JP2003526326A - 選択可能トランスジェニック幹細胞作成を目的とする雄性生殖細胞の形質移入 - Google Patents

選択可能トランスジェニック幹細胞作成を目的とする雄性生殖細胞の形質移入

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JP2003526326A JP2000582583A JP2000582583A JP2003526326A JP 2003526326 A JP2003526326 A JP 2003526326A JP 2000582583 A JP2000582583 A JP 2000582583A JP 2000582583 A JP2000582583 A JP 2000582583A JP 2003526326 A JP2003526326 A JP 2003526326A
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セダーシナイ メディカル センター
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Abstract

(57)【要約】 雄性生殖細胞を、蛍光または発光レポータータンパク質をコードする遺伝子に作用性があるように連鎖した、例えば、サイクリンA1プロモーターのような、幹細胞特異性プロモーターの転写ユニットを含む核酸作成物を含む形質移入混合物で形質移入することにより、脊椎動物の選択可能トランスジェニック幹細胞を獲得する方法を発表する。該形質移入混合物は、脊椎動物雄性生殖細胞のインビボまたはエキソビボにおける形質移入用の組成物であり、核酸またはトランスジーン、及び遺伝子デリバリーシステム、さらに任意に、細胞によってトランスジーンと共に内在化され、細胞質を通って雄性生殖細胞の核内への遺伝子輸送を増強する、エンドソーム溶解因子のような保護・内在化因子、ウイルスまたはウイルス構成成分を含む。インビボで生育する生殖細胞以外では、幹細胞において、サイクリンA1プロモーター由来のレポーター遺伝子の発現は、核酸作成物中の隣接する遮蔽エレメントの使用により、プロモーターDNAのメチル化を防止することにより、促進される。代替法としては、DNAメチル化の阻害物質をインビトロ生育培地に使用し得る。キットは形質移入混合物の成分を含む。選択可能トランスジェニック幹細胞は安定的にDNAを組み込み、また非ヒトトランスジェニック脊椎動物は、これらの選択可能トランスジェニック幹細胞を含む。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】 (技術分野) 本出願を通じて括弧内に様々な出版物を参照している。これらの出版物全文は
、関連する技術分野の現状をさらに詳細に説明するために、本出願における参考
文献として本明細書中に編入されている。 本発明は、医学分野、特にトランスジェニックス(遺伝子導入学)および遺伝
子療法分野に関する。本発明は特にトランスジェニック脊椎動物幹細胞分野を指
向する。
【0002】 (背景技術) トランスジェニックス分野は、当初は動物個体に関連しての単一遺伝子の作用
、また遺伝子活性化、発現、および相互作用現象を理解するために開発された。
このテクノロジーは、ヒトおよびその他の動物における様々な疾病のモデルを作
成するために使用されてきた。トランスジェニック・テクノロジーは、遺伝学研
究及び遺伝のメカニズムと機能を理解するために使用することのできる最も強力
なツールである。これはまた、遺伝子と疾病の関係を研究するためにも使用され
る。およそ5,000の疾病が単一遺伝子の欠損に起因する。より一般的には、
他の疾病は、1またはそれ以上の遺伝子と、例えばウイルスまたは発ガン物質の
ような環境因子の複雑な相互作用の結果である。そのような相互作用の理解は、
遺伝子療法や薬剤療法のような治療法、さらに臓器移植のような処置の開発のた
めに特に重要である。そのような処置は、機能欠損を代償し及び/または生体内
に発現する望ましくない機能を排除し得る。トランスジェネシス(遺伝子導入体
形成)はまた、家畜の改良、及び生物学的活性薬剤の大規模な製造のために利用
されてきた。
【0003】 歴史的には、トランスジェニック動物は、ほとんど全て受精卵のマイクロイン
ジェクションによってのみ作成されてきた。受精卵の前核は、インビトロで、外
来性DNA分子、すなわち異種または同種異型DNAまたはハイブリッドDNA
をマイクロインジェクトされる。マイクロインジェクトされた受精卵は、次に偽
妊娠雌の生殖器官に移入される。(例:P.J.A.Krimpenfortら、Transgenic mice
depleted in mature T-cells and methods for making transgenic mice(成熟
T細胞を欠損するトランスジェニックマウスとトランスジェニックマウス作成の
方法)米国特許第5,175,384号及び第5,434,340号;P.J.A.Krimpenfortら、Trans
genic mice depleted in mature lymphocytic cell-type(成熟リンパ性細胞型
を欠損するトランスジェニックマウス)米国特許第5,591,669号)。
【0004】 本技術によるトランスジェニック動物の作成は、一般的には再繁殖可能であり
、この理由でその改良はほとんど行われなかった。しかし、本技術は、多数の受
精卵を必要とする。マイクロインジェクション中の溶解に起因する卵子の損失が
高率であることがそのひとつの理由である。その上、操作された胚は子宮内に着
床して生存しにくい。これらの要素は、本技術の効率が極めて低い一因となる。 例えば、3個体のトランスジェニック動物を作成するために、300−500
の受精卵がマイクロインジェクトされる必要がある。多数の胚をマイクロインジ
ェクトする必要性もその一因であるが、トランスジェニック技術はほとんどの場
合、繁殖力が高いためにマウスで利用されてきた。マウスのような小型動物が、
ある疾病の適切なモデルであることが証明されてはいるが、これに関連するその
価値は限定されている。大型動物は、多くの点においてヒト疾病と極めて類似し
ており、またその器官のサイズも同様であるために、ほとんどのヒト疾病に関す
る影響と処置の研究にはさらに適切であり得る。現在では、ヒト異種移植のため
の可能性を有するトランスジェニック動物が開発されているために、ヒトと比較
可能であるサイズを有する大型動物を必要とする。トランスジェニック技術は、
そのようなドナー動物をヒトレシピエントと免疫適合性にすることを可能にする
。しかし、従来のトランスジェニック技術には、受精雌性生殖細胞または卵子の
十分な蓄えがあることが必要である。霊長類、ウシ、ウマ、およびブタのような
ほとんどの大型哺乳類は、ホルモン刺激後でさえ、動物/サイクル当たり10−
20またはそれ以下の卵子しか産生しない。従って、これらの技術によって大型
動物を作成することは極めて高価なものにつく。
【0005】 本発明は、雄脊椎動物における精子形成が、莫大な数の雄性生殖細胞を生成し
、雌性生殖細胞よりもより容易に入手可能であることに基づく。ほとんどの雄哺
乳類は通常では、各射精中に少なくとも108の精子を生産する。これは、過排
卵性薬剤で処置後でさえ、マウスにおいては10−20のみの卵子が生産される
ことと対照的である。同様な状況がほとんど全ての大型動物の排卵についても真
実である。この理由のみをとっても、雄性生殖細胞は、生殖系列内に異質DNA
を導入するためのより好ましいターゲットであり、その結果、単純かつ自然な交
尾後に、高い効率でトランスジェニック動物の作成に至る。 精子形成は、二倍体精原幹細胞が、娘細胞を供給し、これが劇的かつ独特な形
態学的変化を経て、完全に成熟すると卵細胞を受精し得る、自己運動性のハプロ
イド(一倍体)細胞(雄性配偶子)となるプロセスである。
【0006】 原生殖細胞は、E8における内胚葉性卵黄嚢上皮において最初に見られ、胚の
外胚葉に由来すると考えられている(A.McLarenとBuehr、Cell Diff.Dev.31:185[1
992];Y.Matsuiら、Nature 353:750[1991])。それらは、卵黄嚢上皮から後腸内胚
葉を経て、生殖隆線へと移動して、有糸分裂により増殖して精巣に集合する。 性的成熟に達すると、精原細胞は、減数分裂に入る前に5または6回の有糸分
裂を経る。原始精原幹細胞(Ao/As)は、増殖して、中間精原細胞型Apr
、Aal、A1−4の集団を形成し、その後B型精原細胞に分化する。B型精原
細胞は、分化して一次精母細胞を形成し、これは遷延された減数分裂前期に入り
、その期間中に相同染色体が対となり組み換えをする。形態学的に識別可能であ
る減数分裂状態は:前細糸期、細糸期、合糸期、太糸期、第二次精母細胞、およ
びハプロイド精子細胞である。精子細胞は、精子形成中に、核の再成形、先体(
アクロソーム)形成及びテールの構築のような、大きな形態学的変化を経る。(A
.R.Bellveら、Recovery,capacitation,acrosome reaction,and fractionation o
f sperm,(精子の回収、受精能獲得、先体反応、及び分画)Methods Enzymol.22
5:113-36[1993])。精母細胞及び精子細胞は、セルトリ細胞膜との独特なヘミ接
合アタッチメントによりセルトリ細胞と重要な接触を確立する。精子の成熟にお
ける最終的な変化は、受精前に雌の生殖器官内で起こる。
【0007】 当初は、DNAを精子に付加し、その後インビトロでマウスの卵子を受精する
ためにこれを使用して、トランスジェニック動物を作成する試みが行われた。受
精卵は次に、偽妊娠養育雌に移入され、誕生した仔のうち、30%はトランスジ
ェニックであるかまたはトランスジーン(導入遺伝子)を発現すると報告された
。他の研究者らが努力を反復したにも関わらず、しかし、この実験は再現不能で
あり、トランスジェニックである仔は獲得されなかった。実際に、本方法により
獲得されたと考えられたトランスジェニック動物は、全くトランスジェニックで
はなく、報告されたDNAの組み込みは、実験的アーチファクトに過ぎなかった
ということにはほとんど疑問がない。本方法の試験に従事する世界中の研究室か
ら集められたデータは、作成された合計890個体の仔からはトランスジェニッ
クス(遺伝子導入体)は獲得されなかったことを示した。
【0008】 要約すると、現在では、生存トランスジェニック子孫を作成することが可能で
はあるが、従来使用可能であった方法はコストが高く極めて効率が悪い。従って
、トランスジェニック動物を生産するための簡易で、経済的かつ低侵襲性である
方法の明らかな需要がある。 胚性物質の使用は倫理的問題を起こす可能性があるために、研究または治療的
用途のためには、胚性物質を使用する必要のない、非幹細胞から幹細胞を選択ま
たは分離するための方法がまた必要とされている。さらには、特に非胚性(例え
ば、成体)脊椎動物の生理学的環境における幹細胞の研究は、これらの生体の組
織において、幹細胞を非幹細胞から選択、同定、または分離することが困難であ
るために制約されていた。 幹細胞は、生体の生涯を通して自己再生可能である未分化型母細胞であり、多
分化能がある。これはすなわち、完全に成熟分化型細胞系統に発育可能である様
々な決められた前駆細胞を発生することが可能であることを意味する。(T. Zigo
va と P.R. Sanberg、The rising star of neural stem cell research(神経幹
細胞研究における注目物)、Nature Biotechnol. 16(11):1007-08 [1998])。
全ての脊椎動物組織は、様々なタイプの血液細胞を由来する 胚細胞を含む幹細
胞に由来する。
【0009】 近年、遺伝的疾病、代謝欠損症、様々な種類の外傷、神経系疾病、または血液
ガンに苦しむ患者のための可能性を有する治療的ツールとして、トランスジェニ
ック幹細胞が大いに注目されている。インビトロまたはインビボで幹細胞を操作
するにあたり、注目する幹細胞を非幹細胞から識別かつ選択することが重要であ
る。 Tsukamotoら、は、Thy−1及びCD34表面エピトープ(抗原決
定基)に結合する特異性抗体に基づいてヒト造血幹細胞を同定する方法を発表し
た(A.Tsukamoto ら、Identification and isolation of human hematopoietic s
tem cells(ヒト造血幹細胞の同定と分離)、米国特許第5,643,741号)。Tsu
kamotoらは、抗体を蛍光色素で標識し、蛍光標示式細胞分取器(FACS
)により幹細胞を検出する方法の実施態様を教示した。Murrayらは、Cd
w109に特異的な単クローン抗体の結合を使用した、CDw109マーカーを
発現する造血幹細胞集団の精製の方法を教示した(L. Murrayら、Method of puri
fying a population of cells enriched for hematopoietic stem cells, popul
ations of cells obtained thereby and methods of use thereof(造血幹細胞
を豊富に含む細胞集団の精製方法、それにより獲得される細胞集団とそれを使用
する方法)、米国特許第5,665,557号)。 トランスジェニック神経幹細胞(NSCs)もまた、免疫蛍光法や他の免疫染
色技術を使用して同定かつ選択された。(J.D. Flax ら、Engraftable human neu
ral stem cells respond to developmental cues, replace neurons, and expre
ss foreign genes(移植可能なヒト神経幹細胞は、発生上の指示に反応し、ニュ
ーロンを置換し、また異種遺伝子を発現する)、 Nature Biotechnol. 16(11):
1033‐39 [1998]; O. Bruestleら、 Chimeric brains generated by intravent
ricular transplantation of fetal human brain cells into embryonic rats(
胎児ヒト脳細胞をラット胚中に脳室内移植することにより作成されたキメラ脳)
、Nature Biotechnol. 16(11):1040‐44 [1998])。
【0010】 しかし、これらのような免疫学に基づいた方法は、組織または細胞株特異性エ
ピトープに依存しており、細胞を一貫して生存可能な状態にしないために、幹細
胞の同定や選択におけるその有用性には限界がある。他の者は、特に蛍光または
生物発光性マーカーをコードする遺伝子を使用する、トランスジェニック細胞を
標識するための非致死的方法の使用により後者の問題に対応した。例えば、Ch
alfieらは、いずれかの外来性調節エレメントに作用性があるように連鎖し
た緑色蛍光タンパク質遺伝子を含む組み換え型DNA分子を発表した。(M. Chal
fieら、Uses of green-fluorescent protein(緑色蛍光タンパク質の用途)、米
国特許第5,491,084号)。 Cormierらは、生物発光性タンパク質である、アポエク
オリンの遺伝子を含む組み換え型DNAベクターについて教示した(M.J. Cormierら
、Recombinant DNA vectors capable of expressing apoaequorin(アポエクオ
リンを発現可能な組み換え型DNAベクター、米国特許第5,422,266号)。 Contagらは、インビボで発光成分を発現する、所望する形質転換細胞検
出の方法を発表した(C.H. Contag、Non-invasive localization of a light-emi
tting conjugate in a mammal(哺乳類における発光抱合体の非侵襲的ローカリ
ゼーション)、 米国特許第5,650,135号)。 同様にして、Horanらは、細胞を蛍
光シアニン色素で標識することに関連する、インビボにおける細胞トラッキング
(追跡)の方法を発表した。(P.K. Horanら、In vivo cellular tracking(イン
ビボ細胞トラッキング)、米国特許第4,762,701号)。またPattersonら
は、蛍光標識した相補性核酸プローブと蛍光活性化フローサイトメトリ(FAC
S)を使用することにより、特定のヌクレオチドターゲット配列を発現する細胞
検出のための方法を教示した(Pattersonら、Method of detecting amplified nu
cleic sequences in cells by flow cytometry(フローサイトメトリーによる細
胞における増幅核酸配列検出方法)、米国特許第5,840,478号)。 マーカー遺伝子の発現と連鎖され得る系列特異性幹細胞プロモーター及び他の
調節エレメントも使用し得る。例えば、Burnらは、造血幹細胞に特異的であ
るCD34promoterの用途を教示した(T.C. Burn ら、Hematopoietic
stem cell specific gene expression(造血幹細胞特異性遺伝子の発現)、米国
特許第5,556,954号)。 Gayは、インビトロにおける系列特異性幹細胞分離方法を発表した(D.A. Ga
y、 Method of isolating a lineage specific stem cell in vitro(インビト
ロにおける系列特異性幹細胞分離の方法)、米国特許第5,639,618号)。本方法は
、蛍光または他のレポータータンパク質をコードするDNAに作用性があるよう
に連鎖した、系列特異性プロモーター配列を含む作成物による多能性胚幹細胞の
インビトロ形質移入を含む。しかし、本方法は、トランスジェニック動物におい
てインビトロまたはインビボで幹細胞を選択するための一般化された方法では適
応可能ではなかった。この目的のために、系列特異性様式で転写を制御するより
はむしろ、様々な種類の幹細胞において作動するプロモーター配列への明確な需
要がある。
【0011】 幹細胞から体細胞への分化は、通常の細胞生長と同様に、細胞サイクルの制御
に依存している。この制御の機能障害は、非管理型細胞生長やガンの原因となり
得る(L.H. Hartwell と M.B. Kastan、Cell cycle control and cancer(細胞サ
イクル制御とガン Science 266:1821-28 [1994])。生長と分化の制御において
、サイクリンは重要である。サイクリンは、サイクリン依存性キナーゼ(CDK
s)の正の制御因子であり、これによって細胞サイクルを通して細胞をドライブ
する中心的役割を果たす活性化複合体を形成し得る。 これらのCDKの活性度
は、リン酸化と脱リン酸化イベントの経時的な活性化と不活性化によって制御さ
れる。(D.O. Morgan、Principles of CDK regulation(CDK制御の原理)、Natur
e (Lond.) 374:131-34 [1995]; C.J. Sherr、 Phase progression: cycling o
n cue(フェーズ・プログレッション(相の進行):指示に従うサイクリング)
、Cell 79:551-555 [1994]; P. Nurse、Ordering S phase and M phase in th
e cell cycle(細胞サイクルにおけるS期とM期の順序付け)、Cell 79:547-50
[1994])。CDK抑制因子と呼ばれる負の制御因子は、CDKに結合し、かつCDKを
阻害して、制御の他層を付加する(T. Hirama と H.P. Koeffler、Role of the c
yclin-dependent kinase inhibitors in the development of cancer(ガンの進
行におけるサイクリン依存性キナーゼ抑制因子の役割)、 Blood 86:841‐54 [
1995]; C.J. Sherr と J.M. Roberts、 Inhibitors of mammalian G1 cyclin-d
ependent kinases(哺乳類Glサイクリン依存性キナーゼの抑制因子)、Genes De
v. 9:1149-1163 [1995])。 G1からSへの移行において上昇するサイクリンA/CDK2複合体のキナーゼ
活性は、S期に移行するために必要とされる (K.A.HeichmanとJ.M.Roberts、Rule
s to replicate by(複製のための規則)、Cell 79:557-62 [1994]; M. Pagan
oら、 Cyclin A is required at two points in the human cell cycle(サイク
リンAはヒト細胞サイクルにおいて2点で必要とされる)、EMBO J. 11:961-71
[1992]; J. Pines と T. Hunter、Human cyclin A is adenovirus E1A-associa
ted protein p60 and behaves differently from cyclin B(ヒトサイクリンAは
アデノウイルスE1A関連タンパク質p60であり、サイクリンBとは異なった行
動をする)、 Nature 346:760-63 [1990]; C. Desdouetsら、Cyclin A: funct
ion and expression during cell proliferation(サイクリンA:細胞増殖中の
機能と発現)、 Prog. Cell Cycle Res. 1:15-23 [1995])。 サイクリンAはま
た、CDC2と複合体を形成し、その活性はG2からMへの移行時にピークとな
り、さらにサイクリンA/CDC2のキナーゼ活性はまた、M期に移行するため
に必要とされる。(M. Paganoら [1992])。
【0012】 2種類のサイクリンAが、Xenopus(アフリカツメガエル)において始
めて発見された;初期胚は、サイクリンA1とサイクリンA2の両方を含む。発
生後期において、哺乳類サイクリンA2とかなりの相同性を有するサイクリンA
2は、胚全体に見いだされたが、サイクリンA1は精巣と卵巣にのみ発見された
( J.A. Howeら、Identification of a developmental timer regulating the st
ability of embryonic cyclin A and a new somatic A-type cyclin at gastrul
ation(嚢胚形成時に胚サイクリンAと新体細胞性A型サイクリンの安定性を制御
する発生タイマーの同定)、Genes Dev. 9(10):164-76 [1995])。マウスにおい
ては、サイクリンA2は、発生中に多数の組織内に見いだされたが、サイクリン
A1の発現は極めて限定されており、後期太糸期精母細胞中に高レベル測定され
た(C. Sweeneyら、A distinct cyclin A is expressed in germ cells in the m
ouse(マウス生殖細胞において明確なサイクリンAが発現される)、Developmen
t 122(1):53-64 [1996])。 サイクリンA1は、非胚性組織の完全に分化した細胞においては発現されない
が、多数の骨髄性白血病細胞や未分化血液悪性疾患と同様に、雄性及び雌性生殖
細胞、脳幹細胞、造血前駆細胞を含む、広範囲の幹細胞では発現され得る。(R.
Yang ら、Characterization of a second human cyclin A that is highly expr
essed in testis and in several leukemic cell lines(精巣といくつかの白血
病細胞株において高度に発現される第二ヒトサイクリンAのキャラクタリゼーシ
ョン)、Cancer Res. 57(5):913-20 [1997];A. Kramer ら、Cyclin A1 is pre
dominantly expressed in hematological malignancies with myeloid differen
tiation(サイクリンA1は、骨髄性分化を伴う血液悪性疾患において優勢に発
現される)、Leukemia 12(6):893-98 [1998]; C. Sweeney ら [1996]; J.A.
Howeら [1995])。サイクリンA1発現パターンは、その制御がサイクリンA2の
それとは異なっていることを示し、またこれは、サイクリンA1とサイクリンA
2プロモーターによる、開始因子であるSp1系統群のような転写開始因子の鑑
別結合に関連し得る。 開始因子であるSp1系統群は、幹細胞における分化の制御と関連する(K.L.
Blockら、Blood 88:2071-80 [1996];H.M.Chenら、J.Biol. Chem.268:8230-39
[1993];R.K. Marganaら、J.Biol. Chem.272:3083-90[1997])。Sp1は、サ
イクリンA1発現が見られる組織において高レベルで発現される (C. Sweeneyら
[1996])。さらに、Sp1の誘導は、胚性ガン細胞の分化と関連していることが
発見され、Sp1は、フィブロネクチン遺伝子の発現と偶然に連関しており、S
p1の分化における役割の証拠を提供した(M. Suzukiら、Molecular & Cellular
Biology 18: 3010-3020 [1998])。成体組織においては、造血前駆体および精
子形成の後期において高レベルのSp1が報告されている(J.D. Safer ら、Molecul
ar & Cellular Biology 11: 2189-2199 [1991])。
【0013】 Sp1レベルは、異なる組織において10倍まで変化する(J.D.Safer ら [199
1])。これは、特に様々なプロモーターのシス作動性Sp1系統群結合部位の親
和性が異なるならば、幹細胞における組織特異性発現誘導の根拠を提供し得る。
組織誘導性発現のその他のメカニズムは、Sp1系統群に含まれる開始因子の互
いのモル比に基づき、その結果転写の活性化または抑制を起因する(A.P. Kumar
ら、Nucleic Acids Res. 25:2012-19 [1997]; M.J. Birnbaumら、Biochem. 34
:16503-08 [1995])。Sp1は、転写活性化において特有の役割を果たすことが
示されている:それは、基底転写複合体と直接に相互作用することが可能であり
(A. Emiliら、Molec. Cell. Biol. 14:1582-93 [1994]) 、TATA欠如プロモータ
ーにおける転写開始部位を決定し得る(J. Luら、J. Biol. Chem. 269:5391-540
2 [1994])。しかし、Sp1はまた、より一般的な転写活性化因子として機能す
ることが可能であるが、Sp1系統群に含まれる開始因子であるSp3タンパク
質は、プロモーターにおける結合部位の前後関係に基づき転写活性化因子または
リプレッサーのいずれかとして機能することが知られている。(D. Aptら、Virol
. 224:281-91 [1996]; B. Majelloら、J. Biol. Chem. 272:4021-26 [1997])
。Sp3が単一部位に結合する場合は、転写を活性化するが、複数部位と結合す
ると、強度の転写阻止を誘導し得る。( M.J. Birnbaum ら、Biochem.34:16503-
08 [1995])。 さらに、mybは雄性生殖細胞中に発現されることが示されているため、my
bはおそらく造血と同様に精子形成中におけるサイクリンA1プロモーター由来
発現の重要な転写因子として作用する(J. Sitzmannら、Expression of B-Myb d
uring mouse embryogenesis(マウス胚形成中のB-Mybの発現)、Oncogene 12:1
889-94 [1996]; K. Lathamら、Oncogene 13:1161-68 [1998])。mybタンパ
ク質の構造は、DNA認識に関連するヘリックス・ターン・ヘリックスモチーフ
を含む (M.D. Carrら、Eur. J. Biochem. 235:721-735 [1996])。mybタンパ
ク質は、モノマーとしてDNAを結合し、主要グルーブ内にあるR2及びR3領
域の、コンセンサスmyb結合部位であるMBS(c/TAAcNG)への協同的結合を伴う(
K.M. Howe と R.J. Watson、EMBO J. 9:161-69 [1990];K. Ogataら、Nature S
truct. Biol. 2:309-20 [1995])。細胞サイクル制御におけるmyb転写因子の
正確な役割は知られていないが、転写活性化因子として、サイクリンA1のよう
な細胞サイクル遺伝子の活性化のために重要であり得る。(参照: S.A. Ness, B
iochim Biophys. Acta 1288:F123-F139 [1996]; M.K. Saville と R.J. Watso
n、 Adv. Cancer Res. 72:109-40 [1998])。
【0014】 (発明の開示) 本発明は、動物の生殖細胞中に異種遺伝子と同様に同種異型遺伝子を移入して
、トランスジェニック脊椎動物を生産することにおいて極めて効果的である、イ
ンビトロまたはインビボのいずれかの精子形成形質移入の必要性について説示し
ている。本テクノロジーは、ヒト及び他の脊椎動物種属における生殖細胞系統及
び幹細胞系統の遺伝子療法の必要性を説示する。さらに、本発明による方法は、
特に非胚性生物学的原料由来の分化体細胞を含む、非幹細胞から幹細胞を同定及
び選択するための問題を特に説示する。 本発明のこれら、及びその他の恩恵及び特徴を本明細書中に説明する。
【0015】 本発明は、所望する遺伝物質による真核動物生殖細胞のインビボ及びエキソビ
ボ(インビトロ)形質移入に関する。要するに、インビボ方法は、遺伝物質を適
切なベクターと共に動物の精巣中に直接に注入することを含む。本方法では、効
果的条件下では精巣内の全てまたはいくつかの雄性生殖細胞は、生体内原位置で
形質移入される。エキソビボ方法は、新規分離方法を使用して、適切なドナーの
生殖腺またはその動物自身の生殖腺から生殖細胞を抽出し、それらをインビトロ
で形質移入し、次に自発的に再集合するような適切な条件下でそれらを精巣に戻
すことを含む。本エキソビボ方法は、精巣に戻す前に様々な手段によって形質移
入された生殖細胞をスクリーンして、トランスジーンが安定状態でゲノム中に組
み込まれていることを確認し得るという利点を有する。さらには、スクリーンと
細胞選別後に、高濃度の生殖細胞集団のみを戻すことができる。このアプローチ
は、交配後に高い確率でトランスジェニック子孫を供給する。
【0016】 本発明はまた、精原細胞の分離の新方法に関し、精細管から細胞を押し出して
穏やかな酵素による脱凝集により、精巣細胞の混合集団から精原細胞を獲得する
ことを含む。遺伝的に修飾されるべき精原細胞または幹細胞は、レポーター作成
物;例えば、緑色蛍光タンパク質(EGFP)、黄色蛍光タンパク質、青色蛍光
タンパク質、フィコエリトリンまたはフィコシアニンのようなフィコビリンタン
パク質、または適切な波長の紫外線下で蛍光を発するその他のタンパク質をコー
ドする作成物;と任意に連鎖する、幹細胞においてのみ活性であるプロモーター
配列;例えば、サイクリンA1プロモーター、または、サイクリング精原幹細胞
集団においてのみ活性であるプロモーター配列;例えば、B−mybプロモータ
ー;または、精原細胞特異性プロモーター;例えば、c-kit プロモーター領域、
c-raf-1プロモーター、ATM(アタキシア−テランギエクタシア:ataxia-tela
ngiectasia)プロモーター、RBM(リボソーム結合モチーフ)プロモーター、
DAZ(無精子症においては欠損する)プロモーター、XRCC−1プロモータ
ー、HSP90(熱ショック遺伝子)プロモーター、またはFRMI(脆弱X部
位)プロモーター、の使用を含む新しい方法によって、混合細胞集団から分離さ
れ得る。これらの特有なプロモーター配列は、それらが作動するサイクリング精
原細胞または幹細胞のみに、レポーター作成物の発現をドライブする。すなわち
、混合集団中でレポーター作成物を発現するのは、精原細胞または幹細胞のみで
あり、従って、これを基礎にして分離し得る。蛍光レセプター作成物を発現する
トランスジェニック細胞は、例えば、適切な波長に設定した蛍光標示式細胞分取
器(FACS)の使用により選別し得るか、または化学的方法により選択し得る
。 本発明はまた、蛍光または発光レポータータンパク質をコードする遺伝子に作
用性があるように連鎖された、例えば、サイクリンA1プロモーターのような幹
細胞特異性プロモーターを含むDNA作成物で雄性生殖細胞を形質移入すること
により、選択可能トランスジェニック幹細胞を獲得する方法に関する。本発明は
また安定的にDNAを組み込んだ選択可能トランスジェニック幹細胞とこれらを
含む非ヒトトランスジェニック脊椎動物に関する。生殖細胞以外の幹細胞におい
ては、インビボでのサイクリンA1に由来するレポーター遺伝子の発現は、隣接
する遮蔽エレメントを使用して、プロモーターDNAのメチル化を防止すること
により促進される。他方、トランスジェニック幹細胞をインビトロで生育する場
合は、DNAメチル化の阻害剤を培養基中に添加し得る。
【0017】 形質移入については、本発明による方法は、動物またはインビトロで生殖細胞
中に、所望する形質をコードするポリヌクレオチドを含む核酸量を含む組成物を
投与することを含む。さらには、この組成物は、例えば、ヌクレオチド配列から
成る関連制御プロモーター領域を含む。これは、例えば、レトロウイルスベクタ
ー、アデノウイルス及びアデノウイルス関連ベクター、またはリポソーム試薬ま
たは遺伝子療法に使用されるその他の因子のような細胞形質移入促進因子を含む
遺伝子デリバリーシステムと組み合わせる。これらは、動物生殖細胞に核酸セグ
メントを送達するために効果的な条件下で、任意に生殖細胞のゲノム中に、挿入
されたポリヌクレオチドを導入する。DNAの組み込み後は、処置された動物を
、自然に育種するか、または補助的生殖テクノロージーを使用して繁殖して、所
望の形質を有する子孫を選択する。 本テクノロジーは、動物モデルとしての用途のトランスジェニック動物の生産
、また遺伝物質の付加、修飾またはサブトラクション(減算)により、ヒトを含
む動物ゲノムの修飾に適応可能であり、しばしば、結果として表現型の変化を起
こす。本方法はまた、ヒトを含む動物の、個体が劣性または優性遺伝子障害を保
有していること、または個体がその子孫に多重遺伝子性障害を継代する傾向があ
るという、担体状態の修飾に適応可能である。
【0018】 本方法との使用に適切である調製物は、所望する形質をコードするポリヌクレ
オチドセグメントおよび形質転換促進因子、および任意に時としてDNA分解に
対して保護的である媒介物を備えている取り込み促進因子を含む。形質移入組成
物(混合物)の異なる構成成分はまた、2またはそれ以上の別々の容器に入った
計量済み形式の上記に説明する構成成分を有する、キット形式として供給される
。このキットは一般的には、別々の容器に入った異なる構成成分と有効な使用法
の説明書を含んでいる。他の構成成分はまた担体と同様にキット形式で供給され
る。従って、本テクノロジーは、幹細胞と細胞の発育の研究、及び遺伝子欠損症
の修復と同様にトランスジェニック脊椎動物の生産において莫大な価値を有して
いる。本テクノロジーはまた、ヒト及び他の脊椎動物種属における生殖細胞系統
と幹細胞系統の遺伝子療法に適切である。本発明はまた、疾病または外傷の処置
において移植実施に先立ち、インビトロで特定の組織を修飾及び/または工学的
処理を容易とするために、完全分化の前に細胞系統を同定することに有用である
【0019】 (発明を実施するための最良の形態) 本発明は、動物生殖細胞の遺伝的修飾についての現存する方法とトランスジェ
ニック動物の生産方法を改良したいとの本発明者らによる要望に源を発する。従
来の技術による方法は、インビトロまたはインビボで産生された接合体中へのD
NAの直接注入、またはレシピエント胚盤胞中に組み込んだ胚幹細胞を使用する
キメラ胚の生成に依存している。その次に、このように処理をした胚は、初回刺
激を受けた子宮または卵管内に移入される。使用可能であるこの方法は、極めて
遅延でコスト高であり、いくつかの侵襲的工程に基づき、トランスジェニック子
孫の生産は突発的かつ予期不可能である。 トランスジェニック体生産のための経済的、迅速かつ効率的なアプローチの探
索において、本発明者らは、所望する形質をコードする核酸セグメントによる、
雄動物生殖細胞のインビボまたはエキソビボ(インビトロ)形質移入に基づく本
方法を考案した。 本方法は、以下のストラテジーの少なくとも一つに基づく。
第一の方法は、既知の遺伝子デリバリーシステムを使用して、生体内原位置で動
物の生殖腺に核酸セグメントを送達し(インビボ形質移入)、形質移入された生
殖細胞をその動物自身の環境において分化させ、その後生殖細胞中に核酸の組み
込みを呈示する動物(トランスジェニック動物)を選択する。このようにして選
択した動物を交配するか、またはその精子を媒精またはインビトロ受精のために
使用してトランスジェニック子孫を生産する。選択は、1または両方の生殖腺細
胞診後、またはポリメラーゼ鎖反応法により増幅された動物の射精物を検査して
、所望の核酸配列の組み込みを確認した後に行い得る。所望する核酸の実際の組
み込み確認を簡易化するために、初回形質移入は、緑色蛍光タンパク質をコード
する遺伝子(または増強緑色蛍光タンパク質[EGFP]をコードする)、黄色蛍光タ
ンパク質、青色蛍光タンパク質、フィコエリトリンやフィコシアニンのようなフ
ィコビリンタンパク質、または適切な波長の紫外線下で蛍光を発する他のタンパ
ク質のような、同時形質移入されたレポーター遺伝子を含み得る。
【0020】 他方、雄性生殖細胞をドナー動物から分離して、所望する形質を分与するため
にインビトロで形質移入または遺伝的に修飾し得る。この遺伝学的操作の後、D
NAが所望する方法で修飾された証拠を呈示する生殖細胞を選択して、適切なレ
シピエント動物の精巣に移入する。1または両方の生殖腺細胞診後、またはポリ
メラーゼ鎖反応法により増幅された動物の射精物を検査して、所望の核酸配列が
実際に組み込まれていることを確認した後に、さらなる選択を実施し得る。上記
に説明するように、初回形質移入は、緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子(
または増強緑色蛍光タンパク質[EGFP]をコードする)、黄色蛍光タンパク
質、青色蛍光タンパク質、フィコエリトリンやフィコシアニンのようなフィコビ
リンタンパク質、または適切な波長の紫外線下で蛍光を発する他のタンパク質の
ような、同時形質移入されたレポーター遺伝子を含み得る。生殖細胞を移入する
前に、レシピエント精巣は、一般的に内在性生殖細胞を不活性化または破壊する
ために、ガンマ線照射、化学的処置、ウイルスのような感染性媒介物による手段
、または自己免疫不全症、またはそれらの組み合わせを含む、多数ある方法のう
ちの1またはその組み合わせ処理を受ける。この処置は、修飾されたドナー細胞
によるレシピエント精巣のコロニー形成を促進する。 適切に修飾された精子細胞を保有することを示した動物は、次に自然に交尾さ
せるか、または代替としてその精子を媒精またはインビトロ受精に使用する。こ
のようにして獲得したトランスジェニック子孫を、さらにトランスジェニック子
孫を獲得するために、自然交配または人工媒精により育種する。本発明による方
法は、他の使用可能な方法と比較して侵襲性手技の数が少なく、所望する形質を
コードする核酸配列の子孫ゲノム内への組み込みを生じる成功率が高い。
【0021】 原生殖細胞は、胚の外胚葉から発生すると考えられており、E8期に内胚葉卵
黄嚢において最初に発見される。そこから、これらは後腸内胚葉を通って生殖隆
線へと移動する。A0/Asとして知られる原始精原幹細胞は、B型精原細胞に
分化する。後者はさらに分化して、第一精母細胞を形成し、遷延された減数分裂
前期に移行し、その期間中に相同染色体が対となり組み換えをする。減数分裂の
いくつかの形態学的時期は識別可能である:前細糸期、細糸期、合糸期、太糸期
、第二次精母細胞、およびハプロイド精子細胞である。後者は、精子形成中に、
核の再成形、先体(アクロソーム)形成及びテールの構築を含む、大きな形態学
的変化を経る。精子の成熟における最終的な変化は、受精前に雌の生殖器官内で
起こる。本インビボ方法により投与された核酸セグメントの生殖腺への取り込み
は、1またはそれ以上のこれらの時期にある生殖細胞に到達し、より受容性の高
い時期にこれらによって取り込まれる。遺伝的修飾のエキソビボ(インビトロ)
方法においては、一般的に二倍体精原細胞のみを核酸修飾に使用する。細胞は、
遺伝子療法技術を使用してインビボで、または多数の異なる形質移入ストラテジ
ーを使用してインビトロで修飾し得る。 本発明者らは、従って本発明において、雄性生殖細胞の分離、及び動物生殖細
胞中への異種DNAと同様に同種異型DNAのインビボ及びエキソビボ(インビ
トロ)形質移入の新規かつ類を見ない方法を提供している。これは、遺伝子デリ
バリーシステム、及び少なくとも1つの核酸セグメントを、動物の生殖細胞を修
飾するために有効な条件下、有効量を動物に投与し、核酸セグメントが生殖細胞
内に入り、かつその中で遊離されて、そのゲノム内組み込まれることを可能にす
ることを含む。
【0022】 遺伝子デリバリー混合物の生殖細胞へのインビボ導入は、動物の精巣へ直接送
達し、そこで発生の様々な時期にある雄性生殖細胞へ分配されることによって達
成することが可能である。インビボ方法は、例えばマイクロピペットを使用して
、遺伝子デリバリー混合物を輸出管に、または直接的に精細管、または精巣網中
に注入するような、新しいテクノロジーを利用する。遺伝子デリバリー混合物の
安定した注入を保証するために、精巣内の繊細な細管を損傷しないような圧力下
で、注入は、管理圧力下で正確に計量された容量を送達するピコポンプを用いて
、マイクロピペットを使用して行い得る。 マイクロピペットは、金属またはガ
ラスのような適切な材料から作製することが可能であり、また通常では、ピペッ
ト作製機を使用して、その作業チップが例えば小さな穴になるまで引き伸ばした
ガラス管から作る。チップは、精巣細管システム内へ入りやすくするように便宜
な様式に傾斜し得る。マイクロピペットはまた、注入部位において、穿通時に繊
細な細管への損傷をより改善し、また減少するために斜角のついた作業端を備え
て供給される。この斜角は、特別製造による研磨装置の手段で生産し得る。イン
ビボ注入法用ピペットのチップ直径は、約15〜45ミクロンであるが、必要に
応じて、動物の大きさに基づいて他のサイズも使用し得る。ピペットのチップは
、同軸照明による両眼顕微鏡を使用して、注入点の反対側の細管壁を損傷しない
ように、また外傷を最低限に押さえるよう注意を払いながら、精巣網または精巣
の細管システム中に導入し得る。平均、約25倍〜80倍の拡大率が適切であり
、この手技は助手なしに一人の熟達した技術者が行い得るために、マイクロマニ
ピュレーターを取り付けたベンチはいくつも必要とはしない。少量の適切な非毒
性色素を、精巣の細管への送達と播種を確認するために、遺伝子デリバリー液に
添加し得る。それは、顕微鏡下で可視化して追跡し得る、適切な、非毒性色素の
希釈溶液を含み得る。 このようにして、遺伝子デリバリー混合物は、生殖細胞と密接な接触に置かれ
る。遺伝子デリバリー混合物は、典型的には、所望する形質をコードする修飾核
酸を、適切なプロモーター配列と、任意に、リポソーム、レトロウイルスベクタ
ー、アデノウイルスベクター、アデノウイルス増強遺伝子デリバリーシステムま
たはそれらの組み合わせのような核酸配列取り込みを増加する因子と共に含む。
緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子のようなレポーター作成物をさらに遺伝
子デリバリー混合物に添加し得る。c−kitリガンドのようなターゲティング
分子を、雄性生殖細胞の移動を増強するために、遺伝子デリバリー混合物に添加
してもよい。
【0023】 遺伝的修飾のエキソビボ(インビトロ)方法については、レシピエント精巣中
への修飾生殖細胞の導入は、適切なマイクロピペットを使用して直接注入により
達成し得る。精原細胞分化にホルモン刺激を供給するライディヒまたはセルトリ
細胞のようなサポート細胞は、修飾生殖細胞と共にレシピエント精巣に移入され
得る。これらの移入されたサポート細胞は非修飾であり、または、反対に、それ
自身が生殖細胞と共に、または別々に形質移入され得る。これらの形質移入サポ
ート細胞は、ドナーまたはレシピエント精巣のどちらかと同型または異型であり
得る。移入液内の好ましい細胞濃度は、単純な実験法により容易に確立し得るが
、約1x105〜10x105細胞/10μl液体の範囲内であると思われる。こ
のマイクロピペットは、輸出管、精巣網、または精細管中に、圧力及び/または
容量を調節するためにピコポンプを任意に使用して導入することが可能であり、
またはこの送達は手作業でも実施し得る。使用するマイクロピペットは、そのチ
ップ直径が通常では約70ミクロンであること以外は、インビボ注入に使用した
それとほとんどの点において類似している。導入の顕微手術方法は、上記に説明
したインビボ方法に使用したそれと全ての点において類似である。適切な色素物
をまた、形質移入生殖細胞の良好な送達の識別を容易にするために、担体液中に
組み込み得る。 生殖細胞と接触すると、それが動物の生体内原位置であろうが、インビトロで
あろうが、遺伝子デリバリー混合物は、ゲノム中への組み込みと発現のために、
異種遺伝物質を取り込んで適切な細胞位置への運搬を促進する。多数の既知であ
る遺伝子デリバリー方法が、核酸配列の細胞内への取り込み目的に使用し得る。
【0024】 「遺伝子デリバリー(または形質移入)混合物」とは、本特許との関連におい
ては、例えば、脂質形質移入因子の有効量を混合した適切なベクターを併せて有
する選択された遺伝物質を意味する。この混合物の各構成成分量は、特定種の生
殖細胞の形質移入を最適化するように選択する。そのような最適化は、ルーチン
実験法によるもので十分である。脂質に対するDNAの割合は、広範囲であるが
、好ましくは、1:1である。しかし使用する脂質因子とDNAの種類に基づい
て他の割合も使用し得る。この比率は重要ではない。 「形質移入因子」とは、本明細書中で使用する場合は、真核細胞、好ましくは
哺乳類細胞、より好ましくは哺乳類生殖細胞中に、外来性DNAセグメントの取
り込みを増強するために遺伝物質に添加する物質組成を意味する。エンハンスメ
ント(増強度)は、形質移入因子の存在しない場合の取り込みと比較して測定さ
れる。形質移入因子の実例は、アデノウイルス−トランスフェリン−ポリリジン
−DNA複合体を含む。これらの複合体は、一般的には、細胞へのDNAの取り
込みを増強して、細胞質から細胞の核への通過中にその分解を低減する。これら
の複合体は、c−kitリガンドまたはその修飾物のような生殖細胞の細胞表面
にあるレセプターにより認識される特異生リガンドを使用して、雄性生殖細胞に
ターゲットし得る。 他の好ましい形質移入因子は、リポフェクチン、リポフェクトアミン、DIM
RIE C、スーパーフェクト、およびエフェクチン(Qiagen)を含む。これら
はウイルス性形質移入因子ほど効率が良くないが、ウイルス由来の形質移入因子
に通常関連するサイズ規制なしに、脊椎動物ゲノム中への異種DNA配列の安定
な組み込みを促進する利点を有する。
【0025】 「ウイルス」とは、本明細書で使用する場合は、いずれかのウイルス、または
その形質移入フラグメントを意味し、これらは、雄性生殖細胞中への遺伝物質の
送達を促進し得る。本明細書における使用に適切であるウイルスの実例は、アデ
ノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヒト免疫不全症ウイルスのようなレトロウイ
ルス、Moloneyネズミ白血病ウイルスのようなレンチウイルス、及び水疱
性口内炎ウイルス糖タンパク質(VSV−G)−Moloneyネズミ白血病ウ
イルスと呼ばれるMoloneyウイルス由来のレトロウイルスベクター、ムン
プスウイルス(流行性耳下腺炎)、及びこれらウイルスのいずれかの形質移入フ
ラグメント、及び所望するDNAセグメントの取り込みと、生殖細胞の細胞質中
への遊離を促進する他のウイルス性DNAセグメント及びその混合物である。ム
ンプスウイルスが、精原細胞を含む精子細胞に対する親和性のために特に適切で
ある。上記のウイルスの全てが、非病原性または抗原性を低下するために修飾を
必要とし得る。しかし、他の既知であるベクターシステムもまた、本発明の規定
する範囲において使用し得る。 「遺伝物質」とは、本明細書で使用する場合は、レシピエント動物に新規遺伝
的修飾、または生物学的な機能的特徴を分与し得るDNA配列を意味する。新規
遺伝的修飾または特徴は、1またはそれ以上の遺伝子または遺伝子セグメントに
よりコードされるか、または1またはそれ以上の遺伝子の排除または突然変異に
起因し、さらに調節配列を含み得る。形質移入遺伝物質は、好ましくは、機能的
−すなわち生成物を介して、または他の生成を抑制することにより、所望する形
質を発現する―である。遺伝子機能が発現される他のメカニズムの実例としては
、ゲノムの刷り込み(インプリンティング)、すなわち、胚発生の極めて初期に
おける1対の遺伝子(アレル)のどちらか一つの不活性化、または遺伝子配列の
突然変異または欠失による遺伝物質の不活性化、または 優性負遺伝子産物の抑
止、その他がある。
【0026】 さらには、新規遺伝子修飾は、人工的誘導による突然変異または変異、または
天然に生じる遺伝子の対立遺伝子突然変異または変異であり得る。突然変異や変
異は、多数の技法により人工的に誘導することが可能であり、その全てが当該分
野において既知であり、化学的処理、ガンマ線照射処理、紫外線照射処理、紫外
線照射、及びその同義物を含む。突然変異や変異誘導に有用である化学物質は、
臭化エチジウム及び当該分野で既知である他の物質を含む。 特定配列のDNAセグメントはまた、所望する突然変異または変異を組み込む
こと、または遺伝子を分断したり、ゲノムDNAを修飾することにより作成し得
る。当業者は、遺伝物質は遺伝性であり、従って、その子孫の将来世代の、生殖
細胞を含む、ほとんど全ての細胞内に存在することを容易に認識するであろう。 新規特徴には、過去の非発現形質の発現、発現形質の増強または減少、形質の
過剰発現または過少発現、異所発現−通常発現されない組織内における形質の発
現、または過去の発現形質のアテニュエーション(弱化)または消失がある。他
の新規特徴は、発現形質の質的変化;例えば、待期または軽減、さもなければ多
重遺伝子による遺伝性障害の発現の予防を含む。
【0027】 所望する形質を獲得するための形質移入遺伝物質の発現には、プロモーター配
列を、所望する形質または産物をコードするポリヌクレオチド配列に作用性があ
るように連鎖する。プロモーター配列は、注目する細胞型において作動するもの
が選択される。 例えばB−Mybのような、サイクリング精原幹細胞集団においてのみ活性で
あるプロモーター配列、または精原細胞特異性プロモーター;例えば、c-kit プ
ロモーター領域、c-raf-1 プロモーター、ATM (アタキシア−テランギエクタシ
ア:ataxia-telangiectasia) プロモーター、 RBM (リボソーム結合モチーフ)
プロモーター、 DAZ (無精子症においては欠損する) プロモーター、 XRCC-1 プ
ロモーター、 HSP 90 (熱ショック遺伝子) プロモーター 、または FRMI (脆弱
X部位) プロモーターを、雄性生殖細胞における鑑別発現のために使用し得る。 ヒトサイクリンA1プロモーター領域は、脊椎動物の生殖細胞、造血細胞、他
の幹細胞内での発現を望む場合には、レポーター作成物発現、または他の所望す
る異種遺伝子配列発現をドライブするための最も好ましいプロモーター配列であ
る。 以下のヌクレオチド配列は、ヒトサイクリンA1遺伝子の5’末端を表示する
。非転写領域は、ヌクレオチド−1299〜−1に伸長する;転写済み・非翻訳
領域は、+1〜+127に伸長し、第1ATG配列がここで開始する;またサイ
クリンA1エクソン1(+1〜+234)、イントロン1(+235〜+537)
、及びエクソン2の一部(+538において開始)が表示されており、転写領域
は下線、ヌクレオチド+127〜+129における翻訳開始部位は太字で表記す
る。
【0028】 -1299 TCGATCTGAT TTAGAGATTT AGGGATGGAT GTTTTAAAAA AAGCAAAAGT -1249 AGTAACAGAC TATAGCATTG GTAATGTGTG TGTGCATATA TACATATTAT -1199 TTTTAAAAAA ATAAAGTTCG ATTATTTCAC CTGGCTTGTC AGTCACCTAT -1149 GCAGGCGTCT GAGCCCCCGG GTTTCCAGGA GCCCCCCGTA TAAGGACCCC -1099 AGGGACTCCT CTCCCCACGC GGCCGGGCCG CCCGCCCGGC CCCCAGCCCG -1049 GAGAGCTGCC ACCGACCCCC TCAACGTCCC AAGCCCCAGC TCTGTCGCCC -0999 GCGTTCCTTC CTCTTCCTGG GCCACAATCT TGGCTTTCCC GGGCCGGCTT -0949 CACGCAGTTG CGCAGGAGCC CGCGGGGGAA GACCTCTCGTGGGGACCTCG -0899 AGCACGACGT GCGACCCTAA ATCCCCACAT CTCCTCTGCC GCCTCGCAGG -0849 CCACATGCAC CGGGAGCCGG GCGGGGCAGG CGCGGCCCGC AAGGACCCCC -0799 GCGATGGAGA CGCAACACTG CCGCGACTGC ACTTGGGGCA GCCCCGCCGC -0749 GTCCCAGCCG CCTCCCGGCA GGAAGCGTAG GTGTGTGAGC CGACCCGGAG -0699 CGAGCCGCGC CCTCGGGCCA GCGTGGGCAG GGCGCCGCAG CCTGCGCAGC -0649 CCCGAGGACC CCGCGTCGCT CTCCCGAGCC AGGGTTCTCA GGAGCGGGCC -0599 GCGCAGGAGA CGTTAGAGGG GGTTGTTAGC GGCTGTTGGG AGAACGGGTC -0549 ACGGAAACAG TCCCTTCCAA AGCCGGGGCC ATCGTGGGGT GGGCGAGTCC -0499 GCCCTCCCAG GCCGGGGGCG CGGACCAGAG GGGACGTGTG CAGACGGCCG -0449 CGGTCAGCCC CACCTCGCCC GGGCGGAGAC GCACAGCTGG AGCTGGAGGG -0399 CCGTCGCCCG TTGGGCCCTC AGGGGCCTGA ACGCCCAGGG GTCGCGGCGA -0349 GTCCACCCGG AGCGAGTCAG GTGAGCAGGT CGCCATGGCG ATGCGGCCCC -0299 GGAGAGCGCA CGCCTGCCGC GGTCGGCATG GAAACGCTCC CGCTAGGTCC -0249 GGGGGCGCCG CTGATTGGCC GATTCAACAG ACGCGGGTGG GCAGCTCAGC -0199 CGCATCGCTA AGCCCGGCCG CCTCCCAGGC TGGAATCCCT CGACACTTGG -0149 TCCTTCCCGC CCCGCCCTTC CGTGCCCTGC CCTTCCCTGC CCTTCCCCGC -0099 CCTGCCCCGC CCGGCCCGGC CCGGCCCTGC CCAACCCTGC CCCGCCCTGC -0049 CCCGCCCAGC CGGCCACCTC TTAACCGCGA TCCTCCAGTG CACTTGCCAG +0003 TTGTTCCGGA CACATAGAAA GATAACGACG GGAAGACGGG GCCCCGTTTG +0053 GGGTCCAGGC AGGTTTTGGG GCCTCCTGTC TGGTGGGAGG AGGCCGCAGC +0103 GCAGCACCCT GCTCGTCACT TGGGATGGAG ACCGGCTTTC CCGCAATCAT +0153 GTACCCTGGA TCTTTTAT TG GGGGCTGGGG AGAAGAGTAT CTCAGCTGGG +0203 AAGGACCGGG GCTCCCAGAT TTCGTCTTCC AGGTAACGTG GGTTTAGTAT +0253 CCCGACTTGG AGGCTTGTCA GAATGTTTCT CTCCTTCCAG CCCAACACGA +0303 AGTCTTGGGA TAAAAAGCCT CCCTCAGGGA TTCAAATAAC TGTTTTGATT +0353 CAGAGCAACT TTGATCGCCT GTGCGGTCGC ACCTGCCCTT TCAGCCCCAA +0403 TAATTACTGG GAAGATCAGC AATTGGTGTT AGTCCCATTG CTTGGTGCTC +0453 TCCCTCCTAG AGGTTCGCTG TGTCCTTGGA GCCCGGGGTG GACGGAATCG +0503 ACTAAACAGC TTGTCTGTTT CTCTTTCCCT GGTAGCAGCA GCCCGTGGAG +0553 TCTGAAGCAA TGCACTGCAG CAACCCCAAG AGTGGAGTTG TGCTGGCTAC +0603 AGTGGCCCGA GGTCCCGATG CTTGTCAGAT ACTCACCAGA GCCCCGCTGG +0653 GCCAGGAT (配列番号:1).
【0029】 本発明によるサイクリンA1プロモーターの最も好ましい実施態様は、ヌクレ
オチド−1299〜+144配列を有するDNAフラグメントであり、ATTに
変更されている第一翻訳開始部位(上記のヒト配列のヌクレオチド+127〜+
129における太字で示すATC)を含有する(配列番号:2)。サイクリンA
1プロモーターについての他の好ましい実施態様は、配列番号2またはその非ヒ
ト相同体の作用性のあるフラグメント、これらいずれかの作用性のある誘導体を
含む:作用性のあるフラグメントの好ましい実例は、−1151〜+144フラ
グメント (配列番号:3)、−454〜+144フラグメント(配列番号:4)、
−326〜+144 フラグメント (配列番号:5)、−190〜+144フラグ
メント (配列番号:6)、−160〜+144フラグメント(配列番号:7)、
−120〜+144フラグメント (配列番号:8)、−112〜+144フラグ
メント (配列番号:9)を含み、上記に説明するように、その全てについて+1
27〜+129のATGが変更されている。しかし、ヌクレオチド−112下流
から少なくともヌクレオチド+5またはそれ以上、ヌクレオチド+144まで(
+144を含む)伸長するヌクレオチド配列を含むいずれのサイクリンA1プロ
モーターフラグメントはまた、+127〜+129の翻訳開始部位が無傷(イン
タクト)ではなく、−112〜−37間(GCボックス番号1、2、及び3及び
/または4)の必須Sp1結合部位が以下に説明するように無傷である限りにお
いて、作用性がありかつ有用である。本発明に従う、他の好ましいフラグメント
は、−190〜+20まで伸長するそれ (配列番号:10)、または+190〜
ヌクレオチド+20以上、ヌクレオチド+144までのいずれのヌクレオチド(
翻訳開始部位をのぞく)も含む。しかし−190〜+13(配列番号:11)、−
190〜+6(配列番号:12)、または−190〜+5(配列番号:13)の
ような短フラグメントもまた作用性がありかつ有用である。非ヒト相同体は、注
目する脊椎動物幹細胞型において機能する非ヒト由来のいずれかのサイクリンA
1プロモーター配列を含む。 サイクリンA1の他の好ましい実施態様は、配列番号:2の作用性のある誘導
体、または配列番号:2の作用性のあるフラグメントのいずれか、またはその非
ヒト相同体であり、これらは、第一翻訳開始部位のコドンがATT以外の他のコ
ドン配列に変更されており、また翻訳開始部位として識別さていない;他の好ま
しいサイクリンA1プロモーターは、第一翻訳開始部位が全て欠失されているコ
ドンを有する配列番号:2の誘導体である。他の作用性のある誘導体は、突然変
異、多型性、または配列番号:2のいずれのヌクレオチド位置についてもプロモ
ーター活性を削除していない変異型対立遺伝子を含むサイクリンA1プロモータ
ー配列を含む。
【0030】 他の細胞サイクル調節遺伝子におけるプロモーターと同様に(B. Henglein ら
、Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 、 91:5490-94 [1994];A. Hwangら、J. Bio
l. Chem. 270:28419-24 [1995]; E.W. Lamら、Oncogene 7:1885-90 [1992])
、サイクリンA1プロモーターは 、TATA−ボックスモチーフを保有しない
。転写開始部位周囲のヌクレオチドは、イニシエーターとして機能するように思
われる。サイクリンA1プロモーター領域は、GCボックス、myb、及びE2
F部位を含む転写因子のための複数結合部位を含む。 上流領域は、サイクリンA1プロモーター由来の転写に必須である複数のSp
1結合部位を有するGC高濃度領域を含む。反面、サイクリンA2における予測G
Cボックスは、転写開始部位の120bp以上上流に位置し、これらは遺伝子発
現にとって必須ではないことが示されている。GCボックス及びSp1種属の転
写因子は、サイクリンA1由来の発現調節には重要である。6つのGCボックス
が転写開始部位の最初の200bp上流部に発見される。−112と−37間に
ある4つのGCボックスの取除は、プロモーター活性をほとんど完全に抑止する
。1〜4のGCボックスの中で、転写開始部位に最も近接する2つが特に重要で
ある。GCボックス3と4のうち、これらの一つのみがプロモーターの転写活性
の基底レベルのために必要である。 Sp1−Sp1種属の主要活性因子−、及びSp3は、GCボックス1+2と
3+4に結合し得る。昆虫細胞におけるこれらのフラグメント分析は、Sp1が
GCボックス1〜4を含む全てのフラグメントにおけるサイクリンA1プロモー
ター活性を再構成することを実証している。Sp1(または少なくともSp1種
に含まれる開始因子)は、−112〜−37間に位置するエレメントとの相互作
用を介して、サイクリンA1プロモーター活性のために必要とされる。抑止はS
p3によって達成されるものと考えられるが、E2F、CDE、またはDHRエ
レメントに依存しないレプレッサーメカニズムは未だ同定されていない。
【0031】 動物細胞のDNAは、CpGジヌクレオチドのシチジン塩基の5'炭素位置に
おいてメチル化を受ける。非メチル化CpGsは、転写活性のあるクロマチンに
おいて優先的に発見される (T. Naveh-Manyら、Active gene sequences are und
ermethylated(活性遺伝子配列は過少メチル化状態にある)、Proc. Natl. Acad
. Sci. USA 78:4246-50 [1981])。 過剰メチル化は、転写抑止と関連する (R.
Holliday、 The inheritance of epigenetic defects(後成的欠損症の遺伝)、
Science 238:163-70 [1987])。 雄性生殖細胞におけるサイクリンA1プロモーター由来の組織特異性発現は、
プロモーターのメチル化状態とは関わりなく見いだされる。高レベルのメチル化
でも、精子形成中のサイクリンA1プロモーター発現を抑制しない。これとは対
照的に、体細胞組織におけるサイクリンA1プロモーターの発現は、サイクリン
A1プロモーターをメチル化しないトランスジェニックマウス系統にのみ観察さ
れている。これは遺伝子発現におけるメチル化の影響は組織特異性であり、体細
胞と生殖細胞では異なる可能性があることの証拠である。 マウスと健常ヒトにおけるサイクリンA1の高インビボ発現レベルは、生殖細
胞に限定されている(R. Yang ら、[1997]; Sweeney ら[1996])。理由は解明さ
れていないが、サイクリンA1はまた、急性骨髄性白血病において高レベルで発
現される (R. Yang ら、[1997]; R. Yang 、 Cyclin A1 expression in leukem
ia and normal hematopoietic cells(白血病と正常造血細胞におけるサイクリ
ンA1発現)、Blood 93:2067-74 [1999])。クロマチン構造とメチル化パター
ンにおける変化がおそらく組織特異性発現に寄与している。サイクリンA1プロ
モーターは、極めてGC濃度が高く、数百塩基対以上に伸長し、主要転写開始部
位のおよそ50塩基対上流に終端するCpGアイランドを有している。プロモー
ターの重要部分におけるCpGジヌクレオチドのメチル化パターンを、以下の実
施例22において説明するように、亜硫酸水素塩配列法を使用して分析すると、
体細胞、付着細胞株においては高度のCpGメチル化が観察されたが、サイクリ
ンA1発現白血球細胞株においては観察されなかった。白血球細胞株における低
メチル化は、CpGアイランド外側の+114ではCpGは試験した全ての細胞
株において完全メチル化されていることが発見されたために、明らかにCpGア
イランドに限定されている。
【0032】 従って、本方法に従う選択可能トランスジェニック幹細胞を獲得する目的には
、生殖細胞以外の幹細胞型におけるサイクリンA1プロモーター由来の発現のサ
イレンシングを、プロモーター配列とレポーター遺伝子を遮蔽エレメントで隣接
することにより防止することが好ましい。例えば、本DNA作成物中に、5'末
端をサイクリンA1プロモーター配列に、3’末端をレポータータンパク質遺伝
子に隣接する1.2kbニワトリβ−グロビン遮蔽エレメントの二重コピーを含
むことにより、サイクリンA1プロモーター配列のCpGアイランド内における
CGジヌクレオチド部位においてメチル化は実質的に防止され、従ってレポータ
ー遺伝子発現は、生殖細胞以外の幹細胞型に生じる (M.J. Pikaart ら、Loss of
transcriptional activity of a transgene is accompanied by DNA methylati
on and histone deacetylation and is prevented by insulators(トランスジ
ーンの転写活性の喪失はDNAメチル化とヒストン脱アセチル化を伴い、インス
レーターにより防止される)、Genes Dev. 12:2852-62 [1998]; Chung ら、DN
A sequence which acts as a chromatin insulator element to protect expres
sed genes from cis-acting regulatory sequences in mammalian cells(哺乳
類細胞においてシス作動性調節配列から発現遺伝子を保護するために、クロマチ
ンインスレーターエレメントとして作用するDNA配列)、米国特許第5,610,05
3号)。 他方、選択可能トランスジェニック幹細胞獲得のための方法が、インビトロで
生育する幹細胞を選択するために実施される場合は、トリコスタチンAまたは酪
酸ナトリウムのようなヒストン脱アセチル化及びDNAメチル化の阻害剤を培養
基内に含むことにより、多様な培養幹細胞におけるサイクリンA1由来のレポー
ター発現のサイレンシングを防止することが可能である(M.J. Pikaartら、[1998
])。 サイクリンA1プロモーター配列メチル化の抑制は、時として腎臓有足細胞ま
たはB細胞におけるサイクリンA1プロモーター由来の発現を起因する。その結
果、選択可能な腎臓幹細胞を注目する適用においては、選択可能トランスジェニ
ック幹細胞獲得に関する本方法に従って、サイクリンA1プロモーター由来のレ
ポーター遺伝子を発現する蛍光または発光(ルミネッセンス)有足細胞は、明確
な有足細胞の形態(突出する小足を含む)により蛍光または光を発するトランス
ジェニック腎臓幹細胞から容易に識別される。造血幹細胞を注目する適用におい
ては、サイクリンA1促進転写の結果として発現されるレポータータンパク質の
波長と異なる波長において蛍光または発光する蛍光標識を抱合したB細胞特異性
抗体をさらに使用することにより、蛍光または発光B細胞をトランスジェニック
造血幹細胞から識別する。例えば、B細胞特異性表面エピトープに対するフィコ
エリトリシン抱合単クローン抗体を、トランスジェニック造血幹細胞からB細胞
を識別するために、骨髄からの細胞集団サンプルに適用し得る。
【0033】 mybタンパク質の3つの可能な結合部位は、サイクリンA1遺伝子の転写開
始部位の100 bp以内に存在し、−66−27、及び+2に開始する(図3
)。c−mybタンパク質の結合は、−27及び+2の開始部位に生じ、c−m
ybタンパク質は実施例23に説明するように、ヒトサイクリンA1由来の発現
をトランス活性化する。対照的には、ネズミまたはヒトサイクリンA2プロモー
ターには、コンセンサス(共通)myb部位は発見されていない( X. Huet ら、
Molecular & Cellular Biology 16:3789-98 [1996])。 サイクリンA2遺伝子と同様に、転写因子E2Fの2つの可能結合部位は、サ
イクリンA1の転写開始部位の下流にある。これらのE2F部位は、G1相にお
けるサイクリンA2転写の抑制には必要ない (J. Zwicker ら、(1995) EMBO Jou
rnal 14、 4514-4522; X. Huet ら [1996])。同様にして、サイクリンA1プロ
モーターのこれらの部位における突然変異導入は発現調節を変更しない。これら
のE2F部位が調節に関与しないという証拠は、インビボにおいて細胞サイクル調
節を示した3欠失(−190〜+13)が、両方のE2F部位を含む作成物と類
似することを使用して示された(データ表示なし)。同様に、ヒトサイクリンA
2遺伝子のCDEと類似する6-bp配列が、サイクリンA1プロモーターの−
19〜−24位置(TCGCGG;配列番号:32)においてアンチセンス方向に発見
された これらのヌクレオチドが突然変異された際に、細胞サイクル調節には顕
著な変化は見られなかった(図9)。これは、機能的であるためには、これらの
エレメントが5'から3'への配向性にある必要があるという所見と一致する(J.
Zwicker ら[1995];N. Liuら、Oncogene 16:2957-63 [1998]; N. Liuら、Nucl
eic Acids Res. 25: 4915-20 [1997])。
【0034】 本発明は、脊椎動物由来の選択可能トランスジェニック幹細胞獲得の方法に関
する。本方法は、本明細書中に説明するように、雄性生殖細胞または生殖細胞前
駆体を形質移入混合物で形質移入することを含み、該形質移入混合物は、例えば
、ヒトまたは他の相同脊椎動物サイクリンA1プロモーター配列またはその作用
性のあるフラグメントのような幹細胞特異性プロモーター配列を、蛍光または発
光レポータータンパク質をコードする遺伝子に作用性があるように連鎖して、転
写ユニットを含むように配向したポリヌクレオチドを含む。作用性があるように
連鎖する幹細胞特異性プロモーターとレポーター遺伝子を含むポリヌクレオチド
は、形質移入した雄性生殖細胞または前駆体のゲノム中に組み込まれ、育種後に
子孫に伝達されることが可能であり、インビボで子孫の幹細胞内で作動して、子
孫脊椎動物の組織から回収される、または生体原位置で観察される細胞集団にお
いて、幹細胞が、非幹細胞と比較して異なったレポーター遺伝子を発現する。従
って、これらの幹細胞は組織に存在する非幹細胞の集団から容易に選択可能であ
る。本方法が有用である幹細胞型は、多能性、多分化能性、二分化能性、または
単分化能性幹細胞を含み、これは雄性または雌性生殖細胞または、精原、胚性、
骨原性、造血性、顆粒球形成、交感神経副腎、間葉、上皮性、神経性、神経冠、
O-2A 前駆体、脳、腎臓、膵臓、肝臓または心臓幹細胞を含むが、それに限定は
されない。さらに、本発明はまた本方法により獲得される、いずれの型もの選択
可能トランスジェニック幹細胞を指示する。 好ましいレポーター遺伝子は、緑色蛍光タンパク質(またはEGFP)、黄色蛍
光タンパク質、青色蛍光タンパク質、フィコエリトリンまたはフィコシアニンの
ようなフィコビリンタンパク質、または適切な波長の紫外線下または他の光線下
で蛍光を発するその他のタンパク質を含む蛍光タンパク質をコードする。いくつ
かの適用に適する他のレポーター遺伝子は、酵素的に基質からの発光を誘導する
タンパク質をコードする遺伝子である;本発明の目的では、そのようなタンパク
質は「発光タンパク質」である。例えば、発光タンパク質は、ルシフェラーゼや
アポエクオリンのようなタンパク質を含む。
【0035】 プロモーター由来の追加異種遺伝子を発現する形質移入細胞を含む特定の適用
においては、この発現は、サイクリンA1プロモーターに連鎖するレポーター遺
伝子とは異なる蛍光または発光タンパク質をコードするレポーター遺伝子と連鎖
し得る。従って、異なる波長において蛍光または発光する複数のレポーターを選
択して複数形質の発現に基づく細胞選択を行うことが可能である。選択可能トラ
ンスジェニック幹細胞は、例えば、適切な波長にセットしたFACSスキャナー
を使用して、非幹細胞から分別、分離、または選択し得る。他方、従来の顕微鏡
テクノロジーを使用して、手作業で分離、または選択し得る。選択可能トランス
ジェニック幹細胞を獲得する本方法は、幹細胞を非胚性組織から選択、または分
離することを可能とするため好都合である。 本発明はまた、本発明に従うヒトサイクリンA1プロモーター配列を含む核酸
作成物、またはその作用性のあるフラグメントに関する。選択可能トランスジェ
ニック幹細胞を獲得の方法における使用についての好ましい実施態様において、
サイクリンA1プロモーターは、蛍光タンパク質または発光タンパク質をコード
するヌクレオチド配列を有するDNAと作用性があるように連鎖される。他の好
ましい実施態様は、所望する産物または形質をコードする異種核酸を使用する。
本発明の目的では、「作用性があるように連鎖する」とは、プロモーター配列が
、コード配列から直接上流に位置して、どちらの配列も5'から3'様式に配向さ
れているために、全ての必須酵素、転写因子、コファクター、活性化因子、及び
反応物が存在し、例えば、適切なpH及び温度のような、望ましい物理的条件下
において、インビトロで転写を行い得ることを意味する。これは、いずれかの特
定の細胞において、条件によって転写が好発することを意味するわけではない。
例えば、サイクリンA1由来の転写は、トランスジェニック動物におけるほとん
どの分化細胞型では好発しない。
【0036】 本発明はまた、細胞中への作成物の導入方法にかかわらず、本発明による核酸
作成物を含むトランスジェニック脊椎動物細胞に関する。本発明はまた、そのよ
うな細胞を含むトランスジェニック非ヒト脊椎動物に関する。 本発明はまた、選択可能トランスジェニック幹細胞獲得に有用である、雄脊椎
動物の生殖細胞を形質移入するためのキットに関する。このキットは、脊椎動物
雄性生殖細胞の形質移入を促進するための材料の既成アセンブリである。 本発
明によるキットは、上記に説明するように、形質移入因子、及び蛍光または発光
タンパク質をコードするDNA配列に作用性があるように連鎖した幹細胞特異性
プロモーター配列を含むポリヌクレオチド、その構成成分を有効に使用するため
の説明書を共に含んでいる。このキットは、本発明による核酸作成物を含むこと
が好ましい。任意に、このキットは、シクロスポリンまたは副腎皮質ステロイド
のような免疫抑制剤、及び/または所望する形質の発現のためにコードする追加
ヌクレオチド配列を含み得る。キットを構成する材料または構成成分は、その操
作実用性と効用を保存する便利かつ適切な方法で保管されて従業者に供給される
。例えば、構成成分は、溶解、脱水、または凍結乾燥形状であり得る;室温、冷
蔵または冷凍温度で供給され得る。
【0037】 本発明はまた、精細管から細胞を押し出し、また穏やかな酵素による脱凝集よ
り精巣細胞の混合集団から精原細胞を獲得することを含む、精原細胞の分離方法
に関する。遺伝的に修飾されるべき精原細胞または幹細胞は、レポーター作成物
;例えば、緑色蛍光タンパク質(EGFP)、黄色蛍光タンパク質、青色蛍光タ
ンパク質、フィコエリトリンまたはフィコシアニンのようなフィコビリンタンパ
ク質、または適切な波長の紫外線下で蛍光を発するその他のタンパク質をコード
する作成物;と任意に連鎖する、幹細胞においてのみ活性であるプロモーター配
列;例えば、サイクリンA1プロモーター、または、サイクリング精原幹細胞集
団においてのみ活性であるプロモーター配列;例えば、B-Myb プロモーター;ま
たは、精原細胞特異性プロモーター;例えば、c-kit プロモーター領域、c-raf-
1 プロモーター、ATM (アタキシア‐テランギエクタシア:ataxia-telangiectas
ia) プロモーター、 RBM (リボソーム結合モチーフ) プロモーター、 DAZ (無精
子症においては欠損する) プロモーター、 XRCC-1 プロモーター、 HSP 90 (熱
ショック遺伝子) プロモーター 、または FRMI (脆弱X部位) プロモーター、の
使用を含む新しい方法によって、混合細胞集団から分離され得る。これらの特有
なプロモーター配列は、サイクリング精原細胞内でのみレポーター作成物の発現
をドライブする。精原細胞は、従って、混合集団の中でレポーター作成物を発現
するただ一つの細胞であり、従ってこれを基礎に分離し得る。蛍光レセプター作
成物は、例えば、適切な波長に設定されたFACSを使用することにより選別し
得るか、または化学的方法により選択し得る。 本発明による方法は、多種の脊椎動物への適用に適しており、これらの全ての
脊椎動物は、配偶子、すなわち精子または卵子を産生することが可能である。従
って、本発明に従って、新遺伝的修飾及び/または特徴を、ヒト、非ヒト霊長類
、例えば、サル、マモセット、ヒツジ、ウシ、ブタ、ウマ、特に競走馬のような
家畜農業(農場)動物、海生哺乳類、野生動物、ネコ、イヌ、厚皮動物、マウス
やラットのような齧歯類、スナネズミ、ハムスター、ウサギ、及びその類似物の
ような哺乳類を含む動物に分与し得る。他の動物は、ニワトリ、シチメンチョウ
、アヒル、オーストリッチ、エミュ、ガチョウ、ホロホロチョウ、ハト、ウズラ
、稀少かつ観賞用鳥類、及びその類似物のような家禽を含む。サイ、トラ、チー
タ、コンドルのある種、及びその類似物のような、野生動物のうちで絶滅に瀕す
る種が特に注目される。
【0038】 本発明はまた、本発明に従う選択可能トランスジェニック幹細胞を含むトラン
スジェニック非ヒト脊椎動物に関する。広意には、「トランスジェニック」脊椎
動物とは、細胞内に永久的に導入された外来性DNAを有するものである。動物
細胞内に導入された外来性遺伝子は、「トランスジーン(導入遺伝子)」と呼ば
れる。本発明は、異種、すなわち、外来性のトランスジェニック遺伝物質、また
は、生物学的機能性を有する遺伝物質を、動物の生殖細胞中に存在する、未変性
(天然)、障害を受けていない形状で含む、異なる種属からの物質を含むトラン
スジェニック動物の作成に適応可能である。他の場合は、この遺伝的物質は、例
えば、遺伝子の「正常」型を有する動物または、その所望するアレル由来の、同
種の異なる系統から獲得される「同種異型」遺伝物質である。さらに、この遺伝
子は、共に連鎖するプロモーターDNAとDNAコード配列から成るハイブリッ
ド作成物であり得る。これらの配列は、異なる種、または通常では並列しない同
種由来のDNA配列から獲得し得る。DNA作成物はまた、細菌またはウイルス
のような原核生物からのDNA配列を含み得る。 一つの好ましい実施態様において、トランスジェニック動物の形質移入生殖細
胞は、その染色体中に組み込まれた非内在性(外来性)物質を有する。これは「
安定形質移入」として言及されるものである。これはヒトを含む全ての脊椎動物
に適応可能である。 当業者は、本発明によって生成されたいずれのトランスジ
ェニック動物の遺伝物質への変更の結果として生じる所望する形質は遺伝性であ
ることを容易に認識するであろう。遺伝物質は、最初は親動物の生殖細胞内に単
独で挿入されたにも関わらず、将来の子孫やそれに引き続く世代の生殖細胞内に
本源的に存在する。遺伝物質はまた、子孫の体細胞及び非幹細胞を含む、子孫の
全ての細胞内に存在する。本発明はまた、現存するトランスジェニック動物の育
種に起因する子孫をも包括する。同種の他のトランスジェニックまたは非トラン
スジェニック動物と育種したトランスジェニック動物は、いくつかのトランスジ
ェニック子孫を産生し、これらは繁殖性であるべきである。本発明は、従って、
本明細書中に供給されるトランスジェニック動物の育種、また同様にその繁殖性
を有する子孫の育種に起因する動物系統を供給する。
【0039】 「育種」とは、本特許との関連においては、受精を生起するための雄と雌の配
偶子の結合を意味する。そのような結合は、自然的交尾、すなわちカップリング
、またはインビトロもしくはインビボの人工的手段により起こり得る。人工的手
段は、人工媒精、インビトロ受精、クローニング及び胚移入、細胞質内精子マイ
クロインジェクション、クローニング及び胚開裂、及びその同義物を含むが、こ
れに限定されるわけではない。しかし、他の手段もまた使用し得る。 成熟雄性生殖細胞の形質移入はまた、当該分野では既知である、脊椎動物由来
の細胞の分離についての本テクノロジーを使用して達成することが可能であり、
実施例10で例証する。こうして分離した細胞は、次にエキソビボ(インビトロ
)で形質移入するか、または実施例11に説明するように、凍結保存用に調製し得
る。分離された精巣細胞の実際の横切は、例えば、脊椎動物の精巣を分離し、被
膜剥離、さらに精細管を細裂かつ切り刻むことによって達成し得る。分離した細
胞は、次に細胞基質を穏やかに切断し非破損細胞を遊離することで知られている
、例えば、膵臓トリプシン、コラゲナーゼI型、膵臓デオキシリボヌクレアーゼ
(DNA分解酵素)I型、やウシ血清アルブミンや修正DMEM培地のような酵
素を含む酵素混合物中でインキュベートし得る。細胞は酵素混合物中で、約5分
〜約30分の間、より好ましくは、約15分〜約20分、約33℃〜約37℃、
より好ましくは約36℃〜37℃の温度でインキュベートし得る。細胞を洗浄し
て酵素混合物を除去した後、DMEM及びその同義物のような培養基中に入れ、
培養皿に平板培養し得る。多数の市販入手可能な形質移入混合物のいずれかと、
所望する形質または細胞の形質移入産物 をコードするポリヌクレオチドとを混
合し得る。形質移入混合物は、次に細胞と混合して、約2時間〜約16時間、好
ましくは約3〜4時間、約33℃〜約37℃、より好ましくは約36℃〜37℃
の温度、かつ、より好ましくは一定及び/または制御気圧で相互作用させる。こ
の時期の後、細胞を約33℃〜34℃、好ましくは、約30〜35℃の低めの温
度で、約4時間〜約20時間、好ましくは、約16〜18時間放置することが好
ましい。説明した事項から根本的には逸脱しない他の条件はまた、当業者には既
知であるように使用し得る。
【0040】 本方法は、特定の遺伝的形質をコードし調節する遺伝物質の導入を可能にする
ために、遺伝子療法分野に適応可能である。従って、ヒトにおいては、例えば、
親を治療することにより、さもなければ仔を影響する多数の単一遺伝子障害を矯
正することが可能である。完全に遺伝性である疾病や、一つ以上の遺伝子の相互
作用により生起されるか、または複数遺伝子が寄与するためにより頻繁に生じる
、少なくとも部分的に遺伝的根拠を有する疾病の発現を変更することが同様にし
て可能である。 本テクノロジーはまた、同様にしてヒト霊長類以外の動物にお
ける障害を矯正するためにも適用し得る。ある場合は、所望する治療的効果を獲
得するためには、明らかにされた形質の発現または抑制に複数遺伝子が関わって
いる場合のように、動物の生殖細胞内に1またはそれ以上の「遺伝子」を導入す
る必要があり得る。ヒトにおいては、多重遺伝子性障害は、インスリンの生産ま
たは応答の欠乏により生起される真性糖尿病、炎症性腸疾患、アテローマ性心臓
血管系疾患及び高血圧の特定の形態、精神分裂病及び慢性抑鬱性障害のある形態
、その他諸々を含む。ある場合は、当該分野で既知であるように、一つの遺伝子
が発現性産物をコードしているが、他の遺伝子が調節機能をコードし得る。他の
実例は、相同的組み換え法がゲノム内の点突然変異や欠失の修復に適応されるも
の、病原性や疾病を起因する遺伝子の不活性化、または優性・負の様式で発現す
る遺伝子の挿入、または遺伝子プロモーター、エンハンサー、遺伝子の非翻訳テ
ール領域のような調節エレメントの修飾、またはハンチントン舞踏病、脆弱−X
シンドローム及びその同義物のような疾病を起因するDNAの反復配列増殖の制
御がある。
【0041】 本方法の特定の生殖的適用は、精子形成障害を有する動物、特にヒトの治療で
ある。不完全精子形成または精子完成は、しばしば遺伝的根拠を有し、ゲノム内
の1または数個の突然変異が正常精子細胞の産生不全を起因し得る。これは生殖
細胞発生の様々な時期において出現し、男性不妊または生殖不能を起因し得る。
本発明は、例えば、レシピエントのゲノム内に核酸配列を挿入または組み込ませ
て、従って、これにより、不妊症治療における乏精子症や無精子症の矯正におい
て精子形成を確立することに適応可能である。同様にして、本方法はまた、生殖
能力不全または無精子症が遺伝的根拠を有する運動性障害に起因する男性にも適
応可能である。 本方法はさらに、ヒト及び獣医学または厚生における用途に治療的効果のある
薬剤を発現するトランスジェニック動物の作成に適応可能である。実例は、血友
病型を有する患者の血液凝固を増強する因子、またはインスリン及び他のペプチ
ドホルモンのようなホルモン剤のような薬剤のウシ牛乳中での生産を含む。
【0042】 本方法はさらに、ヒト異種移植片移植に適切な解剖学的及び生理学的表現系を
有するトランスジェニック動物の作成に適応可能である。トランスジェニックテ
クノロジーは、ヒトレシピエントと免疫適合性である動物の作成を可能にする。
適切な器官は、例えば、心臓、肺、及び腎臓の移植を可能とするために、そのよ
うな動物から切除し得る。 さらには、本発明に従って形質移入した生殖細胞は、トランスジェニック動物
から抽出して、当該分野で既知であるように、将来の使用に備えて有効な条件下
で保存し得る。保存条件は、プログラムによる凍結方法及び/または凍結保護剤
を使用することによる低温保存法の使用、及び液体窒素のような物質内での保存
の使用を含む。生殖細胞は、雄動物の精液、または分離した精子、または未成熟
精母細胞、または原始生殖細胞を含む精巣組織の全細胞診の形状として獲得し得
る。そのような保存技法は、白血病またはホジキン病のような疾患の腫瘍学的治
療を受ける若い成人または子供に特に恩恵となる。これらの治療は、しばしば精
巣を非可逆的に損傷し、従って、例えば照射法や化学療法による治療後に精子形
成を再開することを不可能とする。生殖細胞の保存とそれに引き続く精巣移入は
、受精能を修復することを可能にする。そのような場合には、本発明において教
示されるように生殖細胞の移入と操作が達成されるが、形質移入は一般的には関
連がなく必要とされない。 ヒト以外の種属において、本技法は、凍結生殖細胞としての配偶子の運搬のた
めに有用である。そのような運搬は、ドナー動物が遠く離れている場合に、様々
な有用な家畜や家禽の確立を促進する。本アプローチはまた、地球上の絶滅に瀕
する種の保存に適応可能である。
【0043】 本発明に従う、選択可能トランスジェニック幹細胞獲得の方法、選択可能トラ
ンスジェニック幹細胞、トランスジェニック非ヒト脊椎動物び脊椎動物の精液、
及び核酸作成物とキットは、細胞分化及び発生における研究、またガンのような
細胞分化に関連する疾病の新治療法の開発、または外傷性損傷後の組織の修復に
おいて有用なツールである。本発明は、細胞が完全分化する前に細胞系統を同定
して、疾病または外傷の治療において後に行われる移植のために、インビトロで
特定の組織の修飾及び/または工学的操作を容易にすることにおいて有用である
。非胚性組織から幹細胞を選択、分離することを可能とすることは、選択可能ト
ランスジェニック幹細胞を獲得するための本方法の利点であり、従って胚性組織
の使用に関連する倫理的また法的問題を回避し得る。本発明に従って、選択可能
トランスジェニック幹細胞を選択して、インビボ(すなわち生体内において)ま
たはインビトロで分析可能であることはさらなる利点である。 本発明をこれから、限定を含まない以下の実例を参照して、詳細に説明する。
全ての参考文献内容についての関連部分、合法化目的のために必要である本特許
を通じて引用する公表特許出願は、本明細書中に参考文献として組み込まれてい
る。
【0044】 (実施例) 緑色蛍光タンパク質レセプター遺伝子の精巣細胞へのインビボ及びインビトロア
デノウイルス増強−トランスフェリン−ポリリジン−媒介による送達と発現 アデノウイルス増強−トランスフェリン−ポリリジン−媒介による遺伝子デリ
バリーシステムは、Curielらにより説明かつ特許化されている(D.T. Cur
ielら、Adenovirus enhancement of transferrin-polylysine-mediated gene de
livery(トランスフェリン−ポリリジン−媒介による遺伝子デリバリーのアデノ
ウイルスによる増強)、PNAS USA88:8850-8854(1991)。DNAの送達は、トラン
スフェリンレセプターにより媒介されるエンドサイトーシスに依存する(Wagner
ら、Transferrin-polycation conjugates as carriers for DNA uptake into ce
lls(細胞へのDNA取り込みのための担体としてのトランスフェリン−ポリカ
チオン抱合体)、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)87:3410-3414(1990)。さらに、本方
法は、アデノウイルスが、エンドソームのような細胞小胞を破壊してその中に包
括されている内容物を遊離する能力に依存する。本システムは、他の方法の2,
000倍も哺乳類細胞への遺伝子デリバリーを増強し得る。 インビボ及びインビトロ実験に使用する遺伝子デリバリーシステムは、以下の
実施例に示すように調製した。
【0045】 実施例1:トランスフェリン−ポリ−L−リジン複合体の調製 ヒトトランスフェリンを、EDC(1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプ
ロピルカルボジイミド塩酸塩)(Pierce)を使用して、GabarekとGergely
による方法(GabarekとGergely、Zero-length cross-linking procedure with h
e use of active esters(活性エステルを使用するゼロ長架橋方法)、Analyt.B
iochem 185:131(1990))に従って、ポリ(L−リジン)と抱合した。本反応にお
いて、EDCは、ヒトトランスフェリンのカルボキシル基と反応して、アミン反
応性中間体を形成する。活性化されたタンパク質は、室温で2時間ポリ(L−リ
ジン)成分と反応させ、反応は、最終濃度が10mMとなるようにヒドロキシル
アミンを添加することにより停止した。抱合体はゲル濾過により精製して、−2
0°Cで保存した。
【0046】 実施例2:インビボ形質移入用DNAの調製 Green Lantern-1ベクター(Life Technologies、Gibco BRL、Gaithersberg、MD)
は、哺乳類細胞において遺伝子移入をモニタするために使用されるレポーター作
成物である。これは、サイトメガロウイルス(CMV)即時型初期プロモーターに
よりドライブされる緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードする遺伝子から成る。
この遺伝子の下流は、SV40ポリアデニル化シグナルである。Green Lantern-
1を形質移入した細胞は、青色光で照射すると、明るい緑色の蛍光を発する。励
起ピークは490nmである。
【0047】 実施例3:アデノウイルス粒子の調製 E1a領域を欠失する複製不能株である、アデノウイルスdI312を、Jo
nesとShenkにより説明されるように(JonesとShenk、PNAS USA(1979)79:
3665-3669)、E1aトランス相補性細胞株293において増殖させた。ウイル
スの大規模調製は、MitterederとTrapnellによる方法(Mitt
erederら、“Evaluation of the concentration and bioactivity of adenoviru
s vectors for gene therapy"(遺伝子療法のためのアデノウイルスベクター濃
度と生物活性の評価)、J.Urology,70:7498-7509(1996))を使用して実施した。
ビリオン濃度は、紫外線分光法により、1吸光単位を10ウイルス粒子/mlに
等価として測定した。精製ウイルスは−70°Cで保存した。
【0048】 実施例4:トランスフェリン−ポリ−L−リジン−DNA−ウイルス複合体の形
成 実施例1のトランスフェリン−ポリリジン複合体6μgを、実施例3で調製し
たアデノウイルスd1312粒子7.3x107個と混合して、次に実施例2の
Green LanternDNA作製物5μgと混合し、室温で1時間放置し
た。この混合物約100μlを、ピペット作製機で引き伸ばして、マイクロフォ
ージ上でわずかに曲げた、マイクロピペットに吸引した。充填したマイクロピペ
ットを次にピコポンプ(Eppendorf)に取り付けて、実施例6に説明するように
、インビボでマウスに、持続圧力下で、DNA複合体を送達した。 対照は、同一方法に従って行ったが、投与混合物からトランスフェリン−ポリ
−リジン−DNA−ウイルス複合体を取り除いた。
【0049】 実施例5:アデノウイルス増強トランスフェリン−ポリリジンとリポフェクチン
媒介による形質移入の効率比較 DNAと複合体化した抱合アデノウイルス粒子を、インビボ試験の前にCHO
細胞でインビトロ試験した。これらの実験では、ルシフェラーゼ活性は定量が容
易であるために、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を用いた。ルシフェラーゼを
コードするレポーター遺伝子から成る発現作成物は、CMVプロモーター(Invi
trogen、Carlsbad、CA92008)によってドライブされた。CHO細胞は、10%仔
ウシ胎児血清を添加したDulbeccoの修正イーグル培地(DMEM)に生育し
た。遺伝子移入実験には、CHO細胞を6cm組織培養プレート内に播種して、
約50%コンフルーエント(5x105細胞)となるまで生育した。形質移入前
に、培養基を吸引して血清を含まないDMEMと交換した。細胞は、トランスフ
ェリン−ポリリジン−DNA複合体またはリポフェクチンDNA凝集体のどちら
かで形質移入した。トランスフェリン−ポリリジン媒介によるDNA移入では、
細胞当たり0.05〜3.2x104アデノウイルス粒子となるように、DNA
−アデノウイルス複合体を細胞に添加した。プレートは37°Cで1時間、5%
CO2インキュベーターに戻した。1時間後に、ウェルに3mlの完全培地を添
加して、細胞を収集前に48時間インキュベートした。細胞をプレートから取り
除いて、カウントして、次にルシフェラーゼ活性測定のために溶解した。 リポフェクチンで形質移入された細胞については、CMV−ルシフェラーゼD
NA1μgを、17μlのリポフェクチン(Life Technologies)とインキュベ
ートした。DNA−リポフェクチン凝集体をCHO細胞に添加して、37°Cで
4時間、5%CO2でインキュベートした。完全培地3mlを次に細胞に添加し
て48時間インキュベートした。細胞を収集、カウントして、ルシフェラーゼ活
性測定のために溶解した。ルシフェラーゼ活性は、ルミノメーターで測定した。
得られた結果は表1に示す。 以下の表1に含まれるデータは、アデノウイルス増強トランスフェリン−ポリ
リジン遺伝子デリバリーシステムは、CHO細胞の形質移入について、リポフェ
クチンよりも1,808倍効率的であることを示す。
【0050】
【表1】 表1:CHO細胞のリポフェクチン及びアデノウイルス増強 トランスフェリン−ポリリジン形質移入の比較
【0051】 実施例6:DNAのトランスフェリン−L−リジン−DNA−ウイルス複合体を
介しての動物生殖細胞へのインビボ送達 上記の実施例4において説明するように調製した、CMV-EGFP(Gibco-BRL、Life
Technologies、Gaithersburg、MD 20884)DNA−トランスフェリン−ポリリジン
ウイルス複合体を、3週齢のB6D2F1雄マウスの精細管中に送達した。トラ
ンスフェリンレセプター媒介エンドサイトーシスによるDNA送達は、Schmidt
ら及びWagnerら(Schmidtら、Cell 4: 41-51(1986);Wagner,E.ら、PNAS(1990)、
(USA)81:3410-3414(1990))によって説明されている。さらには、本デリバリー
システムは、アデノウイルスの、エンドソームのような細胞小胞を破壊してその
中に包括されている内容物を遊離する能力に依存する。本システムの形質移入効
率は、リポフェクションよりもおよそ2000倍高い。 雄マウスを2%アベルチン(Avertin)(100%アベルチンは、10
gの2,2,2−トリブロモエタノール(Aldrich)と10mlのt−ア
ミルアルコール(Sigma)を含む)で麻酔して、後足レベルで身体の腹側の
皮膚と体壁に小切開を作成した。精巣脂肪パッドをピンセットで掴んで、開口を
通して動物の精巣を引き出し、精巣輸出小管細管を露出してガラスシリンジで支
持した。EGFP DNA−トランスフェリン−ポリリジンウイルス複合体を、
把手式ガラスシリンジに取り付けたガラスマイクロピペット、または圧力式自動
ピペッター(Eppendorf)を使用して一本の輸出管中に注入し、精細管中への混
合物の流入を可視化するためにトリパンブルーを添加した。次に精巣を体腔内に
戻して、体壁を縫合し、皮膚を創傷用クリップで閉合し、温パッド上で動物を回
復させた。
【0052】 実施例7:DNAの検出と転写メッセージ 動物精巣への遺伝物質送達9日後、2匹の動物を屠殺して、その精巣を切除し
、半分に切って、液体窒素内で凍結した。組織の半分の一つからDNAを、他方
の半分からはRNAを抽出して分析した。
【0053】 (a) DNAの検出 抽出物中における増強緑色蛍光タンパク質をコードする(EGFP DNA)DNAの
存在について、形質移入混合物投与9日後にポリメラーゼ鎖反応法及びECFP
特異性オリゴヌクレオチドを使用して試験した。EGFP DNAは、DNA複
合体を受容した動物の精巣内に存在していたが、シャム対照(偽手術された)動
物では存在していなかった。 (b) RNAの検出 実験動物の精巣におけるCMV−EGFP mRNAの存在は以下のように検
定した。注入及び非注入精巣からRNAを抽出し、ECFP特異性プライマーを
使用する逆転写酵素PCR(RTPCR)を使用してEGFPメッセージの存在
を検出した。EGFPメッセージは、注入精巣には存在したが、対照精巣には存
在しなかった。従って、上記でPCR分析によって検出されたDNAは、実は、
エピソームのEGFP DNAまたは動物の染色体に組み込まれたEGFP D
NAである。形質移入遺伝子は発現されていた。 ヒトサイクリンA1プロモーターによる転写調節を確認するために、ノーザン
ブロット分析をさらに実施した。総RNAは、RNA組織調製キット(Qiagen)
を使用して組織から調製した。ポリアデニル化RNAは、オリゴ(dT)−セル
ロースコラム通過により調製した。RNAをポリオキシル化して1.5%寒天ゲ
ルに作用する。電気泳動後に、RNAをニトロセルローズ紙に移動して、サイク
リンA1 cDNAリボプローブでハイブリダイズする。ハイブリダイゼーショ
ン後、この膜を1x SSCを使用して2回、温度60°Cで1時間洗浄した。
洗浄した膜はX線フィルムに露出した。
【0054】 実施例8:非内在性DNAの発現 2匹の雄−EGFP形質移入混合物の注入を受けた1匹と、手術のみを実施し
た対照の1匹−を注入4日後に屠殺して、その精巣を切除し、4%パラホルムア
ルデヒド中で、4℃、18時間固定した。固定精巣を次に2mM塩化マグネシウ
ムを加えたPBS中の30%ショ糖中に、4℃、18時間置き、ドライアイス上
で凍結したOCT内に包埋し、切片を作成した。両動物の精巣を、波長488n
Mの蛍光を使用して共焦点顕微鏡で検査した時に、EGFP−注入マウスの細管
内に明るい蛍光が検出されたが、対照精巣においては検出されなかった。EGF
P−注入マウスの精細管内の多くの細胞が明るい蛍光を表示し、これは緑色蛍光
タンパク質が発現されている証拠である。
【0055】 実施例9:正常交配による子孫の作成 EGFP−形質移入雄を正常雌と交配した。雌は妊娠期間を完了して、仔が誕
生した。仔(F1子孫(offspringまたはprogeny))について新遺伝物質の存在
の有無をスクリーンした。
【0056】 実施例10:精巣細胞のインビトロ形質移入 3匹の10日齢マウスの精巣から細胞を分離した。精巣は被膜剥離して、滅菌
針で精細管を細裂及び切り刻んだ。細胞を酵素混合物中で37℃、20分インキ
ュベートした。酵素混合物は、10mgウシ血清アルブミン(胚試験済み)、5
0mgウシ膵臓トリプシンIII型、クロストリジウムコラゲナーゼタイプI型
、1mgウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼI型を10mlの修正HTF培地(
Irvine Scientific、Irvine、CA)中に含むように作成した。酵素はSigma Company
(St.Louis,Missouri 63178)から購入した。消化後、細胞をHTF培地で500
xgで遠心分離により2回洗浄し、250μl HTF培地に再懸濁した。細胞
をカウントして、0.5x106細胞を、総容量5mlのDMEM(Gibco-BRL、
Life Technologies、Gaithesburg、MD 20884)入りの60mm培養皿に平板培養し
た。形質移入混合物は、5μg Green Lantern DNA(Gibco-BRL、Life Technologi
es、Gaithesburg、MD 20884)を、20μl Superfect(Qiagen、Santa Clarita、CA
91355)及び150μl DMEMと混合することにより調製した。形質移入ミッ
クスを細胞に添加して、37℃、5%CO2の条件下で3時間インキュベートし
た。細胞を33℃インキュベーターに移して一晩インキュベートした。 翌朝、蛍光細胞数をカウントすることにより、細胞の形質移入効率を評価した
。本実験においては、形質移入効率は90%であった(図の表示なし)。Nom
aski optics20倍で観察したGreen Lanternによる形
質移入精巣細胞は、FITCで観察した同一細胞を示した。ほとんど全ての細胞
が蛍光性であり、形質移入が成功したことを確証した。 細胞を、マイクロピペットを使用して輸出管を介して精巣中に注入した。3x
105細胞を含む総容量50μlを注入に使用した。注入前に細胞をトリパンブ
ルーと混合した。3匹の成体マウスに形質移入細胞を注入した。Balb/cB
yJレシピエントマウスは、注入6週間前に800ラドのガンマ線照射を受けた
。1匹のマウスは重態となり注入48時間後に屠殺した。このマウスの精巣は、
組織検査のために、解剖、固定、処理した。 残りの2匹の雄は、表示のように正常雌と育種した。4カ月後に仔が誕生した
。同腹仔は現在トランスジーンの組み込みについてスクリーン中である。
【0057】 実施例11:低温保存のための精巣組織に由来する細胞懸濁液の調製 細胞懸濁液を以下に説明するように異なる日齢のマウスから調製した。 グループI: 7−10 日齢 グループII: 15−17 日齢 グループIII: 24−26 日齢 マウスの精巣を解剖して、リン酸緩衝生理的食塩水(PBS)中に入れ、被膜
剥離し、精細管を細裂した。グループIとIIからの精細管は、間質細胞を除去
するために、1mg/mlウシ血清アルブミン(BSA)(Sigma、St.Louis、MO
63178)とコラゲナーゼI型(Sigma)を含むHEPES緩衝培養基(D-MEM
)(Gibco-BRL、Life Technologies、Gaithesburg、MD 20884)に移した。33℃で
10分インキュベート後、細管を新鮮培養基中に移した。グループIの精巣は脆
弱であるために、この酵素消化は行わなかった。 グループIIとIIIマウスからの細管またはグループIからの全組織を培養
基入りのペトリ皿に移し、滅菌メスと針を使用して0.1−1mm片に切り分け
た。切り刻んだ組織を500xgで5分間遠心分離し、得られたペレットを1m
lの酵素ミックスに再懸濁した。酵素ミックスは、HEPES(Gibco-BRL)を
添加したD−DMEM中に作製し、1mg/mlウシ血清アルブミン(BSA)
(Sigma、胚試験済み)、1mg/mlコラゲナーゼI(Sigma)及び
5mg/mlウシ膵臓トリプシン(Sigma)及び0.1mg/mlデオキシ
リボヌクレアーゼI(DN−EP、Sigma)から構成した。細管は酵素ミッ
クス中で33℃で30分インキュベートした。インキュベーション後、ミックス
中に培地を1ml添加して、細胞を500xgで5分遠心分離した。細胞を培地
中で2回洗浄、遠心分離して再懸濁した。最終洗浄後、細胞ペレットを250μ
lの培養基中に再懸濁してカウントした。
【0058】 実施例12:サイクリンA1遺伝子のクローニングとサイクリンA1−ルシフェ
ラーゼを含むDNA作成物の構築ヒトサイクリンA1のゲノムフラグメントのクローニング。 サイクリンA1遺伝
子を、サイクリンA1 cDNAをプローブとして、胎盤から作成されたゲノム
Fix IIラムダライブラリー(Stratagene)をスクリーンすることによりク
ローンした(R.Yangら[1997])。獲得されたいくつかのファージクローン中、一
つが全てのエクソンを含み、cDNA5'末端の1.3kb上流領域を含んでい
た。遺伝子の5'末端由来の2.2kb NotI−Bam HIフラグメントを
pRS316クローニングベクター内にサブクローンした。作成物をさらにSm
a Iで消化した;さらに3フラグメントをPUC19中にサブクローンした。
サイクルシークエンス法とオートシークエンサー(ABI373)またはSequen
ase2.0(Amersham)を使用して、両方向にフラグメントの配列を決定した。イント
ロンの位置と長さは、異なるプライマーを使用して、全サイクリンA1コード領
域のPCR増幅法により測定した。引き続いて、PCR産物をpGEM−T−E
asy(Promega)を使用してサブクローンするか、またはサイクルシークエン
ス法を使用して直接に配列を決定した。〜4.5kbイントロン2の境界域はラ
ムダファージクローンの直接シークエンス法により測定した。
【0059】サイクリンA1−ルシフェラーゼDNA作成物の生成。 開始ルシフェラーゼ作成
物は、2.2kbサイクリンA1フラグメントを含むpRS316プラズミドの
PCR増幅法により生成した。5'末端のBglII部位及び3’末端のBam
HI部位を導入し、Pfu増幅フラグメントをPGL3−BasicのBglI
I部位中にクローンした。+144フラグメントを+139に開始するE2F可
能部位を含むように生成した(図3)。翻訳開始を回避するために、プライマー
のATG(ヌクレオチド+127〜+129にあるサイクリンA1の開始コドン
)をATTに突然変異した。全ての作成物について、DNAシークエンス法によ
り正しい配列を有することを確認した。5'欠失は、−1299〜+144フラ
グメントを含むKpn I/Sac I消化PGL3−BasicとErase−
a−baseキット(Promega)を使用するエクソヌクレアーゼIII処理によ
って生成した。−37フラグメントは、PGL3−Basicを含む−190〜
+144をNaeI及びHind IIIで消化して、次にこの200bpフラ
グメントをSma IとHind IIIで消化したPGL3−Basic中にク
ローニングすることにより作成した。
【0060】細胞培養と形質移入。 Hela細胞を、100U/mlペニシリンと100μg
/mLストレプトマイシンを含む10%仔ウシ胎児血清(FCS)を補充したD
MEM培地で培養した。形質移入のためには、形質移入16時間前に60mmプ
レートに5x105細胞を播種した。製造元のプロトコルに従ってlipofe
ctAMINE(Gibco、Life Technology)を使用して、形質移入を行った。2
μgルシフェラーゼレポータープラズミドを、標定用に使用された300ng
CMV−β−gal発現ベクターと共に形質移入した。48時間後に細胞を収集
して、ルシフェラーゼとβ−ガラクトシダーゼ活性について分析した。全ての実
験は二重実験とし、少なくとも3回は個別に実施した。ルシフェラーゼアッセイ
のデータは、特に表記しない限りは、3回の個別実験の平均±SEMとして表示
する。Drosophila細胞株S2をATCCより入手して10%FCS補
充Schneider昆虫細胞用培地(Gibco)中、室温で生育した。昆虫細胞
はSuperfect(Qiagen)を使用して形質移入した。要するに、5x10 5 細胞を6ウェルプレート中に播種して、Superfect−DNA混合物を
1滴ずつ添加した。1μgルシフェラーゼレポーターを100ngのSpl発現
ベクターpAC−Sp1と共に、また発現ベクターを加えないで形質移入した。
本発現ベクターはDr.E.Stanbridge(UC Irvine)のご厚意によるものである。ルシ
フェラーゼ活性は48時間後に分析した。使用したプラズミド中のウイルスプロ
モーターもまた適切な発現のためにはSp1に強く依存するために、ルシフェラ
ーゼ値はβ−ガラクトシダーゼ活性を使用して標定できなかった。全ての実験は
二重実験とし、少なくとも3回は個別に実施した。
【0061】細胞サイクル依存性プロモーター活性。 Hela細胞を上記に説明するようにl
ipofectAMINEを使用して形質移入した。形質移入後、細胞を0.1
%FCS含有培地で培養した。16時間後に、培地を交換して、説明のように本
質的に同調した。(D.Carbonaro-Hallら、Oncogene 8:1649-59[1993])。細胞を
、血清スタベーション(無血清)(0.1%)によりG1、アフィディコリン(
2μ/ml)により初期S相、またアフィディコリン処理によりS相で停止し、
収集6時間前に新鮮培地中に遊離した。細胞をノコダゾール(0.1μg/ml
)により、G2/M相で停止した。フローサイトメトリーを使用するDNA定量
法により適切な同調を確認し、実験は少なくとも3回実施した。細胞サイクル遊
離実験については、上記に説明するようにアフィディコリンを使用してHela
細胞を停止したが、細胞は異なる時点で収集した。経時的実験は、個別に2回実
施した。
【0062】RACE及びプライマーの伸長 。5'cDNA末端の急速増幅法(RACE)を5'R
ACEシステム(Gibco)を使用して実施した。本手法は、骨髄性白血病細胞株
ML1とU937のRNAを使用して、製造元のプロトコル指示に従って実施し
た。RNAは、プライマー5'-CCC TCT CAG AAC AGA CAT ACA(配列番号:14;
cDNAの+981〜+961位置)とSuperscript II逆転写酵
素(Gibco)を使用して逆転写した。遺伝子特異性cDNAは、遺伝子特異性プ
ライマー5'-CTG ATC CAG AAT AAC ACC TGA(配列番号:15;cDNAの+46
0〜+440位置)と万能5'RACE短縮アンカープライマー5'-GGC CAC GCG TCG A
CT AGT ACG GGI IGG GII GGG IIG(配列番号:16;I=イノシン)を使用して
PCR増幅した。両RNAサンプルからのPCR増幅は、約450bpの単鎖を
産生した。全PCR産物をフェノール−クロロホルム抽出し、NH4 +酢酸塩を使
用して沈降して、最後にpGEM−T−Easy中にクローンして配列決定を行
った。 プライマー伸長アッセイを、cDNA上の+95〜+76に対応する32P標識
プライマー5'-CTC CTC CCA CCA GAC AGG A(配列番号:17)を使用して、10
μgRNA(U937)の逆転写により行った。ハイブリダイゼーションは58
℃で一晩実施した。Superscript IIは、42℃で50分、逆転写
のために使用した。伸長産物は、配列反応を平行泳動しながら8%シークエンス
法用ゲル上で分離した。負対照としては、10μg t−RNAとRNAを含ま
ないサンプルを使用した。
【0063】電気泳動易動度シフトアッセイ。 Hela細胞からの核抽出物を、説明に従って
調製した(A.M.Chumakovら、Oncogene 8:3005-11[1993])。ゲル遅延実験には、
1ngのGCボックス1+2(5'-CCT GCC CCG CCC TGC CCC GCC CAG CC;配列
番号:18)またはGCボックス3+4(5'-CCT TCC CCG CCC TGC CCC GCC CGG
CCC;配列番号:19)のどちらかを含む32P標識二重鎖オリゴヌクレオチドに
5μg Hela核抽出物を加えて室温で20分インキュベートした。最終反応
は以下を含んだ:10mM Tris塩酸、pH7.5、5%グリセロール、1
mM塩化マグネシウム、0.5mM EDTA、0.5mM DTT、100m
M塩化ナトリウム及び1μgポリ(dI−dC)−ポリ(dI−dC)。競合実
験のためには、Splコンセンサス部位(5'-ATT CGA TCG GGG CGG GGC GAG C;
配列番号:20)、ゲル遅延(上記を参照)に使用したオリゴヌクレオチド、ま
たは非特異性オリゴヌクレオチド(5'-GAG ACC GGC TCG AAC GCA ATC ATG T;配
列番号:21)を含む100ng二重鎖オリゴヌクレオチドを、標識オリゴヌク
レオチドを添加する前に核抽出物を加えて室温で15分プレインキュベートした
。スーパーシフト実験には、抗Spl(Pep2、Santa Cruz)また
は抗Sp3(D20、Santa Cruz)ポリクローン抗体2−3μgに核
抽出物を加えてプレインキュベートした。反応物は0.5x TBE/4%非変
性ポリアクリルアミドゲル上に負荷して、10V/cmで2〜3時間泳動した。
ゲルを乾燥してオートラジオグラフ測定した。
【0064】部位特異的突然変異。 部位特異的突然変異をDengとNickoloffによ
る方法(W.P.DengとJ.A.Nickoloff、Analyt.Biochem.200:81-88[1992])に従って
トランスフォーマ部位特異的突然変異誘発キット(Clontech)を使用して実施し
た。端的には、所望の突然変異を含むリン酸化オリゴヌクレオチドを、単鎖PG
L3−Basicプラズミド(−190〜+144フラグメントを含む)上で、
特有Bam HI部位をEco RI部位に変更したオリゴヌクレオチド5'-AAT
CGA TAA GAA TTC GTC GAC CGA(配列番号:22)を加えてアニールした。相補
鎖が伸長して、T4ポリメラーゼとT4リガーゼを使用してアニールしたオリゴ
体から仕上がった。突然変異体プラズミドの選択は、Bam HIによる2ラウ
ンドの消化と、これに引き続く第一に修復不全株BMH71−18mutS、最
終的にDH5aへの形質転換により実行した。所望の突然変異を確認し、第二部
位突然変異を排除するために、全プロモーターフラグメントの配列決定を行った
。GCボックス1+2と3+4間の距離が短いために、オリゴヌクレオチドは、
両GCボックスを同時に突然変異するようにデザインされた。全ての4GCボッ
クスにおける突然変異は、オリゴ体1+2と3+4を同時に添加することにより
誘導された。これらの実験に使用した全てのオリゴヌクレオチドは、5'末端リ
ン酸化オリゴヌクレオチドである。以下のオリゴヌクレオチドが使用された(突
然変異塩基を下線表示する):
【0065】 GCボックス1:CCC CGC CCT GCC CCT TAC AGC CGG CCA CC(配列番号:23)、 GCボックス2:CCA ACC CTG CCC TTA CCT GCC CCG(配列番号:24)、 GCボックス3:CCC TGC CCC TTC CGG CCC GGC C(配列番号:25)、 GCボックス4:CTG CCC TTC CCT TCC CTG CCC C(配列番号:26)、 GCボックス1+2:GCC CAA CCC TGC CCT TAC CTG CCC CTT ACA GCC GGC CAC CTC
(配列番号:27)、 GCボックス3+4:CTT CCC TGC CCT TCC C TT ACC TGC CCC TTA CGG CCC GGC CC
G GCC(配列番号:28)。
【0066】 サイクリンA1プロモーターにおけるCDE可能エレメントを、以下のオリゴ
ヌクレオチド:CCA CCT CTT AAC AAG CTT CCT CCA GTG CA(配列番号:29)を
使用して突然変異した。 サイクリンA1−EGFP作成物は結局、PGL3−Basic−サイクリン
A1プロモーター作成物から、BgIII−HindIIIフラグメントを、プ
ロモーターを欠如するEGFP−1(Clontech)プラズミド中にクローンするこ
とにより作成した。
【0067】 実施例13:ヒトサイクリンA1遺伝子のゲノムクローニングと遺伝子構造 ヒトゲノムラムダファージライブラリーを、サイクリンA1のcDNAをプロ
ーブとして使用してスクリーンした。遺伝子の断片を含むいくつかのクローンが
獲得され、14.5kbインサートを有する一つのクローンは完全遺伝子を含ん
だ。遺伝子の5’末端に位置する2.2kbフラグメントをサブクローンして配
列を決定した。この2.2kbフラグメントは、第1イントロンとエクソン2の
一部を含んだ。他のエクソン−イントロン境界域を、PCR増幅法により分析し
て、全コード領域をスパンするプライマーのセットを使用して配列決定した。ヒ
トサイクリンA1遺伝子は9つのエクソンと8つのイントロンから成り、-13
kbに渡り伸長する。
【0068】 実施例14:転写開始部位の分析 転写開始部位を、プライマー伸長分析法と5'RACEを使用して決定した。
プライマー伸長は、実施例12の概説に従って実施した。RNAを含まないサン
プルとt−RNA(10μg)サンプルを負対照として使用した。図2に表示す
るプライマー伸長産物は、指示配列の適切なヌクレオチド上に星印により指摘す
る。RACE産物の開始点は、配列下の矢印により指摘する。特定の塩基におい
て開始するRACEクローン数(計25)は、矢印下に表示の数字により指摘す
る。44%(11/25)RACEクローンが開始した部位を+1と指定した。 両方法がいくつかの転写開始部位の存在を実証した。RACE反応によるPC
R産物は、−450bpの単バンドから成った。クローニング後のインサートの
シークエンス法は、RACE産物(20/25)の80%が、4塩基対区間から
開始することを明らかにし、従って優勢開始部位を+1と指定した。この部位は
翻訳開始ATCコドンの130bp上流である。プライマー伸長分析は、同一開
始部位を同定したが、少数の産物はさらに上流にも観察された(図2)。主要開
始部位は、Yangら(1997)により説明されるcDNAクローン5'末端
のRACE結果と一致する。RACEクローンもプライマー伸長分析のどちらも
、骨髄性白血病細胞において、イントロン1の第2ATG上流の転写開始部位を
指摘し得る第2転写の証拠を示さなかった(データの表示なし)。
【0069】 実施例15:5'上流領域における転写因子結合可能部位 転写開始部位の1299bp上流ゲノム配列をクローンかつ配列決定した。推
定転写開始部位の近隣にはTATAボックスは発見されなかった。配列“CCAGTT”は
コンセンサスイニシエーター配列“TCA G/T T T/C”と極めて類似しているため
に、主要転写開始部位は、イニシエーター領域(Inr)として機能しているよう
に思われる(T.W.BurkeとJ.T.Kadonaga,Genes & Developmentl:3020-31[1997]
)。DPEエレメントは、主要転写開始部位の下流には発見されなかった(id
.を参照)。転写因子のためのいくつかの結合可能部位は配列内に生じている。 図3は、ヒトサイクリンA1遺伝子の5'上流領域を表示する。異なるフラグ
メントの第1塩基が−190〜+144の転写因子の可能結合部位と同様に示さ
れている。転写開始部位は、矢印でマークし、翻訳開始コドンは太字で表記する
。E2F部位は、ヌクレオチド+139〜+144に位置し、他の可能部位は+
67に開始する。サイクリンA2プロモーターのサイクル依存性エレメントと類
似する部位が−28に発見された(J.Zwickerら、EMBO J.14:4514-22[1995])。
しかし、このエレメントはアンチセンス鎖上に位置していた。細胞サイクル遺伝
子相同領域(CHR)は発見されなかった。Myb可能部位は+2−27及び−6
6位置に開始すると予測された。しかし、c−mybタンパク質はこれら部位の
最初の2つとのみ結合した(図3と実施例23を参照)。これらのヌクレオチド
配列は、最高90%GC含有量を有する、−1000〜−700及び−550〜
−50に達する2つのCpGアイランドを含む。この領域には複数のGCボック
スが発見され、3つの二重部位として類別される6つのGCボックスはヌクレオ
チド−150〜−45間に位置する。
【0070】 実施例16:サイクリンA1プロモーターの基礎活性の機能分析 サイクリンA1プロモーターの一部分をPfu−PCR増幅して、プロモータ
ーを欠如するPGL3−Basicルシフェラーゼベクター中にクローンした。
Hela細胞中に一過性形質移入後に、プロモーター活性を分析した。図4は、
Hela細胞におけるサイクリンA1プロモーターフラグメントのトランス活性
化活性を示す。5'欠失作成物の活性をルシフェラーゼアッセイで分析した。数
値は活性化の倍率(PGL3−Basic=1)として表現した;3回の個別実
験の平均及びSEMを表示した。5'サイクリンA1上流領域由来の−1299
〜+144のヌクレオチドを含む作成物は、センス方向にクローンすると、顕著
なプロモーター活性を示した。反対方向にクローンした同一フラグメント、また
はエクソン1とイントロン1のみを含む作成物はプロモーター活性を示さなかっ
た(データの表示なし)。 エクソヌクレアーゼIII処理を使用して、5’末端からの欠失を−1299
〜+144フラグメントに作成した。一過性形質移入とこれに引き続くルシフェ
ラーゼアッセイは、−190〜+144bpのフラグメントを含む作成物中に最
も強い活性を明示した(図4)。−1299〜+144及び−190〜+144
作成物のどちらも、Cos−7(サル腎臓細胞)、MCF−7(乳ガン細胞)、
U937(骨髄性白血病細胞)、KCL22(骨髄性白血病細胞)、PC3(前
立腺ガン細胞)、Hela(子宮頚ガン細胞)及びJurkat(T細胞リンパ
腫)を含む様々な細胞株においてプロモーター活性を呈示した(データ表示なし
)。これらの哺乳類細胞株の全てにおいて、−190〜+144作成物により生
起されたルシフェラーゼ活性は、−1299〜+144作成物のそれよりも高か
った。転写開始部位の上流190bp以下を含む5’末端を有する作成物は、プ
ロモーター活性の徐々に失うことを示した。bp−37〜+144を含む作成物
の活性は、プロモーターを欠如するベクターPGL3−Basicの2倍を示す
のみであった。
【0071】 実施例17:サイクリンA1プロモーターの転写活性のためのSp1とGCボッ
クスの役割 TATA欠如プロモーターは、しばしばGCボックスに依存して転写活性化す
る(J.Luら、J.Biol.Chem.269:5391-5402[1994];M.C.Blakeら、Molec.Cell.Biol
.10:6632-41[1990])。これらの部位に結合する転写因子の主要な種類の一つは
、Sp1種タンパク質である(A.J.CoureyとR.Tjian、Cell55:887-98[1988];A.P.K
umarとA.P.Butler、Nucleic Acids Res.25:2012-19[1997];G.Hagenら、J.Biol.Ch
em.270:24989-94[1995])。サイクリンA1プロモーターは、少なくとも6つの
可能GCボックスを転写開始部位上流の190と37bpの間に含む。サイクリ
ンA1プロモーターの活性に関してのSp1の重要性は、内在性Sp1とSp3
を欠如するDrosophila細胞株S2中に形質移入された様々なプロモー
ター作成物の使用により実証されている。 図5は、Drosophila細胞株S2におけるサイクリンA1プロモータ
ーフラグメントの活性を表示する。活性度は、Sp1発現プラズミドを添加しな
いレポーター遺伝子活性と比較するPGL3−Basic活性の倍率として示す
。斑点及び無地のバーは、それぞれSp1を同時発現する場合としない場合の活
性を示す。形質移入のみの場合は、全てのサイクリンA1プロモーターフラグメ
ント活性は、空ベクター対照と明確には異ならない(図5、斑点バー)。 Sp1発現プラズミドの添加は、サイクリンA1プロモーター由来の転写を1
5〜25倍を強く活性化した(図5、無地バー)。転写活性の増加は、配列が転
写開始部位の上流−1299〜−112bp間に開始する配列を含む作成物にの
み観察された。−37〜+144間のヌクレオチド配列を含む作成物は、活性の
増加がなく、−112と−37の間のSp1結合部位は、Drosophila
細胞におけるサイクリンA1プロモーターのSp1媒介による転写活性には必須
であることを示唆した。この領域は2対に類別される4つのGCボックスを含む
(図3)。 Sp1及び他のSp1種に含まれる開始因子のこれらの部位への結合能力は、
5μg Hela核抽出物を使用して実施したゲルシフト実験により表示された
。複合体は、GCボックス1と2を含む32P末端標識オリゴヌクレオチドとGC
ボックス3+4を含む標識オリゴヌクレオチドと結合した。結合は冷却Sp1コ
ンセンサスオリゴヌクレオチド100倍過剰量をはるかに競合し、GCボックス
1+2またはGCボックス3+4のどちらかを使用する冷却オリゴヌクレオチド
100倍過剰量まで競合した。非特異性オリゴヌクレオチドの100倍過剰量は
特異的複合体結合を変更しなかった。抗Sp1抗体をいくつかのサンプルに添加
し、抗Sp3抗体は他のサンプルの反応中に使用した。抗Sp1またはSp3抗
体のいずれかを使用するこれらのスーパーシフト実験は、一つの複合体中にはS
p1、他の2つの複合体中にはSp3の存在を実証した(データ表示なし)。
【0072】 GCボックスのプロモーター活性についての関連性をさらに突然変異分析によ
り研究した。各GCボックス内に点突然変異を作成した。各突然変異体を、他の
部位を変更せずに単独で、または他の突然変異体部位と組み合わせて試験した。
ルシフェラーゼ分析は、GCボックス1または2のどちらかにおける突然変異は
プロモーター活性をそれぞれ約40%また75%低減したが、GCボックス3ま
たは4のどちらかの単一突然変異はプロモーター活性には主要な影響を有しない
ことを実証した。 図6は、プロモーター活性におけるGCボックス突然変異の効果を示す。個々
のGCボックスまたはそれらの組み合わせを突然変異し、Hela細胞内に一過
性形質移入した。ヌクレオチド−190〜+144を含む野生型作成物の活性を
100%として設定した。野生型GCボックスは、白色で示し、突然変異型GC
ボックスは黒色で表示した。GCボックス1と2両方の突然変異はプロモーター
活性を85%低減した。2つの上流GCボックス(GCボックス3または4)両
方における突然変異がプロモーター活性を約80%低減するために、その少なく
とも一つがインタクト(無傷)で存在することがサイクリンA1プロモーター活
性には必須であった。4つのGCボックス全ての突然変異は、サイクリンA1プ
ロモーターの活性を95%低減した。
【0073】 実施例18:プロモーター活性の細胞サイクル調節 サイクリン濃度は細胞サイクル中で変化し、その調節の一つのメカニズムは転
写レベルで起こる(R.Muller、Trends in Genetics 11:173-78[1995])。プロモー
ター活性の細胞サイクル調節を分析するために、一過性形質移入細胞を細胞サイ
クルの異なる相において停止して、ルシフェラーゼ活性について分析した。細胞
サイクル調節活性が全長プロモーターと、−190〜+144フラグメントを含
む作成物に観察された。 図7は、Hela細胞におけるサイクリンA1の細胞サイクル調節活性を表示
する。図7(A)においては、Hela細胞を、サイクリンA1プロモーターの
ヌクレオチド−190〜+144を含むルシフェラーゼ作成物で形質移入後に、
細胞サイクル停止した。その後、細胞のルシフェラーゼ活性を分析した。細胞サ
イクル同調はフローサイトメトリーにより確認した(データ表示なし)。表示の
バーは、少なくとも3回の個別実験の平均とSEMを示す。0hにおけるプロモ
ーター活性を1として設定した。G0/G1相においてはサイクリンA1プロモー
ター活性は比較的低かった。活性は細胞サイクルがG1/S境界域を過ぎてから
増加した。 図7(B)においては、アフィディコリン、それに引き続く一過性形質移入と
血清スタベーション(無血清)を使用してHela細胞をG1/S境界域に同調
した。細胞をブロックから遊離して、表示した時点においてルシフェラーゼと細
胞サイクル分析のために収集した。グラフは代表的実験からのデータを描写する
。一過性形質移入されたHela細胞がアフィディコリンブロックから遊離され
ると、ルシフェラーゼ値が6時間後に増加し始め、12−16時間後に最大値に
達した。 図7(C)は、経時遊離実験の異なる時点における細胞サイクル分布を表示す
る。平行線、オープン、及び無地のバーはそれぞれG1、S及びG2/M相を示す
。活性の最高レベルはSとG2/M相に観察された。細胞の百分率に対応する最
高プロモーター活性はS及びG2/M相に存在する。これは、サイクリンA1m
RNAのレベルがS相中に集積して、最高レベルがS及びG2/M相に存在する
ことを表示するデータと一致する。(Yangら、Mol.Cell.Biol.[出版中1999
])。 ヌクレオチド−1299〜+144、−190〜+144、または−190〜
+13を含むフラグメントは、これら全ての実験において同様に働いた(データ
表示なし)。 様々な点突然変異及び欠失を、サイクリンA1プロモーターによる細胞サイク
ル調節の関連領域決定の目的で、予測E2F部位と推察CDEエレメントにおい
て生成した。アフィディコリン停止細胞における野生型作成物(−1299〜+
144フラグメントを含む)の活性を1.0と設定し、他の作成物と比較した。
4つの突然変異GCボックスを含む作成物については40%のみの低減が検出さ
れた。アンチセンス方向の推定CDE内のヌクレオチドは、−19〜−24に突
然変異を起こす作成物において突然変異した。アフィディコリンによりG1/S
ブロックから遊離後にプロモーター活性は強く増加した。突然変異または5'欠
失のために4GCボックスを欠如する作成物は、S相移行時に誘導されなかった
。野生型と突然変異−19〜−24作成物の間には顕著な差異は観察されなかっ
た。
【0074】 これらの所見は細胞サイクルのG1相におけるSp1媒介による活性の抑止と
一致している。Sp3によるSp1媒介活性の選択的抑止は、いくつかのSp1
部位を含む細胞サイクル調節プロモーターに関連することが実証されている。ジ
ヒドロフォレートレダクターゼ(脱水素葉酸還元酵素)(DHFR)プロモーターは
、4つのSp1部位を含み、特にSp3により抑止される。(M.J.Birnbaumら、B
iochemistry34:16503-08[1995])。Sp3による抑止の他に、G1におけるサイ
クリンA1プロモーター抑止には多分他のメカニズムも寄与している。Sp1や
NF−Yのようなグルタミン濃度の高い活性化因子の抑止が、いくつかのプロモ
ーターについては細胞サイクル調節の優勢メカニズムであることが研究により示
されている(J.Zwickerら、(1995)Nucleic Acids Research23:3822-30[1995];J.Zw
ickeら、(1998)Nucleic Acids Research26:4926-4932[1998])。しかし、既知の
レプレッサーエレメント(CDE、CHR、E2F)のいずれもサイクリンA1
プロモーターと関連するようには思われない。 転写開始部位下流にある2つの推定E2F部位を欠失する3'欠失作成物(−
190〜+13)をPCRにより生成した。これらの2つの推定E2F部位にお
ける突然変異、逆位推定CDEエレメントにおける突然変異、及び3'欠失は、
野生型と比較する際に、識別不能な細胞サイクル調節パターンを示した(データ
表示なし)。 従って、これらのE2F部位と逆位CDEエレメントは、プロモーターの細胞
サイクル調節に役割を果たしているようには思われない。5’欠失及び突然変異
GCボックスを含む作成物の分析は、4つのGCボックスが細胞サイクル調節に
必須であることを明らかにした。突然変異GCボックスを含む作成物の活性は、
1相における野生型レポーター作成物活性の60%を示した。しかし、この作
成物の活性は、細胞がS相に移入する際に増加せず、野生型サイクリンA1プロ
モーター活性の4%のみを示した。同様なデータが4つのGCボックスを欠如す
る5'欠失から得られた。
【0075】 実施例19:サイクリンA1−EGFP DNA存在についてのトランスジェニ
ック脊椎動物のスクリーニング トランスジェニックマウスを、尾から試料採取したDNAのPCR増幅法によ
りスクリーンした。マウスをメタファン(metafane)で麻酔して、滅菌メスを使
用して尾の先から1センチ片を切除した。尾細胞診を、700μLの溶解緩衝液
(10mM Tris、pH7.5、1mM EDTA、及び10%SDS)中
で100μgプロテイナーゼ(タンパク質分解酵素)を加えて50℃で一晩イン
キュベートした。溶解物を、500μlフェノールで一度、フェノール/クロロ
ホルム(1:1)で二度抽出して、氷冷イソプロパノールで沈降した。沈殿物を
遠心分離して、ペレットを70%エタノールで一度洗浄した。ペレットを室温で
30分間空気乾燥して、次に200μL 10mM Tris、pH7.5、0
.1mM EDTAに再懸濁した。尾DNAを65℃で10分インキュベートし
、その後4℃で保存した。 各サンプルについて、尾DNA100ngを、総容量が50μLになるように
PCRカクテルミックスに添加した。各サンプル試験管について、PCRカクテ
ルは、10μL Qiagen Q緩衝液、5μL PCR緩衝液(Qiagen)、
dNTPs及び1対のEGFP−特異性プライマー、5'-TTG TCG GGC AGC AGC A
CG GGG CCG-3'(配列番号:30)及び5'-TCA CCG GGG TGG TGC CAT CCT TGG-3'
(配列番号:31)を含んだ。600bpフラグメントを増幅した。正対照は、
サイクリンA1−EGFPプラズミドDNAを含み、また負対照は、DNAを含
まなかった。
【0076】 実施例20:サイクリンA1プロモーターによりEGFPを発現する選択可能な
蛍光脊椎動物生殖細胞 DNA作成物pCyclinA1−EGFP−1を含み、サイクリンA1プロ
モーターの制御下で蛍光緑色レポーター遺伝子(EGFP)を発現するトランスジェ
ニックマウスの5系統を作成した(サイクリンA1−EGFPマウス)。蛍光緑
色タンパク質が、FITCフィルタにより雄性生殖細胞内に観察される。このマ
ウスを、プロモーターを欠如する蛍光緑色タンパク質(EGFP)発現ベクター
pEGFP−1(Clontech;図1)のBgl II/HindIII部
位中に挿入されたヌクレオチド−1299〜+144を含む、ヒトサイクリンA
1の1.4kb5'隣接領域DNAを含む作成物で形質移入した。このベクター
はまた、選択目的でカナマイシン及びネオマイシン抵抗性遺伝子と同様に、SV
40スプライスとEGFPに対するポリアデニル化シグナル3’を含んだ。pC
yclinA1−EGFP−1作成物は、インビトロではCos−7、MCF−
7、及びU937細胞で発現された。トランスジェニックマウスの作成のために
、ベクター配列を作成物から除去し、サイクリンA1プロモーター、EGFP遺
伝子、及びSV40スプライスとポリアデニル化シグナルを含むDNAフラグメ
ントを10%−40%ショ糖勾配で精製した。この勾配から1ミリリットル分画
を回収して、作成物を含む分画をスライドカセット透析膜(Pierce)内で、4リ
ットルの10mM Tris、pH7.5、0.1 mM EDTAに対して4
8時間3回交換して透析した。 精製pCyclinA1−EGFP作成物は、受精卵の前核中へのDNAのマ
イクロインジェクションによりトランスジェニックマウスを作成するために使用
した。(GordonとRuddle、1980;Hogan,Costantini and Lacy、1996)。里親母マ
ウスは38匹の仔を出産し、そのうち8匹(21%)がトランスジーンを組み込
んでいることがPCR法とサザンブロット分析により示された。創始動物のうち
2匹は繁殖不全であり、1匹は精巣中にトランスジーンの発現を示さなかった。
残りの5匹の動物は雄性生殖細胞中にEGFPを発現した。
【0077】 実施例21:トランスジェニックマウス由来精巣細胞のFACS(蛍光標示式細
胞分取器)分析 サイクリンA1−EGFPトランスジェニックマウス由来の精巣細胞懸濁液を
、Dymらによる方法を修正した酵素消化法を使用して作成した(M.Dymら、Bio
l.Reprod.52:8-9[1995])。安楽死させたトランスジェニックマウスから精巣を
切除して、被膜剥離した。精細管を酵素ミックスI:1%BSA(1mg/mL
;Sigma、胚試験済み)を含む修正HTF培地(Irvine Scientific)中の
コラゲナーゼI(1mg/mL;ウシ膵臓由来、Sigma)中で拡散して、3
7℃で10分インキュベートした。この第一酵素的工程は、ライディヒ細胞のよ
うな精細管以外の細胞を排除することを目的とする。 細管を次に1mLの酵素ミックスII:BSA(1mg/mL)を含む修正H
TF培地中のコラゲナーゼCollagenase I 1mg/mL;ウシ膵
臓由来)、トリプシンIII型(50mg/mL;Sigma)、デオキシリボ
ヌクレアーゼI(1mg/mL;Sigma)中に移して、1mLシリンジに取
り付けた滅菌針を使用して細管を小片に切り分けた。切片細管を酵素ミックスI
I中、37℃で15分インキュベートした。本インキュベーション後に、細胞を
10mL修正HTF培地で3回洗浄、2,000rpmで遠心分離して再懸濁し
た。細胞を2mL修正HTF中に再懸濁し、70μmメッシュで濾過して(Corn
ing)、FACS分析を行った。一般的には、1匹の成熟雄マウスから約3x1
7精巣細胞が収集された。細胞をトリパンブルーでその生存性について試験し
た。腎臓細胞を、第一コラゲナーゼ・インキュベーションを省略した以外は同一
方法で調製した。 トランスジェニック精巣細胞を、チャネル1上でBecton−Dicken
son細胞選別機を使用して、蛍光と横方向散乱について分析した。(緑色蛍光
タンパク質用FITC)。これらの特性に基づき、4集団が識別可能であった:
1)a EGFP陰性集団;及び異なる細胞型を反映する蛍光及び散乱特性を増
加する集団2から4。 サイクリンA1−EGFP細胞をまたPE抱合PE抗c−kit抗体で試験し
て、FACSで分析した。FACS分析は、サイクリンA1プロモーター下でE
GFPを発現する蛍光細胞集団があり、これらの細胞がc−kit陽性であるこ
とを示した。c−kit細胞のいくつかはEGFP陽性ではなかった。 図8は、切除してリン酸緩衝生理的食塩水(PBS)中でリンスし、共焦点レ
ーザースキャン顕微鏡により分析した凍結切片を示す。対照マウスの精巣細管で
は蛍光が観察されなかったが(図8a)、トランスジェニックマウスの精巣内に
は、EGFPの強く、高度な特異的発現(図8bとc)が観察された。最高EG
FP発現は、第一減数分裂中と後に観察され、精原細胞中に弱い染色が存在した
。倍率は400x(図8aとb)及び100x(図8c)である。
【0078】 実施例22:サイクリンA1プロモーターのCpGメチル化の影響 亜硫酸水素塩シークエンス法を、Clarkらにより説明される方法に多少の
修正を加えて実施した(S.J.Clarkら、High sensitivity mapping of methylate
d cytosines(メチル化シトシンの高感度マッピング)、Nucleic Acids Res 22:2
990-2997[1994])。10mg DNAを、亜硫酸水素塩/ヒドロキノン溶液で6
時間インキュベートした。入れ子PCRを実施し(プライマーについての詳細な
情報は、要望に応じて提供する)、最終PCR産物(約400bp)をゲル精製
した。このPCR産物を平滑末端クローン化して、少なくとも10クローンの配
列を決定するか、または精製PCR産物を、ヌクレオチドの33Pサイクルシーク
エンス法を使用して直接的に配列決定した。 インビトロメチル化及びルシフェラーゼアッセイ。 サイクリンA1プロモー
ター−ルシフェラーゼレポーター作成物を、製造元(New England Biolabs)の
指示に従ってSssIでインビトロメチル化した。(S.Kudo、Methyl-CpG bindin
g protein MeCP2 represses Sp1-activated transcription of the human leuko
sialingene when the promoter is methylated(メチル−CpG結合タンパク質
MeCP2は、プロモーターがメチル化されるとヒトロイコシアリン(leukosia
lin)遺伝子のSp1活性化による転写を抑止する)、Mol.Cell.Biol.18:5492-9
9[1998])。S2Drosophila細胞を、1μgメチル化または偽メチル
化ルシフェラーゼ−レポータープラズミド、100ng Sp1発現プラズミド
、及び標定目的のために使用した1μg CMV−β−ガラクトシダーゼ発現プ
ラズミドを用いて、先に説明したように形質移入した。1μgのヒトMeCP2
発現ベクターまたは空ベクター対照を同時形質移入した(S.Kudo[1998])。ルシ
フェラーゼ実験は二重実験として個別に3回反復した。ヒトMeCP2発現ベク
ターは、Dr.S.Kudo、Hokkaido Institute、Sapporo、Japanのご厚意によるものであ
る。 上記に説明するように、サイクリンA1プロモーターは、GC濃度が高く、数
百塩基対に伸長し、主要転写開始部位の50塩基対上流に終端するCpGアイラ
ンドを保有する。プロモーターの重要部分におけるCpGジヌクレオチドのメチ
ル化パターンを、亜硫酸水素シークエンス法を使用して分析すると(S.J.C
larkら、[1994])、体細胞、付着細胞株において高度なCpGメチル
化が観察されるが、サイクリンA1発現白血病細胞株ではこれは観察されない。
白血病細胞株における低メチル化は、試験した全ての細胞株において、CpGア
イランド外側にあるヌクレオチド+114のCpGが完全にメチル化されている
ことが発見されたために、明らかにCpGアイランドに限定されていた。 サイクリンA1のメチル化が遺伝子サイレンシングと関連したか否かを分析す
るために、MG63骨肉腫細胞をサイクリンA1プロモーター−EGFP作成物
で安定的に形質移入した。細胞の遷延培養(二ヶ月)後に、ネオマイシン抵抗性
細胞−すなわち、トランスジーンの安定的取り込みを示す−2集団があった。こ
の集団の一部分は比較的高いEGFP発現を維持したが(図9a、左側ピーク)
、ネオマイシン抵抗性細胞の一部はEGFP発現を経時的に喪失した(図9a、
右側ピーク)。EGFP発現及び非発現細胞集団両方をフローサイトメトリーに
より選別して、サイクリンA1プロモータートランスジーンのCpGメチル化に
ついて分析した。内在性サイクリンA1遺伝子座の分析を回避するために、特定
のプライマーをプロモーター−EGFP作成物用にデザインした。トランスジェ
ニックサイクリンA1プロモーターは、発現細胞においてはほとんど非メチル化
であったが(図9a、左側配列決定ラダー)EGFP発現を喪失した細胞はサイ
クリンA1プロモーターの強いメチル化を示した(図9a、右側配列決定ラダー
)。
【0079】 最近の研究は、メチルCpG結合タンパク質2(MeCP2)がメチル化誘導
による遺伝子サイレンシングの重要な媒介物であることを示した(P.L.Jonesら
、Methylated DNA and MeCP2 recruit histone deacetylase to repress transc
ription(メチル化DNAとMeCP2はヒストン脱アセチル化酵素を補充して転
写を抑止する)、Nature Genetics 19:187-91[1998]);X.NaNら、Transcription
al repression by the methyl CpG-binding protein MeCP2 involves a histone
deacetylase complex(メチルCpG結合タンパク質MeCP2による転写抑止
はヒストン脱アセチル化酵素複合体に関与する)、Nature393:386-89[1998];X.N
aNら、MeCP2 is a transcriptional repressor with abundant binding sites i
n genomic chromatin(MeCP2は、ゲノムクロマチン内に大量の結合部位を有する
転写レプレッサーである)、Cell 88:471-78[1997])。MeCP2は、特異的にメチ
ル化DNAと結合して、mSin3Aのようなコレプレッサーを補充して、ヒス
トンの脱アセチル化と転写活性の抑止を導く。(X.NaNら、[1997]及び[
1998])。ヒトロイコシアリン遺伝子は、そのプロモーターがメチル化され
ると、MeCP2による負の制御を受けることを示す遺伝子の一つである。(S
.Kudo[1998])。ロイコシアリン(サイクリンA1と類似)は、造血
細胞において組織特異性に発現され、その転写活性はSp1転写因子に依存する
。内在性MeCP2を発現しないS2Drosophila細胞を使用して、同
時形質移入されたMeCP2がメチル化(+)または非メチル化(−)サイクリ
ンA1プロモーターの活性を抑制するか否かについて分析した(図9)。インビ
トロメチル化サイクリンA1プロモーター作成物のDrosophila細胞中
への形質移入において、発明者らはMeCP2が存在しないと3倍抑止すること
に気が付いた。MeCP2が、メチル化サイクリンA1プロモーター作成物と同
時発現されていると、プロモーター活性は12倍抑制され、これはMeCP2が
、メチル化サイクリンA1プロモーターの転写活性化を抑制し得ることを指摘し
た(図9b)。
【0080】 哺乳類細胞株においては、メチル化がサイクリンA1遺伝子の調節に関与する
と考えられるために、染色体組み込み部位がメチル化パターンとトランスジェニ
ックサイクリンA1プロモーターの発現を決定するか否かを調べた。4系統のト
ランスジェニックマウスが、上記に説明するようにサイクリンA1プロモーター
−EGFPレポーター作成物を保有した;これは安定MG63細胞株を作成する
ために使用した核酸作成物と同一であった。トランスジェニックマウスの全ての
系統が精巣において、生体原位置ハイブリダイゼーション技法により先に測定さ
れた発現パターンと類似する高度に特異的な発現を示した(図8;C.Swee
neyら[1996])。精巣におけるEGFP発現パターンは、他の系統間で
は識別不能であった。サイクリンA1プロモーターは、染色体組み込み部位とは
独立して精巣に組織特異性発現を導き得た。トランスジーンのメチル化状態は主
として、組み込み部位におけるクロマチン構造、トランスジーンにおけるシス作
動性配列、及び/または遺伝子座調節領域の影響により決定されると考えられる
(J.R.Chailletら、Parental-specific methylation of imprinted transgene i
s established during gametogenesis and progressively changes during embr
yogenesis(刷り込みトランスジーンの親特異性メチル化は、配偶子形成中に確
立され、胚形成中に進行的に変化する)、Cell66:77-83[1991];K.Matsuoら
、An embryonic demethylation mechanism involving binding of transcriptio
n factors to replicating DNA(複製DNAへの転写因子の結合を含む脱メチル
化メカニズム)、EMBO J.17:1446−53[1998];M.Br
andeisら、Nature371:435−38[1994])。トランス
ジーン活性はまた、低メチル化と関連することが報告されている(例:Pika
artら[1998])。トランスジェニックマウス4系統の精巣におけるヒト
サイクリンA1プロモーターのメチル化状態の分析は、2系統ではプロモーター
及びトランスジーンはメチル化されていないことを示した。しかし、他の2系統
の精巣ではプロモーターとトランスジーンは大量にメチル化されていた。精巣に
おけるEGFP発現パターンは、CpGメチル化を有するまたは有しないマウス
系統間における差異は観察されなかった。これらの雄性生殖細胞においてメチル
化にも関わらずEGFPが高度に発現されたことを確認するために、精巣細胞を
脱凝集して、上記に説明するようにフローサイトメトリーで分別した。 亜硫酸水素シークエンス法は、生殖細胞内におけるサイクリンA1プロモータ
ーのメチル化が精巣におけるトランスジーンの発現を抑制しないことを確認した
。精巣におけるメチル化を有しないマウス系統の一つは、腎臓及び骨髄における
プロモーターメチル化を示したが、肝臓ではこれを示さず、精巣を除くいずれの
器官においてもトランスジーンは発現されなかった。メチル化不在における遺伝
子のサイレンシングは他の遺伝子についても同様に説明されている(例:P.M.Wa
rneckeとS.J.Clark、DNA methylation profile of the mouse skeletal alpha-ac
tin promoter during development and differentiation(マウス骨格α −アク
チンプロモーターの発生及び分化中のDNAメチル化プロフィル)、Mol.Cell B
iol.19:164-72[1999])。トランスジェニックマウスの1系統は、トランスジェ
ニックサイクリンA1プロモーターの明らかなメチル化をいずれにおいても示さ
ず、腎臓(25%)、脾臓(10%)及び骨髄(16%)における細胞のサブセ
ットにおいてEGFPを発現した。総括すると、精巣以外でのサイクリンA1プ
ロモータートランスジーンの転写活性は、プロモーターがメチル化されていない
場合のみ観察された。この所見は、サイクリンA1プロモーターのメチル化と体
細胞における転写抑止の連関を支持し得る。対照的に、サイクリンA1プロモー
ター−EGFPトランスジーンのメチル化はネズミ雄性生殖細胞におけるサイレ
ンシングを誘導しなかった。
【0081】 実施例23:c−mybによるサイクリンA1プロモーターのトランス活性化。 サイクリンA1プロモーター配列の分析は、c−mybの結合可能部位が−1
90〜+144フラグメント内にあることを示した(図3)。発現の差異をさら
に分析するために、サイクリンA1発現度の異なる4系統のヒト細胞株を選択し
た。2系統は骨髄系細胞(U937,KCL22)由来であり、他の2系統は充
実性ガン(PC3前立腺ガン、Hela子宮頚ガン)に由来した。サイクリンA
1の発現を、RT−PCRにより分析し、引き続きサザンブロッティングにより
分析した。RT−PCRに結果は、骨髄系細胞株と非骨髄系細胞株ではサイクリ
ンA1発現に差異があることを確認した。最高RNAレベルはU937において
、最低RNAレベルはHela細胞で生じた。 RNAレベルの差異がプロモーター活性と関連したか否かを分析するために、
サイクリンA1プロモーターを、いくつかの骨髄系細胞株と付着細胞株中に一過
性形質移入した(図10)。−1299〜+144及び−190〜+144の範
囲にわたるサイクリンA1プロモーター・ルシフェラーゼ作成物は、全ての4系
統細胞株において活性を示した(図10)。短いプロモーターフラグメントのレ
ポーター活性は、長いフラグメントの活性よりも常に高かった。さらに、サイク
リンA1プロモーター活性は、全ての4系統の細胞株においてSV40プロモー
ター(エンハンサーを有しない)活性よりも高かった。 サイクリンA2は、細胞サイクルにより堅固に調節されており、全てのサイク
リング哺乳類細胞においてトランス活性化されると推定されている。サイクリン
A2プロモーターの活性は、全ての4系統細胞株において検出可能であったが、
活性度はサイクリンA1プロモーター活性により反転修正された。サイクリンA
2プロモーター活性は、PC3及びHela細胞において高く、骨髄系細胞株に
おいては、サイクリンA1プロモーター活性と比較して低かった。(図10)。
骨髄系細胞におけるサイクリンA1プロモーターの優先的活性(サイクリンA2
と比較して)は、試験した両方のプロモーター作成物について明らかであった。
サイクリンA2とサイクリンA1の逆性関係はまた、急性骨髄性白血病患者から
のサンプル中のRNAレベルにも存在した(R.Yangら[1999])。し
かし、一過性形質移入によるサイクリンA1プロモーター活性は、骨髄系細胞株
に限定されてはおらず、PC3及びHela細胞にもまた存在した。これらの細
胞株を由来する組織は、極めて低いレベルのサイクリンA1を発現する。この現
象は、これらの細胞株において発現されるが、正常組織においては発現されない
転写因子が、異常なプロモーター活性を誘導すると説明し得る。広範な細胞株に
おいて発現される一つの転写因子はc−mybである。ウエスタンブロット分析
は、サイクリンA1を高レベルで発現する他の骨髄系細胞株であるML−1と同
様に全ての4系統の細胞株におけるc−mybの発現を実証した。非骨髄系細胞
株は高分子量形状のみを有するが、骨髄系細胞株は高分子量及び低分子量のどち
らの形状も有する。これはリン酸化及び非リン酸化mybタンパク質を反映する
可能性がある。
【0082】 c−mybによるプロモーターのトランス活性化を分析するために、c−my
b発現ベクター(c−mybをコードする同時形質移入プラズミドDNAを0〜
5μg)を、c−mybを発現しないCV−1細胞中に、−190〜+144サ
イクリンA1プロモーター作成物と共に形質移入した。サイクリンA1プロモー
ター活性における用量依存性増加が喚起され(図11a)、c−mybが空レポ
ータープラズミドと同時形質移入された場合には活性増加は観察されなかった(
データ表示なし)。同一実験を、より低レベルのc−mybを発現するU937 骨髄系細胞を使用して反復した。CV−1細胞における場合と同様に、U93
7においてもc−mybは明らかにプロモーターをトランス活性化し、c−my
bをコードするDNA3μgを同時形質移入した時に、最大活性が生じた(図1
1b)。これらの所見は、サイクリンA1プロモーターが骨髄系細胞株における
場合と同様に付着細胞株において、c−mybによりトランス活性化され得るこ
とを指摘する。
【0083】 c−mybが直接にサイクリンA1プロモーターを影響するか否かを分析する
ために、プロモーター領域における予測myb結合部位へのc−mybタンパク
質の結合を試験した。ゲルシフト実験を、Cos−1細胞内で発現するc−my
bタンパク質とサイクリンA1プロモーターのmyb結合部位を構成する32P標
識オリゴヌクレオチドを使用して実施した。実験は、c−mybが+2〜+5結
合部位においてサイクリンA1プロモーターと結合可能であることを示した。弱
い結合が−27〜−24にあるmyb可能部位において観察されたが、−66位
置の部位における特異的結合は検出されなかった。c−mybを発現するCos
−1細胞からの核抽出物は、空発現ベクターのみで形質移入したCos−1細胞
からの核抽出物と比較して2つの新しいバンドの出現を誘導した。+2部位への
結合の特異性は、競合オリゴヌクレオチドとc−myb特異性抗体を使用して確
認された。c−myb特異性抗体の添加は、両バンドの消去を誘導した。c−m
ybバンドと同一位置に出現する迅速に移動するバンドはmybコンセンサス結
合部位上に生成された(データー表示なし)。従って、緩やかに移動するバンド
は、その一つがc−mybであるタンパク質の複合体であり得る。−66にある
可能結合部位の使用では、c−myb結合は検出されなかった。−27の結合部
位は、c−myb発現核抽出物を加えたインキュベーション後にむしろ弱いバン
ドを示した(データー表示なし)。さらに、c−myb抗体添加後にバンドが消
失しなかったことは、c−mybがこの部位には結合しないか、またはその結合
が弱いことを意味する。プロモーターのc−myb活性化がmyb結合部位の修
飾により影響されたか否かを試験するために、異なる部位を突然変異して、その
結果生じる作成物をKCL22細胞内に形質移入した。これらの細胞は全ての細
胞株のうちで最も高いc−myb発現を呈示した。+2におけるmyb部位の抑
止は、明らかにプロモーター活性を50%減少したが、−27における突然変異
または−15におけるets部位の突然変異はプロモーター活性の低減を誘導し
なかった。+2〜+5におけるmyb部位は、転写開始部位に近接し、転写開始
部位を取り巻く塩基対はイニシエーター(Inr)として機能した可能性があっ
た。+2において観察された突然変異の影響が基本的転写機構のための結合喪失
に因ることを除外するために、発明者らは、突然変異レポーター作成物をc−m
yb発現プラズミドまたは空ベクター対照と共にCV−1細胞中に形質移入して
、この結果を野生型プロモータープラズミドを使用する形質移入と比較した。空
ベクター対照と共に形質移入すると、+2における突然変異は、プロモーター活
性のわずかな低下を誘導した。しかし、c−mybによる突然変異プラズミドの
トランス活性化は、50%以上も低下し、これはc−mybがこの部位を介して
サイクリンA1プロモーターをトランス活性化し得ることを指摘した。+2にお
ける突然変異はプロモーター活性の増加を完全には消滅しなかったために、他の
部位または間接的影響がサイクリンA1プロモーター活性化に寄与し得る。c−
mybの異なる量をサイクリンA1プロモーター作成物(−190〜+144フ
ラグメント)と共に同時発現した。空ベクターは全ての実験において、同一総D
NA量を得るために使用した。3回の個別実験の平均と標準誤差を示す。 先述の実施例は例示的であり、以下の請求が提示する本発明の実施態様の徹底
的な説明ではない。
【図面の簡単な説明】
【図1】 図1は、DNA作成物pCyclinA1−EGFP−1の地図を表示する。
【図2】 図2は、ヒトサイクリンA1遺伝子における転写開始部位を表示する。
【図3】 図3は、ヒトサイクリンA1遺伝子の5’末端上流領域を表示する。
【図4】 図4は、Hela細胞におけるサイクリンA1プロモーターフラグメントのト
ランス活性化活性度を表示する。
【図5】 図5は、Drosophila細胞株S2におけるサイクリンA1プロモータ
ーフラグメントの活性度を表示する。
【図6】 図6は、プロモーター活性におけるGCボックス(Sp1部位)突然変異の影
響を表示する。
【図7】 図7は、Hela細胞におけるサイクリンA1プロモーターの細胞サイクル制
御活性を表示する。
【図8】 図8は、ネズミ精巣組織におけるヒトサイクリンA1由来EGFPの生殖細胞
特異性発現を表示する。
【図9】 図9は、MG63細胞におけるサイクリンA1プロモーター−EGFPトラン
スジーンのスプライシングとサイクリンA1プロモーターメチル化の正の会合と
S2Drosophila細胞におけるメチル化とMeCP2によるサイクリン
A1プロモーター活性抑止を表示する。
【図10】 図10は、様々な組織由来の細胞株における、サイクリンA1プロモーターを
含む、異なるプロモーター由来のレポーター遺伝子発現の比較を表示する。
【図11】 図11は、c−mybによるサイクリンA1プロモーターのトランス活性化を
表示する。
【配列表】
【手続補正書】特許協力条約第34条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成13年1月3日(2001.1.3)
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY, DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I T,LU,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW,ML, MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,GM,K E,LS,MW,SD,SL,SZ,UG,ZW),E A(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU,TJ ,TM),AE,AL,AM,AT,AU,AZ,BA ,BB,BG,BR,BY,CA,CH,CN,CU, CZ,DE,DK,EE,ES,FI,GB,GD,G E,GH,GM,HR,HU,ID,IL,IN,IS ,JP,KE,KG,KP,KR,KZ,LC,LK, LR,LS,LT,LU,LV,MD,MG,MK,M N,MW,MX,NO,NZ,PL,PT,RO,RU ,SD,SE,SG,SI,SK,SL,TJ,TM, TR,TT,UA,UG,US,UZ,VN,YU,Z A,ZW (72)発明者 ウィンストン、ロバート イギリス国 ロンドン、デンマン ドライ ブ 11 (72)発明者 コーフラー、エイチ、フィリップ アメリカ合衆国 カリフォルニア、ロス アンジェルス、 リバーズ ロード 13141 (72)発明者 ミューラー、カーステン アメリカ合衆国 カリフォルニア、ロス アンジェルス、 サウス ウィザーリイ ドライブ 142、アパートメント 111 Fターム(参考) 4B024 AA01 AA11 AA20 BA80 CA03 CA05 DA02 EA04 FA02 GA11 HA17 4B065 AA90X AA90Y AB01 AC20 BA02 BB40 CA43 【要約の続き】 に使用し得る。キットは形質移入混合物の成分を含む。 選択可能トランスジェニック幹細胞は安定的にDNAを 組み込み、また非ヒトトランスジェニック脊椎動物は、 これらの選択可能トランスジェニック幹細胞を含む。

Claims (132)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 脊椎動物の選択可能トランスジェニック幹細胞を獲得する方
    法で、該方法が: 雄脊椎動物の配偶子に、少なくとも一つの形質移入因子、及び蛍光または発光
    タンパク質をコードするDNAに作用性があるように連鎖した幹細胞特異性プロ
    モーターの転写ユニットを含む少なくとも一つのポリヌクレオチドを含む形質移
    入混合物を、雄脊椎動物の生殖細胞または生殖細胞前駆体に到達するために効果
    的な条件下で投与すること;及び 該ポリヌクレオチドを該生殖細胞中へ取り込ませ、さらに該生殖細胞中に遊離
    すること; 該ポリヌクレオチドを該生殖細胞または前駆細胞のゲノム中に組み込むことに
    より該蛍光または発光タンパク質を発現する選択可能トランスジェニック幹細胞
    を獲得し、該幹細胞を非幹細胞から分離または選択可能とすること、 を含む、脊椎動物の選択可能トランスジェニック幹細胞を獲得する方法。
  2. 【請求項2】 該方法がさらに、該ポリヌクレオチドを該生殖細胞または前
    駆細胞ゲノム中に組み込んだ後で、該雄脊椎動物をその種の雌と育種して、その
    幹細胞の少なくとも一つにおいて該蛍光または発光タンパク質を発現するトラン
    スジェニック子孫を獲得することを含む、請求項1に記載の方法。
  3. 【請求項3】 育種が、該雌卵子のインビトロまたはインビボ受精による、
    請求項2に記載の方法。
  4. 【請求項4】 該幹細胞特異性プロモーターが、ヌクレオチド配列(配列番
    号:2)、またはその作用性のあるフラグメントまたは非ヒト相同体、またはこ
    れらいずれかの作用性のある誘導体を有するヒトサイクリンA1プロモーターで
    ある、請求項1に記載の方法。
  5. 【請求項5】 該ポリペプチドさらに、該転写ユニットに隣接する少なくと
    も一つの遮蔽エレメント(不導体要素)を含み、これにより該プロモーター配列
    のインビボメチル化が実質的に防止される、請求項1に記載の方法。
  6. 【請求項6】 該遮蔽エレメントの少なくとも一つがニワトリβ−グロビン
    遮蔽エレメントである、請求項5に記載の方法。
  7. 【請求項7】 該蛍光または発光タンパク質が、緑色蛍光タンパク質、黄色
    蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、フィコビリンタンパク質、ルシフェラー
    ゼ、またはアポエクオリンである、請求項1に記載の方法。
  8. 【請求項8】 該脊椎動物が哺乳類または鳥類である、請求項1に記載の方
    法。
  9. 【請求項9】 該脊椎動物が、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、ウサ
    ギ、スナネズミ、ハムスター、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、ブタ、厚皮動物、ウ
    マ、または家畜または海生哺乳類である、請求項1に記載の方法。
  10. 【請求項10】 該脊椎動物が、アヒル、ニワトリ、ガチョウ、オーストリ
    ッチ、エミュ、ハト、ウズラ、ホロホロチョウ、またはシチメンチョウである、
    請求項1に記載の方法。
  11. 【請求項11】 該生殖細胞または前駆細胞が、該ポリヌクレオチドが該生
    殖細胞または前駆細胞のゲノム中に組み込まれた後で、成熟性雄性配偶子に発育
    する、請求項1に記載の方法。
  12. 【請求項12】 該子孫の幹細胞がインビトロで生育する、請求項2に記載
    の方法。
  13. 【請求項13】 該幹細胞がDNAメチル化阻害物質の存在下で生育する、
    請求項12に記載の方法。
  14. 【請求項14】 請求項1に記載の方法により獲得される、選択可能トラン
    スジェニック幹細胞。
  15. 【請求項15】 該幹細胞が多能性、多分化能性、二分化能性、または単分
    化能性幹細胞である、請求項14に記載の選択可能トランスジェニック幹細胞。
  16. 【請求項16】 該幹細胞が、精原、胚性、骨原性、造血性、顆粒球形成、
    交換神経副腎、間葉、上皮性、神経性、神経冠、O−2A前駆体、脳、腎臓、膵
    臓、肝臓または心臓幹細胞である、請求項14に記載の選択可能トランスジェニ
    ック幹細胞。
  17. 【請求項17】 該幹細胞が選択可能トランスジェニック雄性生殖細胞であ
    る、請求項14に記載の選択可能トランスジェニック幹細胞。
  18. 【請求項18】 請求項14に記載の幹細胞を含むトランスジェニック非ヒ
    ト脊椎動物。
  19. 【請求項19】 該脊椎動物が非ヒト哺乳類または鳥類である、請求項18
    に記載のトランスジェニック非ヒト脊椎動物。
  20. 【請求項20】 請求項11に記載の方法により獲得された成熟性雄性配偶
    子を含む脊椎動物精液。
  21. 【請求項21】 未変性生殖細胞を有する非ヒトトランスジェニック脊椎動
    物系統を作成する方法であり、該方法が: 請求項18に記載のトランスジェニック非ヒト脊椎動物を、同種の異性動物と
    育種すること;及び 異種蛍光または発光タンパク質である幹細胞特異性発現について子孫を選択す
    ること、 を含む非ヒトトランスジェニック脊椎動物系統を作成する方法。
  22. 【請求項22】 脊椎動物の選択可能トランスジェニック幹細胞を獲得する
    方法で、該方法が: 雄脊椎動物の配偶子に、少なくとも一つの形質移入因子、及び蛍光または発光
    タンパク質をコードするDNAに作用性があるように連鎖したサイクリンA1プ
    ロモーター配列の転写ユニットを含む少なくとも一つのポリヌクレオチドを含む
    形質移入混合物を、雄脊椎動物の生殖細胞または生殖細胞前駆体に到達するため
    に効果的な条件下で投与すること;及び 該ポリヌクレオチドの該生殖細胞または前駆細胞中へ取り込ませ、さらに該生
    殖細胞または前駆細胞中に遊離すること; 該ポリヌクレオチドを該生殖細胞または前駆細胞のゲノム中に組み込むことに
    より、該蛍光または発光タンパク質を発現する選択可能トランスジェニック幹細
    胞を獲得し、該幹細胞を非幹細胞から分離または選択可能とすること、 を含む脊椎動物の選択可能トランスジェニック幹細胞を獲得する方法。
  23. 【請求項23】 該方法がさらに、該ポリヌクレオチドを該生殖細胞または
    前駆細胞中のゲノム中に組み込んだ後で、該雄脊椎動物をその種の雌と育種して
    、その幹細胞の少なくとも一つにおいて該蛍光または発光タンパク質を発現する
    トランスジェニック子孫を獲得することを含む、請求項22に記載の方法。
  24. 【請求項24】 育種が、該雌卵子のインビトロまたはインビボ受精による
    、請求項23に記載の方法。
  25. 【請求項25】 該サイクリンA1プロモーター配列が、配列番号:2また
    はその作用性のあるフラグメントまたは非ヒト相同体、またはこれらいずれかの
    作用性のある誘導体を含む、請求項22に記載の方法。
  26. 【請求項26】 該ポリヌクレオチドがさらに、該転写ユニットに隣接する
    少なくとも一つの遮蔽エレメントを含み、これにより該プロモーター配列のイン
    ビボメチル化が実質的に防止される、請求項22に記載の方法。
  27. 【請求項27】 該遮蔽エレメントの少なくとも一つがニワトリβ−グロビ
    ン遮蔽エレメントである、請求項26に記載の方法。
  28. 【請求項28】 該蛍光または発光タンパク質が、緑色蛍光タンパク質、黄
    色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、フィコビリンタンパク質、ルシフェラ
    ーゼ、またはアポエクオリンである、請求項22に記載の方法。
  29. 【請求項29】 該脊椎動物が哺乳類または鳥類である、請求項22に記載
    の方法。
  30. 【請求項30】 該脊椎動物が、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、ウ
    サギ、スナネズミ、ハムスター、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、ブタ、厚皮動物、
    ウマ、または家畜または海生哺乳類である、請求項22に記載の方法。
  31. 【請求項31】 該脊椎動物が、アヒル、ニワトリ、ガチョウ、オーストリ
    ッチ、エミュ、ハト、ウズラ、ホロホロチョウ、またはシチメンチョウである、
    請求項22に記載の方法。
  32. 【請求項32】 該生殖細胞または前駆細胞が、該ポリヌクレオチドが該生
    殖細胞または前駆細胞のゲノム中に組み込まれた後で、成熟性雄性配偶子に発育
    する、請求項22に記載の方法。
  33. 【請求項33】 該子孫の幹細胞がインビトロで生育する、請求項23に記
    載の方法。
  34. 【請求項34】該幹細胞が、DNAメチル化阻害物質の存在下で生育する、
    請求項33に記載の方法。
  35. 【請求項35】 請求項22に記載の方法により獲得される選択可能トラン
    スジェニック幹細胞。
  36. 【請求項36】 該幹細胞が多能性、多分化能性、二分化能性、または単分
    化能性幹細胞である、請求項35に記載の選択可能トランスジェニック幹細胞。
  37. 【請求項37】 該幹細胞が、精原、胚性、骨原性、造血性、顆粒球形成、
    交換神経副腎、間葉、上皮性、神経性、神経冠、O−2A前駆体、脳、腎臓、膵
    臓、肝臓または心臓幹細胞である、請求項35に記載の選択可能トランスジェニ
    ック幹細胞。
  38. 【請求項38】 該幹細胞が選択可能トランスジェニック雄性生殖細胞であ
    る、請求項35に記載の選択可能トランスジェニック幹細胞。
  39. 【請求項39】 請求項35に記載の幹細胞を含むトランスジェニック非ヒ
    ト脊椎動物。
  40. 【請求項40】 該脊椎動物が非ヒト哺乳類または鳥類である、請求項39
    に記載のトランスジェニック非ヒト脊椎動物。
  41. 【請求項41】 請求項32の方法により獲得される成熟性雄性配偶子を含
    む脊椎動物精液。
  42. 【請求項42】 未変性生殖細胞を有する非ヒトトランスジェニック脊椎動
    物系統を作成する方法であり、該方法が: 請求項39に記載の脊椎動物を、同種の異性動物と育種すること;及び異種蛍
    光または発光タンパク質である幹細胞特異性発現について子孫を選択すること、
    を含む非ヒトトランスジェニック脊椎動物系統を作成する方法。
  43. 【請求項43】 脊椎動物の選択可能トランスジェニック幹細胞獲得の方法
    で、該方法が: 雄脊椎動物の配偶子に、少なくとも一つの形質移入因子、及び蛍光または発光
    タンパク質をコードするDNAに作用性があるように連鎖したサイクリンA1プ
    ロモーター配列の転写ユニットを含む少なくとも一つのポリヌクレオチドを含む
    形質移入混合物を、雄脊椎動物の生殖細胞または生殖細胞前駆体に到達するため
    に効果的な条件下で投与すること;及び 該ポリヌクレオチドの該生殖細胞または前駆細胞中へ取り込ませ、さらに該生
    殖細胞または前駆細胞中に遊離すること; 該ポリヌクレオチドを該生殖細胞または前駆細胞のゲノム中に組み込むこと; 該生殖細胞または前駆細胞を成熟性雄性配偶子に発育させ;及び 該雄脊椎動物をその種の雌と育種して、その幹細胞の少なくとも一つにおいて
    該蛍光または発光タンパク質を発現するトランスジェニック子孫を獲得し、それ
    によって該幹細胞を非幹細胞から分離または選択可能とすること、 を含む、脊椎動物の選択可能なトランスジェニック幹細胞を獲得する方法。
  44. 【請求項44】 育種が、該雌卵子のインビトロまたはインビボ受精による
    、請求項43に記載の方法。
  45. 【請求項45】 該サイクリンA1プロモーター配列が、配列番号:2、ま
    たはその作用性のあるフラグメントまたは非ヒト相同体、またはこれらいずれか
    の作用性のある誘導体を含む、請求項43に記載の方法。
  46. 【請求項46】 該ポリヌクレオチドがさらに、該転写ユニットに隣接する
    少なくとも一つの遮蔽エレメントを含み、これにより該プロモーター配列のイン
    ビボメチル化が実質的に防止される、請求項43に記載の方法。
  47. 【請求項47】 該遮蔽エレメントの少なくとも一つがニワトリβ−グロビ
    ン遮蔽エレメントである、請求項46に記載の方法。
  48. 【請求項48】 該蛍光または発光タンパク質が、緑色蛍光タンパク質、黄
    色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、フィコビリンタンパク質、ルシフェラ
    ーゼ、またはアポエクオリンである、請求項43に記載の方法。
  49. 【請求項49】 該脊椎動物が哺乳類または鳥類である、請求項43に記載
    の方法。
  50. 【請求項50】 該脊椎動物が、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、ウ
    サギ、スナネズミ、ハムスター、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、ブタ、厚皮動物、
    ウマ、または家畜または海生哺乳類である、請求項43に記載の方法。
  51. 【請求項51】 該脊椎動物が、アヒル、ニワトリ、ガチョウ、オーストリ
    ッチ、エミュ、ハト、ウズラ、ホロホロチョウ、またはシチメンチョウである、
    請求項43に記載の方法。
  52. 【請求項52】 該トランスジェニック子孫の幹細胞がインビトロで生育す
    る、請求項43に記載の方法。
  53. 【請求項53】 該幹細胞が、DNAメチル化阻害物質の存在下で生育する
    、請求項52に記載の方法。
  54. 【請求項54】 請求項43に記載の方法により獲得される選択可能トラン
    スジェニック幹細胞。
  55. 【請求項55】 該幹細胞が多能性、多分化能性、二分化能性、または単分
    化能性幹細胞である、請求項54に記載の選択可能トランスジェニック幹細胞。
  56. 【請求項56】 該幹細胞が、精原、胚性、骨原性、造血性、顆粒球形成、
    交換神経副腎、間葉、上皮性、神経性、神経冠、O−2A前駆体、脳、腎臓、膵
    臓、肝臓または心臓幹細胞である、請求項54に記載の選択可能トランスジェニ
    ック幹細胞。
  57. 【請求項57】 該幹細胞が選択可能トランスジェニック雌性または雄性生
    殖細胞である、請求項54に記載の選択可能トランスジェニック幹細胞。
  58. 【請求項58】 請求項54に記載の幹細胞を含むトランスジェニック非ヒ
    ト脊椎動物。
  59. 【請求項59】 該脊椎動物が非ヒト哺乳類または鳥類である、請求項58
    に記載のトランスジェニック非ヒト脊椎動物。
  60. 【請求項60】 請求項43に記載の方法により獲得される成熟性雄性配偶
    子。
  61. 【請求項61】 請求項60に記載の成熟性雄性配偶子を含む脊椎動物精液
  62. 【請求項62】 未変性生殖細胞を有する非ヒトトランスジェニック脊椎動
    物系統を作成する方法であり、該方法が: 請求項58に記載の脊椎動物を、同種の異性動物と育種すること;及び異種蛍
    光または発光タンパク質である幹細胞特異性発現について子孫を選択すること、 を含む非ヒトトランスジェニック脊椎動物系統を作成する方法。
  63. 【請求項63】 選択可能幹細胞獲得の方法であり、該方法が: 脊椎動物から成熟性雄性生殖細胞を獲得すること; 該雄性生殖細胞をインビトロで、蛍光または発光タンパク質をコードするDN
    Aに作用性があるように連鎖した幹細胞特異性プロモーターの転写ユニットを含
    む少なくとも一つのポリヌクレオチドで、少なくとも一つの形質移入因子を含む
    遺伝子デリバリー混合物の存在下において、該脊椎動物のほぼ体温またはそれ以
    下の温度で形質移入に有効な期間、形質移入をすること; 該ポリヌクレオチドの該生殖細胞へ取り込ませ、さらに該生殖細胞中に遊離す
    ること;及び 該蛍光または発光タンパク質をその幹細胞の少なくとも一つにおいて発現する
    トランスジェニック子孫を獲得するために、該生殖細胞で卵子を受精し、該幹細
    胞から発光を検出することにより、該幹細胞が非幹細胞から選択可能であること
    、 を含む選択可能幹細胞獲得の方法。
  64. 【請求項64】 卵子の受精がインビトロまたはインビボ受精による、請求
    項63に記載の方法。
  65. 【請求項65】 該幹細胞特異性プロモーターがサイクリンA1プロモータ
    ーである、請求項63に記載の方法。
  66. 【請求項66】 該サイクリンA1プロモーター配列が、配列番号:2、ま
    たはその作用性のあるフラグメントまたは非ヒト相同体、またはこれらいずれか
    の作用性のある誘導体を含む、請求項63に記載の方法。
  67. 【請求項67】 該ポリヌクレオチドがさらに、該転写ユニットに隣接する
    少なくとも一つの遮蔽エレメントを含み、これにより該プロモーター配列のイン
    ビボメチル化が実質的に防止される、請求項63に記載の方法。
  68. 【請求項68】 該遮蔽エレメントの少なくとも一つがニワトリzβ−グロ
    ビン遮蔽エレメントである、請求項67に記載の方法。
  69. 【請求項69】 該蛍光または発光タンパク質が、緑色蛍光タンパク質、黄
    色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、フィコビリンタンパク質、ルシフェラ
    ーゼ、またはアポエクオリンである、請求項63に記載の方法。
  70. 【請求項70】 該脊椎動物が哺乳類または鳥類である、請求項63に記載
    の方法。
  71. 【請求項71】 該脊椎動物が、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、ウ
    サギ、スナネズミ、ハムスター、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、ブタ、厚皮動物、
    ウマ、または家畜または海生哺乳類である、請求項63に記載の方法。
  72. 【請求項72】 該脊椎動物が、アヒル、ニワトリ、ガチョウ、オーストリ
    ッチ、エミュ、ハト、ウズラ、ホロホロチョウ、またはシチメンチョウである、
    請求項63に記載の方法。
  73. 【請求項73】 該トランスジェニック子孫の幹細胞がインビトロで生育す
    る、請求項63に記載の方法。
  74. 【請求項74】 該幹細胞が、DNAメチル化阻害物質の存在下で生育する
    、請求項73に記載の方法。
  75. 【請求項75】 請求項63に記載の方法により獲得される選択可能トラン
    スジェニック幹細胞。
  76. 【請求項76】 該幹細胞が多能性、多分化能性、二分化能性、または単分
    化能性幹細胞である、請求項75に記載の選択可能トランスジェニック幹細胞。
  77. 【請求項77】 該幹細胞が、精原、胚性、骨原性、造血性、顆粒球形成、
    交換神経副腎、間葉、上皮性、神経性、神経冠、O−2A前駆体、脳、腎臓、膵
    臓、肝臓または心臓幹細胞である、請求項75に記載の選択可能トランスジェニ
    ック幹細胞。
  78. 【請求項78】 該幹細胞が選択可能トランスジェニック雌性または雄性生
    殖細胞である、請求項75に記載の選択可能トランスジェニック幹細胞。
  79. 【請求項79】 請求項75に記載の選択可能トランスジェニック幹細胞を
    含むトランスジェニック非ヒト脊椎動物。
  80. 【請求項80】 該脊椎動物が非ヒト哺乳類または鳥類である、請求項79
    に記載のトランスジェニック非ヒト脊椎動物。
  81. 【請求項81】 請求項78に記載の雄性生殖細胞を含む脊椎動物精液。
  82. 【請求項82】 未変性生殖細胞を有する非ヒトトランスジェニック脊椎動
    物系統を作成する方法であり、該方法が: 請求項79に記載の脊椎動物を、同種の異性動物と育種すること;及び異種蛍
    光または発光タンパク質である幹細胞特異性発現について子孫を選択すること、 を含む、非ヒトトランスジェニック脊椎動物系統を作成する方法。
  83. 【請求項83】 選択可能幹細胞獲得の方法であり、該方法が: 脊椎動物から成熟性雄性生殖細胞を獲得すること; 該雄性生殖細胞をインビトロで、蛍光または発光タンパク質をコードするDN
    Aに作用性があるように連鎖したサイクリンA1プロモーターの転写ユニットを
    含む少なくとも一つのポリヌクレオチドで、少なくとも一つの形質移入因子を含
    む遺伝子デリバリー混合物の存在下において、該脊椎動物のほぼ体温またはそれ
    以下の温度で形質移入に有効な期間、形質移入をすること;及び 該ポリヌクレオチドを該生殖細胞中へ取り込ませ、さらに該生殖細胞中に遊離
    すること; 該蛍光または発光タンパク質をその幹細胞の少なくとも一つにおいて発現する
    トランスジェニック子孫を獲得するために、該生殖細胞で卵子を受精し、該幹細
    胞から発光を検出することにより、該幹細胞が非幹細胞から選択可能であること
    、 を含む選択可能幹細胞獲得の方法。
  84. 【請求項84】 卵子の受精がインビトロまたはインビボ受精による、請求
    項83に記載の方法。
  85. 【請求項85】 該サイクリンA1プロモーター配列が、配列番号:2、ま
    たはその作用性のあるフラグメントまたは非ヒト相同体、またはこれらいずれか
    の作用性のある誘導体を含む、請求項83に記載の方法。
  86. 【請求項86】 該ポリヌクレオチドがさらに、該転写ユニットに隣接する
    少なくとも一つの遮蔽エレメントを含み、これにより該プロモーター配列のイン
    ビボメチル化が実質的に防止される、請求項83に記載の方法。
  87. 【請求項87】 該遮蔽エレメントの少なくとも一つがニワトリβ−グロビ
    ン遮蔽エレメントである、請求項86に記載の方法。
  88. 【請求項88】 該蛍光または発光タンパク質が、緑色蛍光タンパク質、黄
    色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、フィコビリンタンパク質、ルシフェラ
    ーゼ、またはアポエクオリンである、請求項83に記載の方法。
  89. 【請求項89】 該脊椎動物が哺乳類または鳥類である、請求項83に記載
    の方法。
  90. 【請求項90】 該脊椎動物が、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、ウ
    サギ、スナネズミ、ハムスター、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、ブタ、厚皮動物、
    ウマ、または家畜または海生哺乳類である、請求項83に記載の方法。
  91. 【請求項91】 該脊椎動物が、アヒル、ニワトリ、ガチョウ、オーストリ
    ッチ、エミュ、ハト、ウズラ、ホロホロチョウ、またはシチメンチョウである、
    請求項83に記載の方法。
  92. 【請求項92】 該トランスジェニック子孫の幹細胞がインビトロで生育す
    る、請求項83に記載の方法。
  93. 【請求項93】 該幹細胞が、DNAメチル化阻害物質の存在下で生育する
    、請求項92に記載の方法。
  94. 【請求項94】 請求項83に記載の方法により獲得される選択可能トラン
    スジェニック幹細胞。
  95. 【請求項95】 該幹細胞が多能性、多分化能性、二分化能性、または単分
    化能性幹細胞である、請求項94に記載の選択可能トランスジェニック幹細胞。
  96. 【請求項96】 該幹細胞が、精原、胚性、骨原性、造血性、顆粒球形成、
    交換神経副腎、間葉、上皮性、神経性、神経冠、O−2A前駆体、脳、腎臓、膵
    臓、肝臓または心臓幹細胞である、請求項94に記載の選択可能トランスジェニ
    ック幹細胞。
  97. 【請求項97】 該幹細胞が選択可能トランスジェニック雌性または雄性生
    殖細胞である、請求項94に記載選択可能トランスジェニック幹細胞。
  98. 【請求項98】 請求項94に記載の幹細胞を含むトランスジェニック非ヒ
    ト脊椎動物。
  99. 【請求項99】 該脊椎動物が非ヒト哺乳類または鳥類である、請求項98
    に記載のトランスジェニック非ヒト脊椎動物。
  100. 【請求項100】 請求項97に記載の雄性生殖細胞を含む脊椎動物精液。
  101. 【請求項101】 未変性生殖細胞を有する非ヒトトランスジェニック脊椎
    動物系統を作成する方法であり、該方法が: 請求項98に記載の脊椎動物を、同種の異性動物と育種すること;及び異種蛍
    光または発光タンパク質である幹細胞特異性発現について子孫を選択すること、 を含む、非ヒトトランスジェニック脊椎動物系統を作成する方法。
  102. 【請求項102】 核酸作成物であり、該作成物が、ヌクレオチド配列(配
    列番号:2)、またはその作用性のあるフラグメントまたは非ヒト相同体、また
    はそれらいずれかの作用性のある誘導体を有するサイクリンA1プロモーターを
    含む、核酸作成物。
  103. 【請求項103】 該作成物がさらに、蛍光または発光タンパク質をコード
    するヌクレオチド配列に作用性があるように連鎖した該サイクリンA1プロモー
    ターを、転写ユニットとして含む、請求項102に記載の核酸作成物。
  104. 【請求項104】 該ポリヌクレオチドがさらに、該転写ユニットに隣接す
    る少なくとも一つの遮蔽エレメントを含む、請求項103に記載の核酸作成物。
  105. 【請求項105】 該遮蔽エレメントの少なくとも一つが、ニワトリβ−グ
    ロビン遮蔽エレメントである、請求項104に記載の核酸作成物。
  106. 【請求項106】 該コードされた蛍光または発光タンパク質が、緑色蛍光
    タンパク質、黄色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、フィコビリンタンパク
    質、ルシフェラーゼ、またはアポエクオリンである、請求項103に記載の核酸
    作成物。
  107. 【請求項107】 請求項102に記載の核酸作成物を含むトランスジェニ
    ック脊椎動物細胞。
  108. 【請求項108】 請求項107に記載の細胞を含むトランスジェニック非
    ヒト脊椎動物。
  109. 【請求項109】 該脊椎動物が非ヒト哺乳類または鳥類である、請求項1
    08に記載のトランスジェニック非ヒト脊椎動物。
  110. 【請求項110】 該細胞がトランスジェニック幹細胞である、請求項10
    7に記載のトランスジェニック脊椎動物細胞。
  111. 【請求項111】 該幹細胞が、多能性、多分化性、二分化性、または単分
    化性幹細胞である、請求項110に記載のトランスジェニック幹細胞。
  112. 【請求項112】 該幹細胞が、精原、胚性、骨原性、造血性、顆粒球形成
    、交換神経副腎、間葉、上皮性、神経性、神経冠、O−2A前駆体、脳、腎臓、
    膵臓、肝臓または心臓幹細胞である、請求項110に記載のトランスジェニック
    幹細胞。
  113. 【請求項113】 インビトロで生育する、請求項110に記載のトランス
    ジェニック幹細胞。
  114. 【請求項114】 DNAメチル化阻害物質の存在下において生育する、請
    求項113に記載のトランスジェニック幹細胞。
  115. 【請求項115】 請求項110に記載のトランスジェニック幹細胞を含む
    、トランスジェニック非ヒト脊椎動物。
  116. 【請求項116】 該脊椎動物が、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、
    ウサギ、スナネズミ、ハムスター、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、ブタ、厚皮動物
    、ウマ、または家畜または海生哺乳類である、請求項115に記載のトランスジ
    ェニック非ヒト脊椎動物。
  117. 【請求項117】 該脊椎動物が、アヒル、ニワトリ、ガチョウ、オースト
    リッチ、エミュ、ハト、ウズラ、ホロホロチョウ、またはシチメンチョウである
    、請求項115に記載のトランスジェニック非ヒト脊椎動物。
  118. 【請求項118】 雄脊椎動物の生殖細胞を形質移入するためのキットであ
    り、該キットが、形質移入因子、及び蛍光または発光タンパク質をコードするヌ
    クレオチド配列を有するDNAに作用性があるように連鎖した配列番号:2を有
    するヒトサイクリンA1プロモーター配列、またはその作用性のあるフラグメン
    トまたは非ヒト相同体、またはこれらいずれかの作用性のある誘導体から成る転
    写ユニットを含むポリヌクレオチドを含み、これにより該キットを該生殖細胞を
    形質移入するために使用し得るキット。
  119. 【請求項119】 該形質移入因子が、リポソーム、ウイルスベクター、ト
    ランスフェリン−ポリリジン増強ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、
    レンチウイルスベクター、または取り込み増強DNAセグメント、またはこれら
    いずれかの混合物である、請求項118に記載のキット。
  120. 【請求項120】 該形質移入因子が、レトロウイルスベクター、アデノウ
    イルスベクター、トランスフェリン−ポリリジン増強アデノウイルスベクター、
    ヒト免疫不全症ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、Moloneyネ
    ズミ白血病ウイルス由来ベクター、ムンプス(流行性耳下腺炎)ウイルスベクタ
    ー、ポリヌクレオチドの取り込みと生殖細胞の細胞質中への遊離を促進するDN
    Aセグメントを含む、またはこれらいずれかの作用性のあるフラグメントまたは
    混合物を含む、請求項118に記載のキット。
  121. 【請求項121】 該形質移入因子が、エンドソーム溶解活性を有するアデ
    ノウイルスベクターを含み、該ポリヌクレオチドが該ベクターに作用性があるよ
    うに連鎖されている、請求項118に記載のキット。
  122. 【請求項122】 該形質移入因子が脂質形質移入因子を含む、請求項11
    8に記載のキット。
  123. 【請求項123】 該形質移入因子がさらに、雄性生殖細胞ターゲティング
    分子を含む、請求項118に記載のキット。
  124. 【請求項124】 該雄性生殖細胞ターゲティング分子が特異的に精原細胞
    をターゲットし、c−kitリガンドを含む、請求項123に記載のキット。
  125. 【請求項125】 該キットがさらに、免疫抑制剤を含む、請求項118に
    記載のキット。
  126. 【請求項126】 該免疫抑制剤が、シクロスポリンまたは副腎皮質ステロ
    イドである、請求項125に記載のキット。
  127. 【請求項127】 該キットが、所望する形質の発現をコードするヌクレオ
    チド配列を含む少なくとも一つの追加ポリヌクレオチドを含む、請求項123に
    記載のキット。
  128. 【請求項128】該雄性生殖細胞ターゲティング分子が特異的に精原細胞を
    ターゲットし、c−kitリガンドを含み;さらに該キットが所望する形質の発
    現をコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも一つの追加ポリヌクレオチド
    を含む、請求項127に記載のキット。
  129. 【請求項129】 該雄性生殖細胞ターゲティング分子が特異的に精原細胞
    をターゲットし、さらにc−kitリガンドを含み;さらに蛍光タンパク質をコ
    ードするヌクレオチド配列を有するDNAを、サイクリンA1プロモーター、c
    −kitプロモーター、B−Mybプロモーター、c−raf−1プロモーター
    、ATM(アタキシア−テランギエクタシア(ataxia-telangiectasia))プロ
    モーター、RBM(リボソーム結合モチーフ)プロモーター、DAZ(無精子症
    において欠失する)プロモーター、XRCC−1プロモーター、HSP90(熱
    ショック遺伝子)プロモーター、またはFRMI(脆弱X部位)プロモーターに
    作用性があるように連鎖する、請求項123に記載のキット。
  130. 【請求項130】 該ポリヌクレオチドがさらに、該転写ユニットに隣接す
    る少なくとも一つの遮蔽エレメントを含む、請求項118に記載のキット。
  131. 【請求項131】 該遮蔽エレメントの少なくとも一つが、ニワトリβ−グ
    ロビン遮蔽エレメントである、請求項130に記載のキット。
  132. 【請求項132】 該蛍光または発光タンパク質が、緑色蛍光タンパク質、
    黄色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、フィコビリンタンパク質、ルシフェ
    ラーゼまたはアポエクオリンである、請求項118に記載のキット。
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