａｓら、１
９９８；Ｉｎｏｕｅら、１９９８）。Ｓｍａｄｓは、ＴＧＦ−βファミリーメン
バーに代わってシグナルを形質導入するか、またはＴＧＦ−βシグナル伝達を阻
害するタンパク質である。ＴＧＦ−βシグナル伝達に対するパラダイムは、いく
つかの実験系から開発されている（Ｈｅｌｄｉｎら、１９９７）。Ｄｒｏｓｏｐ
ｈｉｌａにおいて、Ｄｐｐは、Ｉ型およびＩＩ型レセプターの両方に結合し、構
成的に活性なＰｕｎｔキナーゼが、Ｉ型キナーゼ（これは、Ｍａｄをリン酸化す
る）をリン酸化し、そして活性化することを可能にする。リン酸化Ｍａｄは、Ｍ
ｅｄを、転写アクチベーターとして核内に移行し、ｄｐｐ標的遺伝子発現を刺激
する。

【０００９】 Ｄｐｐまたは他のＢＭＰ様シグナル伝達活性の増強は、Ｄａｄ様タンパク質（
例えば、ヒトＳｍａｄ６およびＳｍａｄ７）の存在の減少によって達成され得る
。脊椎動物のＳｍａｄ６およびＳｍａｄ７は、Ｉ型レセプターと相互作用し、そ
して培養細胞およびカエル胚においてＴＧＦ−βおよびＢＭＰシグナル伝達を阻
害することが既知である。従って、特定のＳｍａｄの阻害によるＴＧＦ−βファ
ミリーメンバーの阻害不全は、ＢＭＰ様シグナル伝達カスケードを促進する。さ
らに、Ｄｐｐまたは他のＢＭＰ様シグナル伝達活性は、ＤｐｐまたはＢＭＰレセ
プター（例えば、ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａにおけるＳａｘ、ＴｋｖおよびＰｕｎｔ
、ならびにヒトにおけるＢＭＰレセプター、ＢＭＰＲ−ＩＩ、ＡｃｔＲ−ＩＩ、
Ａｃｔ−ＩＩＢ、ＢＭＰＲ−ＩＡ、およびＡｃｔＲ−Ｉ）の機能の増強によって
増強され得る。ＤｐｐまたはＢＭＰシグナル伝達の他の下流の正のレギュレータ
ーには、ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａにおけるＭａｄ、Ｍｅｄ、Ｄａｄ、およびＳｃｈ
ｎｕｒｒｉタンパク質、ならびにヒトにおけるＳｍａｄ１、Ｓｍａｄ４およびＳ
ｍａｄ５が挙げられる。Ｐａｄｇｅｔｔ（１９９９）による総説を参照のこと。

【００１０】 従って、生殖系列幹細胞の維持および増殖に関与する因子を同定および特徴付
けする先行技術の失敗に取り組むために、本発明者らは、ここで、増殖因子のＴ
ＧＦ−βファミリーのメンバーおよびそのシグナル伝達経路が、思いがけなくこ
の本質的な機能を提供することを開示する。

【００１１】 （発明の要旨） 本発明の目的は、骨形成性タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路を通じたシ
グナル伝達を刺激することによって幹細胞を維持および／または増殖させること
である。この様式で、幹細胞の集団が、インビボまたはインビトロで維持され得
、および／または拡大され得る。

【００１２】 生物の生殖系統および体細胞幹細胞を維持するための方法は、骨形成性タンパ
ク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路を刺激することによって提供される。

【００１３】 レセプターに対するＢＭＰ特異的な結合と関連するシグナル伝達経路は、セリ
ン／スレオニン残基のリン酸化（例えば、キナーゼ、ホスファターゼ）およびそ
のシグナルを連絡するその経路の成分（すなわち、例えば、転写因子のようなシ
グナルトランスデューサー）（これらは、そのシグナルを連絡する）のカスケー
ドを含み得る。例えば、シグナルは、細胞表面におけるＢＭＰ結合から核（ここ
で、下流標的の遺伝子発現は、活性化されるかまたは阻害されるかのいずれかで
ある）へと連絡され得る。従って、ＢＭＰシグナル伝達は、この経路において１
つ以上の工程において、またはこのシグナル伝達経路の上流のレギュレーターま
たは下流の標的に影響を与えることによって調節され得る。ＢＭＰシグナル伝達
の調節（すなわち、刺激または抑制）は、幹細胞に対して直接、または混合され
た細胞集団（例えば、フィーダー層）において他の細胞を介して間接的に、達成
され得る。

【００１４】 この幹細胞の特性は、ＢＭＰシグナル伝達を刺激することによって維持され得
る。さらに、幹細胞は、そのような刺激によって量が増加し得、そして／または
寿命が増加し得る。逆に、集団の中の幹細胞または腫瘍細胞は、ＢＭＰシグナル
伝達を抑制することによって、総数または濃度が減少し得るか、または検出限界
において消失さえし得る。

【００１５】 幹細胞はまた、本発明に従って、増殖および単離され得る。

【００１６】 本発明は、幹細胞への限定されたアクセスおよび限定された数という問題に取
り組む。幹細胞を維持および増殖する能力は、これらの希な細胞の遺伝子操作お
よび特徴付けを容易にする。

【００１７】 （特定の実施態様の説明） 本発明は、生殖系列幹細胞の分裂を維持および制御するための方法を提供する
。ここでは、ｄｐｐが必須な役割を提供し得る。さらに、これは、卵巣腫瘍形成
モデルを提供し、ここで、ｄｐｐの過剰発現は、卵巣幹細胞腫瘍を生成する。ク
ローン分析によって、ｄｐｐシグナル伝達経路の下流成分（すなわち、シグナル
トランスデューサー）が生殖系列幹細胞において、その分裂および維持のための
細胞自律性に必要であることが実証される。本発明はまた、ＢＭＰシグナル伝達
によって細胞のニッチ（ｎｉｃｈｅ）の制御のための方法を提供する。ここで、
生殖系列幹細胞は、例えば、周りの体細胞に由来するようであるｄｐｐシグナル
によって調節される。

【００１８】 幹細胞は、正および負の拡散性の因子によって調節されると考えられるが、こ
れらの因子の殆どの機能は、インビボでは全く実証されていない。本発明は、Ｄ
ｐｐが直接Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ生殖系列幹細胞を維持するようにシグナル伝達
し、そしてその分裂を刺激する方法を提供する。この例の実験は、幹細胞および
その子孫の機能が多くの細胞世代にわたって直接試験され得るクローン細胞作製
方法によって可能になった。ｄｐｐシグナルに加えて、ｄｐｐシグナル伝達経路
において公知の成分は、これらの成体幹細胞において必要であることが示されて
いる。この作用は、幹細胞に特異的であるようである。なぜなら、ｄｐｐ経路成
分を欠く生殖系列細胞は、１６細胞嚢胞を形成し得たからである。この例は、Ｔ
ＧＦ−β様の分子が幹細胞増殖因子として機能することを実証する。

【００１９】 ｄｐｐシグナル伝達は、幹細胞を維持するために必要とされる。この細胞にお
いて、Ｄｐｐは、いくつかの異なる様式で作用し得る。シグナル伝達は、生殖系
列幹細胞が、嚢胞芽細胞および生殖体へと分化することを妨害する。この例は、
過剰発現されたｄｐｐが幹細胞分化を妨害するが、他方でｄｐｐ機能の減少が、
幹細胞分化を促進することを示す。ｄｐｐシグナル伝達経路の魅力的な候補標的
は、Ｂａｍタンパク質である。このタンパク質は、通常、嚢胞芽細胞において、
幹細胞よりもはるかに高いレベルで合成される（ＭｃＫｅａｒｉｎおよびＯｈｌ
ｓｔｅｉｎ，１９９５）。生殖系列幹細胞におけるＢａｍの強制的な発現は、ｄ
ｐｐシグナル伝達の減少によって生じる様式に非常に類似した様式でその生殖系
列幹細胞を分化させる（ＯｈｌｓｔｅｉｎおよびＭｃＫｅａｒｉｎ、１９９７）
。従って、ｄｐｐシグナル伝達は、生殖系列幹細胞においてＢａｍタンパク質レ
ベルを負に調節し得る。２つの他の遺伝子ｐｕｍおよびｎｏｓは、生殖系列幹細
胞を形成および維持するために必要とされる（ＬｉｎおよびＳｐｒａｄｌｉｎｇ
、１９９７；ＦｏｒｂｅｓおよびＬｈｅｍａｎｎ、１９９８）。胚において、こ
の両方のタンパク質は、協同して作用して、標的遺伝子（例えば、ｈｕｎｃｈｂ
ａｃｋ（ｈｂ））の翻訳を抑制する（Ｂａｋｅｒら、１９９２；Ｍｕｒａｔａお
よびＷｈａｒｔｏｎ、１９９５）。卵巣において、ｄｐｐシグナル伝達は、Ｎｏ
ｓ／Ｐｕｍ経路に対する効果を通じて、または独立の機構によってＢａｍを下方
制御し得る。しかし、ｄｐｐ経路を通じた遺伝子が必要である。これは、２つの
核転写因子を含む。このことは、この経路の作用が標的遺伝子の転写に対してで
あることを示唆する。ＡｔｔｉｓａｎｏおよびＷｒａｎａ（１９９８）、Ｋａｗ
ａｂａｔａら（１９９８）ならびにＰａｄｇｅｔｔら、（１９９８）による総説
もまた参照のこと。

【００２０】 ｄｐｐはまた、幹細胞と基底終糸細胞との間の特異化された会合を維持するよ
うに機能し得る。そのような会合は、胚腺（ｇｅｒｍａｒｉｕｍ）前に幹細胞を
保持するが、娘生殖系列細胞はすべて、後へと移動し、そして最終的には胚腺を
離脱すると推定されている。本明細書において提示される結果は、幹細胞欠失が
分化に起因することを示す。おそらく、そのレセプターを介したｄｐｐシグナル
伝達は、細胞表面に存在する接着分子または幹細胞接着を間接的に促進する細胞
質タンパク質の発現を調節する。

【００２１】 ｄｐｐシグナル伝達はまた、幹細胞分裂を刺激するように作用し得る。ｄｐｐ
シグナル伝達は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ発生の間のいくつかの点での細胞増殖を
刺激する。翼成虫盤において、細胞増殖および／または生存のためにこのシグナ
ル伝達は必須である（ＢｕｒｋｅおよびＢａｓｔｅｒ、１９９６）が、他方、こ
のシグナル伝達は、目盤の発生の形態形成の溝におけるＧ２−Ｍ転移を促進する
（Ｐｅｎｔｏｎら、１９９７）。そのような要件に一致して、ｍａｄ変異体は、
非常に減少した成虫盤、短い盲腸、および小さな脳を有する（Ｓｅｋｅｌｓｋｙ
ら、１９９５）。本明細書において開示されたｄｐｐシグナル伝達の必要性は、
成体幹細胞が、増殖を調節するために胚細胞および幼生体細胞の戦略に類似する
戦略を使用することを示唆する。例えば、ｄｐｐは、幹細胞について細胞分裂の
速度を刺激する。

【００２２】 加齢の間、幹細胞の数および活性は、減少すると考えられる。この例は、ｄｐ
ｐシグナル伝達のレベルが生殖系列幹細胞の寿命および分裂速度を制御すること
を示す。減少したｄｐｐシグナル伝達は、未熟な幹細胞の欠失を生じた。おそら
く、さらに驚くべきことは、幹細胞からＤａｄタンパク質活性の除去によって生
じるシグナル伝達において予測される増加が、幹細胞がより長期に維持されるこ
とを可能にしたことが観察されたことである。この知見は、ｄｐｐシグナル伝達
が必要であるばかりでなく、ときに、幹細胞維持について速度の律し得ることを
示唆する。例示的な例は、インタクトな生物において幹細胞寿命が延びる方法を
始めて実証する。

【００２３】 これらの結果は、幹細胞の寿命を延長すること（これは、治療的に有意義であ
り得るプロセスである）が可能であり得ることを示唆する。例えば、幹細胞に対
してＢＭＰシグナル伝達を上方制御する薬物は、ヒトおよび動物における受精能
（例えば、生殖系列細胞（基底細胞）の数が減少した患者における雄性受精能）
を増強し得る。そのような薬物は、幹細胞機能の減少によって引き起こされる血
液の状態（例えば、再生不良性貧血、無ガンマグロブリン血症）および関連する
状態を改善し得る。ＢＭＰシグナル伝達を増強する薬物は、創傷治癒を増強し得
る。幹細胞の欠失によって生じる加齢関連病理（例えば、脱毛、筋肉質量の欠失
、血液細胞数の減少および皮膚ならびに他の幹細胞依存性組織の加齢）は、ＢＭ
Ｐシグナル伝達を増加させることによって処置され得る。ＢＭＰシグナル伝達を
増強する化合物は、生物の平均寿命を延長させ得る。

【００２４】 ｄｐｐシグナル伝達の増強についての一つの方法は、ｄｐｐインヒビターであ
るＤａｄまたは他のＤａｄ様阻害性タンパク質活性（阻害性Ｓｍａｄ活性）の生
殖幹細胞からの除去によって容易にされ得る。Ｄａｄは、ｄｐｐシグナル伝達に
よって誘導されるが、次いで、その生産を活性化したその経路自体を下方制御す
るように作用する。この方法はまた、ｄｐｐシグナル伝達の他の負のレギュレー
ター、および特に阻害性Ｓｍａｄを用いて実施され得る。対照的に、ｂｒｉｎｋ
ｅｒ（ｂｒｋ）は、ｄｐｐシグナル伝達によって抑制される標的遺伝子である。
なぜなら、これはそれ自体が転写リプレッサーであり、Ｂｒｋリプレッサーの発
現を抑制させる正味の効果は、Ｂｒｋで制御された標的遺伝子を上方制御するこ
とであるからである（Ｍｉｎａｍｉら、１９９９；Ｃａｍｐｂｅｌｌら、１９９
９；Ｊａｗｉｎｓｋａら、１９９９）。これは、ｄｐｐシグナル伝達の後にＢｒ
ｋ制御された標的遺伝子の生成の増加を生じる。従って、ＢＭＰシグナル伝達は
、ＳｍａｄまたはＢＭＰシグナル伝達によって調節される標的遺伝子の適切な操
作（すなわち、ＢＭＰシグナル伝達の刺激または抑制を達成するために適切なそ
れらの効果を増加または減少させること）によって刺激または抑制され得る。Ｄ
ａｄおよびＢｒｋの役割は、その経路の残りと同様に、哺乳動物において保存さ
れているようである。

【００２５】 幹細胞に対してＢＭＰシグナル伝達を減少させる薬物は、有用な化学療法剤で
あり得る。例えば、ＢＭＰシグナル伝達経路を阻害する薬物は、幹細胞の分化を
生じさせることによって奇形ガンに対する有用な治療であり得る。別の例として
、ＢＭＰシグナル伝達を阻害する薬物は、継続された成長のためのＢＭＰシグナ
ル伝達に依存する卵巣生殖系列腫瘍に対する首尾よい処置であり得る。

【００２６】 幹細胞に対するＢＭＰシグナル伝達の増加または減少によって、幹細胞の集団
を、骨髄移植の前に増大させ、それによって、首尾よい移植のチャンスを増加さ
せ、そして必要とされるドナー骨髄の量を減少させることを可能にし得る。さら
に、ＢＭＰシグナル伝達の制御は、患者から除去され、インビトロで増大され、
そして次いで患者に再導入されるべき骨髄におけるもの以外の幹細胞の、損傷ま
たは疾患（例えば、パーキンソン病）によって損傷した組織を修復させることを
可能にし得る。

【００２７】 血液腫瘍（例えば、リンパ腫および白血病）を有する患者からの骨髄は、ＢＭ
Ｐ感受性について試験され得る。ＢＭＰ感受性について陽性の試験結果によって
、インビボでの抗ＢＭＰ処置の潜在的な副作用を回避する工程を採ることが可能
になる。例えば、その患者から取り出された骨髄は、ＢＭＰシグナル伝達を阻害
し、それによって腫瘍細胞の分化を誘導し、そしてその腫瘍の負荷を減少するこ
とによって、腫瘍細胞が浄化され得る。次いで、浄化された骨髄は、自己骨髄移
植でその患者に返還され得る。そのような分化治療はまた、肉腫、ガン腫および
神経膠腫症のような固形腫瘍について使用されて、腫瘍負荷を減少させ得る。治
療は、単独または他の処置（例えば、迅速に分裂する細胞を優先的に殺傷する化
学療法、高体温、または放射線）および腫瘍の外科的切除とともに使用され得る
。

【００２８】 幹細胞に対するＢＭＰシグナル伝達の上方制御は、例えば、トランスジェニッ
ク動物を作製するために有用である培養物中の生殖系列幹細胞の増殖を可能にし
得る。そのような技術は、従来、発生および疾患の遺伝的モデルとしては使用さ
れてこなかった生物において特に有用である。

【００２９】 幹細胞ニッチを、ｄｐｐのようなＴＧＦ−βメンバーの過剰発現によって増大
させる能力は、希なヒトの幹細胞、あるいは任意の種の希な幹細胞が、宿主とし
て作用するように遺伝子操作された、生存するＤｒｏｓｏｐｈｉｌａへの移入後
に精製および増殖されることを可能にし得る。

【００３０】 生物医学的な研究および処置に加えて、本発明の他の用途は、農業および野生
動物の保存を含む。幹細胞は、ヒト、霊長類（例えば、ボノボ、チンパンジー、
ゴリラ、マカク、オランウータン）、伴侶（ｃｏｍｐａｎｉｏｎ）動物（例えば
、イヌ、ネコ）、および農場／実験室の動物（例えば、ウシ、ロバ、ヤギ、ウマ
、ブタ、ヒツジ；ヒキガエル（ｆｒｏｇ）、サンショウウオ、カエル（ｔｏａｄ
）のような両生類；ニワトリ、アヒル、シチメンチョウのような鳥類、コイ、ナ
マズ、メダカ、サケ、テラピア（ｔｉｌａｐｉａ）、マグロ、ゼブラフィッシュ
のような魚類；ノウサギ、ウサギのようなウサギ目動物；マウス、ラットのよう
なげっ歯類）において提供され得るか、またはそれらから得られ得る。

【００３１】 幹細胞は、適切なニッチ中または培養物中にて維持および／または維持され得
、そして核移入を通じて、子孫生物をクローニングするための核の供給源、また
は胚の凝集を通じて、モザイク生物の増殖のための細胞供給源として使用され得
る。従って、Ｄｐｐまたは関連ＢＭＰは、動物をクローニングするために、イン
ビトロまたはインビボで幹細胞を増殖させるための手段を提供する。

【００３２】 ＢＭＰシグナル伝達は、ＢＭＰシグナル伝達経路、または異なる型のＢＭＰ、
ＢＭＰレセプター、および互いに機能的に当価なＳＭＡＤの進化的に多様化した
成分の能力のために、１つの型のＢＭＰおよびＢＭＰレセプターの型のみに限定
されないようである。例えば、Ｄｐｐ／Ｔｋｖシグナル伝達とＧｂｂ／Ｓａｘシ
グナル伝達との間にはクロストークが存在するようであり（Ｈａｅｒｒｙら、１
９９８）、そしてあるシグナルトランスデューサーは、異なるシグナル伝達経路
で作用する（Ｌａｇｎａら、１９９６）。例えば、ＢＭＰの混合物は、規定され
た培養培地に添加され得るか、または馴化培養培地に存在し得、その結果、Ｄｐ
ｐおよびＧｂｂは、１よりも多くの異なる型のＢＭＰレセプターを通じて、ＢＭ
Ｐシグナル伝達を開始する際に作用する。別の例としては、１つの型のシグナル
トランスデューサーは、１よりも多くの異なる型のＢＭＰレセプターを通じて、
シグナル伝達を刺激し得る。

【００３３】 ＢＭＰシグナル伝達を刺激するために、正のシグナルトランスデューサーは、
発現において増大され得るか（例えば、より多くの転写物および／または翻訳産
物）、あるいはそのシグナルトランスデューサーの活性を増大させるために機能
獲得表現型に変異され得、一方、負のシグナルトランスデューサーは、発現にお
いて減少され得るか（例えば、より少ない転写物および／または翻訳産物）、あ
るいはそのシグナルトランスデューサーの活性を減少させるために機能喪失表現
型に変異され得る。あるいは、ＢＭＰシグナル伝達の下流の標的遺伝子は、ＢＭ
Ｐが、標的遺伝子の上流に結合するそのＵＡＳまたはエクジソンレセプターを結
合するトランスアクチベーター様ＧＡＬ４を使用する遺伝子工学によってそのレ
セプターに結合することなく、直接的に活性化または阻害され得る。マウスにお
ける同様の技術は、テトラサイクリンまたはＦＫ５０６を用いる誘導を含む。

【００３４】 別の方法は、細胞中で内因性ＢＭＰ活性を増大させるか、または細胞外で内因
性ＢＭＰ活性を増大させることである（特に、リガンドがＢＭＰシグナル伝達に
おける律速成分である場合）。例えば、ＢＭＰ発現は、幹細胞中で増大され得、
そしてオートクライン機構を通じてＢＭＰシグナル伝達を刺激し得る。あるいは
、ＢＭＰ発現は、非幹細胞またはフィーダー細胞中で増大され得、次いで、ＢＭ
Ｐ活性が分泌され、そして幹細胞によって取り込まれるか、あるいは幹細胞の表
面との接触へともたらされる。ＢＭＰはまた、細胞外空間または培養培地に添加
され得る。ＢＭＰ活性は、動物または培養物中に通常存在する量と比較した場合
、少なくとも約１０％、５０％、１００％、または２００％程度、ＢＭＰシグナ
ル伝達を刺激するために増大され得る。

【００３５】 維持され得る幹細胞の特性は、以下を含む：多能性、全能性、１以上の分化し
ている細胞系列へと方向付けること、複数の異なる型の先祖細胞および／または
分化した細胞を生じること、生殖系列に寄与すること、およびそれらの組み合わ
せ。従って、幹細胞の増殖および／または生存は、ＢＭＰシグナル伝達の減少ま
たは除去の後の適切な条件の下で分化する能力を保持しつつ、分化のプログラム
へと方向付けることなく、維持され得る。より簡単には、集団中の幹細胞は、非
幹細胞に関する総数または濃度において拡大され得るか（すなわち、量の増大）
、幹細胞の誕生とその死またはアポトーシスとの間の時間において延長され得る
か（すなわち、寿命の増大）、あるいはそれらの組合せであり得る。逆に、集団
中の幹細胞または腫瘍細胞は、ＢＭＰシグナル伝達を抑制することによって、総
数または濃度において減少され得るか、あるいはさらに、検出限界にて除去され
る。

【００３６】 本発明に従って作製された幹細胞は、全能性または多能性、雄性または雌性、
生殖系列または体細胞性、分裂性または静止状態、脊椎動物または非脊椎動物で
あり得、インサイチュで存在するかまたは単離されてい得、分化細胞から部分的
または実質的に精製されてい得、およびそれらの組合せであり得る。増殖してい
る幹細胞は、二倍体であり、減数分裂に進入し、そして配偶子発生のより後期の
段階は、本発明によって妨げられる、雄性または雌性の生殖系列の幹細胞につい
ての分化プログラムの一部である。幹細胞は、精巣、卵巣、特にＤｒｏｓｏｐｈ
ｉｌａの精巣および／または卵巣小管の頂端（ａｐｉｃａｌ ｔｉｐ）、あるい
は他の成体組織または胚性組織中に存在し得るか、またはそれらから得られ得る
。分化させることによって、幹細胞は、造血系、免疫系、または神経系などの細
胞に分化し得る。好ましくは、本発明によって維持および／または増殖される幹
細胞は、より遅く分化する能力を保持し、それによって卵子形成または精子形成
、３つの全ての胚葉（すなわち、内胚葉、中胚葉、外胚葉）、複数の分化した細
胞系列、およびそれらの組合せに寄与する。

【００３７】 体細胞は、卵巣由来の終糸細胞、キャップ細胞、および鞘内細胞、ならびに精
巣由来のｈｕｂ細胞を含む。好ましくは、本発明は、維持および／または増殖の
間に、生殖系列細胞に関する集団中の体細胞の割合を減少させる。周囲の体細胞
または体細胞を含むフィーダー層によって規定されるニッチは、生殖系列細胞を
維持および／または伝播するために、細胞の接触および他の細胞外シグナルを提
供し得る。例えば、培養細胞を遺伝的に操作して、ＢＭＰ（これは、次いで、幹
細胞上のそのレセプターに結合する）を発現および分泌させることによって、特
定の必須の細胞外シグナルを提供するフィーダー層が、提供され得る。

【００３８】 細胞集団は、生殖系列または体細胞系列（または混合）、雄性または雌性、分
裂性または静止状態、脊椎動物または非脊椎動物であり得、インサイチュで存在
するかまたは単離されてい得、部分的または実質的に精製されてい得、およびそ
れらの組合せであり得る。好ましくは、細胞集団は、１以上のＢＭＰを発現する
細胞を含み；より好ましくは、ＢＭＰは、非幹細胞により分泌され、そして幹細
胞のレセプターに結合してＢＭＰシグナル伝達を刺激する。従って、本発明の幹
細胞は、ＢＭＰ、特にＤｐｐまたはホモログに対するレセプターを含むか、ある
いは少なくともＢＭＰシグナル伝達に応答性である。

【００３９】 哺乳動物、両生類、鳥類、および魚類に加えて、他の生物（例えば、蠕虫（例
えば、Ｈｅｌｍｉｎｔｈｅｓ、Ｎｅｍａｔｏｄｅｓ）、および昆虫（例えば、Ａ
ｎｏｐｈｅｌｅｓ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のような無脊椎動物）が、本発明に
おいて使用され得る。特に、ＢＭＰシグナル伝達経路の成分、上流のレギュレー
ターの成分、および下流の標的の成分の比較は、それらが高度に保存されている
ことを示す（ＢｉｔｇｏｏｄおよびＭｃＭａｈｏｎ、１９９５；Ｐａｄｇｅｔｔ
ら、１９９８）。従って、本発明は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａ
ｓｔｅｒに対するその有用性に限定されるべきではない。ｄｐｐの保存を示し（
Ｎｅｗｆｅｌｄら、１９９７）、かつ有用なようである他の種は、Ｄ．ｓｉｍｕ
ｌａｎｓ、Ｄ．ｐｓｅｕｄｏｏｂｓｃｕｒａ、およびＤ．ｖｉｒｉｌｉｓである
。よく研究されている後生動物亜界の種について、ｄｐｐ様遺伝子が同定されて
いる。

【００４０】 ｄｐｐ、ｇｌａｓｓ ｂｏｔｔｏｍ ｂｏａｔ（ｇｂｂ）、およびｓｃｒｅｗ
（ｓｃｗ）の哺乳動物ホモログは、ＢＭＰ−２／４、ＢＭＰ−５／８、およびＢ
ＭＰ−６としてそれぞれ同定されている（Ｈｏｆｆｍａｎｎ、１９９７；Ｒａｆ
ｔｅｒｙおよびＳｕｔｈｅｒｌａｎｄ、１９９９；Ｗｈａｒｔｏｎら、１９９９
）。ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−４を特異的に結合する哺乳動物のセリン／トレオ
ニンキナーゼレセプターは、同定されている（Ｙａｍａｊｉら、１９９４）。Ｔ
ＧＦ−βファミリーの他の関連メンバー、それらのレセプター、またはそれらの
シグナル伝達経路の他の成分もまた、本発明に使用され得る。米国特許第５，０
１１，６９１号、同第５，０１３，６４９号、同第５１６６，０５８号、同第５
，１６８，０５０号、同第５，２１６，１２６号、同第５，３２４，８１９号、
同第５，３５４，５５７号、同第５，６５３，３７２号、同第５，６３９，６３
８号、同第５，６５０，２７６号、および同第５，８５４，２０７号もまた参照
のこと。

【００４１】 さらに、変異分析および構造−機能の相関の決定は、Ｄｐｐシグナル伝達に保
存された残基および必須な残基を同定した（Ｗｈａｒｔｏｎら、１９９６）。細
菌で発現されたＤｐｐは、再び折り畳まれ、次いで、生化学的および生物物理学
的に特徴付けられる（Ｇｒｏｐｐｅら、１９９８）。ＢＭＰファミリーのメンバ
ーのホモログ、それらのレセプター、およびこのシグナル伝達経路の他の成分は
、アミノ酸が比較される場合の高レベルの構造の保存性によって、ならびに／あ
るいはホモログが変異体の表現型をレスキューするか、またはそれ以外の方法で
ＢＭＰ活性を置換する場合の機能の保存性によって同定され得る。

【００４２】 細胞型は、マーカーによって同定されており、そして遺伝的変異体および発生
研究によって十分に特徴付けられる。幹細胞は、インタクトな生物の部分として
インサイチュで提供され得るか、またはそれらは、インビトロで培養され得る。
生殖系列幹細胞および周囲の細胞は、成体（例えば、卵巣、精巣）または胚に由
来し得る。インビトロの培養について、細胞は、生物から直接的に得られ得るが
（すなわち、初代培養）、これは、それらの数を拡大（例えば、最初の数よりも
少なくとも２倍、１０倍、または１００倍）するために、数回の培養（例えば、
少なくとも５回、１０回、または２０回）を通じて、細胞を継代することが便利
である。

【００４３】 幹細胞は、ＢＭＰシグナル伝達経路を刺激することによって細胞数を増大させ
るか、または増大させずにドナー生物から単離し得；１以上の化学物質での処理
するか、遺伝物質を導入するか、別の細胞と融合させるか、１以上の遺伝子を変
異させるか、所望の遺伝子型または表現型を選択するか、あるいはそれらの組合
せによって、維持および／または増殖のための条件下で、一過性のインビトロ培
養の間に操作され得；ならびにドナーと同一の宿主中に幹細胞を戻して移植する
か（すなわち、自系移植）、ドナーと同様であるが異なる宿主中に幹細胞を戻し
て移植するか（すなわち、同種異系移植）、あるいはドナーとは完全に異なる宿
主中に幹細胞を戻して移植する（すなわち、生体異物移植）。インビトロ培養条
件で、トランスフェクションおよび部位特異的組換え、ならびに細胞または核の
移植によるＤｒｏｓｏｐｈｉｌａの遺伝子工学が、当該分野において公知である
。

【００４４】 Ｄｒｏｓｐｈｉｌａについて、精巣当たり１０個の生殖系列幹細胞および卵巣
当たり３２〜４８個の生殖系列幹細胞（すなわち、卵巣当たり約１６個の卵巣小
管、および卵巣当たり約２または３個の生殖系列幹細胞が存在する）のみが存在
する。本発明は、生体または胚中でインビボで産生され、次いで、インビトロで
培養された、非常に増大した数の幹細胞を提供する。細胞のインビトロ培養は、
まず、各々の卵巣小管中に多数の生殖系列幹細胞を有するハエを作製することに
よって実行され得る。次いで、卵巣は、無菌の培養培地中に外科的に取り出され
得、そして生殖細胞が放出され得る（それらは、接着せず、それによって脱凝集
する必要がない）。あるいは、脱凝集した胚もまた、生殖系列幹細胞の供給源と
して使用され得る。胚当たりの生殖細胞の数は、卵巣および精巣当たりの数と同
じであるが、１００，０００個の胚を用いて開始することが可能であるが、数百
の性腺が、容易に得られ得る。Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ（１９７２）は、Ｄｒｏｓｏ
ｐｈｉｌａ由来の細胞株の誘導を示す。

【００４５】 Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞は、Ｄｐｐ（例えば、Ｐａｎｇａｎｉｂａｎら、１
９９０）またはＨｈ（例えば、Ｌｅｅら、１９９４）を発現する細胞のフィーダ
ー層を含有する小さなウェル、あるいは可溶性因子を分泌する細胞を含む培地を
馴化するか、または組換え産生された可溶性因子（例えば、Ｇｒｏｐｐｅら、１
９９８に従って産生されたＤｐｐ）を単純に添加することによって調製される培
養培地中にプレートされ得る。例えば、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ’ｓ Ｄｒｏｓｏｐ
ｈｉｌａ培地のような、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞を増殖させるためのインビト
ロ培養培地が市販されている。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞はまた、哺乳動物の組
織培養培地中に適応および増殖され得る（Ｓｐｒａｄｌｉｎｇら、１９７５；Ｌ
ｅｎｇｙｅｌら、１９７５）。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞は、哺乳動物細胞のよ
うにトランスフェクトされ得る（Ｂｕｒｋｅら、１９８４）。体細胞、胚細胞（
ＥＳ）、および胚細胞（ＥＧ）中の相同組換えのための構築物およびストラテジ
ーは、インビトロで培養されたＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞を用いる用途のために
適応され得る（Ｃａｐｅｃｃｈｉ、１９８９；ＫｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈｉ
ｅｓ、１９９２）。次いで、培養細胞またはそれらの核は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌ
ａ中に移入され得る（Ｏｋａｄａら、１９７４；Ｖａｎ Ｄｅｕｓｅｎ、１９７
７）。

【００４６】 生殖系列幹細胞を培養する以前の試みは、発生の特定の段階に各胚中に存在す
る４０個の生殖系列細胞を利用した。しかし、ｄｐｐは提供されず、そしてこれ
らの細胞は、培養物中で分化しなかった（Ａｌｌｉｓら、１９７９）。このよう
な培養物中でＢＭＰ発現を誘導すること、または外因性のＢＭＰをそれらに添加
することは、インビトロで生殖系列幹細胞を維持し、かつ増殖させる単純な様式
である。

【００４７】 ＢＭＰはまた、例えば、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、白血病阻害因子（Ｌ
ＩＦ）、およびＳｌ因子（ＳＦ）のような既知の幹増殖因子と置き換えて、また
は組み合わせて使用され得る。従って、本明細書中で観察されるようなＢＭＰ活
性はまた、米国特許第５，４５３，３５７号および同第５，６９０，９２６号に
教示される技術を使用して実証され得る。

【００４８】 身体外でのみ行われるＢＭＰシグナリングの刺激を用いる幹細胞のエキソビボ
培養は、生物におけるＢＭＰシグナリングの全身的効果を避けるために好ましい
。

【００４９】 血管のまたは器官の操作は、内皮または実質にそれぞれ分化する幹細胞を用い
て、幹細胞がコートされたか、もしくは浸透された移植可能な支持体（例えば、
ステント、ホローファイバー、または粒子）とともに、またはこのような支持体
なしで達成され得る。自己に移植されておらず、そして組織不適合性を認識する
免疫系を有する生物中にある場合、同種異系組織または異種組織の移植は、宿主
の免疫抑制（例えば、シクロスポリンＡまたはＦＫ５０６処理）を必要とし得る
。副腎、骨髄、脳、肝臓、卵巣もしくは精巣、膵臓、末梢ニューロンもしくはグ
リア、赤血球もしくは白血球、骨格筋もしくは平滑筋、皮膚、甲状腺、またはこ
れらの組合せの活性および／あるいは構造を有する組織への、幹細胞の分化が好
ましい。

【００５０】 １つ以上の幹細胞の遺伝子は、化学的もしくは環境的誘導、アンチセンス、リ
ボザイム、キメラ修復ベクター、ＲＮＡｉ、またはランダム／配列特異的挿入に
よって活性化または阻害され得る。遺伝子の異所性発現は、特定の空間的または
時間的様式、模倣的な病原性状態または疾患状態、あるいは内在性遺伝子におけ
る変異の表現型模写において制御され得る。相同組換えは、遺伝子ノックアウト
または置き換えを達成するために好ましい（例えば、米国特許第５，５６９，８
２４号、同第５，６０２，３０７号、同第５，６１４，３９６号、同第５，６８
３，９０６号、および同第５，８３０，６８２号を参照のこと）。例えば、幹細
胞は、ポリヌクレオチドを用いてトランスフェクトされ得、ポリヌクレオチドま
たはその部分は、無作為な部位に、または配列特異的な様式で、トランスフェク
トされる幹細胞のゲノムに組み込まれ、目的の遺伝子の遺伝子座における相同組
換えは選択され、そして選択された幹細胞は宿主生物に移植される。ポリヌクレ
オチドの物理的導入（例えば、微粒子銃、エレクトロポレーション、マイクロイ
ンジェクション）が好ましい。あるいは、Ｐエレメントの挿入は、遺伝子を破壊
するために本発明に従って維持され、そして／または増殖された幹細胞において
インビボまたはインビトロで遺伝的に操作され得る（ＺｈａｎｇおよびＳｐｒａ
ｄｌｉｎｇ、１９９４；Ｓｐｒａｄｌｉｎｇら、１９９５を参照のこと）。

【００５１】 ＴＧＦ−βシグナリングは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ精子形成の間に生殖系列嚢
胞の増殖を制限することが示されてきた（Ｍａｔｕｎｉｓら、１９９７）。ｐｕ
ｎｔおよびｓｈｎ機能が、生殖細胞を取り囲む体細胞細胞のクローンにおいて除
去された場合、嚢胞は、４回の有糸分裂後に分裂を継続する（Ｍａｔｕｎｉｓら
、１９９７）。しかし、これらの研究者らは、雄の生殖系列幹細胞においてこの
経路が機能するか否かについて取り扱っていなかった。胚盤（ｅｍｂｒｙｏ ｄ
ｉｓｃ）および成虫盤において、ｐｕｎｔおよびｓｈｎは、ｄｐｐの下流で機能
し得る（Ｒｕｂｅｒｔｅら、１９９５；Ｌｅｔｓｏｕら、１９９５；Ａｒｏｒａ
ら、１９９５；Ｇｒｉｅｄｅｒら、１９９５）が、ｄｐｐまたは別のＴＧＦ−β
ファミリーメンバーがシグナルを送るために使用されるか否かは未知であった。
雄の生殖系列幹細胞のｄｐｐの下流の成分における変異体のクローン分析は、卵
巣において本明細書中で報告されるものと同様に、Ｄｐｐおよび／または他のＴ
ＧＦ−β様分子が精巣におけるそれらの分裂および維持のために必要とされるか
否かを示し得る。

【００５２】 マウスにおいて、ＢＭＰファミリーメンバーであるＢＭＰ−２およびＢＭＰ−
４は、７５％より大きい同一性を伴って、ｄｐｐに最も密接に関連し、そして胚
においてｄｐｐ変異体をレスキューするために機能し得る（Ｐａｄｇｅｔら、１
９９３）。最近、両方の遺伝子は、相同組換えによって不活性化されたが、しか
しホモ接合性の胚は、あまりに初期に死滅するので生殖腺における可能な機能を
評価できなかった（Ｗｉｎｎｉｅｒら、１９９５；ＺｈａｎｇおよびＢｒａｄｌ
ｅｙ、１９９６；Ｈｏｇａｎによる概説、１９９６ｂ）。本発明者らの知見と一
致して、Ｌａｗｓｏｎら（１９９９）は、ＢＭＰ−４は、始原生殖細胞の数に影
響を与え；さらに、ＢＭＰ４は体細胞組織において必要とされ、そしておそらく
、生殖系列細胞においてＢＭＰシグナル伝達を刺激したが、このことは直接に示
されなかったことを報告している。２つの他のＢＭＰファミリーメンバー、ＢＭ
Ｐ−８ＡおよびＢＭＰ−８Ｂの精子形成の間の役割は試験されてきた（Ｚｈａｏ
ら、１９９６；１９９８）。ＢＭＰ−８Ｂは、初期の成熟期において雄の生殖系
列細胞増殖の再開のために必要であり、そして成体における生殖系列細胞の生存
のために必要であるが、一方ＢＭＰ−８Ａは、成体の精子形成の維持において役
割を果たす。

【００５３】 「ニッチ」仮説は、幹細胞が最適な微小環境すなわち「ニッチ」に存在するこ
とを仮定する（Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄ、１９７８）。幹細胞が分裂する場合、１つ
の娘細胞のみがニッチに残存し、一方他の娘細胞は分化される。ニッチ中の幹細
胞は、自己再生の高い可能性を有するが、しかし、分化の経路に進入する可能性
は低い。このモデルは、幹細胞が、多数のインビトロの培養系において増殖およ
び分化のために増殖因子の添加を必要とするという観察と一致する（Ｐｏｔｔｅ
ｒおよびＬｏｅｆｆｌｅｒ，１９９０；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９９７）。ニッ
チにおける微小環境の分子的性質は、なお、任意の系において規定されなければ
ならないが、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ胚腺は、そのようなニッチを含むようである
。以前に、幹細胞は、末端フィラメントおよびキャップ細胞（これらの両方がｈ
ｈを発現する）に隣接するが、一方後者のみがａｒｍａｄｉｌｌｏ（ａｒｍ）お
よびｗｇを発現する（Ｆｏｒｂｅｓら、１９９６ａ；１９９６ｂ）。幹細胞の娘
細胞は、後部により多く存在し、そしておそらく、ｐａｔｃｈｅｄ（ｐｔｃ）お
よびｈｈを発現する胚腺の鞘内細胞と直接的に接触する（Ｆｏｒｂｅｓら、１９
９６ｂ）。構造およびシグナルにおけるこの非対称性は、生殖系列幹細胞がそれ
らの娘細胞からの異なるシグナルのレベルを受け取ることを可能にし得る。ニッ
チの存在と一致して、最近、際だった変異幹細胞を欠失した胚腺における２つの
野生型幹細胞がときどき観察された。このことは、空になったニッチが再び占有
されたことを示唆する。

【００５４】 生殖系列幹細胞ニッチの存在はまた、局所的なｄｐｐが過剰発現された場合に
、幹細胞増殖と一致する。これらの条件下において、ニッチのサイズは、実質的
に拡大され得る。逆に、ｄｐｐ機能の減少は、ニッチが生殖系列幹細胞を維持す
る能力を弱め得、このことは損失を加速させることをもたらす。これらの結果は
、ｄｐｐが必須のニッチシグナルであることを示唆する。しかし、ｄｐｐは、取
り囲む体細胞からの他のシグナルと相互作用し、生殖系列幹細胞のために機能的
なニッチを作るようである。それにも関わらず、鍵となるニッチシグナルとして
のｄｐｐの同定は、インビトロにおけるＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ生殖系列幹細胞を
培養する取り組みを非常に促進する。

【００５５】 技術的な制限により、以前は、生殖系列幹細胞によって受容されるｄｐｐシグ
ナルの供給源の同定が妨害されてきた。理想的には、無効であるｄｐｐ対立遺伝
子のクローンの分析は、細胞がシグナルを産生することを示す。しかし、幹細胞
に隣接する体細胞は、卵巣の発達の初期に分裂を停止し、そして特定の小さなク
ローンの誘導を困難にする。胚腺におけるこのｄｐｐ発現のパターンはまた、シ
グナルの起源についてのいくつかの洞察を与える。しかし、唯一利用可能なｄｐ
ｐ−ｌａｃＺ融合株および全マウントインサイチュ実験が、胚腺における発現を
検出することに失敗したが、後期段階の卵チャンバーにおける卵胞細胞発現が観
察された。本発明者らは、ここでニッチ中の体細胞がｄｐｐを発現することを示
す。多くの系において、低いレベルのｄｐｐ発現が、生物学的効果について十分
であることが公知であり、ゆえに本発明においてごく低いレベルのＢＭＰを提供
することが十分であり得る。

【００５６】 Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａの脚、触角、および生殖盤（ｇｅｎｉｔａｌ ｄｉｓｃ
）において、ｄｐｐおよびｗｇは、ｈｈによって前部の区画に誘導され、そして
ｄｐｐおよびｗｇの相互の抑制は、それらを、それらの適切なドメインに制限す
る（ＢｒｏｏｋおよびＣｏｈｅｎ、１９９６；ＪｉａｎｇおよびＳｔｒｕｈｌ，
１９９６；ＣｈｅｎおよびＢａｋｅｒ，１９９６）。脊椎動物の肢の発達におい
て、ｓｏｎｉｃ ｈｅｄｇｅｈｏｇ（ｓｈｈ）は、ＢＭＰ−２の発現を誘導し得
る（ＪｏｈｎｓｏｎおよびＴａｂｉｎ，１９９５）。体細胞の末端フィラメント
、キャップ、および鞘内細胞はｈｈを発現し、そして生殖系列幹細胞に隣接して
存在する（Ｆｏｒｂｅｓら、１９９６ａ、１９９６ｂ）。ｗｇおよびｄｐｐ発現
は、ｈｈによって誘導され得、そして生殖系列幹細胞の増殖および維持のために
それらの細胞へシグナリングされ得る。データは、これらのシグナル、および、
おそらく前部体細胞由来のさらなるシグナルが、胚腺の先端部の生殖系列幹細胞
についてのニッチを規定することを示す。従って、ヘッジホッグ（ｈｅｄｇｅｈ
ｏｇ）シグナリングを改変する薬剤が使用されて局所的ＢＭＰシグナリングを変
化させ得、それによって幹細胞の維持および／または増殖を調節する。

【００５７】 （実施例） （実施例１：異所性のＤｐｐ発現は、生殖細胞腫瘍を誘導する） ＤｐｐがＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ成体卵巣における生殖系列幹細胞を調節し得る
か否かを評価するために、Ｄｐｐを、ｈｓｐ７０−ＧＡＬ４（ｈｓ−ＧＡＬ４）
およびＵＡＳ−ｄｐｐ（ＢｒａｎｄおよびＰｅｒｒｉｍｏｎ，１９９３）を使用
して、胚腺中で異所的に発現させた。胚腺中の異なる細胞型を区別するために、
本発明者らは、抗Ｈｔｓ抗体および抗Ｖａｓｅ抗体を使用して、体細胞および生
殖系列細胞を、それぞれ可視化した。抗Ｈｔｓ抗体はまた、胚腺の生殖系列細胞
中のスペクトロソーム（ｓｐｅｃｔｒｏｓｏｍｅ）およびフソーム（ｆｕｓｏｍ
ｅ）を認識する（ｄｅ Ｃｕｅｖａｓら、１９９７を参照のこと）。

【００５８】 生殖系列幹細胞および嚢胞芽細胞のみが、大きな円形のスペクトロソームを有
するが、一方、嚢胞は、特徴的な分枝したフソームを有する。野生型胚腺におい
て、２つの生殖系列幹細胞は、嚢胞芽細胞よりもより前方に位置する。胚腺の領
域１および２ａ（すなわち、前方の半分）において成長している嚢胞（これは、
生殖系列幹細胞および嚢胞芽細胞よりもより後方である）は、フソームによって
連結される。胚腺の領域２ｂおよび３において、レンズ型と円形の嚢胞の両方は
、胚腺を横切って広がり、そして体細胞性卵胞細胞によって取り囲まれる。フソ
ーム構造は、これらのより古い嚢胞において変性を始める。

【００５９】 熱ショックに供したｈｓ−ＧＡＬ４雌由来の胚腺および熱ショックの非存在下
でｈｓ−ＧＡＬ４およびＵＡＳ−ｄｐｐを有する雌由来の胚腺は、野生型と区別
できなかった。これらの熱処理した胚腺において、対応する野生型の胚腺領域１
および２ａを満たす大きな単一の生殖系列細胞は、スペクトロソームを含んだが
、嚢胞形成の証拠を示さなかった。対応する野生型領域２ｂおよび３において、
レンズ型と円形の両方の嚢胞が観察された。これらの嚢胞は、おそらく分化した
嚢胞芽細胞に由来するか、または最初の熱ショックの前に形成された嚢胞である
。

【００６０】 この解釈と一致して、熱ショックの４〜５日後に、対応する領域１および２に
おけるすべての生殖系列細胞は、スペクトロソームを含む単一の細胞であった。
そして分枝したフソームを含む成長している嚢胞は、ほとんど検出されなかった
。体細胞性卵胞細胞のみが検出され、生殖系列細胞は存在しなかった。この表現
型は、ｂａｍおよびｂｅｎｉｇｍ ｇｏｎｉａｌ ｃｅｌｌ ｎｅｏｐｌａｓｍ
（ｂｇｃｎ）変異の表現型に非常に類似している（ＭｃＫｅａｒｉｎおよびＳｐ
ｒａｄｌｉｎｇ，１９９０；ＧａｔｅｆｆおよびＭｅｃｈｌｅｒ，１９８９）。

【００６１】 ここで、卵巣小管当たり２〜３の生殖系列幹細胞の野生型の数ではなく、何ダ
ースものその細胞が単一の卵巣小管中に存在した。さらに、その存在する数は、
３日後よりも４〜５日後が２〜３倍より多かった。卵巣あたり１６の卵巣小管、
および雌のハエあたり２つの卵巣が存在するので、上記の数のすべてに３２をか
けて、ハエ当たりの雌の生殖系列幹細胞の数を計算する。生殖系列幹細胞は、ｄ
ｐｐの誘導後に増殖して、大量の正常の外見の、正常に機能する生殖系列幹細胞
を形成する。増殖している細胞は、（１）一般的なサイズおよび外見、（２）フ
ソームの形態、（３）生殖細胞特異的遺伝子ｖａｓａの発現、（４）細胞質Ｂａ
ｍの発現の非存在（すなわち、生殖系列幹細胞が嚢胞芽細胞に分化したという高
感度の指標）、および（５）ｄｐｐの除去後の生殖系列細胞についての正常な経
路に沿って分化する能力、に基づいて生殖系列幹細胞であることを示した。

【００６２】 （実施例２：Ｄｐｐ誘導腫瘍細胞は、生殖系列幹細胞に似ている） 嚢胞芽細胞および初期有糸分裂嚢胞は、幹細胞から区別し得る。なぜなら、前
者は、嚢胞芽細胞段階から８細胞段階の嚢胞段階の終わりまで細胞質Ｂａｍタン
パク質を発現するからである。抗ＢａｍＣおよび抗αスペクトリンを用いる野生
型胚線の免疫蛍光染色は、生殖系列幹細胞ではなく、嚢胞芽細胞および成長して
いる嚢胞が、細胞質Ｂａｍタンパク質を発現することを実証する。抗ＢａｍＣお
よび抗αスペクトリンを用いるｄｐｐ誘導胚線の免疫蛍光染色は、増幅した単一
の生殖系列細胞が、細胞質Ｂａｍタンパク質を発現し損なったことを示した。ｄ
ｐｐ誘導胚腺において、増殖している嚢胞であるように見える、いくつかの、ま
れなＢａｍＣ陽性細胞が観察された。これらのデータは、ｄｐｐ過剰発現によっ
て誘導される、大量の単一の生殖系列細胞は、分化した嚢胞芽細胞よりもむしろ
幹細胞に類似することを示す。

【００６３】 ＢａｍＣ染色のこの非存在は、蓄積した単一の生殖系列細胞の増殖の停止によ
るものではなかったことを実証するために、ｄｐｐ誘導胚腺を、１時間のヌクレ
オチドアナログＢｒｄＵの取り込みの後に、抗ＢｒｄＵ抗体および抗αスペクト
リン抗体を用いて染色した。細胞周期のＳ期において有糸分裂的に活性である細
胞は、ＢｒｄＵを取り込み得る。ｄｐｐ誘導胚腺において、いくつかの単一の生
殖系列細胞は、ＢｒｄＵを取り込んだ。このことは、これらの単一の生殖系列細
胞が増殖の停止を有さなかったことを示す。

【００６４】 これらの結果は、ｄｐｐ過剰発現によって誘導された腫瘍細胞が分裂を続け、
そしてそれらのフソーム形態およびＢａｍタンパク質の非存在において幹細胞に
類似することを示す。これらは、生殖系列幹細胞の数の増加を表す。

【００６５】 これらのｄｐｐ誘導幹細胞が分化する能力を保持するか否かを決定するために
、それらの挙動が試験された。ｈｓ−ＧＡＬ４／ＵＡＳ−ｄｐｐ Ｄｒｏｓｏｐ
ｈｉｌａを、４日間の熱ショック処理によって誘導し、次いで抗Ｈｔｓ抗体およ
び抗Ｖａｓｅ抗体を用いる染色の前に、２または４日間室温に戻した。温度を下
げた２日後から形成し始め、そして腫瘍における最も後部の領域において常に最
初に形成した生殖系列嚢胞を観察した。多くの１６細胞嚢胞が、室温に戻した４
日後に見られた。それらの位置および数に基づくと、これらの嚢胞は、低い温度
への移動後に起こる幹細胞分裂に由来するというよりはむしろ、ｄｐｐ誘導され
た生殖系列幹細胞に由来するに違いない。しかし、すべてのｄｐｐ誘導された生
殖系列幹細胞が、完全な嚢胞を形成し得たわけではなかった。なぜなら、いくつ
かの卵巣小管は、領域３において、１、２、４、または８細胞の嚢胞を有したか
らである。

【００６６】 （実施例３：過剰発現したｄｐｐは、生殖系列幹細胞に直接作用する） ２つの異なるモデルが、生殖系列幹細胞に対するＤｐｐの効果を説明し得る：
生殖系列幹細胞への直接シグナリングおよびリレーシグナリングである。リレー
シグナリングモデルは、異所性のＤｐｐが生殖系列幹細胞を取り囲む体細胞にお
いて第２のシグナルのスイッチを入れることを予測する。

【００６７】 リレーモデルを直接試験するために、ｈｓ−ＧＡＬ４／ＵＡＳ系を使用して、
Ｉ型Ｄｐｐレセプターを活性化した。ｈｓ−ＧＡＬ４／ＵＡＳ系は、成体卵巣中
の体細胞において高レベルの標的遺伝子を発現し得るが、生殖系列細胞では発現
し得ない（Ｍａｎｓｅａｕら、１９９７）。活性化されたｔｋｖ（ｔｋｖ^*）（
Ｎｅｌｌｅｎら、１９９６）および活性化されたｓａｘ（ｓａｘ^*）（Ｄｅｓら
、１９９８）の両方は、多くの発生プロセスにおいてｄｐｐシグナリング経路活
性化を模倣することが示された。

【００６８】 胚腺の体細胞における活性化されたＩ型Ｄｐｐレセプターの過剰発現は、異所
性のｄｐｐ発現の効果を模倣しない。以下の遺伝子型のハエを３日間熱ショック
処理に供し、引き続いて胚腺を抗Ｖａｓｅ抗体および抗Ｈｔｓ抗体を用いて標識
した：ｈｓＧＡＬ４／ＵＡＳ−ｓａｘ^*、ｈｓＧＡＬ４／ＵＡＳ−ｔｋｖ^*、およ
びＵＡＳ−ｓａｘ^*／＋；ｈｓＧＡＬ４／ＵＡＳ−ｔｋｖ^*。異なる染色体部位で
ＵＡＳ−ｔｋｖ^*挿入およびＵＡＳ−ｓａｘ^*挿入を含む２つの独立した系統を試
験した。活性化されたｓａｘ＊もしくはｔｋｖ＊または両方が、ｈｓ−ＧＡＬ４
（これは、ｄｐｐ過剰発現においての同じドライバーである）を用いて胚腺の体
細胞において過剰発現された場合、生殖系列幹細胞増殖は観察されなかった。し
かし、卵チャンバーの出芽は、ｈｓＧＡＬ４／ＵＡＳ−ｔｋｖ^*系統およびＵＡ
Ｓ−ｓａｘ^*／＋；ｈｓＧＡＬ４／ＵＡＳ−ｔｋｖ^*系統における領域３嚢胞中で
頻繁に影響を受けた。このことは、体細胞性卵胞細胞機能が、後期段階では欠損
していたことを示唆する。

【００６９】 これらの結果は、リレーシグナリングが、そのメカニズムに関わらず、それ自
体で生殖系列幹細胞分化を阻害するには十分でないことを示唆する。過剰発現し
たＤｐｐは、リレーシグナルによって作用するようには見えないので、それは、
機能的Ｄｐｐレセプターを介して生殖系列細胞に直接作用して、嚢胞芽細胞分化
を阻害するようである。

【００７０】 （実施例４：ＤｐｐおよびＳａｘは、生殖系列幹細胞の分裂および維持のため
に必要とされる） ｄｐｐの役割を直接試験するために、本発明者らは、ＤｐｐおよびＤｐｐレセ
プターｓａｘの機能を減少させる変異を試験した。Ｄｐｐシグナリングは、Ｄｒ
ｏｓｏｐｈｉｌａ発生の間、多くの点において必須である。ｄｐｐ変異のいくつ
かの温度感受性対立遺伝子の組合せ（ｄｐｐ^e90／ｄｐｐ^hr56およびｄｐｐ^hr4／
ｄｐｐ^hr56を含む）が、１８℃において成体で発生し得る（Ｗｈａｒｔｏｎら、
１９９６）。これらのヘテロ対立遺伝子の組合せは、２８℃にシフトした後に、
本発明者らが胚腺中でｄｐｐの変異体表現型を試験することを可能にした。２８
℃への温度シフトの１週間後試験したこれらの遺伝子型由来の胚腺の４０〜５０
％は、ヘテロ接合体よりも有意に小さかったが、より激しい減少は、より高温に
維持されたより加齢した雌において見られた。幹細胞が失われたか否かを決定す
るために、変異型の雌由来の卵巣を、抗Ｈｔｓ抗体および抗Ｖａｓｅ抗体を用い
て染色し、そして各々の卵巣小管における幹細胞の数を直接計数した（表１）。
試験した遺伝子型の両方の生殖系列幹細胞数において、２週間にわたって劇的な
減少が存在した。２つのうちでより強かった、ｄｐｐ^hr4／ｄｐｐ^hr56）は、２
週間以内にほとんど完全に幹細胞を除去した。この組合せは、多くの少数の成体
のハエを産生し、そしてｄｐｐ^e90／ｄｐｐ^hr56よりもより激しく胚の発生を破
壊することが公知である（Ｗｈａｒｔｏｎら、１９９６）。

【００７１】 変異が生殖系列細胞に特異的に作用する場合、嚢胞細胞および嚢胞は、分裂お
よび発達を継続する。このことを試験するために、変異体の卵巣小管におけるフ
ソームの形態を分析した。幹細胞数に対する弱い効果を有するＤｐｐレセプター
変異ｓａｘ^P由来の卵巣小管もまた、研究された。幹細胞損失の時期は、個々の
胚腺の間で変化することが予想される。なぜなら、幹細胞の損失は、無作為なプ
ロセスであるからである（ＭａｒｇｏｌｉｓおよびＳｐｒａｄｌｉｎｇ，１９９
５）。

【００７２】 １週齢ｓａｘ^P／＋およびｄｐｐ^e90／ＣｙＯＰ２３雌由来のコントロール胚腺
を、抗Ｖａｓｅ抗体およｇび抗Ｈｔｓを用いて二重標識した。両方の場合におい
て、ｄｐｐ対立遺伝子またはｓａｘ対立遺伝子についてヘテロ接合性である１週
齢の雌由来の胚腺は、概してその後部において２つの幹細胞を含んだ。変異胚腺
をまた、抗Ｖａｓｅ抗体および抗Ｈｔｓ抗体を用いて二重標識した。

【００７３】 １週齢雌由来の変異体ｓａｘ^p／ｓａｘ^p胚腺は、野生型よりも小さかった。１
つの場合において、２つの幹細胞が観察されるが、嚢胞の数は減少した。別の場
合において、１つの幹細胞が残存し、そして領域１および２ａは、領域２ｂの開
始によって示されたようにより減少した。このことは、幹細胞が失われかつその
分裂が遅延したことを示す。

【００７４】 ２週齢変異体ｓａｘ^p／ｓａｘ^p雌における多くの胚腺は、両方の幹細胞を失い
、そして有糸分裂性嚢胞が存在しないが、後期の発生段階での嚢胞および卵チャ
ンバーは残存する（例えば、領域２ｂに対応する最も後部の嚢胞）。

【００７５】 変異体ｄｐｐ^e90／ｄｐｐ^hr56雌は、２８℃でより急速な幹細胞の損失を示し
た。このような胚腺は、しばしば、１週間後に１または０の幹細胞を含んだ。１
つの場合において、１つの幹細胞のみが見出され、そして有糸分裂性の嚢胞は見
出されなかった；最も後部の嚢胞は、１６細胞を含んだ。別の場合において、幹
細胞は存在しなかった；８細胞嚢胞および１６細胞嚢胞が後部に存在する。２週
間後、大部分の卵巣小管は完全に幹細胞を欠いていたが、いくつかはなお、１６
細胞嚢胞またはより古い卵胞を含んだ。

【００７６】 正常な嚢胞細胞発生は、胚腺全体にわたって連続するので、これらの変異の効
果は、幹細胞の分裂および維持に大部分限定されるようである。後者のプロセス
において、いくつかの異常、卵チャンバー発芽が観察された。幹細胞の損失は、
細胞死または分化のいずれかによって引き起こされ得る。アポトーシス性細胞は
、生殖系列幹細胞がＤＡＰＩ染色に基づいて位置付けされた、これらの胚腺の最
も後部の領域において観察されなかった。

【００７７】 これらの結果は、ｄｐｐシグナリングのレベルの減少が、生殖系列幹細胞の嚢
胞への分化を促進し、従って幹細胞損失を引き起こすことを示す。以前の研究（
Ｔｗｏｍｂｌｙら、１９９６）と一致して、本発明者らは、これらのｄｐｐ変異
体およびｓａｘ^p変異体において、後部の損失を有する、いくつかの部分的に腹
側化した卵を観察した。

【００７８】 （実施例５：Ｐｕｔ、Ｔｋｖ、Ｍａｄ、およびＤａｄは、生殖系列幹細胞維持
のために、細胞自律的に必要である） ｄｐｐシグナリングが生殖系列によって受容されることを決定的に実証するた
めに、これらの細胞において、シグナル伝達経路の成分が自律的に必要であるか
否かを評価する研究を行った。Ｆｌｐ誘導された有糸分裂的な組換えを利用して
、成体卵巣の生殖系列幹細胞における機能喪失変異についてホモ接合性である、
際だったクローンを産生した（実験手順を参照のこと）。シグナル伝達経路にお
いて、ｄｐｐの下流の遺伝子は、その分裂および維持のために、生殖系列幹細胞
において必要とされる。示された遺伝子型の幹細胞クローンを欠く胚腺またはそ
れを保有する胚腺を生成し、次いで抗ｌａｃｚ抗体および抗Ｈｔｓ抗体を用いて
標識した。標識された幹細胞およびその子孫の嚢胞は、ｌａｃＺタンパク質の非
存在により示された。

【００７９】 クローンを、ａｒｍａｄｉｌｌｏ−ｌａｃＺ（これは、野生型ハエが熱ショッ
クに供せられない場合に、胚腺中のすべての細胞において強力に発現される）を
使用して標識した。幹細胞クローンは認識され得る。なぜなら、幹細胞のみが、
有糸分裂性の組換え事象の後に、５日間より多く胚腺中で持続するからである（
ＭａｒｇｏｌｉｓおよびＳｐｒａｄｌｉｎｇ、１９９５）。組換え事象は有糸分
裂的に活性な成体細胞においてのみで起こり得るので、この方法は、末端で分化
した末端フィラメント、キャップ細胞、および鞘内細胞において変異体クローン
を産生しない。結果的に、このアプローチは、周りを取り囲むこれらの体細胞に
おける変異体クローンに起因する潜在的な複雑さを除外する。このことは、遺伝
子の自律的な機能を、生殖系列幹細胞中で試験することを可能にする。この方法
は、３つの主なさらなる利点を有する。第１に、持続性の変異体クローンが長期
間にわたって研究され得、定量される生殖系列幹細胞の維持を可能にする。第２
に、同じ胚腺に並んでいる変異体幹細胞および野生型幹細胞の両方の存在が、直
接比較による遺伝子の除去の効果についてのコントロールを提供する。従って、
これらの２つの幹細胞の相対的な分裂速度は、１つの変異体および１つの野生型
幹細胞を有する胚腺において、単に変異体および野生型嚢胞の数を計数すること
によって決定され得る。最後に、変異の生殖系列幹細胞特異的効果は、標識した
嚢胞芽細胞、嚢胞、および卵チャンバーの発生状態を観察することによって評価
され得る。

【００８０】 ｐｕｎｔ−、ｔｋｖ−、ｍａｄ−、Ｍｅｄ−、およびＤａｄ−の生殖系列幹細
胞クローンを、適切な遺伝形質の雌を熱ショックに供することおよびこれらの卵
巣を試験すること（１週間後に開始する）によって、生成する。Ｄｒｏｓｏｐｈ
ｉｌａ卵巣における幹細胞は、半減期が約４．６週間の有限の寿命を有する（Ｍ
ａｒｇｏｌｉｓおよびＳｐｒａｄｌｉｎｇ、１９９５；表２）。野生型クローン
と対照的に、試験した遺伝子の各々についての幹細胞変異体（Ｄａｄを除く）は
、より迅速に失われた（表２）。例えば、１週間後、ｐｕｎｔ¹³⁵変異体生殖系
列幹細胞は、相対的に新しい嚢胞の存在によって示されるように、なお存在して
いたか、またはごく最近に失われたかのいずれかであった。しかし、２週間後に
、ｐｕｎｔ¹³⁵変異体生殖系列幹細胞は、通常失われ、そしてほんのわずかな進
行した変異体嚢胞が残存した。

【００８１】 ｍａｄ¹²変異体幹細胞がなおより迅速に失われた。１週間後、ｍａｄ¹²変異体
生殖系列幹細胞は、子孫の嚢胞の欠如により示されるように、ときどき残存する
が、しかし十分に増殖しなかった。より頻繁には、生殖系列幹細胞は、すでに失
われ、そしてより発達した嚢胞が観察された。２週間後、ｍａｄ¹²変異体生殖系
列幹細胞はまれに残存し、そして変異体嚢胞は存在しないが、しかしより古い変
異体卵チャンバーは存在していた。驚くべきことに、２つの野生型生殖系列幹細
胞は、変異体幹細胞が失われた後に時折観察された。これらの結果は、ｄｐｐシ
グナルが直接生殖系列幹細胞に作用してそれらの維持を調節することを示す。し
かし、１６細胞嚢胞の形成または引き続く生殖系列細胞の発達に対する効果は観
察されなかった。

【００８２】 他の試験した遺伝子とは異なり、Ｄａｄは、ｄｐｐシグナル伝達の負のレギュ
レーターである。Ｄａｄ遺伝子は、ｄｐｐシグナル伝達経路によって誘導され、
そしてｄｐｐの機能を拮抗する（Ｔｓｕｎｅｉｚｕｍｉら、１９９７）。Ｄａｄ ^271-68 対立遺伝子は、Ｃ末端の保存されたドメイン全体が欠失する重篤な対立遺
伝子である（Ｔｓｕｎｅｉｚｕｍｉら、１９９７）。きわだったことに、たとえ
、両方の生殖系列幹細胞が、この遺伝子を欠失したとしても（例えば、２つの変
異型生殖系列幹細胞および子孫の嚢胞の正常な補体が存在した）、Ｄａｄ^271-68 についての生殖系列幹細胞変異体は、失われなかった（例えば、変異生殖系列幹
細胞およびその子孫の嚢胞が存在し得る）。クローンの誘導の３週間後でさえも
、ターンオーバーは、検出され得なかった。このことは、増加するｄｐｐシグナ
ル伝達が、生殖系列幹細胞の寿命を延長し得ることを示唆する。

【００８３】 幹細胞に対する異なる変異の効果の大きさを比較するために、変異型生殖系列
幹細胞の半減期を測定した（表２；実験手順）。ｐｕｎｔ¹⁰⁴⁶⁰は、Ｄｐｐ Ｉ
Ｉ型レセプターのハイポモルフ対立遺伝子であり、一方、ｐｕｎｔ¹³⁵は、強力
な対立遺伝子である（Ａｒｏｒａら、１９９５；Ｌｅｔｓｏｕら、１９９５）。
ｐｕｎｔ¹⁰⁴⁶⁰クローンにおいて、生殖系列幹細胞の半減期は、約４．６〜０．
９０週間減少し、一方、強力なｐｕｎｔ¹³⁵対立遺伝子は、生殖系列幹細胞の半
減期を約０．４１週間まで減少した。ｔｋｖ⁸は、Ｉ型レセプターの強力な対立
遺伝子である（Ｂｒｕｍｍｅｌら、１９９４；Ｎｅｌｌｅｎら、１９９４；Ｐｅ
ｎｔｏｎら、１９９４）。ｔｋｖ⁸幹細胞クローンは、生殖系列幹細胞の半減期
を約０．６９週間まで減少した。下流のシグナルトランスデューサーであるｍａ
ｄ⁹およびｍａｄ¹²の２つの対立遺伝子のクローンは、生殖系列幹細胞の半減期
を、それぞれ２．５週間および０．２５週間に減少した。この観察と一致して、
ｍａｄ¹²はｍａｄ⁹よりもかなり強力な対立遺伝子である（Ｓｅｋｅｌｓｋｙら
、１９９５）。Ｍｅｄ²⁶は、別の下流のトランスデューサーの強力な対立遺伝子
である（Ｄｅｓら、１９９８）。Ｍｅｄ²⁶生殖系列幹細胞は、約０．３８週間の
半減期でターンオーバーした。

【００８４】 （実施例６：Ｐｕｎｔ、Ｔｋｖ、Ｍａｄ、Ｍｅｄは、生殖系列幹細胞分裂を刺
激するために細胞自律的に必要とされる） 生殖系列幹細胞分裂の調節におけるｄｐｐ経路の役割をさらに規定するために
、胚腺中で、１つの変異型生殖系列幹細胞および１つの野生型生殖系列幹細胞を
有する、変異型嚢胞および野生型嚢胞の数を比較した。各嚢胞は、１つの生殖系
列幹細胞分裂を示すので、野生型嚢胞および変異型嚢胞の計数は、相対的な生殖
系列幹細胞分裂速度の測定を可能とした。全ての３つの時点からの変異型生殖系
列幹細胞をなお保持する全ての胚腺を計数し、そして野生型嚢胞の数と比較した
。印を付けたが、遺伝的に野生型の生殖系列幹細胞を含むコントロールにおいて
、約５０％の嚢胞に印を付けた。このことは、２つの生殖系列幹細胞が、１週齢
の成体胚腺中に存在し、そして類似の速度で分裂することを示す（表２を参照の
こと）。

【００８５】 以前の実験に基づいて予測されたように、ｐｕｎｔ−、ｔｋｖ−、ｍａｄ−、
およびＭｅｄ−変異型生殖系列幹細胞の全てが、野生型よりゆっくりと分裂した
（表２を参照のこと）。印をつけた野生型生殖系列幹細胞の相対的な分裂速度は
、約０．９３であったが、試験された遺伝子型の速度は、約０．２１から０．６
０の範囲であった。これらの減少は、これら対立遺伝子の公知の強度、および生
殖系列幹細胞の維持に対するその効果と、大部分は相関した。しかし、ｐｕｎｔ ¹⁰⁴⁶⁰ およびｐｕｎｔ¹³⁵変異型生殖系列幹細胞は、これらが強度において異なる
という事実にもかかわらず、野生型よりも約３分の１の速さで増殖した。維持お
よび分裂に対する、これらの変異体の効果の間の差異は、経路の分岐点を反映し
得、そして少なくとも１つのさらなるＩＩ型レセプターがまた、生殖系列幹細胞
の挙動を媒介することを示唆し得る。興味深いことに、野生型よりも安定なＤａ
ｄ^271-68変異型生殖系列幹細胞は、野生型生殖系列幹細胞と類似の速度か、また
は野生型生殖系列幹細胞より若干遅い速度で分裂した。これらの結果は、ｄｐｐ
シグナル伝達経路の成分が生殖系列幹細胞の増殖にとって、自律的に必要とされ
ることを実証する。

【００８６】 以前に示されたように、ｈｓ−ＧＡＬ４によって駆動されて過剰発現されたｄ
ｐｐの存在において産生された嚢胞は、常に１６個の細胞を含んだ。ｄｐｐシグ
ナル伝達が、嚢胞芽細胞および嚢胞細胞の分裂の調節に関与していないことを確
認するために、ｐｕｎｔ¹⁰⁴⁶⁰、ｍａｄ⁹、ｍａｄ¹²、Ｍｅｄ²⁶、およびＤａｄ^{27 1-68} について、個々の嚢胞変異体中の生殖系列細胞の数を計数した。全ての場合
において、これらの嚢胞は、１６個の細胞（単一の卵母細胞を含む）を含んだ。
従って、ｄｐｐシグナル伝達経路は、生殖系列内の幹細胞に特異的に作用する。

【００８７】 （実施例７：ｄｐｐは、生殖系列幹細胞を取り囲む分化した体細胞において、
発現される） Ｄｐｐシグナルの供給源の場所を直接的に決めるために、ホールマウントｍＲ
ＮＡインサイチュハイブリダイゼーションを行い、解剖され固定化された２日齢
の野生型の雌において、ｄｐｐ遺伝子の発現を可視化した。プロテアーゼ消化を
、５０ｇｍ／ｍｌで５分間行った以外は、標準的なプロトコールを使用した（Ｙ
ｕｅおよびＳｐｒａｄｌｉｎｇ、１９９２）。ｄｐｐセンスＲＮＡプローブをコ
ントロールとして使用した場合、染色は観察されなかった。同一の条件下におい
て、ｄｐｐアンチセンスプローブは、生殖系列幹細胞に隣接する鞘内細胞および
キャップ細胞、ならびに後体細胞性卵胞細胞（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ｓｏｍａｔ
ｉｃ ｆｏｌｌｉｃｌｅ ｃｅｌｌ）におけるｄｐｐ ｍＲＮＡを検出したが、
生殖系列および終糸細胞においては、検出されなかった。これらの発現データは
、周囲の分化した体細胞が、生殖系列幹細胞のニッチを構成するという、本発明
者らの知見を、さらに支持する。

【００８８】 （実施例８：失われた生殖系列幹細胞は、同一胚腺内の他の幹細胞の娘細胞に
よって、置換され得る） 卵巣小管内の幹細胞が、ニッチ内に存在するというさらなる証拠を提供するた
めに、本発明者らは、失われた生殖系列幹細胞が、そうでなければ分化する細胞
によって置換され得、そして生殖系列幹細胞として機能し得る。１つの幹細胞棒
に印をつけた１週齢の胚腺において、印をつけた細胞は、ほとんど５０％の嚢胞
に寄与し、このことは、１つの胚腺あたり平均して２つの生殖系列幹細胞が存在
することを示唆する。本発明者らは、野生型生殖系列幹細胞が、４．６週間の半
減期でターンオーバーすることを示したので、ほんの１個または０個の生殖系列
幹細胞を含む卵巣小管が、置換されないかぎり、予測された速度で生じる。例え
ば、４．６週間後、２５％、５０％および２５％の胚腺が、２個、１個または０
個の生殖系列幹細胞を有することが予測される。対照的に、本発明者らは、５週
齢の胚腺の７１％より多くが、まだ２つの生殖系列幹細胞を含み、２０％が１つ
の生殖系列幹細胞を含み、そして９％が含まないことが観察された。これらの結
果は、予測されないものであり、そして喪失後、この期間において、生殖系列幹
細胞が６２％置換された。

【００８９】 いかにして置換が生じるか決定するために、本発明者らは、印をつけた幹細胞
が失われたばかりであり、置換される過程にある卵巣小管を同定した。そのよう
な卵巣小管は、印をつけられた嚢胞芽細胞、および印をつけた発達中の嚢胞を含
むが、印をつけた幹細胞を含まなかった。本発明者らは、卵巣小管の軸に対する
垂直平面中に残る幹細胞の正常ではない分裂を観察した。そのような分裂は、最
近失われた幹細胞と同一の位置に、娘幹細胞を配置する。通常、生殖系列幹細胞
は、前後軸にそって分裂し、そして後方の娘細胞は、嚢胞芽細胞に分化する。こ
れらの知見は、娘幹細胞の運命が、環境によって決定されることを示す。ニッチ
内のこの環境は、幹細胞の運命を維持するが、卵巣小管中のより後方の環境は、
嚢胞芽細胞としての分化を促進する。

【００９０】 （実施例９：Ｄｐｐは、雄性生殖系列幹細胞の維持に必要である） 温度感受性ｄｐｐ変異遺伝子型を、ｄｐｐ^hr56／ＣｙＯをｄｐｐ^hr4およびｄ
ｐｐ^e90／ＣｙＯと交雑して、生成した。温度感受性ｐｕｎｔ変異型雄性を、ｐ
ｕｎｔ¹⁰⁴⁶⁰／ＴＭ３と、ｐｕｎｔ¹³⁵／ＴＭ３ Ｓｂとを交雑することによって
生成した。ｄｐｐ^hr56／ｄｐｐ^e90、ｄｐｐ^hr56／ｄｐｐ^hr4およびｐｕｎｔ^{1046 0} ／ｐｕｎｔ¹³⁵の生体雄性を、２８℃（すなわち、制限温度）で１週間、生育さ
せた。ヘテロ接合型コントロールもまた、２８℃で試験した；精巣を切開して取
り出し、ウサギ抗Ｖａｓａ抗体およびマウス抗Ｈｔｓ抗体を用いて染色した。Ｃ
ｙ３−結合体化ヤギ抗ウサギ２次抗体およびＦＩＴＣ結合体化ヤギ抗マウス２次
抗体を使用して、Ｖａｓａタンパク質（赤色）およびＨｔｓタンパク質（緑色）
を、Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ−ＮＴ共焦点顕微鏡を用いて可視化した。生殖系列幹細
胞は、精巣の先端に位置し、そしてＶａｓａタンパク質（赤色）のその発現によ
って認識され得、そしてまた、円形のフソーム（ｆｕｓｏｍｕ）（黄色）もまた
含み、そしてハブ（ｈｕｂ）細胞（緑色）とのその会合によって認識され得る。
分化した生殖系列細胞は、先端からより遠位にあり、そしてまた、その円形のフ
ソームまたは分岐したフソームのいずれかを含む。

【００９１】 Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ精巣において、ｄｐｐが雄性生殖系列幹細胞を調節する
ことを直接示すために、制限条件下におけるｄｐｐ^hr56／ｄｐｐ^e90、ｄｐｐ^{hr5 6} ／ｄｐｐ^hr4およびｐｕｎｔ¹⁰⁴⁶⁰／ｐｕｎｔ¹³⁵変異精巣における幹細胞の数を
試験し、そしてヘテロ接合型コントロール精巣と比較した。ヘテロ接合型精巣（
コントロール）において、体細胞のハブ細胞に隣接し、そして卵巣中のその対応
物のように円形フソームを含む、７〜９個の生殖系列幹細胞が存在した；これら
の精巣は、発生中の生殖系列嚢胞および一次精子細胞が豊富であった。制限温度
の１週間後、なお７個を越える生殖系列幹細胞が存在した。これらの値は、典型
的な野生型精巣と識別不可能である。対照的に、制限温度で生育されたオス由来
の１週齢のｄｐｐ^hr56／ｄｐｐ^e90、ｄｐｐ^hr56／ｄｐｐ^hr4およびｐｕｎｔ^{1046 0} ／ｐｕｎｔ¹³⁵変異精巣は、減少した数（精巣１つあたり２〜７個の範囲）の生
殖系列幹細胞を含んだ。この損失の結果として、これあの精巣はまた、コントロ
ールよりも有意により小さく、より少ない発生中の生殖系列嚢胞および一次精子
細胞を含んだ。精巣は、卵巣小管よりもかなり多数の生殖系列幹細胞とともに開
始するので、たとえ精巣が雌性生殖系列幹細胞と同程度のｄｐｐおよびｐｕｎｔ
を必要とするとしても、１週間以内の完全な損失は、予測されない。これらの結
果は、ｄｐｐおよびｐｕｎｔが雄性生殖系列幹細胞の維持に必要とされることを
、実証する。

【００９２】 （実施例１０：Ｓｈｎは、生殖系列幹細胞維持のために必要である） ｓｃｈｎｕｒｒｉ（ｓｈｎ）は、ヒトＭＰＢ１と相同なジンクフィンガータン
パク質をコードする。ｓｈｎは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ胚中のｄｐｐシグナル伝
達にとって必要である（Ａｒｏｒａら、１９９５；Ｇｒｅｉｄｅｒら、１９９５
）。変異型ｓｈｎ生殖系列幹細胞クローンを上記のように生成した。ＦＲＴ４２
Ｄ ａｒｍ−ｌａｃＺ／ＦＲＴ４２Ｄ ａｒｍ−ｌａｃＺ未交尾のメスを、それ
ぞれＦＲＴ４２Ｄ ｓｈｎ／ＣｙＯおよびＦＲＴ４２Ｄ ＋／ＦＲＴ４２Ｄ ＋
（コントロール）のオスと、交雑した。ｓｈｎ変異を有する染色体に対してトラ
ンスにあるａｒｍ−ｌａｃＺトランスジーンを保有する２日齢生体の非ＣｙＯの
メスを、各々８時間の間隔で２回、３７℃で６０分間、熱ショックをかけた。生
殖系列幹細胞を、上記と同様の様式において、試験した。これらの結果は、ｓｈ
ｎもまた、生殖系列幹細胞において、これらの維持および分裂に必要であること
を実証する。

【００９３】 （実験手順） 本発明の実施のために有用な材料および方法の記載は、以下の一般的な参考文
献に提供される：

【００９４】

【数１】 Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａストックを、Ｉｎｄｉａｎａ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＢ
ｌｏｏｍｉｎｇｔｏｎ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒより入手し得る。Ｄｒｏｓｏ
ｐｈｉｌａの遺伝学および分子生物学に関する情報（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａゲノ
ムプロジェクトを通して得られる組換えクローンおよびヌクレオチド／アミノ酸
配列を含む）は、ＦＬＹＢＡＳＥ関連データベース（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．２７、８５〜８８、１９９９を参照のこと）において、公に利用可能であ
る。

【００９５】 （Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａストックおよび遺伝学） この研究において使用される以下のハエのストックは、ＦｌｙＢａｓｅにおい
て記載されるか、またはそうでなければ特定されるかのいずれかである：

【００９６】

【化１】 ほとんどのストックを、室温で培養した。その効果を最大限にするために、ｓａ
ｘ^Pおよびｄｐｐ変異体の両方を、２８℃で１〜２週間培養した。

【００９７】 （変異型生殖系列幹細胞クローンの生成および過剰発現） 変異細胞のクローンを、以前に記載されたように（ＸｕおよびＲｕｂｉｎ、１
９９３）、Ｆｌｐ−媒介性有糸分裂組換えによって生成した。幹細胞クローン分
析のためのストックを生成するために、＋ＦＲＴ４０Ａ／ＣｙＯ、ｔｋｖ⁸ ＋
ＦＲＴ４０Ａ／ＣｙＯ、ｍａｄ⁹ ＋ＦＲＴ４０Ａ／ＣｙＯ、およびｍａｄ¹²
＋ＦＲＴ４０Ａ／ＣｙＯのオスをそれぞれ、ｗ ＨＳＰｌｐ１；ａｒｍａｄｉｌ
ｌｏ−ｌａｃＺ ＦＲＴ４０Ａの未交尾のメスと交雑した。ＦＲＴ８２Ｂ Ｍｅ
ｄ²⁶／ＴＭ３ Ｓｂ、ＦＲＴ８２Ｂ ｐｕｎｔ¹³⁵／ＴＭ３ Ｓｂ、ＦＲＴ８２
Ｂ ｐｕｎｔ¹⁰⁴⁶⁰／ＴＭ３ Ｓｂ、ＦＲＴ８２Ｂ Ｄａｄ^271-68／ＴＭ３ Ｓ
ｂのオスをそれぞれ、ｗ ＨＳＰｌｐ１；ＦＲＴ８２Ｂ ａｒｍａｄｉｌｌｏ−
ｌａｃＺの未交尾のメスと交雑した。変異を有する染色体に対してトランスにあ
るａｒｍａｄｉｌｌｏ−ｌａｃＺトランスジーンを保有する２日齢生体の非Ｃｙ
Ｏまたは非Ｓｂのメスを、３７℃で６０分間、熱ショックをかけた。このメスを
室温での毎日の新鮮な食餌に移し、そして卵巣を、最後の熱ショック処理の１週
間後、２週間後、または３週間後に取り除き、抗体染色のために処理した。

【００９８】 過剰発現ｄｐｐおよび活性化レセプターについてのストックを構築するために
、ｈｓ−ＧＡＬ４の未交尾のメスを、それぞれＵＡＳ−ｄｐｐ、ＵＡＳ−ｔｋｖ ^* ／ＣｙＯ、ＵＡＳ−ｔｋｖ^*／ＴＭ３ Ｓｂ、ＵＡＳ−ｓａｘ^*／ＣｙＯ、ＵＡ
Ｓ−ｓａｘ^*／ＴＭ３ Ｓｂ、ＵＡＳ−ｔｋｖ^*／ＣｙＯ；ＵＡＳ−ｓａｘ^*／Ｔ
Ｍ６、ＵＡＳ−ｓａｘ^*／ＣｙＯ；ＵＡＳ−ｔｋｖ^*／ＴＭ６のオスと交雑した。
バランサー（ｂａｌａｎｃｅｒ）染色体を保有しないメスを、毎回、１２時間の
間隔で、３〜５日間、３７℃で３０分、熱ショックをかけた。

【００９９】 （計算） 幹細胞の寿命を決定するために、適切な遺伝型の１〜２日齢のメス中の幹細胞
に、１回の熱パルスによって印をつけた。次に、１週間後、２週間後、および３
週間後、メスの何匹かから卵巣を切開し、そして抗Ｈｔｓ抗体および抗ｌａｃＺ
抗体で染色した。印をつけた幹細胞を含む胚腺の割合を、各時点での６０〜２０
０個の胚腺の計数によって決定し、幹細胞の半減期を計算するために使用した。

【０１００】 幹細胞の分裂速度を測定するために、本発明者らは、１つの野生型幹細胞およ
び１つの変異型幹細胞を含む胚腺中の、野生型嚢胞および変異型嚢胞の相対的な
数を決定した。１．０の相対的な分裂速度は、正常の分裂を示す。所定の遺伝型
について、これらの値は、各時点において類似しており、そして表２に平均を示
す。印をつけた野生型幹細胞は、おそらく２つの生殖系列幹細胞よりむしろ３つ
の生殖系列幹細胞を含む胚腺の小さな割合に起因して、１．０よりむしろ０．９
３の値をもたらした。

【０１０１】 幹細胞の損失を測定するために、２個、１個または０個の生殖系列幹細胞を有
する胚腺を、１週齢および２週齢のメスの卵巣から計数した。ｄｐｐトランスジ
ーンを含むＣｙＯバランサー染色体と組み合わせた１コピーの変異遺伝子を保有
するヘテロ接合型のメス（Ｈｕｒｓｈら、１９９３）を、コントロールとした。
示された幹細胞の組成を有する卵巣小管のパーセントとして、値を示す。

【０１０２】 （免疫組織学） 以下の抗血清を、示された希釈で使用した：ポリクローナル抗Ｖａｓａ抗体（
１：２０００）（Ｌｉａｎｇら、１９９０）；モノクローナル抗Ｈｔｓ抗体１Ｂ
１（１：５）（ＺａｃｃｉおよびＬｉｐｓｈｉｚ、１９９６）；ポリクローナル
抗αスペクトリン抗体（１：１００）（Ｂｙｅｒｓら、１９８７）；ラット抗Ｂ
ａｍ抗体（１：１００）（ＭｃｋｅａｒｉｎおよびＯｈｌｓｔｅｉｎ、１９９５
）；モノクローナル抗ＢｒｄＵ抗体（１：５０）（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎ
ｓｏｎ）；ポリクローナル抗βガラクトシダーゼ抗体（１：１０００）（Ｃａｐ
ｐｅｌ）。ＢｒｄＵを用いる標識を、ＣｕｅｖａｓおよびＳｐｒａｄｌｉｎｇ（
１９９８）によって記載されるように、室温で１時間おこなった。全ての顕微鏡
写真を、Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ−ＮＴ共焦点顕微鏡を用いて撮影した。

【０１０３】 （表１．Ｄｐｐは、生殖系列幹細胞の維持に必要である）

【０１０４】

【表１】 ０個、１個または２個の生殖系列幹細胞を有する卵巣小管のパーセントを、各遺
伝型について示す。実際の数を括弧内に示す。^a Ｐ２３は、ＣｙＯ染色体上のｄｐｐトランスジーンである（Ｈｕｒｓｈら、１
９９３）。

【０１０５】 （表２．ｄｐｐ経路の下流の成分が、生殖系列幹細胞において、それらの維持
および分裂に必要である）

【０１０６】

【表２】 ^aｌａｃＺネガティブ生殖系列幹細胞クローンを有する胚腺の数／全胚腺×１０
０。 実際の計数された胚腺の数を括弧内に示す。^b 実験手順に記載されるように計算した。^c 実験手順に記載されるように計算した。計数された嚢胞の数を、括弧内に示す
。

【０１０７】 本発明は、実際の実施態様および好ましい実施態様であると本明細書において
考慮されるものによって記載されてきたが、特許請求の範囲に記載される本発明
の変更が、本発明の新たな局面から逸脱することなく当業者に自明であり、そし
てそのような変更が特許請求の範囲内にあることが意図されることが、理解され
る。

【０１０８】 例えば、ｄｐｐシグナル伝達経路の成分は、構造（例えば、アミノ酸残基は、
配列が整列される場合、位置の高い割合において、同一であるか、または化学的
に類似している）において保存され、そして哺乳動物タンパク質が経路の相同遺
伝子における変異から生じるＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ変異表現型をレスキューし得
るように機能において保存される。本明細書において同定されるＤｒｏｓｏｐｈ
ｉｌａ遺伝子およびタンパク質、ならびにその変異体の等価物は、アミノ酸配列
におけるその類似性（例えば、ＴＧＦ−βファミリーのメンバー）および／また
は変異表現型を少なくとも部分的にレスキューするその能力、またはそのような
表現型のフェノコピー（ｐｈｅｎｏｃｏｐｙ）を生成するその能力によって、本
発明を実施する当業者に公知である。

【０１０９】 従って、法的保護の程度は、特許査定となる特許請求の範囲に記載される限定
およびその等価物によって規定される。明示的な記載がない限り、本明細書に記
載される本発明の他の局面は、特許請求の範囲を限定しない。この点に関し、明
細書に示唆される作用機序（例えば、ＢＭＰシグナル伝達のモデル）は、本発明
者らの観察についての単なる可能な説明であるが、特許請求の範囲に記載される
発明の実施は、必ずしもその作用機序に依存する必要はない。

【０１１０】 本開示に記載される全ての参考文献、特許出願、および特許は、その全体が本
明細書によって本明細書において参考として援用され、そして本分野の当業者の
高度な技術を示す。特に、上記に示される結果のいくつかは、優先権を有する米
国特許出願第６０／０９４，００８号の出願日後に、ＸｉｅおよびＳｐｒａｄｌ
ｉｎｇによってＣｅｌｌ ９４、２５１〜２６０（１９９８）において刊行され
た。

【０１１１】 （参考文献）

【０１１２】

【表３】 当該分野における標準的な手順は、以下の一般に入手可能な参考文献および研
究室マニュアルに記載される：

【０１１３】

【表４】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA21 CA04 DA02 EA04 GA11 HA01 4B065 AA90X AA90Y AB01 BA01 BA30 CA46

Claims (36)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａの生殖系列幹細胞を維持するための方
   法であって、該方法は、以下の工程： （ａ）該生殖系列幹細胞から構成される集団を提供する工程、および （ｂ）該集団の少なくとも１つの細胞において、骨形成性タンパク質（ＢＭＰ
   ）シグナル伝達経路によってシグナル伝達を刺激する工程であって、該刺激が、
   刺激された該ＢＭＰシグナル伝達経路のシグナル伝達を有していなかった集団と
   比較して、該集団においてさらに生殖系列幹細胞を維持している、工程、 を包含する、方法。
2. 【請求項２】 前記集団が、インビボで維持され、そして前記Ｄｒｏｓｏｐ
   ｈｉｌａが、前記シグナル伝達を刺激するように遺伝的に操作されている、請求
   項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 前記集団がインビトロで維持される、請求項１に記載の方法
   。
4. 【請求項４】 前記生殖系列幹細胞が卵巣由来である、請求項１に記載の方
   法。
5. 【請求項５】 前記生殖系列幹細胞が精巣由来である、請求項１に記載の方
   法。
6. 【請求項６】 胚から前記生殖系列幹細胞を得る工程をさらに包含する、請
   求項１に記載の方法。
7. 【請求項７】 前記ＢＭＰシグナル伝達経路が、前記集団に対して、野生型
   に存在する活性よりも少なくとも１０％多いＤｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ（
   Ｄｐｐ）活性を提供することによって、刺激される、請求項１に記載の方法。
8. 【請求項８】 前記ＢＭＰシグナル伝達経路が、ｄｐｐ遺伝子を機能獲得表
   現型に少なくとも変異させることによって刺激される、請求項１に記載の方法。
9. 【請求項９】 前記ＢＭＰシグナル伝達経路が、前記集団に少なくともＢＭ
   Ｐを提供することによって刺激される、請求項１に記載の方法。
10. 【請求項１０】 前記ＢＭＰがＤｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ（Ｄｐｐ）
    タンパク質、ＢＭＰ−２、およびＢＭＰ−４からなる群より選択される、請求項
    ９に記載の方法。
11. 【請求項１１】 前記ＢＭＰシグナル伝達経路が、Ｉ型またはＩＩ型ｄｅｃ
    ａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ（ｄｐｐ）レセプターを機能獲得表現型に少なくとも
    変異させることによって刺激される、請求項１に記載の方法。
12. 【請求項１２】 前記ＢＭＰシグナル伝達経路が、ＢＭＰを特異的に認識す
    る少なくとも１つのセリン／トレオニンキナーゼレセプターを通じて刺激される
    、請求項１に記載の方法。
13. 【請求項１３】 前記ＢＭＰレセプターが、Ｓａｘｏｐｈｏｎｅ（Ｓａｘ）
    、Ｔｈｉｃｋ ｖｅｉｎ（Ｔｋｖ）、およびＰｕｎｔ（Ｐｕｔ）からなる群より
    選択される、請求項１２に記載の方法。
14. 【請求項１４】 前記ＢＭＰシグナル伝達経路が、ＢＭＰへのレセプター結
    合についての少なくとも１つのシグナルトランスデューサーの活性を変更するこ
    とによって刺激される、請求項１に記載の方法。
15. 【請求項１５】 前記シグナルトランスデューサーが、Ｍｏｔｈｅｒｓ ａ
    ｇａｉｎｓｔ ｄｐｐ（Ｍａｄ）、Ｍｅｄｅａ（Ｍｅｄ）、Ｄａｕｇｈｔｅｒｓ
    ａｇａｉｎｓｔ ｄｐｐ（Ｄａｄ）、Ｓｃｈｎｕｒｒｉ（Ｓｈｎ）、およびＢ
    ｒｉｎｋｅｒ（Ｂｒｋ）からなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。
16. 【請求項１６】 前記ＢＭＰシグナル伝達経路が、前記集団の細胞中のＢＭ
    Ｐ発現を増大させることによって刺激される、請求項１に記載の方法。
17. 【請求項１７】 ＢＭＰ発現が、ｈｅｄｇｅｈｏｇ（ｈｈ）活性化転写また
    はｗｉｎｇｌｅｓｓ（ｗｇ）活性化転写によって増大され、そしてＢＭＰシグナ
    ル伝達が、少なくともいくつかの生殖系列幹細胞において増大される、請求項１
    ６に記載の方法。
18. 【請求項１８】 前記集団が、終糸細胞、キャップ細胞、鞘内細胞、ｈｕｂ
    細胞、および嚢胞前駆細胞からなる群より選択される、少なくとも１つの体細胞
    からさらに構成される、請求項１に記載の方法。
19. 【請求項１９】 少なくとも１つの生殖系列幹細胞が、骨形成性タンパク質
    （ＢＭＰ）を発現するフィーダー細胞と接触してインビトロで培養される、請求
    項１に記載の方法。
20. 【請求項２０】 少なくとも１つの生殖系列幹細胞が、少なくともいくつか
    の体細胞性ニッチ細胞と接触してインビトロで培養される、請求項１に記載の方
    法。
21. 【請求項２１】 前記ＢＭＰシグナル伝達経路を通じるシグナル伝達が、Ｂ
    ＭＰシグナル伝達を刺激する体細胞のフィーダー層とともに前記生殖系列幹細胞
    をインビトロで培養することによって刺激される、請求項１に記載の方法。
22. 【請求項２２】 前記ＢＭＰシグナル伝達経路を通じるシグナル伝達が、Ｂ
    ＭＰシグナル伝達を刺激する培養培地中で、前記生殖系列幹細胞をインビトロで
    培養することによって刺激される、請求項１に記載の方法。
23. 【請求項２３】 多能性段階における少なくとも１つの前記生殖系列幹細胞
    を維持する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
24. 【請求項２４】 全能性段階における少なくとも１つの前記生殖系列幹細胞
    を維持する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
25. 【請求項２５】 宿主Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ中に、前記刺激された生殖系列
    幹細胞の少なくとも１つを移入する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方
    法。
26. 【請求項２６】 前記移入された生殖系列幹細胞の少なくとも１つが、前記
    宿主Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａの２以上の分化した細胞系列に寄与する、請求項２５
    に記載の方法。
27. 【請求項２７】 前記移入された生殖系列幹細胞の少なくとも１つが、前記
    宿主Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａの生殖系列細胞系列に寄与する、請求項２５に記載の
    方法。
28. 【請求項２８】 前記生殖系列幹細胞のゲノムの少なくとも１つの遺伝子を
    変異させる工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
29. 【請求項２９】 前記生殖系列幹細胞のゲノム中に、１以上のポリヌクレオ
    チドを導入する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
30. 【請求項３０】 前記生殖系列幹細胞の標的遺伝子座に、相同組換えによっ
    てポリヌクレオチドを組み込む工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
31. 【請求項３１】 相同組換えのために前記生殖系列幹細胞の少なくとも１つ
    の遺伝子を標的化する工程、該遺伝子の相同組換えを経た少なくとも１つの生殖
    系列幹細胞を選択する工程、および別のＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ中に、該相同組換
    えした生殖系列幹細胞を移入し、その結果、該標的化遺伝子が、該別のＤｒｏｓ
    ｏｐｈｉｌａの生殖系列を通じて、遺伝的に伝達される工程、をさらに包含する
    、請求項１に記載の方法。
32. 【請求項３２】 ＢＭＰシグナル伝達の刺激の前に存在する各生殖系列幹細
    胞について、前記集団中に少なくとも１０の生殖系列幹細胞が存在する、請求項
    １に記載の方法によって作製される、細胞集団。
33. 【請求項３３】 Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ幹細胞を維持するための方法であっ
    て、該方法は、以下の工程： （ａ）該幹細胞から構成される集団を提供する工程、および （ｂ）刺激されていない幹細胞の集団と比較して、より多くの該集団の幹細胞
    が、少なくとも生存可能または未分化として維持されるように、ｄｅｃａｐｅｎ
    ｔａｐｌｅｇｉｃ（ｄｐｐ）シグナル伝達を刺激する工程、 を包含する、方法。
34. 【請求項３４】 生物の幹細胞または腫瘍細胞を減少させるかまたは除去す
    るための方法であって、該方法は、骨形成性タンパク質（ＢＭＰ）レセプター経
    路によるシグナル伝達を抑制し、その結果、該幹細胞または腫瘍細胞が、減少ま
    たは除去される工程を包含する、方法。
35. 【請求項３５】 生物の幹細胞の量を増大させる方法であって、該方法は、
    骨形成性タンパク質（ＢＭＰ）レセプター経路によってシグナル伝達を刺激し、
    その結果、少なくともいくつかの幹細胞の量が増大される工程を包含する、方法
    。
36. 【請求項３６】 生物の幹細胞の寿命を増大させる方法であって、該方法は
    、骨形成性タンパク質（ＢＭＰ）レセプター経路によってシグナル伝達を刺激し
    、その結果、少なくともいくつかの幹細胞の該寿命が増大される工程を包含する
    、方法。