JPH10304790A

JPH10304790A - トランスジェニック動物の作成方法

Info

Publication number: JPH10304790A
Application number: JP7275110A
Authority: JP
Inventors: Masahiro Sato; 正宏佐藤; Nobuhiro Tada; 昇弘多田; Shozo Ogawa; 昭三尾川; Makoto Iwatani; 誠岩谷
Original assignee: Hoechst Japan Ltd
Current assignee: Sanofi Aventis KK
Priority date: 1995-09-29
Filing date: 1995-09-29
Publication date: 1998-11-17
Also published as: AU7096796A; WO1997011597A1; AU707361B2; CA2233694A1; EP0867114A4; EP0867114A1

Abstract

(57)【要約】【構成】成熟動物雄の精巣へ直接外来性ＤＮＡとリポ
ゾームからなるＤＮＡ導入用試薬を３回以上反復して注
入し、注入後該雄を雌と自然交配に付すか、または該雄
の精巣から得られた精子を用いて人工受精または体外受
精させることにより、トランスジェニック動物を作成す
る方法に関する。【効果】上記方法により簡便かつ効率的にトランスジ
ェニック動物を作成することが可能である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、トランスジェニック動
物を簡便に且つ効率的に作成する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】今日、トランスジェニック動物の作成技
術は、様々な分野で応用されている。例えば、遺伝子発
現の組織特異性及び時期特異性の解析、遺伝子の生理機
能の解析、ヒト疾患モデルの作成とその病態解析、及
び、医学的に有用な遺伝子産物を家畜乳汁中に分泌させ
る生産系として、頗る重要となっている。その作成のた
めの最も確立された方法としては、受精卵前核への外来
性ＤＮＡのマイクロマニュピュレーター（micromanipul
ator）を用いた顕微注入法がある（Palmiter and Brins
ter, Annu Rev Genet 20: 465-499, 1986）。外来性Ｄ
ＮＡとは本明細書ではプラスミドＤＮＡを意味する。外
来性ＤＮＡは目的とするトランスジェニック動物の作成
のためには、その導入遺伝子の種類を変えることができ
る。いくつかの研究室では、この方法がルーチンに使わ
れているが、一般的に、顕微注入法によるトランスジェ
ニック動物の作成は、様々な問題を伴っている。例え
ば、外来性ＤＮＡの顕微注入には、時間がかかり、その
操作も特殊な技量を要求される。また、顕微注入のため
の高価なマイクロマニュピュレーターを用意する必要も
ある。更に、ある種の動物卵では、注入すべき核が、顕
微鏡下では見えないので、注入する前に、予め卵に遠心
処置を施す必要がある等、極めて煩雑な方法である。さ
らに目的とするトランスジェニック動物の生産の成否に
ついてもバラツキが大きい。

【０００３】一方、上記顕微注入法によらないトランス
ジェニック動物の作成方法も開発されている。例えば、
マウス精子と外来性ＤＮＡとを試験管の中で混合させた
後、この精子を未受精卵と受精させることにより、トラ
ンスジェニック動物を得る方法がある。ラビトラーノ
（Lavitrano et al., Cell 57: 717-723, 1989）は、こ
の方法による成功を報じたが、その結果には、今のとこ
ろ再現性が確認されていない（Brinster et al., Cell
59:239-241, 1989）。

【０００４】一方、バチラー（Bachiller）らは、上述
のラビトラーノ（Lavitrano）らの手法を更に進めて、
単離された精子内に外来性ＤＮＡを効率的に取り込ませ
るため、外来性ＤＮＡと脂質の一種であるリポゾーム
（liposome）との複合体をマウス精子と共に培養した
後、マウス未受精卵と受精させたが、受精卵には外来性
ＤＮＡを検出できなかった（Mol Reprod Develop 30, 1
94-200, 1991）。即ち、トランスジェニック動物作成に
は、失敗した。従って、この手法は、未だ実用性の域に
達していないが、顕微注入という特殊な操作を必要とし
ないこと、高価なマイクロマニュピュレーターを用意す
る必要もないこと、等の上述の顕微注入法にはない利点
がある。

【０００５】我々も従来より、別の視点から、精子を通
じて、外来性ＤＮＡを卵側へ伝達するという、いわゆ
る、精子を介した遺伝子導入法（sperm-mediated gene
transfer）の開発を試みて来た。例えば、カルシウムリ
ン酸（Ca-phosphate）で沈殿させた外来性ＤＮＡを注射
針で直接雄動物の精巣へ注入するという方法である（Sa
to et al., Animal Biotech 5, 19-31, 1994）。精巣に
は、精子の元となる未分化な精祖細胞（spermatogoni
a）と呼ばれる細胞から、分化の進んだ精原細胞（sperm
atocyte）、更に分化した精巣内精子（testicular sper
matozoa）等の様々なタイプの精子細胞が存在する。精
巣内精子は、精子特有の活発な動きはないが、精巣から
精巣上体へ輸送されるに伴い活発な動きを示すようにな
る。一般的に、カルシウムリン酸で沈殿させた外来性Ｄ
ＮＡは、哺乳動物由来の培養細胞等と共存させるとその
細胞へ容易に入り込む性質がある。その結果として、そ
の細胞は外来性ＤＮＡにより形質転換されることが知ら
れている（Wigler et al., Cell 11, 223-232, 197
7）。従って、このカルシウムリン酸で沈殿させた外来
性ＤＮＡを精巣へ注入すれば、精巣内精子細胞は、その
外来性ＤＮＡ導入によって、形質転換されると考えられ
る。もし、このような形質転換された精子（外来性ＤＮ
Ａを有する）が、放出され、雌動物卵管内で卵と受精す
れば、精子内に存在する外来性ＤＮＡは、受精卵の染色
体へ伝達されるものと想像される。即ち、トランスジェ
ニック受精卵の誕生である。もし、この方法によりトラ
ンスジェニック動物が作成出来れば、１０万匹以上の精
子へ一度に外来性ＤＮＡを導入出来ると共に、家畜の場
合のように、受精卵への外来性ＤＮＡの顕微注入が難し
い場合には、極めて有用な手段となり得る。また、外来
性ＤＮＡを導入された多数の精子を凍結保存しておき、
適時融解して、人工受精あるいは体外受精を施すことに
より、トランスジェニック動物を容易に得ることも可能
である。

【０００６】我々は、この仮説に基づき、上述のよう
に、カルシウムリン酸で沈殿させた外来性ＤＮＡを注射
針で直接雄マウスの精巣へ注入する実験を行った。その
結果、外来性ＤＮＡは、射精された精子内に存在するこ
とが確認出来たが、受精後の卵には、外来性ＤＮＡを検
出することは出来なかった（Sato et al., Animal Biot
ech 5, 19-31, 1994）。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、従来の顕微注入法によらないトランスジェニック動
物の簡便且つ効率的作成法を提供し、これにより、短期
間に大量のトランスジェニック動物を得ることである。
このことにより、従来、牛等の大型家畜のトランスジェ
ニック化が難しいとされてきた問題も解消出来るものと
期待される。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、上記課題
を解決するために検討を重ねた結果、カルシウムリン酸
を用いる代わりに、ＤＮＡ導入用試薬として用いられて
いるリポゾーム（liposome）を外来性ＤＮＡと混ぜ合わ
せ、これを最低３回、継続して精巣へ直接注入する。詳
しくは、リポゾームと外来性ＤＮＡを混合し、リポゾー
ム−外来性ＤＮＡ複合体を調製した後、この複合体を成
熟動物雄の精巣へ注射針を用いて直接注入し、注入され
た雄動物を、正常な発情期雌と自然交配に付することに
より、高頻度に外来性ＤＮＡを自らの染色体に含有する
トランスジェニック動物を簡便に且つ効率的に得ること
が出来、本発明を完成した。

【０００９】本発明は、非ヒト成熟脊椎動物雄の精巣へ
外来性ＤＮＡを注入し、該雄の精巣で産生された精子に
より受精させることによりトランスジェニック非ヒト脊
椎動物を作成する方法に関する。本発明は、非ヒト成熟
脊椎動物雄の精巣へ外来性ＤＮＡを注入し、該雄を雌と
自然交配に付することによりトランスジェニック非ヒト
脊椎動物を作成する方法に関する。本発明は、非ヒト成
熟脊椎動物雄の精巣へ外来性ＤＮＡを注入し、該雄の精
巣で生産された精子を用いて人工受精または体外受精に
より受精させることによりトランスジェニック非ヒト脊
椎動物を作成する方法に関する。

【００１０】本発明の方法を用いれば、小型動物のみな
らず、大型動物たとえば牛、豚、山羊等のトランスジェ
ニック動物の効率的生産へ応用できる。

【００１１】本発明は、外来性ＤＮＡを、ＤＮＡ導入用
試薬と混ぜ複合体を形成した後注入することを特徴とす
るトランスジェニック動物を作成する方法に関する。さ
らに本発明は外来性ＤＮＡをリポゾームと混ぜ複合体を
形成した後注入することを特徴とするトランスジェニッ
ク動物を作成する方法に関する。

【００１２】本発明の重要な点は、外来性ＤＮＡとＤＮ
Ａ導入試薬としてのリポゾームとを精巣内へ注入する前
に試験管内で混合させることにより、リポゾーム−外来
性ＤＮＡ複合体を作製することにある。これにより、精
巣内精子への外来性ＤＮＡの導入効率が高まると考えら
れる。リポゾームは、哺乳動物細胞へのＤＮＡ導入のた
めの試薬として市販されているもので、特に種類は問わ
ないが、例えばリポフェクチン（LIPOFECTIN^TM試薬：Ｎ
−〔１−（２,３−dioleyloxy）propyl〕−Ｎ,Ｎ,Ｎ,−
trimethylammonium chloride（ＤＯＴＭＡ）とdioleoyl
phosphatidylethanolamine （ＤＯＰＥ)とを１：１（w
/w）の割合で含むリポゾーム、GIBCO-BRL社）等を用い
ることが出来る。

【００１３】本発明はさらに成熟動物雄の精巣への直接
外来性ＤＮＡ注入が３回以上反復して行われることを特
徴とするトランスジェニック動物を作成する方法に関す
る。詳しくはＤＮＡ混合液を1/6ゲージ注射針にて、麻
酔処理された成熟雄動物の両方の精巣へ精巣を包む陰嚢
（scrotum）から、直接挿入し注入する。この注入操作
を４日置きに最低三回行う。

【００１４】本発明においては、外来性ＤＮＡを注入さ
れた雄は、最終注入後２日目に、性腺刺激ホルモンで誘
起された発情期雌動物と交配に付される。一部の雌は、
交配が確認された日（妊娠１日目と規定）に屠殺され、
子宮内精子及び卵管内に存在する受精卵（１細胞期胚）
を採取する。これらサンプルは、外来性ＤＮＡの存在を
解析するために付される。その他の雌は、妊娠中期、ま
たは、出産まで生存させる。妊娠中期では、胎児を摘出
した後、そのＤＮＡを抽出し、サザンブロッティング
（Southern blotting）（Southern, J Mol Biol 98, 50
3-517, 1975）またはＰＣＲ法（Saiki et al., Science
239, 487-491, 1988）により、外来性ＤＮＡの胎児染
色体への組み込み率を確認する。同様に、出産した個体
に対しても、生後５日目に尾部ＤＮＡを抽出し、外来性
ＤＮＡの存在を調べる。

【００１５】出産したトランスジェニック個体｛これを
初代トランスジェニック動物（founder）あるいはＦ０
と呼ぶ｝は、正常動物と交配させ、その子孫を得る。Ｆ
０の次の世代であるＦ１個体についてサザンブロッティ
ングまたはＰＣＲ法によるＤＮＡ解析を行い、Ｆ０から
Ｆ１へ外来性ＤＮＡが伝達されているかどうかを検討す
る。本発明の最重要点は、下記の通りである。

【００１６】１) リポゾーム−ＤＮＡ複合体の精巣への
複数回注入、続く雌との交配後、子宮内に放出された、
所請、射精精子（ejaculated spermatozoa）には、外来
性ＤＮＡの存在が認められた。２) リポゾーム−ＤＮＡ複合体の注入回数が増すにつ
れ、胚盤胞（blastocyst；着床直前の胚）において外来
性ＤＮＡの検出される頻度は高まる。この胚盤胞に外来
性ＤＮＡが検出された、ということは、精巣に導入され
た外来性ＤＮＡが精子を通じて卵側に伝達されたことを
裏付ける。３) 胚盤胞における外来性ＤＮＡの存在は、別方法、例
えばβ−ガラクトシダーゼ (β−galactosidase, β−g
alと略す) 活性を捉える組織化学的解析によっても証明
される。即ち、リポゾーム−ＤＮＡ複合体の注入回数が
増すにつれ、β−gal活性を示す胚盤胞の割合が高まる
ことが判明した。

【００１７】本発明は成熟脊椎動物雄がマウスであるこ
とを特徴とするトランスジェニック動物を作成する方法
に関する。従って、本発明は成熟脊椎動物雄の精巣へ直
接外来性ＤＮＡを複数回注入し、精巣内精子（testicul
ar spermatozoa）を外来性ＤＮＡで形質転換することに
より、顕微注入という従来法に比べ効率よくトランスジ
ェニック動物を作成する方法に関するものである。な
お、本法で得られたトランスジェニック動物は通常の飼
育条件、通常の餌にて飼育繁殖することができる。

【００１８】

【実施例】次に、実施例を示して本発明の効果を具体的
に説明する。尚、本発明は実施例に限定されるものでは
ない。

【００１９】実施例１導入ＤＮＡ用プラスミドpMT−neo／MT−β−galの構築マウスメタロチオネイン−Ｉプロモーター｛metallothi
onein−Ｉ promoter（MT）｝断片（約１.９kb）をpMGH
（Palmiter et al., Nature 300, 611-615, 1982）から
EcoRＩ／Bgl II消化により、切断することにより、単離
し、これをpHSG396プラスミド（約２.３kb; Takeshita
et al., Gene 71, 9-18, 1988）のEcoRＩ/Bgl II制限酵
素部位へ導入した。これをpMT／1と称する。次いで、ネ
オマイシン（neomycin）耐性遺伝子（約１.５kb; neo）
をpHSG294プラスミド（Brady etal., Gene 27, 223-23
2, 1984）よりBgl II／Hind III制限酵素消化により単
離し、pMT／1のBgl II／Hind III制限酵素部位へ挿入
し、pMT／neo−１を構築した。これにより、neoをMTの
制御下で発現させることにより、neo発現ユニット（MT
−neo）を含むベクターが構築された。発現ユニットと
は遺伝子を発現するための構築体、通常、プロモーター
＋遺伝子（ｃＤＮＡやゲノムＤＮＡ）から成る。

【００２０】一方、MTと大腸菌由来のβ−gal遺伝子
（約３kb、SV40 ポリＡ付加部位をその３′末端側に含
む）とを融合させた約５kbのβ−gal発現ユニット（MT
−β−gal）をpMT／β−gal−１（Sato et al., Mol Re
prod Develop, 34, 349-356, 1993）から単離し、これ
をpMT／neo−１のHind III制限酵素部位（MT−neoの下
流側）へ挿入した。この際、MT−β−galの３′末端側
には、NotＩリンカー（ベーリンガーマンハイム社）を
設置してある。この操作によって得られた構築体は、pM
T−neo／MT−β−gal（約１０kb; 図１参照）と称され
る。このプラスミドの中には、即ち、MT−neoとMT−β
−galが直列に連結された形のneo発現ユニット及び、β
−gal発現ユニットが含まれる。なお、導入ＤＮＡ用プ
ラスミドとしては、今回、pMT−neo／MT−β−galを用
いているが、MT−neoやMT−β−galの代わりに別の興味
ある遺伝子の発現ユニットを用いることもできる。

【００２１】実施例２成熟雄マウス精巣へのリポゾーム−外来性ＤＮＡ（pMT
−neo／MT−β−gal）複合体の注入及び注入後の精巣か
ら交配によって得られた子宮内精子（intrauterine spe
rmatozoa）並びに胚盤胞における外来性ＤＮＡの検出精巣へのリポゾーム−外来性ＤＮＡ複合体の注入によっ
て、精巣内精子が形質転換を受け、これら精子が雌との
交配によって、精巣から放出された結果、雌子宮内に存
在する精子に外来性ＤＮＡが存在するかどうか、また、
これら精子と受精した受精卵にも外来性ＤＮＡが存在す
るかどうかの検討を試みた。先ず、プラスミドpMT−neo
／MT−β−gal ＤＮＡを制限酵素NotＩで切断し、直鎖
化とする。この直鎖状ＤＮＡ約５μｇとLIPOFECTIN
^TM（GIBCO-BRL社；リン酸緩衝液ＰＢＳ, pH７.２に溶
解）とを室温下にて、１：１の割合で混合し１５分間静
置した。この方法は、製造元の指針に基づいた。この過
程で、外来性ＤＮＡ（pMT−neo／MT−β−gal）は、リ
ポゾームの脂質層に囲まれることとなり、いわゆる、リ
ポゾーム−外来性ＤＮＡ複合体が形成される。対照とし
ては、ＰＢＳでリポゾームを１：１の割合で混合したも
のを作成しコントロールとした。

【００２２】このリポゾーム−外来性ＤＮＡ複合体、ま
たは、コントロール溶液は、1/6ゲージ注射針にて吸引
され、おおよそ２０μl量を麻酔下の成熟ＩＣＲ雄マウ
ス（８〜１０週齢、日本クレア社）の両方の精巣へ向け
て、陰嚢から直接注入される。注入の過程を模式化し、
図２に表した。リポゾーム−外来性ＤＮＡ複合体注入
後、２日目に発情期ＩＣＲ雌（８〜１０週齢、日本クレ
ア社；性腺刺激ホルモンにより、発情期を誘発）と交配
し、卵管内より受精卵（１細胞期胚）及び子宮内精子を
回収した。回収された受精卵は、ヒアルロニダーゼで卵
丘細胞を除去した後、１μＭＣｄＣｌ₂（ＭＴ活性を上
げるのが目的）を含む１００μlのＭ１６培養液（Whitt
ingham, J Reprod Fert 14 (Suppl), 7-21, 1971）（パ
ラフィンで覆われる）にて３７℃、５％ＣＯ₂／９５％
空気の気相下、３日間培養することにより、胚盤胞まで
発生させた。発生した胚盤胞は、ＰＣＲ法によるＤＮＡ
解析を行い、外来性ＤＮＡの有無の検索を試みた。更
に、一部の胚盤胞については、導入遺伝子の発現を調べ
るためにβ−gal活性を組織化学的に解析した。ＰＣＲ
法によるＤＮＡ解析は、サイキらの方法（Saiki et a
l., Science 239, 487-491, 1988）に準じた。この際、
用いたプライマーセットは２種あり、一つは、β−gal
遺伝子の３′側の領域を認識するプライマーMI499β−g
al（配列表配列番号１）およびプライマーMI500β−gal
（配列表配列番号２）（Molecular Cloning-A Laborato
ry Manual, CSH, NY, 1982）、もう一つは、neo遺伝子
の５′側の領域を認識するプライマーMI1511 neo（配列
表配列番号３）およびプライマーMI1512 neo（配列表配
列番号４）（Gene 19, 327-336, 1982）を用いた。ＰＣ
Ｒ反応の条件は、９μlの反応液〔１０mM Tris−Ｃｌ,
pH８.３, １.５mM ＭｇＣｌ₂, ５０mM ＫＣｌ，０.０１
％(w/v)ゲラチン, ２００μM dATP, dTTP, dGTP, dCTP,
５０pMの各種プライマー, ０.１μlのTaqポリメラー
ゼ〕に１μl（約１μｇに相当)のゲノム（genomic）Ｄ
ＮＡもしくは、胚盤胞を含む溶液を加えたものを、３６
サイクルのＰＣＲ反応に付した。反応は、１分間９５℃
にて変性（denaturation）させた後、１分間５８℃にて
アニーリング（annealing）、更に、４分間７５℃にて
伸長反応（extension）を行った。次いで、反応液は４
％アガロースゲルによる電気泳動に付され、ゲルは、臭
化エチジュウム（ethidium bromide）染色に付された。
染色後、ゲルを紫外線照射することにより増幅された外
来性ＤＮＡの存在を確認する。

【００２３】β−galに対する組織化学的解析は、次の
ように行った。即ち、検体（胚盤胞）をＰＢＳに混和し
た１.２５％グルタールアルデヒド（glutaraldehyde）
にて５分間、室温にて固定後、０.０５％牛血清アルブ
ミン（bovine serum albumin、ＢＳＡと略す)を含むＰ
ＢＳ５０μlの小滴の中で三回洗浄した。その後、検体
を１.２mM ５−bromo−４−chloro−３−indolyl−β−
Ｄ−galactopyranoside（Ｘ−Gal）、１mM ＭｇＣｌ₂、
０.１％トリトンＸ−１００(Triton X-100）、３mM Ｋ₄
Ｆｅ〔ＣＮ〕₆・３Ｈ₂Ｏ（Ｐ３２８９；Sigma社）、３m
M Ｋ₃Ｆｅ〔ＣＮ〕₆（Ｐ３６６７；Sigma社）を含むＰ
ＢＳ（５０μl）中にて、約２４時間、３７℃下で反応
させた。この操作により、β−gal活性を示す検体の細
胞質内は青く染色される。一方、β−gal活性を示さな
い検体の細胞質は、全く染色されない。

【００２４】回収された子宮内精子はゲノムＤＮＡの単
離に付された。ゲノムＤＮＡの単離は、佐藤らの方法
（Sato et al., Animal Biotech 5, 19-31, 1994）に準
じて行った。即ち、軽い遠心で沈殿させた子宮内精子を
７００μlの溶解用バッファー（lysis buffer) 〔１５
０μｇ／ml proteinase Ｋ(No. 24568; メルク社)、０.
５mg／mlプロナーゼＥ（Pronase E）(化研科学社)、１
００mM ＮａＣｌ、０.４％ＳＤＳ、１０mM Tris buffe
r、１０mM EDTA、pH８.０〕の中に投じ、３７℃、２４
〜４８時間融解させた。１００μlフェノールをその融
解液に加え、その上清を抽出した。次いで、この上清を
８０μｇ／mlのリボヌクレアーゼＡ（RNase A）にて３
７℃、３０分間処理した後、混在するＲＮＡを分解し
た。そして、この上清から７００μlのイソプロパノー
ル（isopropanol）を処理することによってＤＮＡの沈
殿物を得た。このＤＮＡ沈殿物をギルソン社のイエロー
チップ（Gilson Yellow tip）にて拾い上げ、７０％エ
タノール（ethanol）にて洗浄後、７０μlのＴＥバッフ
ァー（１０mM Tris buffer、１mM EDTA、pH７）に融解
した。この子宮内精子由来ゲノムＤＮＡは、２種類のプ
ライマーセットを用いたＰＣＲ解析に付され、外来性Ｄ
ＮＡの有無の検索が試みられた。

【００２５】リポゾーム−外来性ＤＮＡ（pMT−neo／MT
−β−gal）または、コントロール溶液を精巣内へ注入
後、２日目に発情期雌と交配させ、受精卵を単離した。
それから、β−galを指標とした外来性ＤＮＡの発現解
析を行った（１回目の注入）。１回目のリポゾーム−外
来性ＤＮＡを注入後、４日目に再びリポゾーム−外来性
ＤＮＡまたは、コントロール溶液を精巣内へ注入した。
２回目のリポゾーム−外来性ＤＮＡ注入を終了した雄
は、注入後２日目に、発情期雌と交配させ、受精卵を単
離した後、一回目の注入と同様に、ＤＮＡ解析及び発現
解析を行った。更に、２回目のＤＮＡを精巣へ注入後、
４日目に再びリポゾーム−ＤＮＡまたは、コントロール
溶液を注入した（３回目の注入）。通常、１回目の注入
は、図２中のＡ方向から行い、陰嚢表面から約４mmの深
さまで注射針を刺し、複合体を注入する。２回目の注入
は、Ｂ方向から行い、陰嚢表面から約４mmの深さまで注
射針を刺し、複合体を注入する。３回目の注入は、Ｃ方
向から行い、陰嚢表面から約３mmの深さまで注射針を刺
し、複合体を注入する。３回目のリポゾーム−外来性Ｄ
ＮＡ注入を終了した雄は、注入後、２日目に、発情期雌
と交配させ、受精卵、子宮内精子を単離した後、ＰＣＲ
法による外来性ＤＮＡの検出及びβ−galを指標とした
外来性ＤＮＡの発現解析を行った。以上の成績は、表１
にまとめられている。また、図３には、３回目の注入
後、得られた子宮内精子に外来性ＤＮＡが検出される、
という結果が示されている。図３中、レーン１は、３回
目のリポゾーム−外来性ＤＮＡ複合体を注入後４日目に
精巣から得たゲノムＤＮＡのＰＣＲ解析の結果を示すも
ので、外来性ＤＮＡ由来の２６４bpのサイズの期待され
るバンドの生成が認められる。レーン２は、正常マウス
尾から得たゲノムＤＮＡのＰＣＲ解析の結果を示すもの
で、外来性ＤＮＡ由来の２６４bpのサイズの期待される
バンドの生成は認められない。レーン３は、精製された
外来性ＤＮＡ（pMT−neo／MT−β−gal）１０pgのＰＣ
Ｒ解析の結果を示すもので、外来性ＤＮＡ由来の２６４
bpのサイズの期待されるバンドの生成が認められる。レ
ーン４、５は、３回目のＤＮＡ−リポゾーム複合体を注
入後２日目に雌と自然交配後、翌日得られた子宮内射精
精子から得たゲノムＤＮＡのＰＣＲ解析の結果を示すも
ので、外来性ＤＮＡ由来の２６４bpのサイズの期待され
るバンドの生成が認められる。尚、レーン４、５のサン
プルは、それぞれ異なる雄から得られたものである。図
４(ａ,ｂ)には、３回目の注入後、得られた胚盤胞のβ
−gal活性に対する組織化学的解析の結果が示されてい
る。図４中、ａは、３回目のＤＮＡ−リポゾーム複合体
を注入後２日目に雌と自然交配させ、得られた胚盤胞を
X-Gal存在下、反応させたもので、ほとんどの胚が染色
されている。矢印で示した胚は、不染の胚である。ｂ
は、コントロール液を注入後２日目に雌と自然交配さ
せ、得られた胚盤胞をX-Gal存在下、反応させたもの
で、全ての胚は不染である。図４中のｃは、３回目のＤ
ＮＡ−リポゾーム複合体を注入後２日目に雌と自然交配
させ、得られた妊娠１３日目胚をX-Gal存在下、反応さ
せたもので、２匹が染色されており〔これは、Tg(トラ
ンスジェニック)と見なされる〕、１匹は不染である
〔これは、non-Tg(非トランスジェニック)と見なされ
る〕。図５には、３回目のリポゾーム−外来性ＤＮＡ複
合体を注入後、得られた胚盤胞由来ゲノムＤＮＡのＰＣ
Ｒ解析図（プライマーは、MI499β−gal、MI500β−gal
を使用）が示されている。図５中、レーン１、２は、そ
れぞれ、３回目のＤＮＡ−リポゾーム複合体を注入後２
日目に雌と自然交配させ、得られた１０個及び５個の胚
盤胞ゲノムＤＮＡのＰＣＲ解析の結果を示すもので、外
来性ＤＮＡ由来の２６４bpのサイズの期待されるバンド
の生成が認められる。レーン３は、正常マウスから得た
胚盤胞１０個のゲノムＤＮＡのPCR解析の結果を示すも
ので、外来性ＤＮＡ由来の２６４bpのサイズの期待され
るバンドの生成は、認められない。以上の結果のまとめ
を以下に示す。

【００２６】１) リポゾーム−外来性ＤＮＡ複合体の精
巣への注入及び雌との自然交配後、採取された子宮内の
射精精子には、外来性ＤＮＡの存在が認められた。２) リポゾーム−外来性ＤＮＡ複合体の精巣への注入及
び雌との自然交配後、採取された受精卵由来の胚盤胞に
外来性ＤＮＡが検出された。このことから、精子を介し
て精巣に導入された外来性ＤＮＡが卵側に伝達されたこ
とが考えられる。３) 胚盤胞における外来性ＤＮＡの存在は、β−gal活
性を指標とした組織化学的解析によっても証明された。
即ち、リポゾーム−外来性ＤＮＡ複合体の精巣への注入
回数が増すにつれ、β−gal活性を示す胚盤胞の割合が
高まることが判明した。

【００２７】実施例３成熟雄マウス精巣へのリポゾーム−外来性ＤＮＡ複合体
の注入及び注入後の雄動物から交配によって得られた胎
児（Ｆ０）における外来性ＤＮＡの検出精巣へのリポゾーム−外来性ＤＮＡ複合体の注入によっ
て、精巣内精子が形質転換を受け、これらによって受精
した受精卵由来の胎児（妊娠１３日目）にも外来性ＤＮ
Ａが存在するかどうかの試験を試みた。

【００２８】先ず、リポゾーム−外来性ＤＮＡ複合体、
または、コントロールとしての溶液を３回繰り返し注入
を受けたＩＣＲ雄マウスと発情期ＩＣＲ雌（８〜１０週
齢、性腺刺激ホルモンにより、発情期を誘発）とを交配
させた。妊娠中期に相当する妊娠１３日目に、発生した
胎児を子宮から摘出し、その尾からゲノムＤＮＡを単離
した。ゲノムＤＮＡは、実施例２に記載される方法にて
ＰＣＲ解析を行った。その結果は、表２及び図６に示さ
れる。図６中、レーン１、２、４、６、８は、外来性Ｄ
ＮＡ由来の２６４bpのサイズの期待されるバンドの生成
が認められず、非トランスジェニックと見なされる。レ
ーン３、５、７、９、１０は、外来性ＤＮＡ由来の２６
４bpのサイズの期待されるバンドの生成が認められ、ト
ランスジェニックと見なされる。レーンＣは、正常マウ
ス尾から得たゲノムＤＮＡのＰＣＲ解析の結果を示すも
ので、外来性ＤＮＡ由来の２６４bpのサイズの期待され
るバンドの生成は、認められない。結果をまとめると、
以下のようになる。

【００２９】１) ゲノムＤＮＡのＰＣＲ解析の結果、実
験群では、調べた胎児１４匹中、４匹(２８.６％)に外
来性ＤＮＡの存在が確認された。この結果は、neo遺伝
子を認識するプライマーセットを用いたＰＣＲ解析の場
合でも同様であった。２) 実験群では、調べた胎児５３匹中、１８匹(３４.０
％)にβ−gal活性を示す胎児が確認された。３) 対照群では、調べた胎児１０匹中全てにおいて、外
来性ＤＮＡは存在していなかった。また、調べた胎児２
１匹中全てにおいて、β−gal活性を示す胎児は見られ
なかった。以上から、本法によって外来性ＤＮＡを保有するトラン
スジェニック胎児が得られることが明らかとなった。

【００３０】実施例４成熟雄マウス精巣へのリポゾーム−外来性ＤＮＡ複合体
の注入及び注入後の精巣から交配によって得られたトラ
ンスジェニック個体(Ｆ０)からの次世代（Ｆ１）への外
来性ＤＮＡの伝達精巣へのリポゾーム−外来性ＤＮＡ複合体の注入によっ
て、精巣内精子が形質転換を受け、これら精子が雌との
交配によって、精巣から放出された結果、これら精子と
受精した受精卵由来の個体にも外来性ＤＮＡが存在し、
且つ、その外来性ＤＮＡを持つ個体が、その子孫へ外来
性ＤＮＡを伝達し得るかどうかの試験を試みた。

【００３１】先ず、リポゾーム−外来性ＤＮＡ複合体、
または、コントロールとしての溶液を３回繰り返し注入
を受けたＩＣＲ雄マウスと発情期ＩＣＲ雌マウス（８〜
１０週齢、性腺刺激ホルモンにより、発情期を誘発）と
を最終注入後２日目に交配させた。出産後、得られたマ
ウス（Ｆ０）は生後４週目にその尾の一部を採取し、Ｐ
ＣＲ法によるＤＮＡ解析、または、サザンブロッティン
グ解析を行なった。尾からのゲノムＤＮＡの単離及びＰ
ＣＲによるＤＮＡ解析等の方法は、実施例２に記載され
る方法に従った。サザンブロッティング解析は、基本的
に佐藤らの方法（Mol Reprod Develop 34, 349-356, 19
93）に準じた。即ち、１０μｇのゲノムＤＮＡをEcoRＩ
及びBamHＩ制限酵素を用い消化後これを０.８％アガロ
ースゲルにて展開した後、ゲル内のＤＮＡをナイロン膜
フィルター（Gene Screen Plus^TM；NEN社, 米国）へア
ルカリ条件下、転写させた。このナイロン膜フィルター
は、次いで、放射性アイソトープである³²Ｐで標識され
たプローブ（β−gal遺伝子、または、neo遺伝子の一部
のＤＮＡ断片）を用いたサザンハイブリダイゼーション
（Southern hybridization）に付された。サザンハイブ
リダイゼーション後、フィルターは、０.１ X SSC／０.
０１％ＳＤＳにて１回、５６℃、３０分間洗浄に付され
た後、コダック社XAR-5フィルムに感光された。その結
果は、表２に示される。実験群では、調べた出産個体、
即ち、Ｆ０個体４７匹中、２５匹（５３.２％）に外来
性ＤＮＡの存在が確認された。このことは、精巣へ注入
された外来性ＤＮＡが精子を介し、出産後の個体まで伝
達されたことを物語る。

【００３２】次に、これらＦ０トランスジェニック動物
から得られた次世代子孫(Ｆ１)において、外来性ＤＮＡ
が検出されるかどうかを検討した。Ｆ１マウスの尾の一
部から実施例２に示される方法にてそのゲノムＤＮＡを
抽出した。このゲノムＤＮＡは、実施例２及び実施例４
に示される方法にてＰＣＲ解析、または、サザンブロッ
ティング解析に付された。その結果の一部は、図７に示
される。図７中、Ｆ０、Ｆ１とも生後４週目の尾のゲノ
ムＤＮＡをＰＣＲ法による解析を行い、外来性ＤＮＡを
持つ個体を調べた。Ｆ０子孫のＤＮＡ解析の結果では、
Ｆ０子孫の約４０％が、トランスジェニックであること
が判明した。また、Ｆ１子孫のＤＮＡ解析の結果では、
Ｆ１子孫の約３８％が、トランスジェニックであること
が判明した。この割合は、まさに、メンデル方式で外来
性ＤＮＡが子孫に伝達されたことを物語るもので、従来
の方法（顕微注入法）で得られたトランスジェニック個
体の外来性遺伝子の伝達様式と全く同じである。

【００３３】

【表１】

【００３４】

【表２】

【００３５】

【発明の効果】本発明の方法により、従来の煩雑な顕微
注入法と比較して簡便に且つ効率的にトランスジェニッ
ク動物を作成するものである。さらに、この方法を用い
て、小型動物のみならず、大型の動物、たとえば牛等の
トランスジェニック動物の効率的生産へ応用できる。

【００３６】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：２１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸起源：なし生物名：なし株名：なし配列の特徴：β−gal遺伝子の４０３５から４０５５番
目のヌクレオチドを認識するプライマー、MI499β−gal
と名付けた。配列： GACCGCTGGG ATCTGCCATT G

【００３７】配列番号：２配列の長さ：２１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸起源：なし生物名：なし株名：なし配列の特徴：β−gal遺伝子の４２７８から４２９８番
目のヌクレオチドを認識するプライマー、MI500β−gal
と名付けた。配列： TACTGACGGG CTCCAGGAGT C

【００３８】配列番号：３配列の長さ：２６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸起源：なし生物名：なし株名：なし配列の特徴：neo遺伝子の１７５２から１７６７番目の
ヌクレオチドを認識するプライマー、MI1511 neoと名付
けた。配列： TCGTGGCTGG CCACGACGGG CGTTCC

【００３９】配列番号：４配列の長さ：１６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸起源：なし生物名：なし株名：なし配列の特徴：neo遺伝子の１８４６から１８６１番目の
ヌクレオチドを認識するプライマー、MI1512 neoと名付
けた。配列： GACAGGAGAT CCTGCC

【図面の簡単な説明】

【図１】導入ＤＮＡ用プラスミドpMT−neo／MT−β−ga
lのプラスミドマップを表した図である。マウスメタロ
チオネイン−Ｉプロモーター(ＭＴ)のＤＮＡ配列、ネオ
マイシン耐性遺伝子(neo)をコードするＤＮＡ配列およ
び繰り返されたマウスメタロチオネイン−Ｉプロモータ
ーのＤＮＡ配列の下流にβ−ガラクトシダーゼ遺伝子
（β−gal）をコードするＤＮＡ配列を有する。図中の記号の説明：Ｈ, Hind III制限酵素部位；Ｅ, Ec
oRＩ制限酵素部位；Ｋ, KpnＩ制限酵素部位；Xh, XhoＩ
制限酵素部位；Ｂ, BamHＩ制限酵素部位；Xb,XbaＩ制限
酵素部位；Ｓ, SalＩ制限酵素部位；Ｐ, PstＩ制限酵素
部位；B II, Bgl II制限酵素部位；Sm, SmaＩ制限酵素
部位；ATG, 蛋白翻訳開始部位；SV pA,SV40ポリ付加シ
グナル部位;Ｎ, NotＩ制限酵素部位；Cm^R, クロラムフ
ェニコール耐性遺伝子；ori, 複製開始点を示す。

【図２】リポゾーム−外来性ＤＮＡ複合体を成熟ＩＣＲ
雄マウスの両方の精巣へ向けて直接注入する操作の模式
図である。

【図３】３回目のリポゾーム−外来性ＤＮＡ複合体を注
入後、得られた子宮内射精精子由来ゲノムＤＮＡのＰＣ
Ｒ解析の写真（プライマーは、MI499β−gal、MI500β
−galを使用）である。ｍは、分子量マーカーを示す。

【図４】図(ａ)および(ｂ)は３回目のリポゾーム−外来
性ＤＮＡ複合体を注入後、得られた胚盤胞の顕微鏡写真
であり、図(ｃ)は妊娠１３日目胚の写真である。(ａ)に
おける矢印はβ−gal酵素活性を示さない胚盤胞、(ｃ)
におけるＴｇは外来性ＤＮＡを有し、β−gal酵素活性
を示す胚、そしてＮｏｎ−Ｔｇはβ−gal酵素活性を示
さない非トランスジェニック胚である。

【図５】３回目のリポゾーム−外来性ＤＮＡ複合体を注
入後、得られた胚盤胞由来ゲノムＤＮＡのＰＣＲ解析の
写真（プライマーは、MI499β−gal、MI500β−galを使
用）である。ｍは、分子量マーカーを示す。

【図６】３回目のリポゾーム−外来性ＤＮＡ複合体を注
入後、得られた妊娠１３日目の胎児の尾由来ゲノムＤＮ
ＡのＰＣＲ解析の写真（プライマーは、MI499β−gal、
MI500β−galを使用）である。Ｍは、分子量マーカーを
示す。

【図７】精巣へ外来性ＤＮＡの注入を受けた雄No.７由
来の子孫の系図である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】非ヒト成熟脊椎動物雄の精巣へ外来性Ｄ
ＮＡを注入し、該雄の精巣で産生された精子により受精
させることを特徴とするトランスジェニック非ヒト脊椎
動物の作成方法。
【請求項２】非ヒト成熟脊椎動物雄の精巣へ外来性Ｄ
ＮＡを注入し、該雄を雌と自然交配に付することを特徴
とするトランスジェニック非ヒト脊椎動物の作成方法。
【請求項３】非ヒト成熟脊椎動物雄の精巣へ外来性Ｄ
ＮＡを注入し、該雄の精巣で産生された精子を用いて人
工受精または体外受精により受精させることを特徴とす
るトランスジェニック非ヒト脊椎動物の作成方法。
【請求項４】外来性ＤＮＡを、ＤＮＡ導入用試薬と混
ぜ複合体を形成した後注入することを特徴とする請求項
１〜３のいずれかの項の方法。
【請求項５】ＤＮＡ導入用試薬が、リポゾームである
ことを特徴とする請求項４の方法。
【請求項６】注入が３回以上反復して行われることを
特徴とする、請求項１〜５のいずれかの項の方法。
【請求項７】成熟脊椎動物がマウスであることを特徴
とする請求項１〜６のいずれかの項の方法。