JP7263005B2 - 基底状態の多能性の誘導及び維持に関するプラットフォーム - Google Patents
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Description
この出願は、2015年10月16日出願の米国仮出願第62/242,842号の優先権を主張し、その開示はその全体を参照することによりここに組み入れられたものとする。
多能性細胞の産生及び維持に関する既存の方法は、自然分化を含まず高分解能(high-resolution)/高クローン性の単一細胞継代及び大規模増殖に従う、フットプリントフリーである多能性細胞の均質培養を未だ実現できていない。基底状態の多能性細胞は、これら課題を解決する品質及び特性を与えることができる。しかしながら、今日まで、フィーダーフリー条件下での基底状態の多能性細胞を、高い生産性で産生する、信頼性があり頑健である方法は、存在してない。すなわち、この技術分野における既存の方法は、産業グレード又は臨床グレードの多能性細胞の産生に好適ではあり得なかった。本明細書で意図する発明では、基底状態の多能性の特性における又は該特性を伴う、安定な多能性細胞の頑健な産生の必要性に対処し、産業的使用及び臨床的使用に好適である安定な多能性細胞の作製における課題を解決する。
B.定義
C.細胞
D.自然分化を低減させ、基底状態の多能性を誘導する培養プラットフォーム
1.TGFΒ受容体/ALK5阻害剤
2.WNT経路アゴニスト
3.GSK-3β阻害剤
4.ERK/MEK阻害剤
5.ROCK阻害剤
7.培養基質
8.フィーダーフリー環境
9.解離
10.富化及び枯渇の戦略
E.細胞初期化培養プラットフォーム
F.多能性細胞の特性決定
G.ポリヌクレオチド
H.ポリペプチド
表2:例示的な2A部位は以下の配列を含む:
実施例1-IPSCを長期間維持及び増殖する培地プラットフォームの特定
概説
結果
実施例2-単一細胞の継代及びFFフォーマットでの導入遺伝子フリーのhiPSC作製に関するプラットフォーム
概説
結果
実施例3-FMM中での導入遺伝子フリーのhiPSC株の長期間継代及び増殖
概説
結果
実施例4-最小限の遺伝子によるエピソーマル初期化を可能とする多段階培地プラットフォーム
概説
結果
実施例5-基底状態の多能性を支持するFMMプラットフォーム
概説
結果
実施例6-小分子培養におけるhiPSCの維持
実施例7-小分子培養における最小限の遺伝子による初期化
表3:初期化因子の組み合わせ及び多能生表現型の発現
実施例8-初期化因子及びそれらの化学量論の影響
実施例9-実験手順
表4:FAM標識TaqManプローブ
表5:導入遺伝子特異的プライマーセット
実施例10-初期化因子として用いるために特定した遺伝子
表6-初期化因子として用いるために特定した遺伝子
表7:iPSC初期化に関する化学量論的因子を含有するコンストラクト
実施例11-センダイウイルスベクターを介した、化学量論的因子を用いた初期化
Claims (29)
- ヒト非多能性細胞を初期化する管内における方法であって、
複数のポリペプチド又は該複数のポリペプチドをコードする1つ若しくは複数のポリヌクレオチドを前記非多能性細胞に導入し、それによって前記非多能性細胞を多能性細胞に初期化することを含み、前記複数のポリペプチドは、
(i)OCT4、KLF、SOX2、CDH1、ZIC3、及びHESRG;
(ii)OCT4、KLF、SOX2、L1TD1、DPPA4及びTDGF1;又は
(iii)OCT4、ECAT1、UTF1、NANOG、ESRRB、CDH1、ZIC3、HESRG、L1TD1、DPPA4及びTDGF1
を含む、方法。 - 1つ又は複数のポリヌクレオチドが1つ又は複数のコンストラクトに含まれ、それぞれのコンストラクトは同じ又は異なる数のポリヌクレオチド又は/及びポリヌクレオチドの組み合わせを含み、前記1つ又は複数のコンストラクトはベクターにより非多能性細胞に導入される、請求項1記載の方法。
- 前記コンストラクトが、以下のうちの少なくとも一つを含む、請求項2に記載の方法。
(i)少なくとも2つのOCT4のコピーをコードするポリヌクレオチド、
(ii)OCT4をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド及びNANOGをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド、
(iii)OCT4をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド及びESRRBをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド、
(iv)ECAT1をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド及びUTF1をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド、
(v)OCT4をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド、ESRRBをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド、及びNANOGをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド、
(vi)CDH1、ZIC3及びHESRGのうちの少なくとも1つをコードするポリヌクレオチド、
(vii)L1TD1、DPPA4及びTDGF1のうちの少なくとも1つをコードするポリヌクレオチド、並びに、
(viii)DNMT3Bをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド。 - 前記複数のポリペプチドを前記非多能性細胞に導入することは、
(a)以下のうちの少なくとも一つを含む、少なくとも一つのコンストラクトを導入すること、
(i)少なくとも2つのOCT4のコピーをコードするポリヌクレオチド、
(ii)OCT4をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド及びNANOGをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド、
(iii)OCT4をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド及びESRRBをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド、
(iv)ECAT1をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド及びUTF1をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド、又は、
(v)OCT4をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド、ESRRBをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド及びNANOGをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド、並びに、
(b)以下のポリヌクレオチドのうち少なくとも一つを含む、1つまたは複数の追加のコンストラクトを導入すること、
(i)CDH1をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド、ZIC3をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド及びHESRGをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド、
(ii)L1TD1をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド、DPPA4をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド及びTDGF1をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド、又は、
(iii)DNMT3Bをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド、
を含む、請求項3記載の方法。 - 前記コンストラクトは、以下のうちの少なくとも1つを含む、請求項4記載の方法。
(a)Nanog、ESRRB及びOCT4のうちの1つ又は複数をコードする1つ又は複数のポリヌクレオチド、
(b)ECAT1及びUTF1のうちの一方又は両方をコードする1つ又は複数のポリヌクレオチド、
(c)L1TD1、DPPA4及びTDGF1のうちの1つ又は複数をコードする1つ又は複数のポリヌクレオチド、又は、
(d)CDH1、ZIC3及びHESRGのうちの1つ又は複数をコードする1つ又は複数のポリヌクレオチド。 - 少なくとも1つのコンストラクトが、OCT4をコードする1つ又は複数のポリヌクレオチドを含み、少なくとも別のコンストラクトが、以下のうちの少なくとも1つを含む、請求項4に記載の方法。
(a)L1TD1、DPPA4及びTDGF1をコードするポリヌクレオチド、並びに、(b)CDH1、ZIC3、及びHESRGをコードするポリヌクレオチド。 - 前記ベクターが、レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、エピソーム、プラスミド、ミニサークル、発現カセットを有するベクターシステム、又はmRNAである、請求項2に記載の方法。
- 前記ベクターはセンダイウイルスである、請求項7記載の方法。
- コンストラクトに含まれる前記1つ又は複数のポリヌクレオチドは、少なくとも1つの自己切断ポリペプチドにより連結されている、請求項2記載の方法。
- 前記方法が、以下の特徴のうち少なくとも一つを有する、請求項1記載の方法。
(i)前記非多能性細胞が多能性細胞に初期化される、
(ii)前記非多能性細胞が体細胞である、又は
(iii)前記複数のポリペプチドがSOX2、KLF4、及びc-Mycのうちの少なくとも一つを除外する。 - ヒト非多能性細胞を多能性細胞に初期化するための組成物であって、複数のポリペプチド又は該複数のポリペプチドをコードする1つ若しくは複数の外因性ポリヌクレオチドを含み、前記複数のポリペプチドは、
(i)OCT4、KLF、SOX2、CDH1、ZIC3、及びHESRG;
(ii)OCT4、KLF、SOX2、L1TD1、DPPA4及びTDGF1;又は
(iii)OCT4、ECAT1、UTF1、NANOG、ESRRB、CDH1、ZIC3、HESRG、L1TD1、DPPA4及びTDGF1
を含む、組成物。 - ヒト非多能性細胞の集団を更に含む、請求項11に記載の組成物。
- 1つ又は複数の外因性ポリヌクレオチドが1つ又は複数のコンストラクトに含まれ、それぞれのコンストラクトが同じ又は異なる数の同一ポリペプチド及び/又はポリペプチドの組み合わせを含む、請求項11に記載の組成物。
- 前記1つ又は複数のコンストラクトが、以下のうちの少なくとも一つを含む、請求項13に記載の組成物。
(i)OCT4、ESRRB、ECAT1、UTF1、及びNANOGからなる群から選択される1つ又は複数のポリペプチドをコードする1つ又は複数のポリヌクレオチド、並びに、CDH1、ZIC3、HESRG、L1TD1、DPPA4、TDGF1、及びDNMT3Bからなる群から選択される2つ又は複数のポリペプチドをコードする1つ又は複数の追加のポリヌクレオチド、
(ii)OCT4をコードする少なくとも2つのポリヌクレオチド、
(iii)OCT4をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド及びNANOGをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド、
(iv)OCT4をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド及びESRRBをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド、
(v)ECAT1をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド及びUTF1をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド、並びに/又は、
(vi)OCT4をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド、ESRRBをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド、及びNANOGをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド、
ここで、前記1つ又は複数のコンストラクトは、1つ又は複数のSOX2、KLF、及びc-Mycをコードするポリヌクレオチドを場合により含まない。 - 前記一つ又は複数のコンストラクトが、以下のうちの少なくとも一つを含む、請求項13記載の組成物。
(i)CDH1をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド、ZIC3をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド、及びHESRGをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド、
(ii)L1TD1をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド、DPPA4をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド、及びTDGF1をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド、並びに/又は、
(iii)DNMT3Bをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド。 - 前記1つ又は複数のコンストラクトが以下のうちの少なくとも一つを含む、請求項13記載の組成物。
(i)少なくとも2つのOCT4のコピーをコードするポリヌクレオチド、
(ii)OCT4をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド及びNANOGをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド、
(iii)OCT4をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド及びESRRBをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド、
(iv)ECAT1をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド及びUTF1をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド、
(v)OCT4をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド、ESRRBをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド、及びNANOGをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド、
(vi)CDH1、ZIC3、及びHESRGのうちの少なくとも1つをコードするポリヌクレオチド、
(vii)L1TD1、DPPA4、及びTDGF1のうちの少なくとも1つをコードするポリヌクレオチド、又は、
(viii)DNMT3Bをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド。 - 前記1つ又は複数のコンストラクトが、グループ(a)からの少なくとも1つの組み合わせ及びグループ(b)からの少なくとも1つの組み合わせを含む、請求項13記載の組成物。
(a):
(i)少なくとも2つのOCT4のコピーをコードするポリヌクレオチド、
(ii)OCT4をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド及びNANOGをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド、
(iii)OCT4をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド及びESRRBをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド、
(iv)ECAT1をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド及びUTF1をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド、又は、
(v)OCT4をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド、ESRRBをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド、及びNANOGをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド、並びに、
(b):
(i)CDH1をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド、ZIC3をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド、及びHESRGをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド、
(ii)L1TD1をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド、DPPA4をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド、及びTDGF1をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド、又は、
(iii)DNMT3Bをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド。 - ヒト非多能性細胞が以下の組み合わせのうちの少なくとも1つを含む、請求項12に記載の組成物。
(a)1つ又は複数のNanog、ESRRB及びOCT4をコードするポリヌクレオチド、
(b)1つ又は複数のECAT1及びUTF1をコードするポリヌクレオチド、
(c)1つ又は複数のL1TD1、DPPA4及びTDGF1をコードするポリヌクレオチド、又は、
(d)1つ又は複数のCDH1、ZIC3、及びHESRGをコードするポリヌクレオチド。 - 前記1つ又は複数のコンストラクトが、レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、エピソーム、プラスミド、ミニサークル、又はmRNAによって前記非多能性細胞に導入され得る、請求項13に記載の組成物。
- ヒト非多能性細胞を初期化する管内における方法であって、
(a)OCT4、NANOG、ECAT1、UTF1、ESRRB、CDH1、ZIC3、HESRG、L1TD1、DPPA4及びTDGF1をコードする1つ又は複数のポリヌクレオチドを、前記非多能性細胞に導入すること、
(b)OCT4、KLF、SOX2、L1TD1、DPPA4及びTDGF1をコードする1つ又は複数のポリヌクレオチドを、前記非多能性細胞に導入すること、又は
(c)OCT4、KLF、SOX2、CDH1、ZIC3、及びHESRGをコードする1つ又は複数のポリヌクレオチドを、前記非多能性細胞に導入すること、
それによって多能性細胞を取得すること、を含む、方法。 - 前記1つ又は複数のポリヌクレオチドは、1つ又は複数のコンストラクトに含まれ、並びに、前記コンストラクトは同じ又は異なる数の同一ポリペプチド及び/又はポリペプチドの組み合わせを含む、請求項20記載の方法。
- 1つ又は複数のコンストラクトが、以下のうちの少なくとも1つを含む、請求項21に記載の方法。
(a)Nanog、ESRRB、及びOCT4のうちの1つ又は複数をコードするポリヌクレオチド、
(b)ECAT1及びUTF1のうちの1つ又は複数をコードするポリヌクレオチド、
(c)L1TD1、DPPA4、及びTDGF1のうちの1つ又は複数をコードするポリヌクレオチド、又は、
(d)CDH1、ZIC3、及びHESRGのうちの1つ又は複数をコードするポリヌクレオチド。 - 少なくとも1つのコンストラクトが、OCT4をコードする少なくとも2つのポリヌクレオチドを含む、請求項21記載の方法。
- 前記1つ又は複数のコンストラクトが、レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、エピソーム、プラスミド、ミニサークル、又はmRNAによって前記非多能性細胞に導入される、請求項21記載の方法。
- ベクターコンストラクトがセンダイウイルスによって導入される、請求項24記載の方法。
- (a)及び(b)の前記1つ又は複数のポリヌクレオチドは、1つ又は複数のベクターによって導入され、並びに、同一又は異なるポリペプチドをコードする、請求項25記載の方法。
- 前記1つ又は複数のベクターが、以下を含むコンストラクトを含む、請求項26記載の方法。
(a)1つ又は複数のNanog、ESRRB、及びOCT4をコードするポリヌクレオチド、
(b)1つ又は複数のECAT1及びUTF1をコードするポリヌクレオチド、
(c)1つ又は複数のL1TD1、DPPA4及びTDGF1をコードするポリヌクレオチド、又は、
(d)1つ又は複数のCDH1、ZIC3及びHESRGをコードするポリヌクレオチド。 - 請求項25記載の方法であって、前記1つ又は複数のポリヌクレオチドは、OCT4をコードする1つ又は複数のポリヌクレオチドを含むベクター、及び、以下のうちの少なくとも一つのベクター、を介して導入され、前記ベクターはセンダイウイルスによって運ばれる、方法。
(a)Nanog、ESRRB、及びOCT4をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、
(b)ECAT1及びUTF1をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、
(c)L1TD1、DPPA4、及びTDGF1をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、並びに、
(d)CDH1、ZIC3、及びHESRGをコードするポリヌクレオチドを含むベクター。 - 前記1又は複数のコンストラクトが、
(i)L1TD1、DPPA4、及びTDGF1をコードするポリヌクレオチド、又は、
(ii)CDH1、ZIC3、及びHESRGをコードするポリヌクレオチド、
を含む、請求項22記載の方法。
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