KR20180055918A - 기저 상태 다능성의 유도 및 유지를 위한 플랫폼 - Google Patents

기저 상태 다능성의 유도 및 유지를 위한 플랫폼 Download PDF

Info

Publication number
KR20180055918A
KR20180055918A KR1020187013539A KR20187013539A KR20180055918A KR 20180055918 A KR20180055918 A KR 20180055918A KR 1020187013539 A KR1020187013539 A KR 1020187013539A KR 20187013539 A KR20187013539 A KR 20187013539A KR 20180055918 A KR20180055918 A KR 20180055918A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
polynucleotide
oct4
cells
vector
coding polynucleotide
Prior art date
Application number
KR1020187013539A
Other languages
English (en)
Inventor
바흐람 발라메르
메건 로빈슨
람지 아부자라우
Original Assignee
페이트 세러퓨틱스, 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 페이트 세러퓨틱스, 인코포레이티드 filed Critical 페이트 세러퓨틱스, 인코포레이티드
Publication of KR20180055918A publication Critical patent/KR20180055918A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C12N2015/8518—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic expressing industrially exogenous proteins, e.g. for pharmaceutical use, human insulin, blood factors, immunoglobulins, pseudoparticles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C12N2015/8527—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic for producing animal models, e.g. for tests or diseases
    • C12N2015/8536—Animal models for genetic diseases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C12N2501/602—Sox-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C12N2501/603—Oct-3/4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C12N2501/605—Nanog
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C12N2501/606—Transcription factors c-Myc
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18611—Respirovirus, e.g. Bovine, human parainfluenza 1,3
    • C12N2760/18641—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18811—Sendai virus
    • C12N2760/18841—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2760/18843—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/108—Plasmid DNA episomal vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/002—Vectors comprising a special translation-regulating system controllable or inducible
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/007—Vectors comprising a special translation-regulating system cell or tissue specific

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 발명은 다능성 세포를 제조하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 기저 상태 다능성을 가지는 다능성 세포를 제조하기 위한 개선된 배양 플랫폼을 제공한다.

Description

기저 상태 다능성의 유도 및 유지를 위한 플랫폼
관련 출원
본 출원은 2015년 10월 16일자로 출원된 미국 가출원 제62/242,842호(이의 개시내용은 참고로 그 전문이 본 명세서에 포함됨)에 대한 우선권을 주장한다.
기술분야
본 발명은 일반적으로 다능성 세포를 제조하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 기저 상태 다능성을 가지는 다능성 세포를 제조하기 위한 개선된 배양 플랫폼에 관한 것이다.
오늘날의 다능성 줄기 세포 기반 질환 및 독성학 스크리닝 노력 및 미래의 자발요법/동종이계 다능성 줄기 세포 치료는 인간 배아 줄기 세포(human embryonic stem cell: hESC) 및 인간 유도된 다능성 줄기 세포(human induced pluripotent stem cell: hiPSC)의 세포주 생성 및 증식의 탄탄하고 재현 가능한 방법을 요할 것이다. hiPSC는 게놈 통합 레트로바이러스 및 렌티바이러스 발현 시스템을 통해 도입된 다능성 인자의 이소성 발현에 의해 생성되었다. 가능한 한 많은 통합 사건을 제거하고자 하는 노력은 다수의 재프로그래밍 인자에 대해 소분자 저해제를 치환하는 것을 포함하였다. 그러나, 비통합적 방법은 비효율적이고 노동 집약적인 것으로 입증되거나, 재프로그래밍 체세포에서 비효과적이어서, 추가의 재프로그래밍 인자를 요한다(Lee et al., 2013).
다능성 줄기 세포의 배양과 연관된 몇몇 도전 과제는 산업 및 임상 분야에서 사용하기에 적합한 세포의 유도를 허용하도록 해결되어야 한다. 대부분의 흔히 사용되는 종래의 배양 시스템에서, hESC 및 hiPSC는 피더 세포(feeder cell)에서 유지되는 한편, 광범위한 세포사 및 게놈 비정상을 막도록 덩어리로서 계대배양된다(Thomson et al., 1998). 피더 비함유(feeder-free: FF) 환경에서 단일 세포 배양 hiPSC에 대한 불능은 잠재적인 산업 규모의 스크리닝 또는 세포 치료 분야를 심하게 제한한다(Skottman et al., 2007; Valamehr et al., 2011). 또한, hiPSC를 개선하는 것에 대한 최근의 노력은 전이유전자 비함유가 아닌 렌티바이러스 유래 hiPSC에 초점을 두어서, 이러한 노력의 치료학적 관련성을 제한한다.
게놈 변형이 부족한, 성공적으로 해결되어야 할 또 다른 도전 과제는 배양에서의 인간 다능성 줄기 세포의 자발적인 분화에 대한 경향이다(Pera and Trounson, 2004; Sathananthan and Trounson, 2005; Valamehr et al., 2011).
hESC 및 hiPSC의 연구가 기재되어 있지만, 다능성 유전자의 계속적인 이소성 발현은 게놈 변형된 인간 다능성 줄기 세포를 생성시키는 기저 상태를 유지시키는 데 필요하고(Hanna et al., 2010a), 이는 산업 및 임상 등급의 다능성 세포에 부적합하다.
또한, 재프로그래밍은 오래 대기하는 비효율적이고 확률론적인 과정인 것으로 공지되어 있다. 발현의 시기 및 수준, 및 더 중요하게는 재프로그래밍 인자의 화학량론은 재프로그래밍의 완료를 결정한다. 화학량론은 반응 과정에서의 시약 사이의 정량적 관계를 측정하고, 소정의 반응에서 필요한 시약의 양 및 때때로 제조된 생성물의 양을 결정하도록 이용된다. 화학량론은 시약의 화학량론적 양 또는 시약의 화학량론적 비율 둘 다를 고려하고, 이것은 반응을 완료하기 위한 시약(들)의 최적 양 또는 비율이다.
재프로그래밍 인자 화학량론은 재프로그래밍의 초기 단계에서뿐만 아니라, 후기 단계에서 중요하고, 중간 세포 단계의 확립 및 성숙에 중요하다. 상이한 재프로그래밍 인자 화학량론은 재프로그래밍 효율에 영향을 미치고, 또한 다양한 품질을 가지는 iPSC를 제조할 수 있다. 예를 들어, 재프로그래밍 인자의 화학량론은 iPSC의 다능성, 자기 재생, 동종성 및 자발적인 분화의 수준을 포함하는 생물학적 특성에 영향을 미친다.
따라서, 높은 품질의 인간 다능성 세포 생성물의, 고속의 효율적이고, 전이유전자 또는 발자국이 없는 생성을 위한 조성물 및 방법의 부재는 이에 따라 미래의 다능성 줄기 세포 치료의 개발 및 상용화에서 실질적인 난관인 것으로 오래전에 입증되었다.
본 발명은 일반적으로 비다능성 세포를 재프로그래밍하기 위한 개선된 방법 및 조성물을 제공한다. 일반적인 방법은 비다능성 세포로 (ⅰ) OCT4, SOX2, NANOG, KLF4, LIN28, C-MYC, ECAT1, UTF1, ESRRB, SV40LT, HESRG, CDH1, TDGF1, DPPA4, DNMT3B, ZIC3 및 L1TD1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 폴리펩타이드를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드; 및 (ⅱ) HESRG, CDH1, TDGF1, DPPA4, DNMT3B, ZIC3 및 L1TD1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 폴리펩타이드를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 단계를 포함한다. 대안적으로, 일반적인 방법은 비다능성 세포를 (ⅰ) OCT4, SOX2, NANOG, KLF4, LIN28, C-MYC, ECAT1, UTF1, ESRRB, SV40LT, HESRG, CDH1, TDGF1, DPPA4, DNMT3B, ZIC3 및 L1TD1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 폴리펩타이드; 및 (ⅱ) HESRG, CDH1, TDGF1, DPPA4, DNMT3B, ZIC3 및 L1TD1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 폴리펩타이드와 접촉시키는 단계를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 비다능성 세포는 체세포이다. 몇몇 실시형태에서, 비다능성 세포는 성체 줄기 세포를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 비다능성 세포는 다능성 세포로 재프로그래밍된다. 다른 실시형태에서, 비다능성 세포는 유도된 다능성 줄기 세포(iPSC)로 재프로그래밍된다. 더욱 다른 실시형태에서, iPSC는 재프로그래밍된 성체 줄기 세포를 포함한다.
상기 방법의 일 실시형태에서, 상기 중 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 벡터에 의해 도입된다. 몇몇 실시형태에서, 각각의 벡터에서의 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 동일한 또는 상이한 폴리펩타이드를 코딩한다. 몇몇 실시형태에서, 하나 이상의 벡터는 레트로바이러스, 센다이 바이러스, 아데노바이러스, 에피솜, 미니-서클, 발현 카세트를 가지는 벡터 시스템 또는 mRNA에 의해 도입된다. 특정한 실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 렌티바이러스 벡터에 의해 도입된다. 몇몇 실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 에피솜 벡터에 의해 도입된다. 다양한 다른 실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 센다이 바이러스 벡터에 의해 도입된다.
상기 방법의 몇몇 실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 동일한 작제물 또는 벡터에 포함된다. 몇몇 다른 실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 상이한 벡터에 포함된다. 일 실시형태에서, 2개 이상의 폴리뉴클레오타이드는 폴리시스트론성 벡터(polycistronic vector)에 포함되고, 인접한 폴리뉴클레오타이드의 하나 이상의 쌍은, 자가 절단 펩타이드 또는 IRES에 의해 연결되는 것으로 개시된 것처럼, 재프로그래밍 인자를 코딩한다. 더욱 또 다른 실시형태에서, 폴리시스트론성 벡터는 OCT4 폴리펩타이드를 각각 코딩하는 2개 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 특정한 실시형태에서, OCT4 폴리펩타이드를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드는 선택 가능한 마커에 연결된다.
또 다른 실시형태에서, 상기 방법은 비다능성 세포로 적어도 2개의 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 하나의 벡터를 도입하는 단계를 포함한다. 더욱 또 다른 실시형태에서, 상기 방법은 비다능성 세포로 적어도 2개의 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제1 벡터 및 적어도 1개의 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제2 벡터를 도입하는 단계를 포함한다. 상기 방법의 몇몇 실시형태에서, 제1 벡터 및 제2 벡터 중 적어도 하나는 폴리시스트론성이다. 상기 방법의 몇몇 다른 실시형태에서, 제1 벡터 및 제2 벡터의 둘 다는 폴리시스트론성이다. 더욱 몇몇 다른 실시형태에서, 비다능성 세포로 적어도 2개의 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제1 벡터 및 적어도 1개의 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제2 벡터를 도입하는 단계를 포함하는 방법은, 비다능성 세포로 적어도 1개의 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제3의 또는 이것 초과의 벡터를 도입하는 단계를 추가로 포함한다. 여전히 몇몇 다른 실시형태에서, 비다능성 세포로 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 하나 이상의 벡터를 도입하는 단계를 포함하는 방법은, SOX2, NANOG, KLF4, LIN28, C-MYC, ECAT1, UTF1, ESRRB, SV40LT, HESRG, CDH1, TDGF1, DPPA4, DNMT3B, ZIC3 및 L1TD1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 단계를 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 비다능성 세포로 도입되는 재프로그래밍 인자는 SOX2 및/또는 KLF4를 포함하지 않는다. 몇몇 실시형태에서, SOX2 및/또는 KLF4는 비다능성 세포로 도입되는 재프로그래밍 인자로부터 배제된다. 몇몇 실시형태에서, SOX2 및/또는 KLF4는 NANOG, LIN28, C-MYC, ECAT1, UTF1, ESRRB, SV40LT, HESRG, CDH1, TDGF1, DPPA4, DNMT3B, ZIC3 및 L1TD1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드의 존재 하에 불필요하다. 더욱 몇몇 다른 실시형태에서, 2개 이상의 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제1 벡터를 도입하는 단계를 포함하는 방법은, NANOG, LIN28, C-MYC, ECAT1, UTF1, ESRRB, SV40LT, HESRG, CDH1, TDGF1, DPPA4, DNMT3B, ZIC3 및 L1TD1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 적어도 하나의 벡터를 도입하는 단계를 추가로 포함한다. 더욱 몇몇 다른 실시형태에서, 상기 방법은 비다능성 세포로 하나 이상의 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 하나 이상의 벡터를 도입하는 단계를 포함하고, HESRG, CDH1, TDGF1, DPPA4, DNMT3B, ZIC3 및 L1TD1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 하나 이상의 벡터를 도입하는 단계를 추가로 포함한다.
일반적인 방법의 일 실시형태에서, 비다능성 세포로 OCT4, SOX2, NANOG, KLF4, LIN28, C-MYC, ECAT1, UTF1, ESRRB 및 SV40LT로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 단계를 포함하는 방법은, HESRG, CDH1, TDGF1, DPPA4, DNMT3B, ZIC3 및 L1TD1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 단계를 추가로 포함한다.
소정의 실시형태에서, 일반적인 방법에 따라 비다능성 세포를 재프로그래밍하는 것은 비다능성 세포로 OCT4, NANOG, ECAT1, UTF1 및 ESRRB로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 비다능성 세포를 재프로그래밍하는 것은 비다능성 세포로 Oct4, NANOG, ECAT1, UTF1 및/또는 ESRRB를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 및 HESRG, CDH1, TDGF1, DPPA4, DNMT3B, ZIC3 및 L1TD1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 단계를 포함한다.
소정의 실시형태에서, 일반적인 방법에 따라 비다능성 세포를 재프로그래밍하는 것은 비다능성 세포로 OCT4, ECAT1 및 UTF1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 비다능성 세포를 재프로그래밍하는 것은 비다능성 세포로 Oct4, ECAT1 및/또는 UTF1를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 및 HESRG, CDH1, TDGF1, DPPA4, DNMT3B, ZIC3 및 L1TD1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 단계를 포함한다.
그러므로, 본 출원의 일반적인 방법에 따라, 몇몇 실시형태에서, 비다능성 세포로 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 것은 하나 이상의 벡터를 도입하는 단계를 포함하고, 각각의 벡터는 (ⅰ) 적어도 2개의 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅱ) 적어도 1개의 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 NANOG 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅲ) 적어도 1개의 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 ESRRB 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅳ) 적어도 1개의 ECAT1 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 UTF1 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅴ) 적어도 1개의 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드, 적어도 1개의 ESRRB 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 NANOG 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅵ) 적어도 1개의 CDH1, ZIC3 및 HESRG 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅶ) 적어도 1개의 L1TD1, DPPA4 및 TDGF1 코딩 폴리뉴클레오타이드; 또는 (ⅷ) 적어도 1개의 DNMT3B 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 몇몇 특정한 실시형태에서, 비다능성 세포로 도입되는 재프로그래밍 인자는 SOX2, KLF4 및 c-Myc 중 하나 이상을 포함하지 않는다. 몇몇 실시형태에서, 비다능성 세포로 하나 이상의 상기 벡터를 도입하는 단계를 포함하는 비다능성 세포를 재프로그래밍하는 방법은, 비다능성 세포로 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 코딩하는 하나 이상의 추가의 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 단계를 추가로 포함한다. 몇몇 다른 특정한 실시형태에서, SOX2, c-Myc 및/또는 KLF4는 비다능성 세포로 도입되는 재프로그래밍 인자로부터 배제된다. 훨씬 다른 특정한 실시형태에서, SOX2, c-Myc 및/또는 KLF4는 NANOG, LIN28, C-MYC, ECAT1, UTF1, ESRRB, SV40LT, HESRG, CDH1, TDGF1, DPPA4, DNMT3B, ZIC3 및 L1TD1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드의 존재 하에 불필요하다.
몇몇 다른 실시형태에서, 비다능성 세포로 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 것은 (a) 하나 이상의 벡터를 도입하는 단계(여기서, 각각의 벡터는 (ⅰ) 적어도 2개의 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅱ) 적어도 1개의 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 NANOG 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅲ) 적어도 1개의 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 ESRRB 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅳ) 적어도 1개의 ECAT1 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 UTF1 코딩 폴리뉴클레오타이드; 또는 (ⅴ) 적어도 1개의 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드, 적어도 1개의 ESRRB 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 NANOG 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함함); 및 (b) 하나 이상의 벡터를 도입하는 단계(여기서, 각각의 벡터는 (ⅰ) 적어도 1개의 CDH1 코딩 폴리뉴클레오타이드, 적어도 1개의 ZIC3 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 HESRG 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅱ) 적어도 1개의 L1TD1 코딩 폴리뉴클레오타이드, 적어도 1개의 DPPA4 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 TDGF1 코딩 폴리뉴클레오타이드; 또는 (ⅲ) 적어도 1개의 DNMT3B 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함함)를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 비다능성 세포로 하나 이상의 상기 벡터를 도입하는 단계를 포함하는 비다능성 세포를 재프로그래밍하는 방법은, 비다능성 세포로 하나 이상의 추가의 재프로그래밍 인자를 도입하는 단계를 추가로 포함한다. 몇몇 특정한 실시형태에서, 비다능성 세포로 재프로그래밍 인자를 도입하는 방법은 SOX2, c-Myc 및/또는 KLF4를 포함하지 않는다. 몇몇 다른 특정한 실시형태에서, SOX2, c-Myc 및/또는 KLF4는 비다능성 세포로 도입되는 재프로그래밍 인자로부터 배제된다. 훨씬 다른 특정한 실시형태에서, SOX2, c-Myc 및/또는 KLF4는 NANOG, LIN28, C-MYC, ECAT1, UTF1, ESRRB, SV40LT, HESRG, CDH1, TDGF1, DPPA4, DNMT3B, ZIC3 및 L1TD1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드의 존재 하에 불필요하다. 몇몇 다른 실시형태에서, 상기 일반적인 방법에서 사용되는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 (a) NANOG, ESRRB 및 Oct4 중 하나 이상을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드; (b) ECAT1 및 UTF1 중 하나 또는 둘 다를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드; (c) L1TD1, DPPA4 및 TDGF1 중 하나 이상을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드; 또는 (d) CDH1, ZIC3 및 HESRG 중 하나 이상을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 적어도 하나의 벡터에 의해 도입된다. 일 실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 Oct4를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터, 및 (a) NANOG, ESRRB 및 Oct4를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터; (b) ECAT1 및 UTF1을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터; (c) L1TD1, DPPA4 및 TDGF1을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터; 및 (d) CDH1, ZIC3 및 HESRG를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 중 적어도 하나의 벡터에 의해 도입된다.
본 출원의 또 다른 양태는 다능성 세포를 제조하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 비다능성 세포로 (ⅰ) OCT4, SOX2, NANOG, KLF4, LIN28, C-MYC, ECAT1, UTF1, ESRRB, SV40LT, HESRG, CDH1, TDGF1, DPPA4, DNMT3B, ZIC3 및 L1TD1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 폴리펩타이드를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드; 및 (ⅱ) HESRG, CDH1, TDGF1, DPPA4, DNMT3B, ZIC3 및 L1TD1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 폴리펩타이드를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 단계를 포함한다. 대안적인 실시형태에서, 다능성 세포를 제조하는 방법은 비다능성 세포를 (ⅰ) OCT4, SOX2, NANOG, KLF4, LIN28, C-MYC, ECAT1, UTF1, ESRRB, SV40LT, HESRG, CDH1, TDGF1, DPPA4, DNMT3B, ZIC3 및 L1TD1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 폴리펩타이드; 및 (ⅱ) HESRG, CDH1, TDGF1, DPPA4, DNMT3B, ZIC3 및 L1TD1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 폴리펩타이드와 접촉시키고, 이로써 비다능성 세포를 다능성 세포로 재프로그래밍하는 단계를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 비다능성 세포는 세포에서 내인성 OCT4의 발현을 증가시킴으로써 다능성 상태로 재프로그래밍된다. 다른 실시형태에서, 비다능성 세포는 유도된 다능성 줄기 세포로 재프로그래밍된다. 더욱 다른 실시형태에서, 하나 이상의 iPSC는 재프로그래밍된 성체 줄기 세포를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 다능성 세포를 제조하는 방법은 비다능성 세포로 하나 이상의 벡터에 포함된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 단계를 포함하고, 각각의 벡터는 (ⅰ) 적어도 2개의 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅱ) 적어도 1개의 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 NANOG 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅲ) 적어도 1개의 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 ESRRB 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅳ) 적어도 1개의 ECAT1 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 UTF1 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅴ) 적어도 1개의 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드, 적어도 1개의 ESRRB 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 NANOG 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅵ) 적어도 1개의 CDH1, ZIC3 및 HESRG 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅶ) 적어도 1개의 L1TD1, DPPA4 및 TDGF1 코딩 폴리뉴클레오타이드; 또는 (ⅷ) 적어도 1개의 DNMT3B 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 비다능성 세포로 하나 이상의 상기 벡터를 도입하는 단계를 포함하는 다능성 세포를 제조하는 방법은, 비다능성 세포로 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 코딩하는 하나 이상의 추가의 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 단계를 추가로 포함하다.
몇몇 다른 실시형태에서, 다능성 세포를 제조하는 방법은 (a) 하나 이상의 벡터를 도입하는 단계(여기서, 각각의 벡터는 (ⅰ) 적어도 2개의 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅱ) 적어도 1개의 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 NANOG 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅲ) 적어도 1개의 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 ESRRB 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅳ) 적어도 1개의 ECAT1 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 UTF1 코딩 폴리뉴클레오타이드; 또는 (ⅴ) 적어도 1개의 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드, 적어도 1개의 ESRRB 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 NANOG 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함함); 및 (b) 하나 이상의 벡터를 도입하는 단계(여기서, 각각의 벡터는 (ⅰ) 적어도 1개의 CDH1 코딩 폴리뉴클레오타이드, 적어도 1개의 ZIC3 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 HESRG 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅱ) 적어도 1개의 L1TD1 코딩 폴리뉴클레오타이드, 적어도 1개의 DPPA4 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 TDGF1 코딩 폴리뉴클레오타이드; 또는 (ⅲ) 적어도 1개의 DNMT3B 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함함)를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 다능성 세포를 제조하는 방법은 SOX2, Klf4 및 c-Myc 중 하나 이상의 사용을 배제한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 방법에서의 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 (a) NANOG, ESRRB 및 Oct4 중 하나 이상을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드; (b) ECAT1 및 UTF1 중 하나 또는 둘 다를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드; (c) L1TD1, DPPA4 및 TDGF1 중 하나 이상을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드; 또는 (d) CDH1, ZIC3 및 HESRG 중 하나 이상을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 적어도 하나의 벡터에 의해 도입된다. 몇몇 다른 실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 Oct4를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터, 및 (a) NANOG, ESRRB 및 Oct4를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터; (b) ECAT1 및 UTF1을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터; (c) L1TD1, DPPA4 및 TDGF1을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터; 및 (d) CDH1, ZIC3 및 HESRG를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터의 벡터 중 적어도 하나에 의해 도입된다. 상기 방법의 몇몇 실시형태에서, 하나 이상의 벡터는 레트로바이러스, 센다이 바이러스, 아데노바이러스, 에피솜, 미니-서클, 발현 카세트를 가지는 벡터 시스템 또는 mRNA에 의해 도입된다. 하나의 특정한 실시형태에서, 벡터는 센다이 바이러스에 의해 도입된다.
본 발명의 또 다른 양태는 비다능성 세포를 다능성 세포로 재프로그래밍하기 위한 혼합물을 제공한다. 일 실시형태에서, 혼합물은 하나 이상의 비다능성 세포를 포함하고, 비다능성 세포는 (ⅰ) OCT4, SOX2, NANOG, KLF4, LIN28, C-MYC, ECAT1, UTF1, ESRRB, SV40LT, HESRG, CDH1, TDGF1, DPPA4, DNMT3B, ZIC3 및 L1TD1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 폴리펩타이드를 코딩하는 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드; 및 (ⅱ) HESRG, CDH1, TDGF1, DPPA4, DNMT3B, ZIC3 및 L1TD1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 폴리펩타이드를 코딩하는 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일 실시형태에서, 혼합물은 하나 이상의 비다능성 세포를 포함하고, 비다능성 세포는 (ⅰ) 하나 이상의 벡터(각각의 벡터는 Oct4, ESRRB, ECAT1, UTF1 및/또는 NANOG를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함함)를 포함하고; 비다능성 세포는 (ⅱ) 하나 이상의 벡터(각각의 벡터는 CDH1, ZIC3, HESRG, L1TD1, DPPA4, TDGF1; 및/또는 DNMT3B를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함함)를 추가로 포함한다.
재프로그래밍을 위한 혼합물의 더욱 또 다른 실시형태에서, 비다능성 세포는 하나 이상의 벡터를 포함하고, 각각의 벡터는 (ⅰ) 적어도 2개의 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅱ) 적어도 1개의 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 NANOG 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅲ) 적어도 1개의 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 ESRRB 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅳ) 적어도 1개의 ECAT1 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 UTF1 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅴ) 적어도 1개의 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드, 적어도 1개의 ESRRB 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 NANOG 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅵ) 적어도 1개의 CDH1 코딩 폴리뉴클레오타이드, 적어도 1개의 ZIC3 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 HESRG 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅶ) 적어도 1개의 L1TD1 코딩 폴리뉴클레오타이드, 적어도 1개의 DPPA4 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 TDGF1 코딩 폴리뉴클레오타이드; 또는 (ⅷ) 적어도 1개의 DNMT3B 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 재프로그래밍을 위한 혼합물의 몇몇 실시형태에서, 하나 이상의 상기 벡터를 포함하는 비다능성 세포는 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 코딩하는 하나 이상의 추가의 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함한다.
재프로그래밍을 위한 혼합물의 더욱 또 다른 실시형태에서, 비다능성 세포는 (a) 하나 이상의 벡터를 포함하고, 적어도 하나의 벡터는 (ⅰ) 적어도 2개의 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅱ) 적어도 1개의 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 NANOG 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅲ) 적어도 1개의 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 ESRRB 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅳ) 적어도 1개의 ECAT1 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 UTF1 코딩 폴리뉴클레오타이드; 또는 (ⅴ) 적어도 1개의 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드, 적어도 1개의 ESRRB 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 NANOG 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하고; 비다능성 세포는 (b) 하나 이상의 벡터를 추가로 포함하고, 각각의 벡터는 (ⅰ) 적어도 1개의 CDH1 코딩 폴리뉴클레오타이드, 적어도 1개의 ZIC3 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 HESRG 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅱ) 적어도 1개의 L1TD1 코딩 폴리뉴클레오타이드, 적어도 1개의 DPPA4 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 TDGF1 코딩 폴리뉴클레오타이드; 또는 (ⅲ) 적어도 1개의 DNMT3B 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
하나의 특정한 실시형태에서, 본 발명은 하나 이상의 핵산을 제공하고, 각각의 핵산은 (ⅰ) OCT4 폴리펩타이드를 코딩하는 cDNA, (ⅱ) ECAT1 폴리펩타이드를 코딩하는 cDNA, (ⅲ) UTF1 폴리펩타이드를 코딩하는 cDNA, (ⅳ) NANOG 폴리펩타이드를 코딩하는 cDNA, (ⅴ) ESRRB 폴리펩타이드를 코딩하는 cDNA, (ⅵ) HESRG 폴리펩타이드를 코딩하는 cDNA, (ⅶ) CDH1 폴리펩타이드를 코딩하는 cDNA, (ⅷ) TDGF1 폴리펩타이드를 코딩하는 cDNA, (ix) DPPA4 폴리펩타이드를 코딩하는 cDNA, (x) DNMT3B 폴리펩타이드를 코딩하는 cDNA, (xi) ZIC3 폴리펩타이드를 코딩하는 cDNA, 및 (xii) L1TD1 폴리펩타이드를 코딩하는 cDNA 중 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 8개, 9개, 10개 또는 11개를 포함한다.
일 실시형태에서, 핵산은 OCT4 폴리펩타이드를 코딩하는 cDNA, ECAT1 폴리펩타이드를 코딩하는 cDNA, UTF1 폴리펩타이드를 코딩하는 cDNA, NANOG 폴리펩타이드를 코딩하는 cDNA 및 ESRRB 폴리펩타이드를 코딩하는 cDNA를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 핵산은 OCT4 폴리펩타이드를 코딩하는 cDNA, ECAT1 폴리펩타이드를 코딩하는 cDNA 및 UTF1 폴리펩타이드를 코딩하는 cDNA를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 핵산은 OCT4 폴리펩타이드를 코딩하는 cDNA, NANOG 폴리펩타이드를 코딩하는 cDNA 및 ESRRB 폴리펩타이드를 코딩하는 cDNA를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 핵산은 CDH1 폴리펩타이드를 코딩하는 cDNA, ZIC3 폴리펩타이드를 코딩하는 cDNA 및 HESRG 폴리펩타이드를 코딩하는 cDNA를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 핵산은 L1TD1 폴리펩타이드를 코딩하는 cDNA, DPPA4 폴리펩타이드를 코딩하는 cDNA 및 TDGF1 폴리펩타이드를 코딩하는 cDNA를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 핵산은 DNMT3B 폴리펩타이드를 코딩하는 cDNA를 포함한다.
본 발명의 더욱 또 다른 양태는 (ⅰ) OCT4, SOX2, NANOG, KLF4, LIN28, C-MYC, ECAT1, UTF1, ESRRB, SV40LT, HESRG, CDH1, TDGF1, DPPA4, DNMT3B, ZIC3 및 L1TD1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 폴리펩타이드를 코딩하는 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드; 및 (ⅱ) HESRG, CDH1, TDGF1, DPPA4, DNMT3B, ZIC3 및 L1TD1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 폴리펩타이드를 코딩하는 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포를 제공한다. 몇몇 실시형태에서, 세포는 분화전능 세포, 다능성 세포, 다분화능 세포, 소분화능 세포, 단분화능 세포 또는 말단 분화된 세포이다. 일 실시형태에서, 세포는 비다능성 세포이다. 또 다른 실시형태에서, 세포는 유도된 다능성 줄기 세포이다. 더욱 또 다른 실시형태에서, 세포는 전구체 세포이다. 몇몇 실시형태에서, 본 발명은 (ⅰ) NANOG, LIN28, C-MYC, ECAT1, UTF1, ESRRB 및 SV40LT로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 폴리펩타이드를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드; 및 (ⅱ) HESRG, CDH1, TDGF1, DPPA4, DNMT3B, ZIC3 및 L1TD1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 폴리펩타이드를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포를 제공한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 세포는 외인성 SOX2, Klf4 및 c-Myc 중 하나 이상을 포함하지 않는다.
본 출원의 일 양태는 다능성 세포를 제조하기 위한 키트를 제공하고, 키트는 하나 이상의 벡터를 포함하고, 각각의 벡터는 (ⅰ) OCT4, SOX2, NANOG, KLF4, LIN28, C-MYC, ECAT1, UTF1, ESRRB, SV40LT, HESRG, CDH1, TDGF1, DPPA4, DNMT3B, ZIC3 및 L1TD1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 폴리펩타이드를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드; 및 (ⅱ) HESRG, CDH1, TDGF1, DPPA4, DNMT3B, ZIC3 및 L1TD1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 폴리펩타이드를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 대안적인 실시형태에서, 키트는 (ⅰ) OCT4, SOX2, NANOG, KLF4, LIN28, C-MYC, ECAT1, UTF1, ESRRB, SV40LT, HESRG, CDH1, TDGF1, DPPA4, DNMT3B, ZIC3 및 L1TD1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 폴리펩타이드; 및 (ⅱ) HESRG, CDH1, TDGF1, DPPA4, DNMT3B, ZIC3 및 L1TD1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 키트는 하나 이상의 벡터를 포함하고, 각각의 벡터는 (ⅰ) 적어도 2개의 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅱ) 적어도 1개의 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 NANOG 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅲ) 적어도 1개의 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 ESRRB 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅳ) 적어도 1개의 ECAT1 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 UTF1 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅴ) 적어도 1개의 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드, 적어도 1개의 ESRRB 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 NANOG 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅵ) 적어도 하나의 CDH1g, ZIC3 및 HESRG 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅶ) 적어도 1개의 L1TD1, DPPA4 및 TDGF1 코딩 폴리뉴클레오타이드; 또는 (ⅷ) 적어도 1개의 DNMT3B 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 하나 이상의 상기 벡터를 포함하는 키트는 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 코딩하는 하나 이상의 추가의 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함한다.
더욱 몇몇 다른 실시형태에서, 키트는 (a) (ⅰ) 적어도 2개의 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅱ) 적어도 1개의 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 NANOG 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅲ) 적어도 1개의 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 ESRRB 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅳ) 적어도 1개의 ECAT1 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 UTF1 코딩 폴리뉴클레오타이드; 또는 (ⅴ) 적어도 1개의 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드, 적어도 1개의 ESRRB 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 NANOG 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 하나 이상의 벡터; 및 (b) (ⅰ) 적어도 1개의 CDH1 코딩 폴리뉴클레오타이드, 적어도 1개의 ZIC3 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 HESRG 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅱ) 적어도 1개의 L1TD1 코딩 폴리뉴클레오타이드, 적어도 1개의 DPPA4 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 TDGF1 코딩 폴리뉴클레오타이드; 또는 (ⅲ) 적어도 1개의 DNMT3B 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 키트의 벡터는 (a) NANOG, ESRRB 및 Oct4 중 하나 이상을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드; (b) ECAT1 및 UTF1 중 하나 또는 둘 다를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드; (c) L1TD1, DPPA4 및 TDGF1 중 하나 이상을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드; 또는 (d) CDH1, ZIC3 및 HESRG 중 하나 이상을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 몇몇 다른 실시형태에서, 상기 키트는 Oct4를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터, 및 (a) NANOG, ESRRB 및 Oct4를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터; (b) ECAT1 및 UTF1을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터; (c) L1TD1, DPPA4 및 TDGF1을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터; 및 (d) CDH1, ZIC3 및 HESRG를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 중 적어도 하나의 벡터를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 키트의 벡터는 레트로바이러스, 센다이 바이러스, 아데노바이러스, 플라스미드, 미니-서클 또는 mRNA에 의해 운반된다. 몇몇 실시형태에서, 키트의 벡터는 센다이 바이러스에 의해 운반된다.
본 발명의 또 다른 양태는 (a) (ⅰ) OCT4, SOX2, NANOG, KLF4, LIN28, C-MYC, ECAT1, UTF1, ESRRB, SV40LT, HESRG, CDH1, TDGF1, DPPA4, DNMT3B, ZIC3 및 L1TD1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 펩타이드; 및 (ⅱ) HESRG, CDH1, TDGF1, DPPA4, DNMT3B, ZIC3 및 L1TD1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 펩타이드를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드; 또는 (b) (ⅰ) OCT4, SOX2, NANOG, KLF4, LIN28, C-MYC, ECAT1, UTF1, ESRRB, SV40LT, HESRG, CDH1, TDGF1, DPPA4, DNMT3B, ZIC3 및 L1TD1; 및 (ⅱ) HESRG, CDH1, TDGF1, DPPA4, DNMT3B, ZIC3 및 L1TD1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함하는 재프로그래밍 조성물을 제공한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 재프로그래밍 조성물의 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 (a) NANOG, ESRRB 및 Oct4 중 하나 이상을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드; (b) ECAT1 및 UTF1 중 하나 또는 둘 다를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드; (c) L1TD1, DPPA4 및 TDGF1 중 하나 이상을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드; 또는 (d) CDH1, ZIC3 및 HESRG 중 하나 이상을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 적어도 하나의 벡터에 포함된다. 몇몇 다른 실시형태에서, 재프로그래밍 조성물은 Oct4를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터, 및 (a) NANOG, ESRRB 및 Oct4를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터; (b) ECAT1 및 UTF1을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터; (c) L1TD1, DPPA4 및 TDGF1을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터; 및 (d) CDH1, ZIC3 및 HESRG를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 중 적어도 하나를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 재프로그래밍 조성물에서의 벡터는 레트로바이러스, 센다이 바이러스, 아데노바이러스, 플라스미드, 미니-서클 또는 mRNA에 의해 운반된다. 몇몇 실시형태에서, 재프로그래밍 조성물에서의 벡터는 센다이 바이러스에 의해 운반된다.
본 발명의 추가의 양태는 비다능성 세포를 재프로그래밍하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 (a) 비다능성 세포로 Oct4, 및 임의로 Klf, Sox2, Myc, NANOG 및 ESRRB 중 하나 이상을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 단계; 및 (b) 비다능성 세포로 ECAT1, UTF1, L1TD1, DPPA4, TDGF1, CDH1, ZIC3 및 HESRG 중 적어도 하나를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입하고; 이로써 다능성 세포를 수득하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 벡터에 의해 도입되고, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 동일한 또는 상이한 폴리펩타이드를 코딩할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 방법을 위한 벡터는 (a) NANOG, ESRRB 및 Oct4 중 하나 이상을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드; (b) ECAT1 및 UTF1 중 하나 또는 둘 다를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드; (c) L1TD1, DPPA4 및 TDGF1 중 하나 이상을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드; 또는 (d) CDH1, ZIC3 및 HESRG 중 하나 이상을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 적어도 하나의 작제물을 포함한다. 몇몇 다른 실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 Oct4를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터, 및 (a) NANOG, ESRRB 및 Oct4를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터; (b) ECAT1 및 UTF1을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터; (c) L1TD1, DPPA4 및 TDGF1을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터; 및 (d) CDH1, ZIC3 및 HESRG를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 중 적어도 하나의 벡터를 통해 도입된다. 몇몇 실시형태에서, 벡터는 레트로바이러스, 센다이 바이러스, 아데노바이러스, 플라스미드, 미니-서클 또는 mRNA에 의해 도입된다. 몇몇 특정한 실시형태에서, 벡터는 센다이 바이러스에 의해 도입된다.
본 발명의 또 다른 양태는 센다이 바이러스를 사용하여 비다능성 세포를 재프로그래밍하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 (a) 비다능성 세포로 Oct4, 및 임의로 Klf, Sox2, Myc, NANOG 및 ESRRB 중 하나 이상을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 단계; 및 (b) 비다능성 세포로 ECAT1, UTF1, L1TD1, DPPA4, TDGF1, CDH1, ZIC3 및 HESRG 중 적어도 하나를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입하고; 이로써 다능성 세포를 수득하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 벡터에 의해 도입되고; 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 동일한 또는 상이한 폴리펩타이드를 코딩한다. 몇몇 실시형태에서, 벡터는 (a) NANOG, ESRRB 및 Oct4 중 하나 이상을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드; (b) ECAT1 및 UTF1 중 하나 또는 둘 다를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드; (c) L1TD1, DPPA4 및 TDGF1 중 하나 이상을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드; 또는 (d) CDH1, ZIC3 및 HESRG 중 하나 이상을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 작제물을 포함한다. 몇몇 다른 실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 Oct4를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터, 및 (a) NANOG, ESRRB 및 Oct4를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터; (b) ECAT1 및 UTF1을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터; (c) L1TD1, DPPA4 및 TDGF1을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터; 및 (d) CDH1, ZIC3 및 HESRG를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 중 적어도 하나의 벡터를 통해 도입된다.
본 발명의 훨씬 또 다른 양태는 센다이 바이러스를 사용하여 비다능성 세포를 재프로그래밍하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 (a) 비다능성 세포로 Oct4, 및 임의로 Klf, Sox2, Myc, NANOG 및 ESRRB 중 하나 이상을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 단계; 및 (b) 비다능성 세포로 (ⅰ) ECAT1 및 UTF1 중 하나 또는 둘 다를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드; (ⅱ) L1TD1, DPPA4 및 TDGF1 중 하나 이상을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 또는 (ⅲ) CDH1, ZIC3 및 HESRG 중 하나 이상을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 작제물 중 하나를 도입하고, 이로써 다능성 세포를 수득하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 Oct4를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터, 및 (a) NANOG, ESRRB 및 Oct4를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터; (b) ECAT1 및 UTF1을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터; (c) L1TD1, DPPA4 및 TDGF1을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터; 및 (d) CDH1, ZIC3 및 HESRG를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 중 적어도 하나의 벡터를 통해 도입된다.
다양한 특정한 실시형태에서, 본 발명은 재프로그래밍 비다능성 세포에 의해 하나 이상의 다능성 줄기 세포를 수득하는 단계를 포함하는 유도된 다능성 줄기 세포(iPSC)를 제조하는 방법을 제공한다. 추가의 특정한 실시형태에서, 하나 이상의 비다능성 세포를 재프로그래밍하는 것은 하나 이상의 비다능성 세포를 Wnt 경로 작용제와 접촉시키는 단계를 포함하고, 임의로 Wnt 경로 작용제는 GSK3 저해제; MEK 저해제; 및 TGFβR 저해제 및 임의로 ROCK 저해제이다. 유도된 다능성 줄기 세포(iPSC)를 제조하는 상기 방법은 TGFβR 저해제를 포함하지 않는 세포 배양 배지에서 하나 이상의 다능성 줄기 세포를 배양하고, 이로써 기저 상태 iPSC를 제조하는 단계를 추가로 포함한다. 관련된 특정한 실시형태에서, 세포 배양 배지는 Wnt 경로 작용제를 포함하고, 임의로 Wnt 경로 작용제는 GSK3 저해제; MEK 저해제; 및 ROCK 저해제이다. 소정의 추가의 실시형태에서, 하나 이상의 다능성 세포는 피더 비함유 환경에서 배양된다. 추가의 실시형태에서, iPSC는 iPSC의 집단을 포함한다. 특정한 실시형태에서, iPSC의 집단은 iPSC의 균일한 집단이다.
본 명세서에 제공된 방법 및 조성물의 특정한 실시형태에서, 다능성 세포의 집단 중 적어도 95%는 SSEA4-FITC 및 TRA1-81 또는 TRA1-60을 발현한다. 추가의 실시형태에서, 세포 배양 배지에서 다능성 세포를 배양하는 것은 배양된 세포의 자발적인 분화를 감소시킨다.
일 실시형태에서, 배양된 세포에서의 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 또는 5개 이상의 분화 마커 유전자의 발현은 TGFβR 저해제를 포함하는 배지에서 배양된 다능성 세포에서의 하나 이상의 분화 마커 유전자의 발현과 비교하여 적어도 약 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 감소하고, 분화 마커 유전자는 FOXA2, FGF5, SOX17, XIST, NODAL, COL3A1, OTX2, DUSP6, EOMES, NR2F2, NR0B1, CXCR4, CYP2B6, GATA3, GATA4, ERBB4, GATA6, HOXC6, INHA, SMAD6, RORA, NIPBL, TNFSF11, CDH11, ZIC4, GAL, SOX3, PITX2, APOA2, CXCL5, CER1, FOXQ1, MLL5, DPP10, GSC, PCDH10, CTCFL, PCDH20, TSHZ1, MEGF10, MYC, DKK1, BMP2, LEFTY2, HES1, CDX2, GNAS, EGR1, COL3A1, TCF4, HEPH,kDR, TOX, FOXA1, LCK, PCDH7, CD1D FOXG1, LEFTY1, TUJ1, T 유전자(Brachyury) 및 ZIC3으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시형태에서, 하나 이상의 분화 마커 유전자는 T 유전자, CXCR4, NODAL, GATA4, SOX17, FOXA2, OTX2, 및 TUJ1로 이루어진 군으로부터 선택된다.
소정의 실시형태에서, 세포 배양 배지에서 다능성 세포를 배양하는 것은 다능성의 기저 상태를 유지시키거나 유도한다. 특정한 실시형태에서, 하나 이상의 다능성 세포의 다능성의 기저 상태는 적어도 5회 계대배양 동안 유지된다. 소정의 특정한 실시형태에서, 하나 이상의 다능성 세포의 다능성의 기저 상태는 적어도 10회 계대배양 동안 유지된다. 추가의 특정한 실시형태에서, 하나 이상의 다능성 세포의 다능성의 기저 상태는 적어도 50회 계대배양 동안 유지된다. 추가의 특정한 실시형태에서, 하나 이상의 다능성 세포의 다능성의 기저 상태는 적어도 100회 계대배양 동안 유지된다.
다양한 실시형태에서, 상기 방법은 계대배양 동안 하나 이상의 다능성 세포를 해리하는 단계를 추가로 포함한다. 소정의 실시형태에서, 하나 이상의 다능성 세포의 생존능력은 계대배양 동안 유지된다.
소정의 특정한 실시형태에서, 본 출원의 제공된 방법을 이용하여 수득한 하나 이상의 다능성 세포는 정상 핵형을 포함한다.
소정의 추가의 실시형태에서, 하나 이상의 다능성 세포의 게놈 안정성은 적어도 10회 계대배양 동안 유지된다. 소정의 관련된 실시형태에서, 하나 이상의 다능성 세포의 게놈 안정성은 적어도 50회 계대배양 동안 유지된다. 소정의 다른 실시형태에서, 하나 이상의 다능성 세포의 게놈 안정성은 적어도 100회 계대배양 동안 유지된다.
다양한 실시형태에서, 본 발명은, 부분적으로, 다능성 세포를 피더 비함유 배양에 적응시키는 방법을 고려하고, 상기 방법은 (a) 피더 세포의 존재 하에 배양된 하나 이상의 다능성 세포를 단리하는 단계; (b) Wnt 경로 작용제를 포함하는 화학적으로 한정된 세포 배양 배지에서 하나 이상의 다능성 세포를 배양하는 단계(여기서, 임의로 Wnt 경로 작용제는 GSK3 저해제; MEK 저해제; 및 ROCK 저해제이고, 배지는 TGFβR 저해제를 포함하지 않음)를 포함한다.
다양한 특정한 실시형태에서, 본 발명은, 부분적으로, 단일 세포로서 효소로 계대배양된 다능성 세포를 배양하는 방법을 고려하고, 상기 방법은 (a) 하나 이상의 다능성 세포를 효소로 처리하여 단일 다능성 세포를 계대배양하는 단계; (b) 피더 비함유 환경에서 단일 다능성 세포를 배양하는 단계; (c) Wnt 경로 작용제(임의로 GSK3 저해제; MEK 저해제; 및 ROCK 저해제(이들로 제한되지는 않음) 포함)를 포함하는 화학적으로 한정된 세포 배양 배지에서 단일 다능성 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 배지는 TGFβR 저해제를 포함하지 않는다.
다양한 소정의 실시형태에서, 본 발명은, 부분적으로, 하나 이상의 다능성 세포의 자발적인 분화를 감소시키는 방법을 고려하고, 상기 방법은 (a) 피더 비함유 환경에서 하나 이상의 다능성 세포를 배양하는 단계; (b) Wnt 경로 작용제를 포함하는 화학적으로 한정된 세포 배양 배지에서 하나 이상의 다능성 세포를 배양하는 단계(여기서, 임의로 Wnt 경로 작용제는 GSK3 저해제; MEK 저해제; 및 ROCK 저해제이고, 배지는 TGFβR 저해제를 포함하지 않음)를 포함한다.
다양한 추가의 실시형태에서, 본 발명은, 부분적으로, 유도된 다능성 줄기 세포(iPSC)를 제조하는 방법을 고려하고, 상기 방법은 (a) 하나 이상의 비다능성 세포를 수득하는 단계; (b) 하나 이상의 비다능성 세포를 다능성 상태로 재프로그래밍하는 단계; (c) TGFβR 저해제를 포함하지 않는 세포 배양 배지에서 다능성 세포를 배양하고, 이로써 iPSC를 제조하는 단계를 포함한다.
도 1은 증대된 재프로그래밍 및 hiPSC 유지를 위한 다단계 배양 플랫폼으로부터의 결과를 보여준다. (a) 렌티바이러스 생성된 hiPSC 클론 FTi088은 SMC4에서 미분화된 세포의 균일한 집단을 유지하는 한편, SMC4에서 배양된 렌티바이러스 생성된 hiPSC 라인 FTi096에서 자발적인 분화가 보였다. SSEA4 및 TRA1-81에 대한 형태(상부 패널) 및 유세포분석법(하부 패널)에 의해 도시된 것처럼, 3회 계대배양을 위해 FTi096이 FMM으로 이행될 때 자발적인 분화가 최소화되었다. (b) 바이러스 유전요소 WPRE의 전이유전자 발현을 위한 qRT-PCR. 렌티바이러스 감염 후 4일에(4일 P.I.) 발현을 GAPDH로 및 모 섬유아세포 라인의 WPRE 발현에 대해 정규화하였다. 음성 대조군으로서 비감염된 섬유아세포 라인(섬유아세포) 및 인간 ESC 라인 HUES9를 사용하였다. 각각의 세트의 값은 막대 위에 표시되어 있다. (c) 10회 계대배양 후 전이유전자 비함유 렌티바이러스 유도된 hiPSC의 SSEA4 및 TRA1-81집단에 대한 다양한 배지 성분의 효과의 스크린; SB431542(-TGFβRi)의 제거, 10으로부터 100ng/㎖의 bFGF의 증가, 10ng/㎖의 LIF의 첨가. (d) 섬유아세포 세포주를 유전자 세트 OCT4/KLF4/SOX2를 함유하는 렌티바이러스 작제물에 의해 형질감염시키고, 다양한 배지(종래의 배지; Conv.)로 분할하고, 17일에 배양하고, 17일에 SSEA4 및 TRA1-81 이중 양성 집단에 대해 분류하였다. 분류 게이트는 청색으로 강조된다. 각각의 세트를, FMM 및 SMC4로 분할된 SMC4 세트를 제외하고, 각각의 배지에서 추가 10일 동안 배양하였다. 27일에, 배양물은 SSEA4 및 TRA1-81 이중 양성 집단에 대해 의지되고, 분류된 사건의 정규화된 밀도로 시딩하고, 추가 9일 동안 각각의 배지에서 유지시켰다. 종래의 배양 세트 게이팅을 확장하여 정규화된 수의 세포를 달성하였다. 36일에, 각각의 배양물을 OCT4 및 NANOG 발현을 위해 염색시켰다. 각각의 세트에 대해 오른쪽 패널에 도시된 대표적인 면역세포화학 영상. (e) (d)에 기재된 36일 염색의 콜로니 수. 오차 막대는 FRM 내지 FMM 및 FRM에 대한 3회 반복 및 FMM 및 hESC에 대한 2회 반복을 나타낸다.
도 2는 개별 에피솜 재프로그래밍된 hiPSC가 클론성 증식을 위해 효율적으로 선택되고 96웰 플레이트에서 시딩된다는 것을 보여준다. (a) 에피솜 유도, 다단계 배양 플랫폼, 유세포분석법 분류 및 클론성 증식의 도식적 시기 예시. (b) 에피솜의 유세포분석법 프로필은 형질감염 후 표시된 일자에 (a에서 표시된) FF 배양물에서 FMM으로의 FRM의 이행에서 유지된 재프로그래밍을 유도하였다. 각각의 모 라인(SSEA4+/TRA1-81+/CD30+ 집단)에 사용된 분류 게이팅 전략은 개별 hiPSC 클론을 함유하는 96웰 플레이트의 웰의 백분율을 나타내는 하부 히스토그램 패널에 상응하는 각각의 색상에 예시되어 있다. 다수의 클론 또는 분화된 클론을 함유하는 웰을 점수 매기지 않았다. 실선은 표준 편차를 나타내는 점선에 의해 모든 유도 중에서 평균 백분율을 나타낸다. (c) MEF 세포의 존재 하에 종래의 배지에서 유지된 형질감염 후 19일에 재프로그래밍하도록 유도된 FTC007의 흐름 프로필. 유도된 집단은 (b)에서 FTC007의 동일한 집단으로부터 취해지지만, 이후 상이한 배양물에서 처리되었다. (d) 96웰 플레이트에서의 분류된 콜로니의 다양한 다능성 마커의 면역세포화학 분석. 오른쪽 코너 패널은 DAPI 염색을 나타낸다. (e) 웰마다 3개의 세포로 SSEA4/TRA1-81/CD30 직접 분류된 (FACS) 96웰 플레이트의 각각의 웰에 대한 NANOG 발현에 대한 qRT-PCR. 발현 범위는 범례에 기재된 바대로 H1 인간 ESC에 대한 발현의 0배 내지 4배이고, GAPDH로 정규화된다.
도 3은 에피솜 재프로그래밍된 hiPSC 클론이 이의 미분화된 상태를 유지시키고, 전이유전자 서열이 없다는 것을 보여준다. (a) 단일 세포 계대배양 후 24시간에 hiPSC 클론의 통상적인 형태. (b) 배양 동안 hiPSC 클론의 대표적인 영상. (c) 다양한 hiPSC 클론으로부터 유래된 에피솜 DNA에 대한 PCR 분석. 1 레인, FTC007-c1 p4; 2 레인, FTC007-c21 p4; 3 레인, FTC016-c25 p5; 4 레인, FTC016-c36 p5; 5 레인, FTC017-c11 p7; 6 레인, FTC017-c14 p7; 7 레인, FTC017-c17 p6(양성 대조군으로서 사용되는 에피솜 작제물을 유지시키는 라인); 8 레인, 비형질감염된 FTC007; 9 레인, (교차 오염에 대해 대조군으로서 작용하도록) 렌티바이러스 작제물을 사용하여 생성된 hiPSC; 10 레인, 양성 대조군으로서 사용된 에피솜 벡터. 모든 세트에 100ng의 게놈 DNA의 유입 및 35회 PCR 사이클을 사용하였다. (d) OCT4, NANOG, TRA1-81 및 TRA160의 발현에 대해 면역형광에 의해 검출된 다능성 마커. (e) 다양한 모 라인으로부터 선택된 hiPSC 클론에 대한 유세포분석법 프로필. 상부 열 프로필 SSEA4/TRA1-81 표면 발현. 하부 열 프로필 OCT4/NANOG 세포내 발현. (f) 내인성 다능성 유전자 발현에 대한 qRT-PCR 분석. 데이터를 GAPDH로 및 HUES9 hESC에 대해 정규화하였다. KLF4 발현의 경우에, 2개의 데이터 점은 HUES9보다 15배 초과를 넘고, 그래프에 표시되었다. 오차 막대는 반복시험의 표준 편차를 나타낸다.
도 4는 게놈 안정성 및 다능성은 연속 단일 세포 및 FF 배양 동안 유지된다는 것을 보여준다. (a) FF 및 단일 세포 배양에서 유지된 다양한 hiPSC 클론으로부터의 20 내지 40G 밴딩된 중기 세포에서의 세포유전학적 분석. (b) FF 및 단일 세포 배양에서 장기간 계대배양된 (p25-30) hiPSC 클론의 유세포분석법 프로필 및 세포유전학적 분석. (c) FTC017-c11의 3일 내지 4일 지시된 분화. (d) 삼계열 분화를 나타내는 hiPSC 클론의 배양체 형성 및 분화. 분화 후 28일에 수행된 면역세포화학: 외배엽, TUJ1; 중배엽, 알파 평활근 액틴(aSMA); 내배엽, AFP. (e) 각각의 체성 계열을 나타내는 FTC007-c21 및 FTC016-c25로부터 유래된 기형종의 조직학적 절편. 검정 화살표, 내배엽; 백색 화살표, 외배엽; 회색 화살표, 중배엽.
도 5는 재프로그래밍 인자의 최소 수를 가지는 hiPSC 클론의 유도를 보여준다. (a) OCT4, SOX2 및 NANOG를 다양한 포맷으로 pCEP4로 클로닝하였다. 표는 벡터 시스템 및 약어를 나타낸다. (b) 유도 후 13일에 다양한 유전자 조합에 의해 유도된 재프로그래밍 동역학의 SSEA4 및 TRA1-81 유세포분석법 프로필. OS+ONS+T 대 2xO+ONS+T(0.1% : 1.03%)를 사용하여 재프로그래밍의 효율을 비교하고; 2xO+ONS+T 대 2xO+ONS+OS+T(1.03% : 3.53%)를 비교하고; 2xO+OS+T 대 2xO+ONS+OS+T(0.58% : 3.53%)를 비교하고; ONS+T 대 2xO+ONS+T(0.6% : 1.03%)를 비교하고; OS+T 대 2xO+OS+T(0.06% : 0.58%)를 비교함으로써 재프로그래밍 인자 화학량론의 효과가 도시되어 있음; (c) 웰마다 3개 및 9개의 세포로 96웰 플레이트의 웰에서 TRA1-81 양성 hiPSC 클론의 존재를 나타내는 효율 히스토그램. (d) 다양한 hiPSC 클론으로부터 유래된 에피솜 DNA에 대한 PCR 분석. 1 레인 2xO+OS+ONS+T-c7 p6; 2 레인, 2xO+OS+ONS+T-c10 p6; 3 레인, 2xO+ONS+T-c5 p5; 4 레인, 2xO+ONS+T-c9 p5; 5 레인, 2xO+OS+T-c7 p7; 6 레인, 2xO+OS+T-c9 p6; 7 레인, 비형질감염된 FTC007; 8 레인, 렌티바이러스 작제물을 사용하여 생성된 hiPSC; 9 레인, 양성 대조군으로서 사용된 에피솜 벡터. 모든 세트에 100ng의 게놈 DNA의 유입 및 35회 PCR 사이클을 사용하였다. (e) 2xO+OS+T로부터 유래된 클론 9의 형태. (F) OCT4, NANOG, TRA1-81 및 TRA160의 발현에 대해 면역형광에 의해 검출된 다능성 마커. 10배 배율로 찍은 영상. (g) 선택된 유전자 세트로부터 유래된 hiPSC 클론의 흐름 프로필. 상부 열 프로필 SSEA4/TRA1-81 표면 발현. 하부 열 프로필 OCT4/NANOG 세포내 발현. (h) 유도 후 대략 72시간 내지 96시간에 선택된 hiPSC 클론의 지시된 분화. (i) FF 및 단일 세포 배양에서 유지된 다양한 hiPSC 클론으로부터의 G 밴딩된 중기 세포에서의 세포유전학적 분석. (J) 각각의 체성 계열을 나타내는 hiPSC 클론 2xO+OS+ONS+T-c10으로부터 유래된 기형종의 조직학적 절편. 왼쪽 패널, 내배엽; 중간 패널, 중배엽; 오른쪽 패널, 외배엽.
도 6은 FMM에서 최소 인자 에피솜 유도된 hiPSC의 상대 유전자 발현 프로필을 보여준다. 종래대로 유지된 hiPSC 라인, 종래대로 유지된 H1 hESC 및 FMM에서 유지된 다양한 유전자 조합을 사용하여 유래된 에피솜 hiPSC 라인의 다능성(a) 및 분화(b) 유전자의 상대 유전자 발현 수준(RQ)을 도시하는 플루다임(Fluidigm) 동적 어레이로부터 유래된 열지도 결과. 각각의 라인에 대한 상대 유전자 발현은 범례(하부 오른쪽)에 요약된 3개의 발현 수준에 기초하여 코딩된 색상 및 각각의 박스 내에 표시된다. 모든 세트는 2회 수행되고, 2개의 하우스키핑 유전자(GAPDH 및 HPRT1)의 평균 발현으로 정규화되고, 1x 값을 나타내는 6개의 대조군 종래의 라인(MEF에서 OSK hiPSC 및 H1 hESC)의 중앙치 발현 수준에 대해 참조된다.
도 7은 FMM 유지된 hiPSC가 분화된 유전자의 감소한 발현을 가지고 기저 상태를 나타낸다는 것을 보여준다. (a) 전체 339개의 프로브는 종래의 배양과 FMM 배양 사이에 차등적으로 2.5배 초과 또는 미만으로 발현되었다. 유클리드 거리 측정에 기초한 완전한 연결 방법을 이용한 339개의 프로브 세트에서의 계층적 클러스터링. (b) (FMM 배양과 비교하여) 종래의 배양에 의해 2.5배 이상 상향조절된 213개의 프로브 세트의 유전자 존재론 생물학적 과정 농후 분석(D.A.V.I.D.). (c) 기저 상태 또는 준안정한 다능성 상태를 대표하는 유전자 목록. 텍스트에 기재된 참조물로부터 유래된 목록. (d) 유클리드 거리 측정에 기초한 완전한 연결 방법을 이용한 (c)에서의 유전자에 상응하는 231개의 프로브 세트에서의 계층적 클러스터링. (e) (c)에서의 유전자에 상응하는 프로브 세트에 대한 RMA (log2) 강도. 왼쪽 패널은 기저 상태에 대한 39개의 프로브 세트를 나타내고, 오른쪽 패널은 준안정한 상태에 대한 188개의 프로브 세트를 나타낸다. 평균 종래의 배양 강도 수준은 X축에 작도되는 한편, 평균 FMM/SMC4 강도는 Y축에 있고, 검정 선은 동등한 발현을 나타낸다. (f) Affymetrix 프로브 세트를 사용한 종래의 배지 배양에서 유래하고 배양된 hiPSC 클론과 SMC4 배양에 적응된 이의 대응물 사이의 X 염색체 위치한 유전자의 유전자 발현 비교. XIST 유전자 발현과 연관된 프로브 세트는 강조된다. (g) 5회 계대배양에 대한 FMM에서 유지되거나 종래의 배양에 적응된 hiPSC 클론에 대한 HEK27me3의 대표적인 영상. 왼쪽 패널에서의 점선 화살표는 H3K27me3 염색이 부재한 대표적인 핵을 나타내는 한편, 오른쪽 패널에서의 실선 화살표는 H3K27me3 염색에 양성인 핵을 나타낸다. 핵 양성 염색의 백분율은 각각의 패널의 하부 왼쪽 측에 표시되어 있다. FMM 배양된 세포는 더 큰 핵을 가진다. 스케일 막대 = 50㎛.
도 8은 FRM 및 FMM에 의한 에피솜 유도된 재프로그래밍을 보여준다. (a) 재프로그래밍 풀의 10일 SSEA4 및 TRA1-81 흐름 프로필. (b) 재프로그래밍 동안 보이는 통상적인 콜로니의 대표적인 형태. 형질감염 후 13일에 찍은 영상. (c) 처음 14일 동안 FRM에서 유지된 에피솜 재프로그래밍된 섬유아세포 세포는 분할되고, FRM에서 유지되거나 FMM으로 전환되었다. 이후, 재프로그래밍 배양물을 형질감염 후 21일에 SSEA4/TRA1-81/CD30에 대해 분류하고, 분석 전에 추가 10일 동안 FRM 또는 FMM에서 유지시켰다. (d) FRM 또는 FMM에서의 대표적인 배양물의 형태 및 흐름 프로필. 흰색 화살표는 미분화된 집단 및 분화된 집단의 혼합물로 이루어진 배양물에서의 분화된 세포의 영역을 나타낸다. 검정 화살표는 주로 미분화된 집단의 날카로운 테두리를 나타낸다. 하부 패널은 대표적인 흐름 프로필이다. FSC; 전방 측방 산란.
도 9는 다양한 모 라인의 재프로그래밍을 보여준다. (a) 이 연구에 사용된 출발 세포주의 요약의 표. 각각의 라인과 관련된 특정한 정보 이외에, 에피솜 형질감염 후 분류의 시간에 양성 SSEA4/TRA1-81/CD30 집단의 백분율이 표시된다. (b) CD34 농후화된 제대혈 세포의 분류 및 배양을 도시하는 예시. 은행에서 이전에 유지된 0.5㎖의 제대혈의 용적을 이용하여 65,000개의 CD34+CD45+Lin- 세포를 추출하고, 이것을 에피솜 형질감염 전 6일 동안 현탁액 중에 배양하였다.
도 10은 재프로그래밍 및 유지 과정 동안에 hiPSC의 규명을 보여준다. (a) 단일 세포 96웰 플레이트 분류 후 3일에 통상적인 콜로니 형태. 스케일 막대는 400㎛를 나타낸다. (b) 다양한 출발 세포로부터 분류 후 7일 내지 9일에 단일 세포 유래 hiPSC 유사 콜로니의 대표적인 형태. 스케일 막대는 1000㎛를 나타낸다. (c) 96웰 플레이트에서 hiPSC 유사 콜로니의 NANOG 발현에 대한 면역세포화학. (d) 재프로그래밍하도록 유도되고 마트리겔 또는 비트로넥틴 코팅된 배양 플레이트에서 유지된 FTC007의 16일 흐름 프로필 분석. (e) 광시야 영상, (f) OCT4 및 NANOG에 대한 면역형광 또는 (g) 계속해서 마트리겔에서 또는 5회 계대배양 비트로넥틴에 대해 FMM에서 유지된 FTC016-c28의 SSEA4 및 TRA1-81에 대한 유세포분석법 분석.
도 11은 FMM 배양 플랫폼에 의한 최소 유전자 재프로그래밍의 예를 보여준다. (a) 하이그로마이신 선택 카세트를 함유하는 에피솜 작제물에 의한 형질감염 후 2일 내지 5일에 하이그로마이신에 의해 처리된 세포의 형태. (b) 재프로그래밍 풀을 더 긴 기간 동안 유지시키고, 형질감염 후 16일에 프로파일링하였다. (c) 마트리겔 또는 비트로넥틴에서 유지된 배양물의 외관.
도 12는 다수의 조건에서 배양된 hiPSC의 특징을 보여준다. (a) 렌티바이러스 유래하고 SMC4 유지된 FTi111은 다능성의 특징을 나타내고, 게놈 통합성을 유지시켰다. (b) FTi111 p43의 해동 전략의 도시. 단일 바이알을 기재된 바와 같이 4의 배양 환경으로 해동하였다. 생존한 배양물을 피더 세포에서 티아조비빈이 보충된 종래의 배양물을 제외하고 각각의 배양물에서 계대배양하고, 이것을 피더 세포의 존재 하에 티아조비빈이 없는 종래의 배양물로 이행하고, 덩어리로서 계대배양하였다. (c) 해동 후 다양한 배양물에서 회수하는 세포의 형태. 피더 세포의 존재 하에 티아조비빈이 없는 종래의 배양물에서 생존한 세포가 식별되지 않았다. (d) 해동 후 계대배양 3에서의 배양 세트의 형태. 더 큰 콜로니 형태는 종래의 배양물과 연관된다. 스케일 막대 1000㎛. (e) 각각의 배양 세트의 내인성 다능성 유전자 발현에 대한 qRT-PCR 분석. 데이터를 GAPDH로 및 H1 hESC에 대해 정규화하였다.
도 13은 다양한 조건에서 배양된 hiPSC의 유전자 발현 프로필의 유전자 존재론을 보여준다. (a) 전반적인 유전자 발현 연구에 기재된 각각의 라인의 유도 및 유지를 기술하는 표. (b) 전체 300개의 프로브 세트는 종래의 배양 조건과 소분자(FMM 및 SMC4) 배양 조건 사이에 차등적으로 2.5배 초과 또는 미만으로 발현되었다. 유클리드 거리 측정에 기초한 완전한 연결 방법을 이용한 300개의 프로브 세트에서의 계층적 클러스터링. (c) (소분자 배양과 비교하여) 종래의 배양에 의해 2.5배 이상 상향조절된 133개의 프로브 세트의 유전자 존재론 생물학적 과정 농후 분석(D.A.V.I.D.). (d) (종래의 배양과 비교하여) 소분자 배양에 의해 2.5배 이상 상향조절된 167개의 프로브 세트의 유전자 존재론 생물학적 과정 농후 분석(D.A.V.I.D.). (e) (종래의 배양과 비교하여) FMM 배양에 의해 2.5배 이상 상향조절된 126개의 프로브 세트의 유전자 존재론 생물학적 과정.
도 14는 재프로그래밍을 위해 사용된 렌티바이러스 작제물(a-b) 및 에피솜 작제물(c-f)의 예를 예시하는 클로닝 지도를 보여준다. 렌티바이러스 작제물은 전이유전자의 CRE 매개된 절제를 위한 EF1α 프로모터 및 LOXP 부위를 포함한다. 에피솜 작제물은 또한 EF1α 프로모터를 포함한다.
도 15a 내지 도 15c는 8일 내지 15일에 다양한 재프로그래밍 인자 조합에 대한 대표적인 흐름 분석을 보여준다. 인간 섬유아세포 세포를 OCT4, ECAT1 및 UTF1을 포함하는 렌티바이러스 매개된 재프로그래밍 인자의 다양한 조합에 의해 유도하였다.
도 16a 내지 도 16d는 21일 내지 27일에 다양한 재프로그래밍 인자 조합에 대한 대표적인 흐름 분석 및 iPSC 형태 특징을 보여준다. 데이터는 고유한 재프로그래밍 조합이 SSEA4+/TRA181+ hiPSC를 유래하도록 사용될 수 있다는 것을 보여준다.
도 17a 및 도 17b는 흐름 분석(SSEA4+/TRA181+ 및 CD30+ 집단) 및 iPSC 형태 특징에 의해 예시된 바와 같은 매우 증대된 렌티바이러스 재프로그래밍 효율을 보여준다. 인간 섬유아세포 세포를 OCT4, ECAT1, UTF1, ESRRB 및 NANOG에 의해 재프로그래밍하였다. 세포를 FRM을 사용하여 재프로그래밍하고, FMM에서 유지시켰다.
도 18a 내지 도 18d는 96웰 분류 후 7회 내지 9회 계대배양 후 확립된 4개의 iPSC 클론의 대표적인 흐름 분석 및 위상 영상을 보여준다. 클론을 FRM에 의해 렌티바이러스 재프로그래밍 인자(OCT4, ECAT1, UTF1, ESRRB 및 NANOG)에 의해 생성하고, FMM에서 유지시켰다. 높은 SSEA4+/TRA181+를 발현하는 집단은 다능성을 나타낸다.
도 19a 내지 도 19b는 렌티바이러스 재프로그래밍 인자 OCT4, ECAT1, UTF1, NANOG 및 ESRRB에 의해 재프로그래밍된 인간 섬유아세포 세포에서 OCT4 및 NANOG의 발현에 대한 대표적인 흐름 분석을 보여준다. 클론을 FRM을 사용하여 재프로그래밍하고, FMM에서 유지시켰다. 높은 OCT4+/NANOG+를 발현하는 집단은 다능성을 나타낸다.
도 20a 내지 도 20c는 렌티바이러스 재프로그래밍 인자 OCT4, ECAT1, UTF1, NANOG 및 ESRRB에 의해 재프로그래밍된 인간 섬유아세포 세포로부터 유래된 hiPSC 클론의 핵형 분석을 보여준다. 클론을 FRM을 사용하여 재프로그래밍하고, FMM에서 유지시켰다. 클론은 정상 수컷 핵형을 나타낸다.
도 21은 재프로그래밍 인자 조합 OCT4/NANOG/SOX2/LARGE T와 비교된 재프로그래밍 인자 조합 OCT4/ESRRB/NANOG/ECAT1/UTF1의 96웰 플레이트 분류 효율을 보여준다.
도 22a 및 도 22b는 (a) 4일, 6일 및 11일에 OCT4-P2A-OCT4 / NANOG-P2A-ESRRB-T2A-LIN28 / ECAT1-T2A-UTF1, 및 (b) 7일에 2개의 웰 및 10일에 1개의 웰에 대한 OCT4-P2A-ESRRB/OCT4-P2A-NANOG/ECAT1-T2A-UTF1에 의해 재프로그래밍된 세포에 대한 96웰의 증식 동안 콜로니의 영상을 보여준다.
도 23은 (a) 재프로그래밍 인자 화학량론 및 이소성 OCT4 발현을 가지는 세포의 선택을 위한 유전적 마커의 사용의 효과를 나타내는 흐름 분석의 결과의 요약, (b) OCT4의 선택 없이 에피솜 OCT4-P2A-NANOG-T2A-SOX2/SV40 큰 T 항원에 의해 재프로그래밍된 인간 섬유아세포의 흐름 분석, 및 (c) 에피솜 OCT4-P2A-NANOG-T2A-SOX2/SV40 큰 T 항원/OCT2-P2A-OCT4-퓨로마이신에 의해 재프로그래밍된 인간 섬유아세포에 대한 흐름 분석을 보여준다.
도 24는 CRE 매개된 절제 후 SSEA4+/TRA181+/CD30+ 96웰 플레이트 분류된 클론의 영상을 보여준다. 콜로니를 원래 인간 섬유아세포 세포로부터 유래된 iPSC 클론으로부터 분류하고, 렌티바이러스 인자 OCT4, ECAT1, UTF1, NANOG 및 ESRRB에 의해 재프로그래밍하고, 전이유전자에 대해 절제하였다. 분류된 콜로니는 iPSC 표현형을 보여준다.
도 25는 센다이 바이러스 벡터 NANOG-P2A-ESRRB-T2A-OCT4(NEO) 및 CDH1-P2A-ZIC3-T2A-HESRG(CZH)의 조합이 일찍 7일에 일찍 SSEA4 및 TRA181에 대해 양성인 세포의 집단을 효율적으로 제조하였다는 것을 보여준다.
도 26은, 재프로그래밍 인자 Oct4, Klf 및 Sox2 단독(A)을 함유하는 센다이 바이러스 벡터, 및 EcU(B), LDT1(C) 및 CZH(D)가 보충된 센다이 바이러스 벡터를 사용한 iPSC에 대한 섬유아세포 세포의 재프로그래밍을 나타내는, iPSC 마커 SSEA4+/TRA181+의 발현을 위한 형질감염 후 7일에 유세포분석법 분석을 보여준다.
도 27은 OKS, 및 OO, EcU, NEO, CZH 및 LDT1을 포함하는 추가의 인자 조합 중 하나를 사용한 재프로그래밍 섬유아세포 세포에서 iPSC 마커 SSEA4+/TRA181+의 발현을 위한 형질감염 후 20일에 유세포분석법 분석을 보여준다.
도 28은 0일 및 7일에 각각의 인자 조합의 이중 형질도입을 이용하여 재프로그래밍된 25일 세포에서 검출된 iPSC 마커 SSEA4+/TRA181+를 보여준다.
A. 개관
다능성 세포의 제조 및 유지를 위한 기존의 방법은 아직까지 자발적인 분화의 염려가 없는 발자국이 없는 다능성 세포의 균일한 배양을 실현하고, 고해상도/고클론성 단일 세포 계대배양 및 대규모 증식으로 수정 가능하지 않는다. 기저 상태 다능성 세포는 이들 도전 과제를 극복하는 품질 및 특징을 부여할 수 있다. 그러나, 현재까지 피더 비함유 조건에서 기저 상태 다능성 세포의 고속 생성에 대한 신뢰할 만하거나 탄탄한 방법이 존재하지 않는다. 따라서, 당해 분야에서의 기존의 방법은 산업 또는 임상 등급의 다능성 세포의 제조에 적합하지 않을 수 있다. 본 명세서에서 고려되는 발명은 기저 상태 다능성에서의 또는 이의 특징을 가지는 안정한 다능성 세포의 탄탄한 생성에 대한 수요를 해소하고, 산업 또는 임상 등급에 적합한 안정한 다능성 세포의 제조에서의 문제점을 해결한다.
일반적으로, 본 발명은 다능성 세포, 특히 감소한 자발적인 분화를 가지는 세포, 예컨대 기저 상태 다능성 세포의 개선된 제조를 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 더 특히, 본 발명은, 단계 특이적 방식으로 세포 신호 형질도입 경로의 소분자 조절제를 사용하고, 다능성 세포 유도 및 유지가 배양 방법 및 다능성 세포의 유도 방법이 하류 사용을 위한 가변성 및/또는 게이팅 활성의 소스가 더 이상 아닌 점까지 가능하게 하는, 다단계 배양 플랫폼에 관한 것이다. 더구나, 본 명세서에서 고려되는 배양 플랫폼은, 개선된 게놈 안정성, 개선된 미분화된 상태, 감소한 자발적인 분화, 개선된 배양 동종성, 단일 다능성 세포의 배양, 해리 및 계대배양 중 개선된 생존, 및 기저 상태 다능성으로의 전이유전자 또는 발자국 비함유 재프로그래밍 세포의 개선된 방법에 의한, 피더 비함유 조건에서 다능성 세포의 유도 및 유지가 가능하게 한다. 따라서, 본 명세서에서 고려되는 조성물 및 방법은 산업 및 임상 사용에 적절한 다능성 세포 및/또는 기저 상태 다능성 세포의 제조가 가능하게 한다.
현재까지 소분자 추진된 플랫폼은 재프로그래밍을 증대시키고, 인간 세포로부터 유래된 발자국이 없는 유도된 다능성 줄기 세포(iPSC)의 단일 세포 및 FF 배양을 지지하는 능력을 입증하지 못했다(Nichols and Smith, 2012). 본 명세서에서 고려되는 배양 플랫폼은, 부분적으로, 다능성 줄기 세포의 신속하고 탄탄한 재프로그래밍 및 안정한 장기간 배양이 가능하게 하는 단계 특이적 방식으로 소분자 저해제의 특정한 조합의 적용을 제공한다. 다양한 실시형태에서, 기저 상태 다능성을 포함하는 개선된 미분화된 다능성 상태를 유도하거나 유지하기 위한 배양 플랫폼이 제공된다. 본 명세서에서 고려되는 플랫폼은 또한 인간 iPSC(hiPSC)에서 기저 상태 다능성의 제조 및 유지를 위한 탄탄한 배양 시스템을 제공한다. 일 실시형태에서, 배양 플랫폼은 재프로그래밍의 전이유전자 또는 발자국이 없는 방법이 가능하게 한다. 특정한 실시형태에서, 본 명세서에서 고려되는 플랫폼은 전이유전자가 없는 hiPSC의 다수의 유도 및 유지에서 중요한 도전과제를 극복하는 hiPSC의 제조를 위한 개선된 방법을 나타낸다.
본 발명의 실행은, 구체적으로 달리 표시하지 않은 한, 당해 분야의 기술 내에 있는 화학, 생화학, 유기 화학, 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 기법, 유전학, 면역학, 세포 생물학, 줄기 세포 프로토콜, 세포 배양 및 형질전환 생물학의 종래의 방법을 이용할 것이고, 이들 중 대부분은 예시의 목적을 위해 하기 기재되어 있다. 이러한 기법은 문헌에 완전히 설명되어 있다. 예를 들어, 문헌[Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Edition, 2001)]을 참조한다.
본 명세서에 인용된 모든 공보, 특허 및 특허 출원은 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함된다.
B. 정의
달리 정의되지 않은 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 숙련자가 흔히 이해하는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 발명의 목적을 위해, 하기 용어는 하기 정의되어 있다.
관사 "일", "하나" 및 "이"는 관사의 문법적 목적어의 하나 또는 하나 초과(즉, 적어도 하나)를 의미하도록 본 명세서에서 사용된다. 예로서, "부재"는 하나의 부재 또는 하나 초과의 부재를 의미한다.
대안(예를 들어, "또는")의 사용은 대안의 하나, 둘 다, 또는 임의의 이들의 조합을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
용어 "및/또는"은 대안 중 하나 또는 둘 다를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "약" 또는 "대략"은 기준 분량, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이와 비교하여 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1%만큼 변하는 분량, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다. 일 실시형태에서, "약" 또는 "대략"은 기준 분량, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이의 ±15%, ±10%, ±9%, ±8%, ±7%, ±6%, ±5%, ±4%, ±3%, ±2%, 또는 ±1%의 분량, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이의 범위를 의미한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "실질적으로" 또는 "본질적으로"는 기준 분량, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이와 비교하여 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상인 분량, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다. 일 실시형태에서, 용어 "본질적으로 동일한" 또는 "실질적으로 동일한"은 기준 분량, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이와 거의 동일한 분량, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이의 범위를 의미한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "실질적으로 없는" 및 "본질적으로 없는"은 상호호환 가능하게 사용되고, 조성물, 예컨대 세포 집단 또는 배양 배지를 기재하도록 사용될 때, 기재된 물질이 없는, 예컨대 기재된 물질이 95% 없는, 96% 없는, 97% 없는, 98% 없는, 99% 없거나, 종래의 수단에 의해 측정된 바대로 검출 불가능한 조성물을 의미한다. 유사한 의미는, 조성물의 특정한 물질 또는 성분의 부재를 의미하는, 용어 "부재하다"에 적용될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "상당한"은 하나 이상의 표준 방법에 의해 용이하게 검출 가능한 분량, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이의 범위 또는 사건을 의미한다. 용어 "미미한" 및 "상당하지 않은" 및 등가물은 표준 방법에 의해 용이하게 검출 가능하지 않거나 검출 가능하지 않은 분량, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이의 범위 또는 사건을 의미한다. 일 실시형태에서, 사건은 시간의 5% 미만, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.1%, 0.01%, 0.001% 또는 이것 미만에 발생하는 경우 상당하지 않다.
본 명세서에 걸쳐, 문맥이 달리 요구하지 않는 한, 단어 "포함한다", "포함" 및 "포함하는"은 임의의 다른 단계 또는 요소 또는 단계 또는 요소의 그룹의 배제가 아니라 기재된 단계 또는 요소 또는 단계 또는 요소의 그룹의 포함을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 특정한 실시형태에서, 용어 "수반한다", "가진다", "함유한다" 및 "동반한다"는 동의어로 사용된다.
"이루어진"이란 구절 "이루어진"에 뒤따르는 어떤 것이든 포함하고 이들로 제한된다는 것을 의미한다. 따라서, 구절 "이루어진"은 기재된 요소가 필요하거나 강제이고, 다른 요소가 존재할 수 있다는 것을 나타낸다.
"본질적으로 이루어진"이란 구절 뒤에 기재된 임의의 요소를 포함하고, 기재된 요소에 대해 본 개시내용에 규명된 활성 또는 작용을 방해하지 않거나 이에 기여하는 다른 요소로 제한된다는 것을 의미한다. 따라서, 구절 "본질적으로 이루어진"은 기재된 요소가 필요하거나 강제이지만, 다른 요소가 옵션이 아니고, 기재된 요소의 활성 또는 작용에 영향을 미치는지 또는 아닌지에 따라 존재하거나 존재하지 않을 수 있다.
본 명세서에 걸쳐 "하나의 실시형태", "일 실시형태", "특정한 실시형태", "관련된 실시형태", "소정의 실시형태", "추가의 실시형태" 또는 "추가의 실시형태" 또는 이들의 조합에 대한 언급은 실시형태와 연결되어 기재된 특정한 특성, 구조 또는 특징이 적어도 하나의 본 발명의 실시형태에 포함된다는 것을 의미한다. 따라서, 본 명세서에 걸쳐 다양한 자리에서의 상기 구문의 출현은 반드시 모두 동일한 실시형태를 의미할 필요는 없다. 더욱이, 특정한 특성, 구조 또는 특징은 하나 이상의 실시형태에서 임의의 적합한 방식으로 조합될 수 있다.
용어 "생체외"는 일반적으로 유기체 외부에 생기는 활성, 예컨대 바람직하게는 자연 조건의 최소 변경으로 유기체 외부의 인공 환경에서 살아 있는 조직에서 또는 내에 수행된 실험 또는 측정을 의미한다. 특정한 실시형태에서, "생체외" 절차는 유기체로부터 취해지고, 보통 무균 조건 하에 상황에 따라 통상적으로 수 시간 또는 약 24시간 이하(그러나 48시간 또는 72시간 이하 포함) 동안 실험실 장치에서 배양된 살아 있는 세포 또는 조직을 수반한다. 소정의 실시형태에서, 이러한 조직 또는 세포는 수집되고 동결되고, 이후 생체외 처리를 위해 해동될 수 있다. 살아 있는 세포 또는 조직을 사용하여 수 일보다 길게 지속하는 조직 배양 실험 또는 절차는 통상적으로 "시험관내"인 것으로 고려되지만, 소정의 실시형태에서, 이 용어는 생체외와 상호 호환 가능하게 사용될 수 있다.
용어 "생체내"는 일반적으로 유기체 내에 생기는 활성을 의미한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "재프로그래밍" 또는 "탈분화" 또는 "세포 효력의 증가" 또는 "발생 효력의 증가"는 세포의 효력을 증가시키거나 세포를 덜 분화된 상태로 분화시키는 방법을 의미한다. 예를 들어, 세포 효력이 증가한 세포는 재프로그래밍되지 않은 상태에서의 동일한 세포와 비교하여 더 발생적인 가소성을 가진다(즉, 더 많은 세포 유형으로 분화할 수 있다). 다른 말로, 재프로그래밍된 세포는 재프로그래밍되지 않은 상태에서의 동일한 세포보다 덜 분화된 상태인 것이다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "효력"은 세포에 접근 가능한 모든 발생 옵션의 합(즉, 발생 효력)을 의미한다. 당해 분야의 숙련자는 세포 효력이 최대의 발생 효력을 가지는 분화전능 줄기 세포인 최대의 가소성 세포로부터 최소의 발생 효력을 가지는 말단으로 분화된 세포인 최소의 가소성 세포에 이르는 연속체라는 것을 인식할 것이다. 세포 효력의 연속체는 분화전능 세포, 다능성 세포, 다분화능 세포, 소분화능 세포, 단분화능 세포 및 말단으로 분화된 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "다능성"은 신체 또는 세포체(즉, 적절한 배아)의 모든 계열을 형성하는 세포의 능력을 의미한다. 예를 들어, 배아 줄기 세포는 외배엽, 중배엽 및 내배엽의 3개의 배엽 층의 각각으로부터 세포를 형성할 수 있는 다능성 줄기 세포의 유형이다.
다능성은, 부분적으로 세포의 다능성 특징을 평가함으로써 결정될 수 있다. 다능성 특징은 (ⅰ) 다능성 줄기 세포 형태; (ⅱ) 비제한된 자기 재생에 대한 잠재력; (ⅲ) 다능성 줄기 세포 마커, 예를 들어 SSEA1(마우스 단독), SSEA3/4; SSEA5, TRA1-60/81; TRA1-85, TRA2-54, GCTM-2, TG343, TG30, CD9, CD29, CD133/프로미닌, CD140a, CD56, CD73, CD90, CD105, OCT4, NANOG, SOX2, CD30 및/또는 CD50(이들로 제한되지는 않음)의 발현; (ⅳ) 모든 3개의 체성 계열(외배엽, 중배엽 및 내배엽)로 분화하는 능력; (ⅴ) 3개의 체성 계열로 이루어진 기형종 형성; 및 (ⅵ) 3개의 체성 계열로부터의 세포로 이루어진 배양체의 형성을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
2개의 유형의 다능성은 이전에 기재되어 있다: 후기 배반포의 외배반 줄기 세포(EpiSC)에 유사한 다능성의 "프라이밍된" 또는 "준안정한" 상태 및 초기/착상전 배반포의 내부 세포 덩어리에 유사한 다능성의 "나이브" 또는 "기저" 상태. 다능성 상태 둘 다가 상기 기재된 바와 같은 특징을 나타내지만, 나이브 또는 기저 상태는 (ⅰ) 암컷 세포에서의 X 염색체의 예비불활성화 또는 재활성화, (ⅱ) 단일 세포 배양 동안 개선된 클론성 및 생존, (ⅲ) DNA 메틸화의 전반적인 감소, (ⅳ) 발생 조절 유전자 프로모터에서의 H3K27me3 억제 염색질 마크 침착의 감소, 및 (ⅴ) 프라이밍된 상태 다능성 세포에 비해 분화 마커의 감소한 발현을 추가로 나타낸다. 외인성 다능성 유전자가 체세포로 도입되고 발현되고 이후 침묵화되거나 생성된 다능성 세포로부터 제거된 세포 재프로그래밍의 표준 방법론은 일반적으로 다능성의 프라이밍된 상태의 특징을 가지는 것으로 보인다. 표준 다능성 세포 배양 조건 하에, 이러한 세포는 외인성 전이유전자 발현이 유지되지 않는 한 프라이밍된 상태로 있고, 여기서 기저 상태의 특징이 관찰된다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "다능성 줄기 세포 형태"는 배아 줄기 세포의 전통적인 형태학적 특징을 의미한다. 정상 배아 줄기 세포 형태는, 높은 핵 대 세포질 비율, 핵소체의 눈에 띄는 존재 및 통상적인 세포간 공간으로, 형상이 둥글고 작은 것을 특징으로 한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "유전자 발현 프로필", "유전자 발현 서명", "유전자 발현 패널", "유전자 패널" 또는 "유전자 서명"은 또 다른 세포 또는 세포의 집단으로부터 세포 또는 세포의 집단을 구별하도록 작용하는 복수의 유전자의 발현 또는 발현의 수준을 의미한다. 예를 들어, 자발적인 분화를 방지하도록 배지에서 유지된 다능성 세포의 집단은 동일한 배지에서 유지되지 않은 동일한 기원의 다능성 세포의 대조군 집단에 비해 분화 유전자의 감소한 발현을 포함하는 유전자 발현 프로필을 나타낼 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "분화 마커 유전자" 또는 "분화 유전자"는 발현이 다능성 세포와 같은 세포 내에 발생하는 세포 분화를 나타내는 유전자를 의미한다. 분화 마커 유전자는 FOXA2, FGF5, SOX17, XIST, NODAL, COL3A1, OTX2, DUSP6, EOMES, NR2F2, NR0B1, CXCR4, CYP2B6, GATA3, GATA4, ERBB4, GATA6, HOXC6, INHA, SMAD6, RORA, NIPBL, TNFSF11, CDH11, ZIC4, GAL, SOX3, PITX2, APOA2, CXCL5, CER1, FOXQ1, MLL5, DPP10, GSC, PCDH10, CTCFL, PCDH20, TSHZ1, MEGF10, MYC, DKK1, BMP2, LEFTY2, HES1, CDX2, GNAS, EGR1, COL3A1, TCF4, HEPH,kDR, TOX, FOXA1, LCK, PCDH7, CD1D FOXG1, LEFTY1, TUJ1, T 유전자(Brachyury) 및 ZIC3의 유전자를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "분화 마커 유전자 프로필" 또는 "분화 유전자 프로필", "분화 유전자 발현 프로필", "분화 유전자 발현 서명", "분화 유전자 발현 패널", "분화 유전자 패널" 또는 "분화 유전자 서명"은 복수의 분화 마커 유전자의 발현 또는 발현 수준을 의미한다.
특정한 실시형태에서, 감소한 자발적인 분화를 나타내는 다능성 세포의 집단은 분화 마커 유전자 또는 분화 마커 유전자 프로필의 발현의 감소를 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, 다능성 세포 또는 다능성 세포의 집단에서의 감소한 자발적인 분화는 배양 조건의 소정의 세트가, 동일한 배양 조건이 부족한 대조군 다능성 세포 또는 다능성 세포의 집단의 분화 마커 유전자의 발현과 비교하여, 적어도 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 이것 초과의 하나 이상의 분화 마커 유전자의 발현을 감소시키는 경우 나타날 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "유전자 발현"은 생물학적 샘플, 예컨대 다능성 세포 또는 다능성 세포를 포함하는 세포의 집단에서의 유전자의 발현의 상대 수준 및/또는 발현의 패턴을 의미한다. 특정한 실시형태에서, 다능성 세포는 iPSC이다.
본 발명의 세포를 규명하는 유전자의 발현을 검출하기 위해 당해 분야에서 이용 가능한 임의의 방법은 본 명세서에 포함된다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "발현을 검출하는 것"은 유전자의 RNA 전사체 또는 이의 발현 생성물의 분량 또는 존재를 결정하는 것을 의미한다. 유전자의 발현을 검출하는 방법, 즉 유전자 발현 프로파일링은 폴리뉴클레오타이드의 혼성화 분석에 기초한 방법, 폴리뉴클레오타이드의 서열분석에 기초한 방법, 면역조직화학 방법 및 단백체학 기반 방법을 포함한다. 상기 방법은 일반적으로 관심 있는 유전자의 발현 생성물(예를 들어, mRNA)을 검출한다. 몇몇 실시형태에서, PCR 기반 방법, 예컨대 역전사 PCR(RT-PCR)(Weis et al., TIG 8:263-64, 1992) 및 어레이 기반 방법, 예컨대 마이크로어레이(Schena et al., Science 270:467-70, 1995)를 사용한다.
"부착한다"는 적절한 배양 배지의 존재 하에 용기에 부착하는 세포, 예를 들어 무균 플라스틱(또는 코팅된 플라스틱) 세포 배양 접시 또는 플라스크에 부착하는 세포를 의미한다. 세포의 소정의 종류는, 이것이 세포 배양 용기에 부착하지 않는 한, 배양물 중에 지속하지 않거나 성장하지 않는다. 세포("비부착성 세포")의 소정의 종류는 부착하지 않으면서 배양물 중에 유지되고/되거나 증식한다.
"배양" 또는 "세포 배양"은 시험관내 환경에서의 세포의 유지, 성장 및/또는 분화를 의미한다. "세포 배양 배지", "배양 배지"(각각의 경우에 단수 "배지"), "보충제" 및 "배양 보충제"는 세포 배양을 배양하는 영양소 조성물을 의미한다.
"배양한다"는 예를 들어 무균 플라스틱(또는 코팅된 플라스틱) 세포 배양 접시 또는 플라스크에서 조직 또는 신체의 밖에서 세포의 지속, 전파(성장) 및/또는 분화를 의미한다. "배양"은 세포를 전파하고/지속시키는 데 도움을 주는 영양소, 호르몬 및/또는 다른 인자의 공급원으로서 배양 배지를 사용할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "해리된" 세포는 다른 세포 또는 표면(예를 들어, 배양 플레이트 표면)으로부터 실질적으로 분리되거나 정제된 세포를 의미한다. 예를 들어, 세포는 기계적 방법 또는 효소에 의한 방법에 의해 동물 또는 조직으로부터 해리될 수 있다. 대안적으로, 시험관내 응집하는 세포는, 예컨대 클러스터, 단일 세포 또는 단일 세포 및 클러스터의 혼합물의 현탁액으로 효소에 의해 또는 기계적으로 해리함으로써, 서로로부터 해리될 수 있다. 더욱 또 다른 대안적인 실시형태에서, 부착성 세포는 배양 플레이트 또는 다른 표면으로부터 해리된다. 해리는 따라서 세포외 매트릭스(ECM)와 기질(예를 들어, 배양 표면) 사이의 세포 상호작용의 파괴 또는 세포 사이의 ECM의 파괴를 수반한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "농후시킨다" 및 "농후화"는 조성물에서 기재된 성분, 예컨대 세포의 조성물의 양의 증가를 의미하고, "농후화된"은, 세포의 조성물, 예컨대 세포 집단을 기재하도록 사용될 때, 농후화되기 전의 세포의 집단에서의 이러한 성분의 비율과 비교하여, 기재된 성분에 비율적으로 증가한 양을 가지는 세포의 집단을 의미한다. 예를 들어, 조성물, 예컨대 세포의 집단은 표적 세포 유형(즉, 기재된 특징을 가지는 세포)과 관련하여 농후화될 수 있어서, 농후화되기 전의 세포의 집단에 존재하는 표적 세포의 비율과 비교하여, 표적 세포 유형의 증가한 비율 또는 백분율을 가진다. 세포의 집단은 당해 분야에 공지된 세포 선택 및 분류 방법에 의해 표적 세포 유형에 대해 농후화될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 세포의 집단은 본 명세서에서의 실시예에 기재된 바와 같은 분류 또는 선택 과정에 의해 농후화된다. 특정한 실시형태에서, 표적 세포 집단에 대해 농후화시키는 방법은 표적 세포 집단과 관련하여 세포 집단을 적어도 약 20%만큼 농후화시키고, 이는 농후화된 세포 집단이 그 집단을 농후화시키기 전의 집단에서보다 약 20% 초과의 표적 세포 유형을 비례하여 포함한다는 것을 의미한다. 일 실시형태에서, 표적 세포 집단에 대해 농후화시키는 방법은 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99%, 또는 적어도 약 99.5%, 또는 특정한 실시형태에서, 약 99.9%만큼 비례하여 표적 세포 집단과 관련하여 세포 집단을 농후화시킨다.
소정의 실시형태에서, 세포의 집단은 다능성 세포 또는 다능성 특징을 나타내는 세포의 양과 관련하여 농후하다. 본 발명의 특정한 실시형태에서, 재프로그래밍을 겪은 세포의 집단은 다능성의 특징, 예컨대 다능성 마커, 예를 들어 제한 없이, SSEA3, SSEA4, TRA 1-60, TRA-1-81, CD30 또는 CD50의 발현을 가지는 표적 세포에 대해 농후화된다.
특정한 실시형태에서, 세포의 집단, 예컨대 재프로그래밍을 겪은 세포의 집단은, 예를 들어 CD13, CD26, CD34, CD45, CD31, CD46 또는 CD7을 포함할 수 있는, 분화된 세포 계열 또는 비다능성 세포에 특이적인 표면 마커를 사용하여 비다능성 세포가 고갈된다. 생성된 세포 집단은 따라서 다능성 세포에 대해 농후화된 세포의 집단으로 기재될 수 있다.
특정한 실시형태에서, 농후화된 세포는 구별되는 유전자 또는 단백질 발현 프로필, 예를 들어 SSEA3, SSEA4, TRA 1-60, TRA-1-81, CD30 및 CD50과 같은 적어도 2개의 다능성 마커의 세포 표면 발현을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 농후화된 세포는 2개 이상의 다능성 마커를 포함한다. 특정한 실시형태에서, 농후화된 세포는 TRA-181 또는 TRA-160과 조합되어 SSEA4를 발현한다. 더 특정한 실시형태에서, 농후화된 세포는 SSEA4, TRA181 및 CD30을 발현한다. 일 실시형태에서, 세포의 집단은 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99%의 농후화된 세포, 예컨대 다능성 세포를 포함한다.
따라서, 몇몇 실시형태에서, 다능성 세포에 대한 세포의 집단을 농후화하는 방법은 SSEA3, SSEA4, TRA 1-60, TRA-1-81, CD30 및 CD50과 같은 다능성 마커의 세포 표면 발현에 기초하여 세포 집단을 분류하는 단계 및 다능성 세포에 대해 농후화된 세포의 집단을 수득하도록 이러한 마커를 발현하는 세포의 분획을 수집하는 단계를 포함한다. 다른 실시형태에서, 세포의 집단은 CD13, CD26, CD34, CD45, CD31, CD46 및 CD7과 같은 분화하는 또는 분화된 세포의 마커의 세포 표면 발현에 기초하여 세포 집단을 분류하고, 다능성 세포에 대해 농후화된 세포의 집단을 수득하도록 이러한 세포의 세포의 집단을 고갈시킴으로써 다능성 세포에 대해 농후화된다. 특정한 실시형태에서, 세포 집단은 CD13의 발현에 기초하여 분류되고, CD13+ 세포는 다능성 세포에 대해 농후화된 세포의 집단을 수득하도록 세포 집단으로부터 제거된다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "피더 세포" 또는 "피더"는, 피더 세포가 제2 세포 유형의 지지를 위해 성장 인자 및 영양소를 제공하면서, 제2 유형의 세포가 성장할 수 있는 환경을 제공하도록 제2 유형의 세포와 동시배양되는 일 유형의 세포를 기재하도록 사용된 용어이다. 피더 세포는 임의로 이것이 지지하는 세포와 상이한 종 유래이다. 예를 들어, 줄기 세포를 포함하는 인간 세포의 소정의 유형은 마우스 배아 섬유아세포 및 불멸화된 마우스 배아 섬유아세포의 1차 배양에 의해 지지될 수 있다. 피더 세포는 조사 또는 유사분열방지 물질, 예컨대 미토마이신 c에 의한 처리에 의해 다른 세포와 동시배양될 때 이것이 지지하는 세포가 과성장하는 것을 막도록 통상적으로 불활성화될 수 있다. 상기를 제한하지 않으면서, 하나의 특정한 피더 세포 유형은 인간 피더, 예컨대 인간 피부 섬유아세포일 수 있다. 또 다른 피더 세포 유형은 마우스 배아 섬유아세포(mouse embryonic fibroblast: MEF)일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "피더 비함유"(FF) 환경은 피더 세포가 본질적으로 없고/없거나, 피더 세포의 배양에 의해 예비 컨디셔닝되지 않은 세포 배양 또는 배양 배지와 같은 환경을 의미한다. "예비 컨디셔닝된" 배지는 피더 세포가 일정한 시간의 기간, 예컨대 적어도 1일 동안 배지 내에 배양된 후 수확된 배지를 의미한다. 예비 컨디셔닝된 배지는 배지 중에 배양된 피더 세포에 의해 분비되는 사이토카인 및 성장 인자를 포함하는 많은 매개자 물질을 함유한다.
게놈 안정성은 DNA를 충실하게 복제하고 DNA 복제 과정의 통합성을 유지시키는 세포의 능력을 의미한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "게놈에 의해 안정한 세포" 및 "게놈 안정성을 가지는 세포"는 정상 체성 인간 세포에 비해 돌연변이 및 염색체 이상의 빈도와 실질적으로 유사한 돌연변이 및 염색체 이상(예컨대, 전이, 이수성, 카리수 변이 및 중복)의 빈도를 나타내는 세포를 의미한다.
"성분"은 세포의 성장 및/또는 분화를 유지하고/하거나 촉진하도록 세포 배양 배지에서 사용될 수 있는, 기원이 화학적 또는 생물학적이든, 임의의 화합물 또는 다른 재료를 의미한다. 용어 "성분", "영양소" 및 "성분"은 상호 호환 가능하게 사용될 수 있다. 세포 배양 배지에 사용된 종래의 성분은 아미노산, 염, 금속, 당, 지질, 핵산, 호르몬, 비타민, 지방산, 단백질 등을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 생체외 세포의 배양을 촉진하고/하거나 유지시키는 다른 성분은 원하는 효과에 필요한 바대로 당해 분야의 숙련자에 의해 선택될 수 있다.
"단리한다" 또는 "단리하는"은 자연 환경으로부터 조성물 또는 재료를 분리하고 수집하는 것, 예컨대 조직 또는 신체로부터 개별 세포 또는 세포 배양물을 분리하는 것을 의미한다. 일 양태에서, 세포의 집단 또는 조성물은 세포 및 자연에서 이것이 연관될 수 있는 재료가 실질적으로 없다. 표적 세포의 집단과 관련하여 "단리된" 또는 "정제된" 또는 "실질적으로 순수한"은 전체 세포 집단을 구성하는 표적 세포와 관련하여 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%인, 특정한 실시형태에서, 적어도 약 95% 순수한 세포의 집단을 의미한다. 세포의 집단 또는 조성물의 순도는 당해 분야에 널리 공지된 적절한 방법에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 실질적으로 순수한 다능성 세포의 집단은 전체 세포 집단을 구성하는 다능성 세포와 관련하여 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%인, 특정한 실시형태에서 적어도 약 95%, 및 소정의 실시형태에서 약 98% 순수한 세포의 집단을 의미한다. 용어 "본질적으로 순수한"은 본 명세서에서 "실질적으로 순수한"과 상호 호환 가능하게 사용된다.
"계대배양" 또는 "계대배양하는"은, 세포가 원하는 정도로 증식할 때, 다수의 세포 배양 표면 또는 용기로 세포를 세분하고 플레이팅하는 작용을 의미한다. 몇몇 실시형태에서, "계대배양" 또는 "계대배양하는"은 세포를 세분하고 희석하고 플레이팅하는 것을 의미한다. 세포가 1차 배양 표면 또는 용기로부터 후속하는 세트의 표면 또는 용기로 계대배양되면서, 후속하는 배양은 본 명세서에서 "제2 배양" 또는 "제1 계대배양" 등으로 칭해질 수 있다. 새로운 배양 용기로 세분하고 플레이팅하는 각각의 작용은 하나의 계대배양으로 생각된다.
"플레이팅"은 세포가 세포 배양 용기에 부착하고 이에 분산되도록 세포 또는 세포들을 배양 용기에 위치시키는 것을 의미한다.
"다능성 인자"는, 단독으로 또는 다른 물질과 조합되어, 세포의 발생 효력을 증가시킬 수 있는 물질을 의미한다. 다능성 인자는, 제한 없이, 세포의 발생 효력을 증가시킬 수 있는 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 및 소분자를 포함한다. 예시적인 다능성 인자는 예를 들어 전사 인자 및 소분자 재프로그래밍 물질을 포함한다.
"증식한다"는 하나의 세포가 2개의 본질적으로 동일한 세포 또는 세포의 집단으로 분열하여 수를 증가시키는(예를 들어, 생식하는) 경향을 의미한다.
"전파"는 예를 들어 무균 용기, 예컨대 플라스틱(또는 코팅된 플라스틱) 세포 배양 접시 또는 플라스크에서 조직 또는 신체 밖에서 자라는(예를 들어, 세포 증식을 통해 생식하는) 세포를 의미한다.
"1차 배양"은 단리된 세포가 배양 배지를 가지는 제1 배양 용기에 위치하는 세포, 조직 및/또는 배양물을 의미한다. 세포, 조직 및/또는 배양물은 지속하고/하거나 증식할 수 있지만, 세포, 조직 및/또는 배양물이 제1 용기에 있는 한, 세포, 조직 및/또는 배양물은 1차 배양이라 칭해진다.
용어 "소분자 재프로그래밍 물질" 또는 "소분자 재프로그래밍 화합물"은 본 명세서에서 상호 호환 가능하게 사용되고, 단독으로 또는 다른 다능성 인자와 조합되어, 세포의 발생 효력을 증가시킬 수 있는 소분자를 의미한다. "소분자"는 약 5kD 미만, 약 4kD 미만, 약 3kD 미만, 약 2kD 미만, 약 1kD 미만 또는 약 .5kD 미만의 분자량을 가지는 물질을 의미한다. 소분자는 핵산, 펩티도미메틱, 펩토이드(peptoid), 탄수화물, 지질 또는 다른 유기 또는 무기 분자를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 소정의 실시형태에서, 진균, 박테리아 또는 조류 추출물과 같은 화학 및/또는 생물학적 혼합물의 라이브러리는 당해 분야에 공지되어 있고, 소분자의 공급원으로서 사용될 수 있다. 특정한 실시형태에서, 본 명세서에서 사용되는 소분자 재프로그래밍 물질은 10,000 달톤 미만, 예를 들어 8000 미만, 6000, 4000, 2000 달톤, 예를 들어 50 내지 1500, 500 내지 1500, 200 내지 2000, 500 내지 5000 달톤의 분자량을 가진다.
감염의 다중도(multiplicity of infection: MOI)는 감염 동안 세포마다 첨가되는 비리온의 수를 의미한다. 100만 개의 비리온이 100만 개의 세포에 첨가되면, MOI는 1이다. 1000만 개의 비리온이 첨가되면, MOI는 10이다. 100,000개의 비리온을 첨가하고, MOI는 0.1이다.
C. 세포
특정한 실시형태에서, 하나 이상의 세포는 본 명세서에서 고려되는 조성물 및 방법을 이용하여 배양되고 해리되고 계대배양될 수 있다. 일 실시형태에서, 단일 세포는 본 명세서에서 고려되는 조성물 및 방법을 이용하여 배양되고 해리되고 계대배양된다. 또 다른 실시형태에서, 세포 또는 복수의 세포의 집단은 본 명세서에서 고려되는 조성물 및 방법을 이용하여 배양되고 해리되고 계대배양된다.
특정한 실시형태에서 사용하기에 적합한 세포의 출발 집단은 본질적으로 임의의 적합한 공급원으로부터 유래할 수 있고, 세포 유형 또는 다능성의 상태와 관련하여 불균일 또는 균일할 수 있다. 적합한 세포는 태아 세포 및 성체 세포를 포함한다. 또한, 적합한 세포는 예를 들어 설치류, 고양이, 개, 돼지, 염소, 양, 말, 소 또는 영장류로부터의 기원에서 포유류일 수 있다. 일 실시형태에서, 세포는 인간 세포이다.
세포는 체성, 비다능성, 불완전하게 또는 부분적으로 다능성인 줄기 세포, 다분화능 세포, 소분화능 세포, 단분화능 세포, 말단 분화된 세포 또는 상기의 임의의 조합을 포함하는 세포의 혼합된 집단일 수 있다. 특정한 실시형태에서 사용하기에 적합한 다능성 세포는 천연 발생 줄기 세포, 배아 줄기 세포 또는 iPSC를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 세포의 "혼합된" 집단은 다양한 정도의 발생 효력의 세포의 집단이다. 예를 들어, 세포의 혼합된 집단은 재프로그래밍을 겪는 세포를 포함할 수 있어서, 혼합된 집단은 다능성 세포, 부분적으로 다능성인 세포 및 비다능성 세포, 예컨대 완전히 분화된 세포를 포함한다.
일 실시형태에서, 세포의 출발 집단은 성체 또는 신생아 줄기/전구체 세포로부터 선택된다. 특정한 실시형태에서, 줄기/전구체 세포의 출발 집단은 중배엽성 줄기/전구체 세포, 내배엽성 줄기/전구체 세포 및 외배엽성 줄기/전구체 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
중배엽성 줄기/전구체 세포의 예시적인 예는 중배엽성 줄기/전구체 세포, 내피 줄기/전구체 세포, 골수 줄기/전구체 세포, 탯줄 줄기/전구체 세포, 지방 조직 유래 줄기/전구체 세포, 조혈 줄기/전구체 세포(HSC), 간충직 줄기/전구체 세포, 근육 줄기/전구체 세포, 신장 줄기/전구체 세포, 조골세포 줄기/전구체 세포, 연골세포 줄기/전구체 세포 등을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
외배엽성 줄기/전구체 세포의 예시적인 예는 신경 줄기/전구체 세포, 망막 줄기/전구체 세포, 피부 줄기/전구체 세포 등을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
내배엽성 줄기/전구체 세포의 예시적인 예는 간 줄기/전구체 세포, 췌장 줄기/전구체 세포, 상피 줄기/전구체 세포 등을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
소정의 실시형태에서, 세포의 출발 집단은 췌도 세포, CNS 세포, PNS 세포, 심근 세포, 골격근 세포, 평활근 세포, 조혈 세포, 골 세포, 간 세포, 지방 세포, 신장 세포, 폐 세포, 연골세포, 피부 세포, 여포성 세포, 혈관 세포, 상피 세포, 면역 세포, 내피 세포 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 세포의 불균일한 또는 균일한 집단일 수 있다.
D. 자발적인 분화를 감소시키고 기저 상태 다능성을 유도하기 위한 배양 플랫폼
세포 뱅킹, 질환 모델링 및 세포 치료 분야는 고품질의 다능성 세포의 제조에 대한 증가하는 수요를 두었다. 예를 들어, 발자국이 없는 iPSC의 고속 유도 및 규모화된 제조를 허용하는 시스템에서의 이의 증식은 기술적으로 찾기 힘들게 있다. 특정한 실시형태에서, 단계 특이적 배지 조성물에서 소분자 경로 저해제를 사용한 다능성 세포의 신속하고 병행하는 생성, 선택 및 증식을 허용하는 배양 플랫폼이 고려된다. 본 명세서에서 고려되는 플랫폼은 완전한 피더 비함유 환경에서 최소 재프로그래밍 인자를 사용한 효율적이고 촉진된 재프로그래밍을 지지하고; 균일한 및 게놈에 의해 안정한 다능성 집단을 유지하면서 다능성 세포의 단일 세포 배양 및 증식이 가능하게 한다. 더구나, 본 명세서에서 고려되는 배양 플랫폼은 유전적 배경과 무관하게 전이유전자 발현과 독립적으로 자발적인 분화의 감소한 상태 및 다능성의 일반 기저 상태로 hESC 및 hiPSC를 포함하는 다능성 세포를 배양하는 것을 제공한다.
본 명세서에서 고려되는 배양 플랫폼은, 부분적으로, 배양에서 감소한 자발적인 분화를 가지는 산업 또는 임상 등급의 다능성 세포의 제조에 유용하다. 일 실시형태에서, 비다능성 세포는 다능성 세포가 되도록 유도되고, 다능성을 유지시키도록 배양된다. 또 다른 실시형태에서, 비다능성 세포는 다능성 세포가 되도록 유도되고, 배양에서 감소한 자발적인 분화를 달성하고/하거나 유지시키도록 배양된다. 또 다른 실시형태에서, 비다능성 세포는 다능성 세포가 되도록 유도되고, 기저 상태 다능성을 달성하고/하거나 유지시키도록 배양된다.
다양한 실시형태에서, 본 명세서에서 고려되는 배양 플랫폼은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90, 100 또는 이것 초과의 계대배양(임의의 개재 수의 계대배양 포함) 동안 하나 이상의 다능성 세포의 기저 상태 다능성, 정상 핵형 및 게놈 안정성을 유지한다.
다른 실시형태에서, 본 명세서에서 고려되는 배양 플랫폼은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90, 100 이것 초과의 계대배양(임의의 개재 수의 계대배양 포함) 동안 하나 이상의 다능성 세포에서의 감소한 자발적인 분화를 유지한다.
일 실시형태에서, 배양 플랫폼은 세포 배양 배지 및 GSK-3 저해제, MEK 저해제 및 Rho 키나제(ROCK) 저해제를 포함하는 세포 배양 배지를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 본 명세서에서 고려되는 세포 배양 배지는 TGFβ/액티빈 신호전달 경로의 저해제, 예를 들어 TGFβ 수용체(TGFβR) 저해제 및 ALK5 저해제를 포함하지 않는다. 임의의 특정한 이론에 구속되고자 바라지 않으면서, 본 발명자들은 놀랍게도 TGFβR/ALK5 저해제가 재프로그래밍의 효율을 증가시키지만, 이 저해제가 다능성 세포 집단의 장기간 유지, 품질 및 동종성에 대항한다는, 즉 TGFβ 경로 신호전달의 저해가 세포 재프로그래밍의 효율을 개선하였지만, 다능성 세포 집단의 후속하는 유지에 시험관내 배양 시스템, 특히 감소한 자발적인 분화를 가지는 균일한 다능성 집단이 바람직하고, 더 특히 전이유전자 발현이 부재한, 피더 세포 비함유 및 단일 세포, 효소 계대배양을 사용하는 시스템에서 이 저해로부터의 완화가 필요하다는 것을 발견하였다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, 계대배양의 수(이것으로 제한되지 않음)에 의해 측정되는 바와 같은 용어 "장기간"은 대개 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 또는 이것 초과의 계대배양을 의미한다. 정의된 바대로, "계대배양"은 세포가 원하는 정도로 증식할 때 다수의 세포 배양 표면 또는 용기로 세포를 하위분할하고 플레이팅하는 작용을 의미한다. 또한, 본 명세서에 개시된 바와 같은, GSK-3 저해제 및 MEK 저해제 및 임의로 ROCK 저해제를 포함하고 TGFβR/ALK5 저해제가 부족한 배지에서 준안정한 다능성 세포를 배양하는 것은 다능성 세포를 이행시켜 감소한 자발적인 분화를 달성하고/하거나, 기저 상태 다능성을 달성한다. 본 명세서에서 고려되는 배양 배지 플랫폼은 또한 피더 비함유 환경에서 다능성 세포의 효율적인 재프로그래밍 및 장기간 배양이 가능하게 한다. 추가로, "ALK5 저해제"가 비특이적 키나제 저해제를 포함하는 것으로 의도되지 않지만, "ALK5 저해제"는 ALK5, 예를 들어 SB- 431542 등 이외에 ALK4 및/또는 ALK7을 저해하는 저해제를 포함하는 것으로 이해되어야 한다(예를 들어, 문헌[Inman, et al., J Mol. Pharmacol. 62(1): 65-74 (2002]을 참조한다).
바람직한 실시형태에서, 배양 플랫폼은 GSK-3 저해제, MEK 저해제, Rho 키나제(ROCK) 저해제 및 임의로, LIF 및/또는 bFGF를 포함하는 세포 배양 배지를 포함하고, TGFβ/액티빈 신호전달 경로의 소분자 저해제, 예를 들어 TGFβR 또는 ALK5 저해제(이들로 제한되지는 않음)를 포함하지 않는다.
추가의 실시형태에서, 세포 배양 배지는 실질적으로 사이토카인 및/또는 성장 인자가 없고, 임의로 피더 비함유 환경이다. 다른 실시형태에서, 세포 배양 배지는 보충제, 예컨대 혈청, 추출물, 성장 인자, 호르몬, 사이토카인 등을 함유한다.
하나의 바람직한 실시형태에서, 배양 플랫폼은 피더 비함유 배양물을 포함한다.
본 명세서에서 고려되는 배양 플랫폼은 또한 다수의 이점, 예컨대 감소한 자발적인 분화를 가지고/가지거나, 기저 상태 다능성을 달성하는 산업 또는 임상 등급의 다능성 세포의 균일한 집단의 제조를 제공한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "균일한"은 각각의 세포가 집단에서의 다른 세포와 동일하거나 실질적으로 동일한 세포의 집단을 의미한다. 일 실시형태에서, 세포는 각각의 세포가 본 명세서에서 고려되는 바와 같은 하나 이상의 동일한 다능성 마커, 예를 들어 SSEA4 및 TRA1-81을 발현하는 경우 집단에서의 다른 세포와 동일하다. 일 실시형태에서, 집단은 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 이것 초과의 세포가 집단에서의 다른 세포와 동일하거나 실질적으로 동일한 경우 균일하다.
1. TGFB 수용체/ ALK5 저해제
TGFβ 수용체(예를 들어, ALK5) 저해제는 TGFβ 수용체(예를 들어, ALK5)의 발현을 억제하는 안티센스 핵산, 및 이에 대한 항체 및 이의 우성 음성 변이체를 포함할 수 있다. 예시적인 TGFβ 수용체/ALK5 저해제는 SB431542(예를 들어, 문헌[Inman, et al., Molecular Pharmacology 62(1):65-74 (2002)] 참조), 3-(6-메틸-2-피리디닐)-N-페닐-4-(4-퀴놀리닐)-1H-피라졸-1-카보티오아마이드로도 공지된 A-83-01(예를 들어, 문헌[Tojo, et al., Cancer Science 96(11):791-800 (2005)]을 참조하고, 예를 들어 Toicris Bioscience로부터 상업적으로 구입 가능); 2-(3-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-4-일)-1,5-나프티리딘, Wnt3a/BIO(예를 들어, 달톤 등의 WO2008/094597(본 명세서에서 참고로 포함됨) 참조), BMP4(상기 달톤 문헌 참조), GW788388(-{4-[3-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-4-일]피리딘-2-일}-N-(테트라하이드로-2H-피란-4-일)벤즈아마이드)(예를 들어, 문헌[Gellibert, et al., Journal of Medicinal Chemistry 49(7):2210-2221 (2006)] 참조), SM16(예를 들어, 문헌[Suzuki, et al., Cancer Research 67(5):2351-2359 (2007)] 참조), IN-1130(3-((5-(6-메틸피리딘-2-일)-4-(퀴녹살린-6-일)-1H-이미다졸-2-일)메틸)벤즈아마이드)(예를 들어, 문헌[Kim, et al., Xenobiotica 38(3):325-339 (2008)] 참조), GW6604(2-페닐-4-(3-피리딘-2-일-1H-피라졸-4-일)피리딘)(예를 들어, 문헌[de Gouville, et al., Drug News Perspective 19(2):85-90 (2006)] 참조), SB-505124(2-(5-벤조[1,3]다이옥솔-5-일-2-tert-뷰틸-3H-이미다졸-4-일)-6-메틸피리딘 염산염)(예를 들어, 문헌[DaCosta, et al., Molecular Pharmacology 65(3):744-752 (2004)] 참조) 및 피리미딘 유도체(예를 들어, Stiefl 등의 WO2008/006583(본 명세서에서 참고로 포함됨)에 기재된 것 참조)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 추가로, "ALK5 저해제"는 비특이적 키나제 저해제를 포함하도록 의도되지 않지만, "ALK5 저해제"는 ALK5, 예를 들어 SB-431542 등 이외에 ALK4 및/또는 ALK7을 저해하는 저해제를 포함하는 것으로 이해되어야 한다(예를 들어, 문헌[Inman, et al., J, Mol. Pharmacol. 62(1): 65-74 (2002)] 참조). 본 발명의 범위를 제한하고자 의도하지 않으면서, ALK5 저해제가 상피로의 간충직의 전환/이행(mesenchymal to epithelial conversion/transition: MET) 과정에 영향을 미친다고 생각된다. TGFβ/액티빈 경로는 간충직으로의 상피의 이행(epithelial to mesenchymal transition: EMT)에 대한 추진체이다. 따라서, TGFβ/액티빈 경로의 저해는 MET(즉 재프로그래밍) 과정을 수월하게 할 수 있다.
ALK5를 저해하는 것의 효과를 보여주는 본 명세서에서의 데이터의 검토 시, TGFβ/액티빈 경로의 저해가 ALK5를 저해하는 것의 유사한 효과를 가질 것이라고 생각된다. 따라서, TGFβ/액티빈 경로의 (예를 들어, 상류에 또는 하류에) 임의의 저해제는 본 명세서에서의 각각의 문단에 기재된 바와 같은 ALK5 저해제와 조합되어, 또는 이것 대신에 사용될 수 있다. 예시적인 TGFβ/액티빈 경로 저해제는 TGFβ 수용체 저해제, SMAD 2/3 인산화의 저해제, SMAD 2/3 및 SMAD 4의 상호작용의 저해제, 및 SMAD 6 및 SMAD 7의 활성인자/작용제를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 더욱이, 하기 기재된 분류화는 단지 체계적 목적을 위한 것이고, 당해 분야의 숙련자는 그 화합물이 경로 내의 하나 이상의 지점에 영향을 미칠 수 있고, 따라서 화합물이 하나 초과의 한정된 카테고리에서 작용할 수 있다는 것을 알 것이다.
TGFβ 수용체(TGFβR) 저해제는 TGFβ 수용체를 표적화하는 siRNA 또는 안티센스 핵산 및 이에 대한 항체 및 이의 우성 음성 변이체를 포함할 수 있다. TGFβ 수용체 저해제의 구체적인 예는 SU5416; 2-(5-벤조[1,3]다이옥솔-5-일-2-tert-뷰틸-3H-이미다졸-4-일)-6-메틸피리딘 염산염(SB-505124); 레르델리무맙(CAT-152); 메텔리무맙(CAT-192); GC-1008; ID11; AP-12009; AP-11014; LY550410; LY580276; LY364947; LY2109761; SB-505124; SB-431542; SD-208; SM16; NPC-30345; Ki26894; SB-203580; SD-093; Gleevec; 3,5,7,2',4'-펜타하이드록시플라본(Morin); 액티빈-M108A; P144; 가용성 TBR2-Fc; 및 TGFβ 수용체를 표적화하는 안티센스 형질감염된 종양 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. (예를 들어, 문헌[Wrzesinski, et al., Clinical Cancer Research 13(18):5262-5270 (2007); Kaminska, et al., Acta Biochimica Polonica 52(2):329-337 (2005); 및 Chang, et al., Frontiers in Bioscience 12:4393-4401 (2007)]을 참조한다.)
SMAD 2/3 인산화의 저해제는 SMAD2 또는 SMAD3을 표적화하는 안티센스 핵산 및 이에 대한 항체 및 이의 우성 음성 변이체를 포함할 수 있다. 저해제의 구체적인 예는 PD169316; SB203580; SB-431542; LY364947; A77-01; 및 3,5,7,2',4'-펜타하이드록시플라본(Morin)을 포함한다. (예를 들어, 상기 Wrzesinski 문헌; 상기 Kaminska 문헌; Shimanuki, et al., Oncogene 26:3311-3320 (2007); 및 Kataoka 등의 EP1992360(본 명세서에 참고로 포함됨)을 참조한다.)
SMAD 2/3 및 smad4의 상호작용의 저해제는 SMAD2, SMAD3 및/또는 smad4를 표적화하는 안티센스 핵산 및 이에 대한 항체 및 이의 우성 음성 변이체를 포함할 수 있다. SMAD 2/3 및 SMAD4의 상호작용의 저해제의 구체적인 예는 Trx-SARA, Trx-xFoxH1b 및 Trx-Lef1을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. (예를 들어, 문헌[Cui, et al., Oncogene 24:3864-3874 (2005) and Zhao, et al., Molecular Biology of the Cell, 17:3819-3831 (2006))을 참조한다.)
SMAD 6 및 SMAD 7의 활성인자/작용제는 SMAD 6 또는 SMAD 7을 표적화하는 안티센스 핵산 및 이에 대한 항체 및 이의 우성 음성 변이체를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 저해제의 구체적인 예는 smad7-as PTO-올리고뉴클레오타이드를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. (예를 들어, Miyazono 등의 US6534476 및 Steinbrecher 등의 US2005119203(둘 다 본 명세서에 참고로 포함됨)을 참조한다.)
2. WNT 경로 작용제
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "Wnt 신호 촉진제", "Wnt 경로 활성제" 또는 "Wnt 경로 작용제"는 Wnt 신호전달 경로의 작용제, 예를 들어 Wntl, Wnt2, Wnt2b/13, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt7c, Wnt8, Wnt8a, Wnt8b, Wnt8c, Wnt10a, Wntl0b, Wnt11, Wnt14, Wnt15 또는 Wnt16 중 하나 이상의 작용제(이들로 제한되지는 않음)를 의미한다. Wnt 경로 작용제는 하기 폴리펩타이드 중 하나 이상 또는 이의 단편을 추가로 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다: Dkk 폴리펩타이드, 크레센트 폴리펩타이드, 케르베로스 폴리펩타이드, 액신 폴리펩타이드, Frzb 폴리펩타이드, T 세포 인자 폴리펩타이드 또는 우성 음성 디쉐벌드 폴리펩타이드.
Wnt 경로 작용제의 비제한적인 예는 하기 중 하나 이상을 추가로 포함한다: Wnt 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산, Wnt 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리펩타이드, 활성화된 Wnt 수용체를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산, 활성화된 Wnt 수용체의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, Wnt/β-카테닌 신호전달을 촉진하는 소형 유기 분자, 소형 Wnt 길항제의 발현 또는 활성을 저해하는 유기 분자, Wnt 길항제의 발현을 저해하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, Wnt 길항제의 발현을 저해하는 리보자임, Wnt 길항제의 발현을 저해하는 RNAi 작제물, siRNA 또는 shRNA, Wnt 길항제에 결합하고 이의 활성을 저해하는 항체, β-카테닌 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산, β-카테닌 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, Lef-1 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산, Lef-1 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드.
Wnt 경로 작용제는 GSK3 저해제, 예를 들어 우성 음성 GSK-3, GSK3α 또는 GSK3β 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산, 우성 음성 GSK-3, GSK3α 또는 GSK3β 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, GSK-3, GSK3α 또는 GSK3β에 결합하고 이의 발현 또는 활성을 저해하는 소형 유기 분자, GSK-3, GSK3α 또는 GSK3β에 결합하고 이의 발현 및/또는 활성을 저해하는 RNAi 작제물, siRNA, 또는 shRNA, GSK-3, GSK3α 또는 GSK3β에 결합하고 이의 발현을 저해하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, GSK-3, GSK3α 또는 GSK3β에 결합하고 이의 발현 및/또는 활성을 저해하는 항체, GSK-3, GSK3α 또는 GSK3β에 결합하고 이의 발현을 저해하는 리보자임, 및 GSK-3 저해에 대한 효과가 유사한 β-카테닌 표적 유전자를 활성화하는 임의의 GSK-3 독립적 시약 등을 추가로 포함한다.
3. GSK-3β 저해제
GSK-3β 저해제는 본 명세서에서 고려되는 조성물에서 사용하기에 적합한 구체적인 예시적인 Wnt 경로 작용제이고, 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 및 소분자를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 본 명세서에서 고려되는 GSK-3β 저해제는 GSK-3β 발현 및/또는 GSK-3β 활성을 감소시킬 수 있다. 본 명세서에서 고려되는 GSK-3β 저해제의 예시적인 예는 GSK-3β를 표적화하는 항-GSK-3β 항체, 우성 음성 GSK-3β 변이체, siRNA, shRNA, miRNA 및 안티센스 핵산을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
다른 예시적인 GSK-3β 저해제는 켄파울론, l-Aza켄파울론,CHIR99021, CHIR98014, AR-A014418, CT 99021, CT 20026, SB216763, AR-A014418, 리튬, SB 415286, TDZD-8, BIO, BIO-아세톡심, (5-메틸- lH-피라졸-3-일)-(2-페닐퀴나졸린-4-일)아민, 피리도카바졸사이클로펜타다이엔일루테늄 복합체, TDZD-8 4-벤질-2-메틸-l,2,4-티아다이아졸리딘-3,5-다이온, 2-티오(3-요오도벤질)-5-(l-피리딜)-[l,3,4]-옥사다이아졸, OTDZT, 알파-4-다이브로모아세토페논, AR-AO 144-18, 3-(l-(3-하이드록시프로필)-lH-피롤로[2,3-b]피리딘-3-일]-4-피라진-2-일-피롤-2,5-다이온; TWSl 19 피롤로피리미딘 화합물, L803 H-KEAPPAPPQSpP-NH2 또는 이의 미리스토일화 형태; 2-클로로-l-(4,5-다이브로모-티오펜-2-일)-에타논; GF109203X; RO318220; TDZD-8; TIBPO; 및 OTDZT를 포함하자민, 이들로 제한되지는 않는다.
특정한 예시적인 실시형태에서, GSK-3β 저해제는 CHIR99021, BIO 또는 켄파울론이다.
바람직한 실시형태에서, GSK-3β 저해제는 CHIR99021이다.
4. ERK/MEK 저해제
본 명세서에서 고려되는 조성물에서 사용하기에 적합한 ERK/MEK 저해제는 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 및 소분자를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 본 명세서에서 고려되는 ERK/MEK 저해제는 MEK 또는 ERK 발현 및/또는 MEK 또는 ERK 활성을 감소시킬 수 있다. 본 명세서에서 고려되는 MEK/ERK 저해제의 예시적인 예는 MEK 또는 ERK를 표적화하는 항-MEK 또는 항-ERK 항체, 우성 음성 MEK 또는 ERK 변이체, siRNA, shRNA, miRNA 및 안티센스 핵산을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
다른 예시적인 ERK/MEK 저해제는 PD0325901, PD98059, UO126, SL327, ARRY- 162, PD184161, PD184352, 수니티닙(sunitinib), 소라페닙(sorafenib), 반데타닙(Vandetanib), 파조파닙(pazopanib), 악시티닙(Axitinib), GSKl 120212, ARRY-438162, RO5126766, XL518, AZD8330, RDEAl 19, AZD6244, FR180204 및 PTK787을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
추가의 예시적인 MEK/ERK 저해제는 국제 공개 특허 출원 WO 99/01426, WO 02/06213, WO 03/077914, WO 05/051301 및 WO2007/044084에 개시된 화합물을 포함한다.
MEK/ERK 저해제의 추가의 예시적인 예는 하기 화합물을 포함한다: 6-(4-브로모-2-클로로-페닐아미노)-7-플루오로-3-메틸-3H-벤조이미다졸-5-카복실산(2,3-다이하이드록시-프로폭시)-아마이드; 6-(4-브로모-2-클로로-페닐아미노)-7-플루오로-3-(테트라하이드로-피란-2-일메틸)-3H-벤조이미다졸-5-카복실산(2-하이드록시-에톡시)-아마이드, 1-[6-(4-브로모-2-클로로-페닐아미노)-7-플루오로-3-메틸-3H-벤조이미다졸-5-일]-2-하이드록시-에타논, 6-(4-브로모-2-클로로-페닐아미노)-7-플루오로-3-메틸-3H-벤조이미다졸-5-카복실산(2-하이드록시-1,1-다이메틸-에톡시)-아마이드, 6-(4-브로모-2-클로로-페닐아미노)-7-플루오로-3-(테트라하이드로-퓨란-2-일메틸)-3H-벤조이미다졸-5-카복실산(2-하이드록시-에톡시)-아마이드, 6-(4-브로모-2-플루오로-페닐아미노)-7-플루오로-3-메틸-3H-벤조이미다졸-5-카복실산(2-하이드록시-에톡시)-아마이드, 6-(2,4-다이클로로-페닐아미노)-7-플루오로-3-메틸-3H-벤조이미다졸-5-- 카복실산(2-하이드록시-에톡시)-아마이드, 6-(4-브로모-2-클로로-페닐아미노)-7-플루오로-3-메틸-3H-벤조이미다졸-5-카복실산(2-하이드록시-에톡시)-아마이드(이하 MEK 저해제 1이라 칭함); 2-[(2-플루오로-4-요오도페닐)아미노]-N-(2-하이드록시에톡시)-1,5-다이메틸-6- -옥소-1,6-다이하이드로피리딘-3-카복스아마이드(이하 MEK 저해제 2라 칭함); 및 4-(4-브로모-2-플루오로페닐아미노)-N-(2-하이드록시에톡시)-1,5-다이메틸-6-- 옥소-1,6-다이하이드로피리다진-3-카복스아마이드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
바람직한 실시형태에서, MEK/ERK 저해제는 PD98059이다.
5. ROCK 저해제
Rho 연관된 키나제(ROCK)는 Rho 키나제의 이펙터 하류에 작용하는 세린/트레오닌 키나제이다(이들 중 RhoA, RhoB 및 RhoC의 3개의 아이소폼이 존재함). 본 명세서에서 고려되는 조성물에서 사용하기에 적합한 ROCK 저해제는 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 및 소분자를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 본 명세서에서 고려되는 ROCK 저해제는 ROCK 발현 및/또는 ROCK 활성을 감소시킬 수 있다. 본 명세서에서 고려되는 ROCK 저해제의 예시적인 예는 ROCK를 표적화하는 항-ROCK 항체, 우성 음성 ROCK 변이체, siRNA, shRNA, miRNA 및 안티센스 핵산을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본 명세서에서 고려되는 예시적인 ROCK 저해제는 티아조비빈, Y27632, 파수딜(Fasudil), AR122-86, Y27632 H-1152, Y-30141, Wf-536, HA-1077, 하이드록실-HA-1077, GSK269962A, SB-772077-B, N-(4-피리딜)-N'-(2,4,6-트라이클로로페닐)유레아, 3-(4-피리딜)-1H-인돌 및 (R)-(+)-트랜스-N-(4-피리딜)-4-(1-아미노에틸)-사이클로헥산카복스아마이드 및 미국 특허 제8,044,201호(본 명세서에서 그 전문이 참고로 포함됨)에 개시된 ROCK 저해제를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
일 실시형태에서, ROCK 저해제는 티아조비빈, Y27632 또는 피르인테그린이다.
바람직한 실시형태에서, ROCK 저해제는 티아조비빈이다.
본 명세서에서 고려되는 조성물 및 세포 배양 배지에서의 소분자의 양은 특정한 배양 조건, 예를 들어 사용된 특정한 분자 및 조합, 배지 중에 배양되는 세포의 유형 및 특정한 분야에 따라 변할 수 있고 최적화될 수 있다. 일 실시형태에서, 소분자는 다능성을 유도하거나, 재프로그래밍의 효율을 개선하거나, 세포의 효력을 증가시키거나 유지시키거나, 기저 상태 다능성을 유도하거나 유지시키기에 충분한 농도로 조성물에 존재한다.
특정한 실시형태에서, 본 발명의 세포 배양 배지에서의 소분자의 바람직한 농도 및 조합은 운명 유지 배지(Fate Maintenance Medium: FMM)로서 표 1에 기재되어 있다. 배지의 성분은 표 1에 기재된 거의 최적 농도의 최적 범위 내의 양으로 배지 중에 존재할 수 있다. 운명 재프로그래밍 배지(Fate Reprogramming Medium: FRM)는 세포의 재프로그래밍을 포함하는 본 명세서에서 고려되는 배양 플랫폼에서 유용하지만, 기저 상태 다능성 세포의 확립 및 장기간 유지에 적합하지 않다.
Figure pct00001
6. 사이토카인 및 성장 인자
특정한 실시형태에서, 본 발명의 세포 배양 배지는 사이토카인 및/또는 성장 인자가 실질적으로 없다. 소정의 실시형태에서, 세포 배양 배지는 하나 이상의 보충제, 예를 들어 혈청, 추출물, 성장 인자, 호르몬, 사이토카인 등(이들로 제한되지는 않음)을 함유한다.
하나의 예시적인 실시형태에서, 배양 배지는 ECM 단백질, 라미닌 1, 피브로넥틴, 콜라겐 IV 아이소타입, 프로테아제, 프로테아제 저해제, 세포 표면 부착 단백질, 세포 신호전달 단백질, 카데린, 클로라이드 세포내 채널 1, 막관통 수용체 PTK7, 인슐린 유사 성장 인자, 또는 인히빈 베타 A 중 하나 이상을 포함할 수 있지만, TGFβ/액티빈/NODAL 신호전달 경로 또는 액티빈 A의 인듀서를 포함하지 않는다. 다른 실시형태에서, 배지는 TGFβ/액티빈/NODAL 신호전달 경로의 인듀서를 포함할 수 있다.
또 다른 예시적인 실시형태에서, 배양 배지는 하기 사이토카인 또는 성장 인자 중 하나 이상을 포함한다: 표피 성장 인자(epidermal growth factor: EGF), 산성 섬유아세포 성장 인자(acidic fibroblast growth factor: aFGF), 염기성 섬유아세포 성장 인자(basic fibroblast growth factor: bFGF), 백혈병 저해 인자(leukemia inhibitory factor: LIF), 간세포 성장 인자(hepatocyte growth factor: HGF), 인슐린 유사 성장 인자 1(insulin-like growth factor 1: IGF-1), 인슐린 유사 성장 인자 2(insulin-like growth factor 2: IGF-2), 각질세포 성장 인자(keratinocyte growth factor: KGF), 신경 성장 인자(nerve growth factor: NGF), 혈소판 유래 성장 인자(platelet-derived growth factor: PDGF), 형질전환 성장 인자 베타(transforming growth factor beta: TGF-β), 혈관 내피 세포 성장 인자(vascular endothelial cell growth factor: VEGF) 트랜스페린, 다양한 인터류킨(예컨대, IL-1 내지 IL-18), 다양한 콜로니 자극 인자(예컨대, 과립구/대식세포 콜로니 자극 인자(granulocyte/macrophage colony-stimulating factor: GM-CSF)), 다양한 인터페론(예컨대, IFN-γ) 및 줄기 세포에 효과를 가지는 다른 사이토카인, 예컨대 줄기 세포 인자(stem cell factor: SCF) 및 에리쓰로포이에틴(erythropoietin: Epo). 이 사이토카인은 상업적으로, 예를 들어 알앤디 시스템즈(R&D Systems)(미네소타주 미니애폴리스)로부터 얻어질 수 있고, 천연 또는 재조합일 수 있다. 특정한 실시형태에서, 성장 인자 및 사이토카인은 본 명세서에서 고려되는 농도로 첨가될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 성장 인자 및 사이토카인은 경험적으로 또는 확립된 사이토카인 분야에 의해 안내되는 바대로 결정된 농도로 첨가될 수 있다.
7. 배양 기질
임의의 적합한 용기 또는 세포 배양 용기는 기본 배지 및/또는 세포 배양 보충제에서 세포 배양에 대한 지지체로서 사용될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 지지체에서의 기질 코팅이 필요하지 않다. 몇몇 다른 실시형태에서, 부착 촉진 기질(예를 들어, 콜라겐, 피브로넥틴, RGD 함유 폴리펩타이드, 젤라틴 등)에 의해 배양 용기의 표면의 코팅은 그러나 세포의 부착을 촉진하고, 특정한 실시형태에서 본 명세서에 개시된 세포 배양 배지 및 보충제의 효과를 증대시킬 수 있다. 세포의 배양 및 계대배양에 적합한 기질은 당해 분야에 공지되어 있고, 제한 없이, 비트로넥틴, 젤라틴, 라미닌, 피브로넥틴, 콜라겐, 엘라스틴, 오스테오폰틴, 천연 발생 세포주 생성된 매트릭스의 혼합물, 예컨대 마트리겔(상표명), 및 합성 또는 인공 표면, 예컨대 폴리아민 단층 및 카복시 말단된 단층을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 명세서에서 고려되는 배양 플랫폼은 마트리겔(상표명) 또는 비트로넥틴을 포함하는 기질을 포함한다.
8. 피더 비함유 환경
다능성 세포를 배양하기 위한 기존의 방법은 피더 세포 또는 피더 세포에 의해 예비 컨디셔닝되고 소 태아 혈청을 함유하는 배지에 매우 의존하지만, 이러한 환경은 임상적 및 치료학적 사용을 위해 세포를 제조하기에 적합하지 않을 수 있다. 예를 들어, 동물 성분에 대한 노출이 면역 거부 및 확인되지 않은 병원균을 치료된 환자에게 전달하는 데 있어서 심각한 위험을 제시할 수 있고, 동물 레트로바이러스를 잠재적으로 재활성화할 수 있으므로, 이러한 외래 오염된 환경에서 배양된 세포는 일반적으로 인간 세포 이식에 적합하지 않다고 생각된다. 동물 비함유 배양 배지를 사용한 배양 시스템, 예컨대 본 명세서에서 고려되는 피더 비함유 환경은 임상 등급의 세포주, 특히 hESC 및 hiPSC 세포주의 제조를 촉진한다.
특정한 실시형태에서, 피더 비함유 환경은 인간 피더 세포가 본질적으로 없고, 제한 없이, 마우스 배아 섬유아세포, 인간 섬유아세포, 각질세포 및 배아 줄기 세포를 포함하는 피더 세포에 의해 예비 컨디셔닝되지 않는다. 피더 비함유 세포 배양 배지는 다능성 세포의 배양, 세포의 재프로그래밍, 다능성 세포의 단일 세포 배양, 해리 및 계대배양, 다능성 세포의 세포 분류, 기저 상태 다능성 세포의 생성 및 기저 상태 다능성의 유지에서 사용하기에 적합하다. 특정한 실시형태에서, 피더 비함유 환경은 다능성을 유도하고/하거나, 재프로그래밍의 효율을 개선하고/하거나, 세포의 효력을 증가시키거나 유지시키도록 사용된다. 소정의 실시형태에서, 피더 비함유 환경은 사이토카인 및 성장 인자, 예를 들어 bFGF가 실질적으로 없다.
9. 해리
본 명세서에서 고려되는 배양 플랫폼에 의해 제공되는 이점 중 하나는 단일 기저 상태 다능성 세포를 배양하고 계대배양하고 해리하는 것의 증대된 생존능력 및 생존이다. 단일 세포, 예컨대 단일 세포 현탁액으로의 세포의 해리는 효소에 의한 또는 기계적 수단에 의해 달성될 수 있다. 단일 세포로 세포의 해리를 허용하는 것으로 당해 분야에 공지된 임의의 효소 물질은 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 해리 물질은 트립신/EDTA, TrypLE-Select, 콜라게나제 IV 및 디스파제로부터 선택된다.
킬레이터, 예컨대 EDTA, Accutase 또는 AccuMax가 본 명세서에서 고려되는 방법에 따라 세포를 해리하는 데 있어서, 단독으로 또는 효소 물질과 조합되어, 또한 사용될 수 있다. 해리 물질은 단일 세포로의 해리를 촉진하기 위해 칼슘 및 마그네슘 비함유 PBS 중에 용해될 수 있다.
해리 동안에 및 후에 세포의 생존을 증대시키기 위해, 몇몇 실시형태에서, 생존 촉진 물질, 예를 들어 하나 이상의 성장 인자, 세포 사멸 및 아폽토시스에 관여된 세포 경로의 저해제 또는 순화 배지를 첨가한다. 일 실시형태에서, 생존 촉진 물질은 ROCK 저해제, 예를 들어 티아조비빈(이것으로 제한되지는 않음)이다.
세포 배양 및 배지 수집에서의 기법은 문헌[Hu et al., Curr. Opin. Biotechnol. 8:148, 1997; K. Kitano, Biotechnology 17:73, 1991; Curr. Opin. Biotechnol. 2:375, 1991; Birch et al., Bioprocess Technol. 19:251, 1990; "Teratocarcinomas and embryonic stem cells: A practical approach" (E. J. Robertson, ed., IRL Press Ltd. 1987); "Guide to Techniques in Mouse Development" (P. M. Wasserman et al. eds., Academic Press 1993); "Embryonic Stem Cell Differentiation in vitro" (M. V. Wiles, Meth. Enzymol. 225:900, 1993); "Properties and uses of Embryonic Stem Cells: Prospects for Application to Human Biology and Gene Therapy" (P. D. Rathjen et al., al., 1993)]에 기재되어 있다.
줄기 세포의 분화는 문헌[Robertson, Meth. Cell Biol. 75:173, 1997; and Pedersen, Reprod. Fertil. Dev. 10:31, 1998]에 검토되어 있다.
10. 농후 및 고갈 전략
특정한 실시형태에서, 다능성 세포, 예를 들어 iPSC에 대해 세포의 집단을 농후화하기 위한 전략이 제공된다. 일 실시형태에서, 농후화는 비교적 짧은 시간에 클론성 iPSC 콜로니를 유도하기 위한 방법을 제공하고, 이로써 iPSC 생성의 효율을 개선한다. 농후화는 다능성의 마커를 발현하는 세포를 재프로그래밍하고 식별하고 수득하도록 유도된 세포의 집단을 분류하는 것을 포함할 수 있고, 이로써 다능성 세포에 대해 농후화된 세포의 집단을 수득한다. 추가의 농후화 방법론은 농후화된 다능성 세포의 집단을 수득하도록 분화의 마커를 발현하는 세포 또는 비다능성 세포의 고갈을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 재프로그래밍 후 배양된 세포는 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일 이상, 그러나 10일 이하, 11일, 12일, 15일, 18일, 20일, 22일, 24일, 26일, 28일, 30일, 32일, 35일, 40일, 또는 임의의 이들 사이의 일자의 수 동안 유도된다. 몇몇 실시형태에서, 재프로그래밍 후 배양된 세포는 약 4일 내지 30일, 약 4일 내지 24일, 약 6일 내지 22일, 또는 약 8일 내지 약 12일 동안 유도된다.
일 실시형태에서, 다능성 세포에 대해 세포의 집단을 농후화하는 것은 집단에서의 세포를 해리하고 세포를 재현탁시킴으로써 단일 세포 현탁액을 제조하는 것을 포함한다. 해리된 세포는 세포를 유지시키거나 세포 분류를 수행하기 위해 임의의 적합한 용액 또는 배지에서 재현탁될 수 있다. 특정한 실시형태에서, 단일 세포 현탁액은 GSK3 저해제, MEK 저해제 및 Rock 저해제를 함유하고, TFGβ 저해제가 부족하다. 소정의 실시형태에서, GSK3 저해제는 CHIR99021이고/이거나, MEK 저해제는 PD0325901이고/이거나, Rock 저해제는 티아조비빈이다.
특정한 실시형태에서, 세포의 집단은 다능성 세포를 양성으로 선택하도록 분류되고/되거나, 그 집단은 비재프로그래밍된 또는 비다능성 세포가 고갈되고, 이로써 다능성 세포에 대해 농후화된 세포의 집단을 수득한다. 일 실시형태에서, 단일 세포 현탁액을 제조하고, 이후 예를 들어 적절한 항체를 사용하여 예컨대 다능성의 마커에 대해 염색함으로써 분류를 위해 단일 세포를 제조한다. 세포를 분류하는 임의의 적합한 방법에 의해, 예컨대 자기 비드 또는 유세포분석법(FACS) 분류에 의해 세포를 분류할 수 있다.
세포는, 제한 없이, SSEA3/4, TRA1-60/81, TRA1-85, TRA2-54, GCTM-2, TG343, TG30, CD9, CD29, CD133/프로미닌, CD140a, CD56, CD73, CD105, OCT4, NANOG, SOX2, KLF4, SSEA1(마우스), CD30, SSEA5, CD90 및/또는 CD50의 발현과 같은 다능성의 하나 이상의 마커에 기초하여 분류될 수 있다. 다양한 실시형태에서, 세포는 다능성의 적어도 2개, 적어도 3개 또는 적어도 4개의 마커에 기초하여 분류된다. 소정의 실시형태에서, 세포는 SSEA4의 발현 및 소정의 특정한 실시형태에서 TRA1-81 및/또는 TRA1-60과 조합하여 SSEA4의 발현에 기초하여 분류된다. 소정의 실시형태에서, 세포는 SSEA4, TRA1-81 또는 TRA1-60 및/또는 CD30 발현에 기초하여 분류된다. 일 실시형태에서, 세포는 SSEA4, TRA1-81 및 CD30에 기초하여 분류된다. 또 다른 실시형태에서, 세포는 SSEA4, TRA1-60 및 CD30에 기초하여 분류된다. 소정의 실시형태에서, 세포는 초기에 CD13, CD26, CD34, CD45, CD31, CD46 및 CD7(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는 분화하는 세포의 하나 이상의 표면 마커를 사용하여 비재프로그래밍된 세포에 대해 고갈되고, 이후 SSEA4, TRA1-81 및/또는 CD30과 같은 다능성 마커에 대해 농후화된다.
다능성 세포에 대해 농후화된 집단은 세포 배양 시스템, 예컨대 종래의 hESC 배지 또는 본 발명의 세포 배양 배지에 위치할 수 있다. 세포 배양 시스템은 피더 세포에 의해 보충될 수 있거나, 임의로 피더 비함유 환경일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 다능성의 마커를 발현하는 분류된 세포를 피더 세포 보충된 배양 시스템에 위치시키고, 이후 피더 비함유 환경으로 옮긴다. 일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 피더 비함유 환경이고, GSK3 저해제, MEK 저해제 및 Rock 저해제를 포함하고, TGFβ 저해제가 결여된다. 특정한 실시형태에서, GSK3 저해제는 CHIR99021이고/이거나, MEK 저해제는 PD0325901이고/이거나, Rock 저해제는 티아조비빈이다. 본 발명의 다른 특정한 실시형태에서, 세포 배양 시스템은 마트리겔(상표명) 코팅된 조직 플레이트를 포함하는 피더 비함유 환경이다. 일 실시형태에서, 세포 배양 시스템은 표 1에 기재된 FMM 배지를 포함한다.
농후화된 세포 집단은, 통상적으로 분류 후 약 3일 내지 약 25일; 분류 후 약 5일 내지 20일; 분류 후 5일 내지 15일; 분류 후 5일 내지 12일; 분류 후 약 5일 내지 9일, 또는 분류 후 약 5일 내지 7일에 보이는, 기저 상태 iPSC 콜로니를 수득하기 위해 본 명세서에 기재된 세포 배양 시스템에서 배양될 수 있다. iPSC 콜로니는 클론성 증식을 위해 선별되고 분류될 수 있다. 본 명세서에서 고려되는 농후화 전략을 이용하여, 세포 집단은 다능성 세포에 대해 적어도 약 3배, 5배 또는 10배 또는 이것 초과로 농후화된다.
몇몇 실시형태에서, 재프로그래밍을 겪은 세포의 집단 또는 다능성 세포의 집단은 분화된 세포가 고갈된다. 일 실시형태에서, 다능성 세포 또는 재프로그래밍하도록 유도된 세포의 집단은 분화된 세포의 하나 이상의 세포 표면 마커를 가지는 세포가 고갈될 수 있다. 분화하는 세포의 세포 표면 마커의 예시적인 예는 CD13, CD26, CD34, CD45, CD31, CD46 및 CD7을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 특정한 실시형태에서, CD13은 분화하는 세포의 표면 마커로서 사용된다.
다른 실시형태에서, 세포의 집단은 원하는 계열로 분화하도록 유도되고, 분화하는 또는 분화된 세포의 농후한 집단을 수득하도록 다능성 세포가 고갈된다. 몇몇 실시형태에서, 분화된 세포의 집단은 특정한 계열로 분화하도록 유도되는 ESC 또는 iPSC와 같은 세포의 집단을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 세포의 집단은 상기 기재된 음성 세포 분류 기법("패닝"), 예컨대 자기 비드에 따른 집단에서의 세포의 분류 또는 다능성의 마커에 기초한 FAC를 사용하여 다능성 세포가 고갈될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 분화된 세포를 포함하는 세포의 집단은 다능성 마커를 사용하여 FAC에 의해 분류되고, 다능성 마커를 발현하는 세포가 고갈된 분획이 수득된다. 다른 실시형태에서, 세포의 집단은 다능성의 마커가 고갈된 분획을 수득하도록 분화의 마커, 예컨대 계열 특이적 마커, 예를 들어 CD13, CD26, CD34, CD45, CD31, CD46 및 CD7(이들로 제한되지는 않음)에 기초하여 FAC에 의해 분류된다. 본 발명의 몇몇 특정한 실시형태에서, CD13은 분화하는 세포의 표면 마커로서 사용된다.
E. 재프로그래밍 세포를 위한 배양 플랫폼
세포에서 다능성을 유도하거나 효력을 증가시키고(Takahashi, K., and Yamanaka, S., Cell 126, 663-676 (2006); Takahashi et al., Cell 131, 861-872 (2007); Yu et al., Science 318, 1917-1920 (2007); Zhou et al., Cell Stem Cell 4, 381-384 (2009); Kim et al., Cell Stem Cell 4, 472-476 (2009); Yamanaka et al., 2009; Saha, K., Jaenisch, R., Cell Stem Cell 5, 584-595 (2009)), 재프로그래밍의 효율을 개선하도록(Shi et al., Cell Stem Cell 2, 525-528 (2008a); Shi et al., Cell Stem Cell 3, 568-574 (2008b); Huangfu et al., Nat Biotechnol 26, 795-797 (2008a); Huangfu et al., Nat Biotechnol 26, 1269-1275 (2008b); Silva et al., Plos Bio 6, e253. doi: 10.1371/journal. pbio. 0060253 (2008); Lyssiotis et al., PNAS 106, 8912-8917 (2009); Ichida et al., Cell Stem Cell 5, 491-503 (2009); Maherali, N., Hochedlinger, K., Curr Biol 19, 1718-1723 (2009b); Esteban et al., Cell Stem Cell 6, 71-79 (2010); Feng et al., Cell Stem Cell 4, 301-312 (2009), 다양한 전략이 추구된다. 그러나, 기존의 방법은 아직 산업 또는 임상 등급의 다능성 세포, 즉 균일한 다능성, 미미한 자발적인 분화 및 단일 세포, 한정된, 외래 비함유, 피더 세포 배양 시스템에서의 효소 계대배양을 사용하여 세포 집단을 배양하고 증식시키는 능력을 가지는 클론성 전이유전자가 없는 다능성 세포 집단의 제조를 위한 고속 해결책을 실현하지 못했다.
본 명세서에서 고려되는 배양 플랫폼은, 부분적으로, 고등급의 유도된 다능성 줄기 세포(iPSC)의 제조에 유용하다. 일 실시형태에서, 비다능성 세포는 다능성으로 재프로그래밍되고, 다능성을 유지시키도록 배양된다. 또 다른 실시형태에서, iPSC는 기저 상태 다능성으로 배양된다.
다양한 실시형태에서, 배양 플랫폼은 재프로그래밍의 전이유전자 및/또는 발자국이 없는 방법이 가능하게 한다. 본 명세서에서 고려되는 배양 플랫폼은 hiPSC 생성에 필요한 시간 및 노력이 상당히 감소하면서 매우 효율적인 에피솜 재프로그래밍을 제공한다. 어떠한 특정한 이론에 구속되고자 바라지 않으면서, 초기 재프로그래밍 과정에서의 분화 신호를 차단하는 것 및 특정한 경로(MEK, ERK, TGFβ 및 ROCK)의 소분자 저해를 통해 상피로의 간충직의 이행(MET)을 촉진하는 것 둘 다에 의해, FF 및 단일 세포 배양 시스템에서 hiPSC 생성의 효율이 에피솜 벡터를 사용하여 유의미하게 개선되는 것으로 고려된다.
일 실시형태에서, 배양 플랫폼은 세포에서 내인성 OCT4의 발현을 증가시키는 것을 포함하는 하나 이상의 비다능성 세포를 다능성 상태로 재프로그래밍하는 것을 포함한다. 세포에서의 내인성 OCT4의 발현은 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 또는 OCT4 발현의 소분자 인듀서를 도입함으로써 증가할 수 있다. 일 실시형태에서, 세포로의 OCT4를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 OCT4 폴리펩타이드의 도입은 세포에서의 OCT4의 내인성 발현을 유도하기에 충분하다.
일 실시형태에서, 배양 플랫폼은 OCT4, SOX2, NANOG, KLF4, LIN28, C-MYC 및 SV40LT로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 하나 이상의 비다능성 세포로 도입하는 단계를 포함하는 하나 이상의 비다능성 세포를 재프로그래밍하는 것을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 배양 플랫폼은 OCT4, SOX2, NANOG, KLF4, LIN28, C-MYC, SV40LT, hTERT, SALL4, GLIS, ESRRB, DPPA2, ECAT1, SOX1, SOX3, KLF2, KLF5, L-MYC, N-MYC, LRH1, UTF1, HESRG, CDH1, TDGF1, DPPA4, DNMT3B, ZIC3 및 L1TD1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 폴리펩타이드를 하나 이상의 비다능성 세포로 도입하는 단계를 포함하는 하나 이상의 비다능성 세포를 재프로그래밍하는 것을 포함한다.
실시형태에서, 배양 플랫폼은 OCT4, NANOG, ESRRB, ECAT1 및 UTF1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 하나 이상의 비다능성 세포로 도입하는 단계를 포함하는 하나 이상의 비다능성 세포를 재프로그래밍하는 것을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 배양 플랫폼은 OCT4, NANOG, ESRRB, ECAT1 및 UTF1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 폴리펩타이드를 하나 이상의 비다능성 세포로 도입하는 단계를 포함하는 하나 이상의 비다능성 세포를 재프로그래밍하는 것을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, OCT4, NANOG, ESRRB, ECAT1 및 UTF1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 하나 이상의 비다능성 세포는 HESRG, CDH1, TDGF1, DPPA4, DNMT3B, ZIC3 및 L1TD1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함한다. 몇몇 다른 실시형태에서, HESRG, CDH1, TDGF1, DPPA4, DNMT3B, ZIC3 및 L1TD1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 하나 이상의 비다능성 세포는 OCT4, NANOG, ECAT1, UTF1 및 ESRRB로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함한다.
본 명세서에 사용된 바대로, 특정한 실시형태에서, 용어 "도입하는"은 세포를 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 또는 소분자와 접촉하는 것을 포함하는 과정을 의미한다. 도입하는 단계는 세포로의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 미량주사, 세포로 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드를 전달하기 위한 리포솜의 사용, 또는 세포로 도입하도록 세포 투과성 모이어티에 대한 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 융합을 또한 포함할 수 있다.
특정한 실시형태에서, OCT4, SOX2, NANOG, KLF4, LIN28, C-MYC, SV40LT, hTERT, SALL4, GLIS, ESRRB, DPPA2, ECAT1, SOX1, SOX3, KLF2, KLF5, L-MYC, N-MYC, LRH1, UTF1, HESRG, CDH1, TDGF1, DPPA4, DNMT3B, ZIC3 및 L1TD1로 이루어진 군으로부터 선택된 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 이것 초과의 재프로그래밍 인자를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 세포를 재프로그래밍하도록 비다능성 세포로 도입될 수 있다. 세포로 도입되는 각각의 재프로그래밍 인자를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 수는 본 명세서에서 고려되는 바와 같은 기저 상태 다능성을 달성하기에 적합한 임의의 조합으로 동일하거나 상이할 수 있다.
일 실시형태에서, OCT4, SOX2 및 NANOG로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 재프로그래밍 인자의 각각을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 비다능성 세포로 도입된다.
일 실시형태에서, OCT4, SOX2 및 NANOG의 각각을 코딩하는 1개 이상의 폴리뉴클레오타이드는 비다능성 세포로 도입된다.
일 실시형태에서, OCT4 및 SOX2의 각각을 코딩하는 1개 이상의 폴리뉴클레오타이드는 비다능성 세포로 도입된다.
일 실시형태에서, Oct4를 코딩하는 1개 이상의 폴리뉴클레오타이드는 비다능성 세포로 도입된다.
일 실시형태에서, OCT4, SOX2 및 NANOG의 각각을 코딩하는 2개의 폴리뉴클레오타이드는 비다능성 세포로 도입되고, SV40LT는 임의로 비다능성 세포로 도입된다.
또 다른 실시형태에서, OCT4, SOX2 및 NANOG의 각각을 코딩하는 3개의 폴리뉴클레오타이드 및 UTF1을 코딩하는 1개의 폴리뉴클레오타이드는 비다능성 세포로 도입된다.
다양한 예시적인 실시형태에서, 비다능성 세포를 재프로그래밍하는 것을 포함하는 배양 플랫폼은 OCT4를 코딩하는 1개 내지 5개의 폴리뉴클레오타이드; 임의로, SOX2를 코딩하는 1개 내지 3개의 폴리뉴클레오타이드 및/또는 NANOG를 코딩하는 1개 또는 2개의 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 것을 포함한다. 다수의 폴리뉴클레오타이드는 동일한 또는 별개의 작제물, 또는 벡터에서 임의의 조합으로 세포로 도입될 수 있다. 하나의 비제한적인 예에서, OCT4를 코딩하는 1개 내지 4개의 폴리뉴클레오타이드, SOX2를 코딩하는 1개 또는 2개의 폴리뉴클레오타이드 및 NANOG를 코딩하는 1개의 폴리뉴클레오타이드는 비다능성 세포로 도입된다. 또 다른 비제한적인 예에서, 비다능성 세포를 다능성 상태로 재프로그래밍하는 것은 OCT4를 코딩하는 2개의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제1 벡터, OCT4를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 SOX2를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제2 벡터; 및 OCT4를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, SOX2를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 NANOG를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제3 벡터를 비다능성 세포로 도입하는 것을 포함한다. 추가의 비제한적인 예에서, 하나 이상의 비다능성 세포를 재프로그래밍하는 것은 OCT4를 코딩하는 2개의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제1 벡터, 및 OCT4를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, SOX2를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 NANOG를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제2 벡터를 비다능성 세포로 도입하는 것을 포함한다. 훨씬 추가의 비제한적인 예에서, OCT4를 코딩하는 2개의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제1 벡터 및 OCT4를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 SOX2를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제2 벡터는 다능성 세포를 제조하도록 비다능성 세포로 도입된다.
일 실시형태에서, 하나 이상의 작제물(또는 벡터)은 비다능성 세포로 도입되고, 여기서 작제물은 (ⅰ) OCT4를 코딩하는 2개의 폴리뉴클레오타이드; (ⅱ) ECAT1을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 UTF1을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드; (ⅲ) NANOG를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, ESRRB를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 OCT4를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드; (ⅳ) CDH1을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, ZIC3을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 HESRG를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드; (ⅴ) 폴리펩타이드를 코딩하는 L1TD1을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, DPPA4를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 TDGF1을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 또는 (ⅵ) DNMT3B를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 비다능성 세포로 도입된 재프로그래밍 인자는 SOX2 및/또는 KLF4를 포함하지 않는다. 몇몇 실시형태에서, SOX2 및/또는 KLF4는 비다능성 세포로 도입되는 재프로그래밍 인자로부터 배제된다. 몇몇 실시형태에서, SOX2 및/또는 KLF4는 NANOG, LIN28, C-MYC, ECAT1, UTF1, ESRRB, SV40LT, HESRG, CDH1, TDGF1, DPPA4, DNMT3B, ZIC3 및 L1TD1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드의 존재에 의해 없어질 수 있다.
일 실시형태에서, 단일 작제물(또는 벡터)(본 명세서에서 고려되는 폴리펩타이드를 코딩하는 재프로그래밍 인자의 임의의 수 및 조합을 포함함)은 도입되고, 세포를 다능성 상태로 재프로그래밍하기에 충분하다.
일 실시형태에서, 하나 이상의 작제물(벡터)(이들의 각각은 본 명세서에서 고려되는 폴리펩타이드를 코딩하는 재프로그래밍 인자의 임의의 수 및 조합을 포함함)은 비다능성 세포로 도입되고, 세포를 다능성 상태로 재프로그래밍하기에 충분하다.
바람직한 실시형태에서, 비체세포를 재프로그래밍하는 것에 대해 본 명세서에서 고려되는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 하나 이상의 벡터는 세포로 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입하도록 사용되고, 세포를 재프로그래밍하기에 충분하다.
가장 바람직한 실시형태에서, 비체세포를 재프로그래밍하는 것에 대해 본 명세서에서 고려되는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 하나 이상의 에피솜 벡터는 세포로 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입하도록 사용되고, 세포를 재프로그래밍하기에 충분하다. 감소한 자발적인 분화 및/또는 기저 상태를 나타내는 다능성 세포는 본 명세서에서 고려되는 바와 같은 에피솜 벡터에 의해 제조되고, 이후 재프로그래밍 인자를 코딩하는 외인성 핵산을 포함하지 않는 감소한 자발적인 분화 및/또는 기저 상태를 나타내는 다능성 세포를 수득하도록 벡터의 소실까지 배양될 수 있다.
작제물 또는 벡터가 적어도 2개의 재프로그래밍 인자를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나, 1개의 재프로그래밍 인자를 코딩하는 적어도 2개의 폴리뉴클레오타이드를 포함할 때, 작제물/벡터가 각각의 폴리펩타이드 사이의 자가 절단 폴리펩타이드 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 IRES 서열을 포함한다고 추가로 고려된다.
몇몇 양태에서, 비다능성 세포의 재프로그래밍의 효율은 재프로그래밍 인자 폴리뉴클레오타이드를 비다능성 세포로 도입한 후 하나 이상의 재프로그래밍 인자 폴리뉴클레오타이드의 이소성 발현에 대해 선택함으로써 증가한다. 이러한 선택은 예를 들어 하나 이상의 재프로그래밍 인자 폴리뉴클레오타이드를 선택 가능한 마커에 연결하고, 재프로그래밍 인자 폴리뉴클레오타이드 및 선택 가능한 마커를 비다능성 세포로 도입하고, 선택 가능한 마커를 발현하는 이 세포를 선택함으로써 발생할 수 있고, 여기서 선택은 마커의 발현이 부족한 세포 및 이의 연관된 재프로그래밍 인자 폴리뉴클레오타이드에 대해 증가한 재프로그래밍 효율을 가지는 세포를 식별한다. 당해 분야의 숙련자는 비다능성 세포에 의해 도입된 재프로그래밍 폴리뉴클레오타이드의 발현을 식별하는 임의의 선택 가능한 마커가 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 이러한 선택 가능한 마커의 하나의 비제한적인 예는 항생제 내성 유전자, 예컨대 퓨로마이신 내성을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 선택 가능한 마커는 하기 재프로그래밍 인자 폴리뉴클레오타이드 중 하나 이상에 연결될 수 있다: OCT4, SOX2, NANOG, KLF4, LIN28, C-MYC, SV40LT, hTERT, SALL4, GLIS, ESRRB, DPPA2, ECAT1, SOX1, SOX3, KLF2, KLF5, L-MYC, N-MYC, LRH1, UTF1, HESRG, CDH1, TDGF1, DPPA4, DNMT3B, ZIC3 및 L1TD1. 몇몇 실시형태에서, 재프로그래밍 인자 폴리뉴클레오타이드의 특정한 조합은 폴리시스트론성 벡터(또는 작제물)로서 도입되고, 선택 가능한 마커는 재프로그래밍 인자 폴리뉴클레오타이드에 연결된다. 벡터에 포함된 폴리뉴클레오타이드는 본 명세서에 개시된 재프로그래밍 인자 중 2개 이상을 코딩할 수 있다. 하나의 비제한적인 실시형태에서, 폴리시스트론성 벡터는 OCT4를 코딩하는 2개 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 폴리뉴클레오타이드는 선택 가능한 마커, 예컨대 퓨로마이신 내성을 코딩하는 유전자에 연결된다.
몇몇 양태에서, 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 코딩하는 폴리시스트론성 벡터 및 선택 가능한 마커는 하나 이상의 재프로그래밍 인자 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 하나 이상의 폴리시스트론성 벡터 이외에 비다능성 세포로 도입되고, 선택 가능한 마커를 발현하는 세포에 대한 선택은 선택 가능한 마커의 발현이 부족한 세포보다 더 높은 재프로그래밍 효율을 가지는 세포의 집단을 제조한다. 하나의 비제한적인 예에서, OCT4, NANOG 및 SOX2 폴리뉴클레오타이드는 OCT4를 코딩하는 2개 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 폴리시스트론성 벡터 이외에 비다능성 세포로 도입되고, 폴리뉴클레오타이드는 퓨로마이신 내성 유전자에 연결된다. 선택 가능한 마커를 발현하는 비다능성 세포의 후속하는 선택은 선택 가능한 마커를 발현하지 않는 비다능성 세포에 비해 더 높은 재프로그래밍 효율을 가지는 비다능성 세포를 식별한다. 선택된 세포는 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30% 또는 적어도 40%의 재프로그래밍 효율을 가질 수 있다.
소분자는 대개 특정한 바람직한 실시형태의 재프로그래밍 단계에 포함된다. 어떠한 특정한 이론에 구속되고자 바라지 않으면서, 다양한 분화 경로의 소분자 저해제의 포함이 재프로그래밍의 효율 및 동역학을 증가시키는 것으로 고려된다. 따라서, 특정한 실시형태에서, 재프로그래밍 비다능성 세포는 본 명세서에서 고려되는 바대로 세포로 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 도입하고, 세포를 GSK3 저해제; MEK 저해제; TGFβR 저해제 및 ROCK 저해제와 접촉시키는 것을 포함한다.
재프로그래밍의 효율의 개선은 (1) (예를 들어, 소분자가 없는 유사한 또는 동일한 과정과 비교하여 적어도 하루만큼 다능성 세포를 생성하는 시간을 줄임으로써) 다능성 세포의 재프로그래밍 및 생성에 필요한 시간을 감소시킴으로써, 또는 대안적으로, 또는 조합으로, (2) 특정한 과정에 의해 생성된 다능성 세포의 수의 증가(예를 들어, 소분자가 없는 유사한 또는 동일한 과정과 비교하여 소정의 시간 기간에 적어도 10%, 30%, 50%, 100%, 200%, 500% 등만큼의 재프로그래밍된 세포의 수의 증가)에 의해 측정될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 재프로그래밍 효율의 2배 내지 20배 개선이 관찰된다. 몇몇 실시형태에서, 재프로그래밍 효율은 20배 초과만큼 개선된다. 몇몇 실시형태에서, 소분자 재프로그래밍 물질 없는 방법에 비해 100배 초과의 효율의 개선(예를 들어, 100배 초과의 생성된 다능성 세포의 수의 증가)이 관찰된다.
일 실시형태에서, 본 명세서에서 고려되는 배양 플랫폼은 본 명세서에서 고려되는 바대로 세포로 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 도입하고, 세포를 GSK3 저해제; MEK 저해제; 및 TGFβR 저해제 및/또는 ROCK 저해제와 접촉시킴으로써 비다능성 세포를 재프로그래밍하는 것을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 명세서에서 고려되는 배양 플랫폼은 본 명세서에서 고려되는 바대로 세포로 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 도입하고, 세포를 GSK3 저해제; MEK 저해제; TGFβR 저해제 및 ROCK 저해제와 접촉시킴으로써 비다능성 세포를 재프로그래밍하는 것을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 본 명세서에서 고려되는 배양 플랫폼은 본 명세서에서 고려되는 바대로 세포로 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 도입하고, 세포를 GSK3 저해제; MEK 저해제; TGFβR 저해제 및 ROCK 저해제와 접촉시킴으로써 비다능성 세포를 재프로그래밍하는 것을 포함하고, 여기서 ROCK 저해제는 티아조비빈이다.
감소한 또는 미미한 자발적인 분화를 가지는 피더 세포 비함유 및 효소 계대배양 배양 시스템에서 다능성 세포의 장기간 배양이 가능하게 하도록, 또는 기저 상태 다능성을 유도하고/하거나 유지시키기 위해, 일 실시형태에서, iPSC는 GSK3 저해제, MEK 저해제 및 임의로 Rho 키나제(ROCK) 저해제를 포함하는 세포 배양 배지에서 후속하는 배양을 요하고, 여기서 세포 배양 배지는 본 명세서에서 고려되는 바대로 TGFβ 수용체(TGFβR) 저해제 및 ALK5 저해제를 포함하는 TGFβ/액티빈 신호전달 경로의 저해제를 포함하지 않거나 이것이 부족하다. 어떠한 특정한 이론에 구속되고자 바라지 않으면서, TGFβR/ALK5 저해제를 가지는 다능성 세포의 장기간 배양이 배양된 전이유전자가 없는 iPSC의 자발적인 분화 및 궁극적으로 기저 상태 다능성의 소실을 발생시킨다고 고려된다.
다양한 실시형태에서, 2단계 배양 플랫폼은 기저 상태 다능성을 포함하는 배양에서 감소한 자발적인 분화를 달성하도록 체세포를 안정하게 재프로그래밍하도록 사용된다. 소정의 실시형태에서, 비다능성 세포는 당해 분야에 개시된 임의의 적합한 방법에 의해 재프로그래밍되고, 후속하여 재프로그래밍된 체세포는 GSK3 저해제, MEK 저해제 및 Rho 키나제(ROCK) 저해제를 포함하는 배지에서 세포를 배양함으로써 배양에서 감소한 자발적인 분화를 달성하도록 배양되고, 여기서 배지는 TGFβR/ALK5 저해제가 부족하다. 몇몇 실시형태에서, 재프로그래밍된 체세포는 기저 상태 다능성 세포를 제공하도록 배양된다.
특정한 실시형태에서, 비다능성 세포는 본 명세서에 개시된 방법에 의해 재프로그래밍되고, 후속하여 재프로그래밍된 체세포는 GSK3 저해제, MEK 저해제 및 Rho 키나제(ROCK) 저해제를 포함하는 배지에서 세포를 배양함으로써 다능성의 안정한 기저 상태로 배양되고, 여기서 배지는 TGFβR/ALK5 저해제가 부족하다.
몇몇 실시형태에서, 비다능성 세포는 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 도입하고, GSK3 저해제, MEK 저해제, Rho 키나제(ROCK) 저해제 및 TGFβR/ALK5 저해제를 포함하는 배지에서 세포를 배양함으로써 재프로그래밍되고, 후속하여 재프로그래밍된 체세포는 GSK3 저해제, MEK 저해제 및 Rho 키나제(ROCK) 저해제를 포함하는 배지에서 세포를 배양함으로써 감소한 자발적인 분화를 가지는 세포를 제공하도록 배양되고, 여기서 배지는 TGFβR/ALK5 저해제가 부족하다.
몇몇 실시형태에서, 비다능성 세포는 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 도입하고, GSK3 저해제, MEK 저해제, Rho 키나제(ROCK) 저해제 및 TGFβR/ALK5 저해제를 포함하는 배지에서 세포를 배양함으로써 재프로그래밍되고, 후속하여 재프로그래밍된 체세포는 GSK3 저해제, MEK 저해제 및 Rho 키나제(ROCK) 저해제를 포함하는 배지에서 세포를 배양함으로써 다능성의 안정한 기저 상태로 배양되고, 여기서 배지는 TGFβR/ALK5 저해제가 부족하다.
바람직한 실시형태에서, 비다능성 세포는 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 도입하고, GSK3 저해제, MEK 저해제, Rho 키나제(ROCK) 저해제 및 TGFβR/ALK5 저해제를 포함하는 배지에서 세포를 배양함으로써 재프로그래밍되고, 후속하여 재프로그래밍된 체세포는 GSK3 저해제, MEK 저해제 및 Rho 키나제(ROCK) 저해제를 포함하는 배지에서 세포를 배양함으로써 다능성의 안정한 기저 상태로 배양되고, 여기서 배지는 TGFβR/ALK5 저해제가 부족하고, 재프로그래밍 전이유전자의 상당한 잔류 발현이 없다.
일 실시형태에서, 비다능성 세포는 본 명세서에서 그 외 개시된 바와 같은 OCT4, SOX2, NANOG, KLF4, LIN28, C-MYC, SV40LT, hTERT, SALL4, GLIS, ESRRB, DPPA2, ECAT1, SOX1, SOX3, KLF2, KLF5, L-MYC, N-MYC, LRH1, UTF1, HESRG, CDH1, TDGF1, DPPA4, DNMT3B, ZIC3 및 L1TD1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 도입하고, GSK-3 저해제, MEK 저해제, Rho 키나제(ROCK) 저해제 및 TGFβR/ALK5 저해제를 포함하는 배지에서 세포를 배양함으로써 재프로그래밍되고, 후속하여 재프로그래밍된 체세포는 GSK-3 저해제, MEK 저해제 및 Rho 키나제(ROCK) 저해제를 포함하는 배지에서 배양되고, 여기서 배지는 TGFβR/ALK5 저해제가 부족하다.
바람직한 실시형태에서, 비다능성 세포는 본 명세서에서 그 외 개시된 바와 같은 OCT4, SOX2, NANOG, KLF4, LIN28, C-MYC, SV40LT, hTERT, SALL4, GLIS, ESRRB, DPPA2, ECAT1, SOX1, SOX3, KLF2, KLF5, L-MYC, N-MYC, LRH1, UTF1, HESRG, CDH1, TDGF1, DPPA4, DNMT3B, ZIC3 및 L1TD1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 도입하고, GSK-3 저해제, MEK 저해제, Rho 키나제(ROCK) 저해제 및 TGFβR/ALK5 저해제를 포함하는 배지에서 세포를 배양함으로써 재프로그래밍되고, 후속하여 재프로그래밍된 체세포는 GSK-3 저해제, MEK 저해제 및 Rho 키나제(ROCK) 저해제를 포함하는 배지에서 배양되고, 여기서 Rock 저해제는 티아조비빈이고, 배지는 TGFβR/ALK5 저해제가 부족하다.
다양한 실시형태에서, 본 명세서에서 고려되는 배양 플랫폼을 사용하여 감소한 자발적인 분화를 가지는 다능성 세포 및/또는 기저 상태 유도된 다능성 줄기 세포(iPSC)를 제조하는 방법이 제공된다.
특정한 실시형태에서, 감소한 자발적인 분화를 가지는 다능성 세포 및/또는 기저 상태 유도된 다능성 줄기 세포(iPSC)는 하나 이상의 비다능성 또는 부분적으로 다능성인 줄기 세포를 포함하는 출발 물질을 사용하고, TGFβR 저해제를 포함하지 않는 배양 배지에서 하나 이상의 다능성 또는 부분적으로 다능성인 줄기 세포를 배양하여 제조된다. 출발 물질은 수득되거나 생성될 수 있다. 예를 들어, 비다능성 또는 부분적으로 다능성인 줄기 세포는 상업적 공급자 또는 다른 공급원으로부터 제공될 수 있거나, 새로(de novo) 수득될 수 있고; 비다능성 세포는 또한 조직 또는 장기로부터 단리될 수 있고; 부분적으로 다능성인 세포는 또한 체세포 또는 성체 줄기 세포를 재프로그래밍함으로써 생성될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 다능성 배아 줄기 세포 또는 체성 핵 전달에 의해 얻어진 다능성 세포는 본 명세서에 기재된 배양 배지 및 플랫폼을 사용하여 기저 상태 다능성을 달성하도록 유도될 수 있다.
특정한 실시형태에서, 하나 이상의 iPSC의 집단은 재프로그래밍된 체세포 또는 재프로그래밍된 성체 줄기 세포를 포함할 수 있다. 특정한 실시형태에서, iPSC는 상기 방법을 수행함으로써 또는 상기 방법에 의해 생성된 iPSC를 수득함으로써 임의의 공지된 방법에 의해 생성될 수 있다.
iPSC를 생성하는 예시적인 방법은 비다능성 세포에서 내인성 OCT4의 발현을 증가시키는 것; OCT4, SOX2, NANOG, KLF4, LIN28, C-MYC, SV40LT, hTERT, SALL4, GLIS, ESRRB, DPPA2, ECAT1, SOX1, SOX3, KLF2, KLF5, L-MYC, N-MYC, LRH1, UTF1, HESRG, CDH1, TDGF1, DPPA4, DNMT3B, ZIC3 및 L1TD1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 하나 이상의 비다능성 세포로 도입하는 것; 또는 OCT4, SOX2 및 NANOG로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 비다능성 세포로 도입하는 것을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. iPSC를 생성하는 방법은 비다능성 세포 또는 부분적으로 다능성 세포를 GSK3 저해제; MEK 저해제; 및 TGFβR 저해제 및 임의로 ROCK 저해제와 접촉시켜 하나 이상의 iPSC를 제조하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
소정의 실시형태에서, 세포 배양 배지는 GSK3 저해제; MEK 저해제; 및 ROCK 저해제를 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 세포 배양 배지는 GSK3 저해제; MEK 저해제; 및 ROCK 저해제를 포함하고, 여기서 ROCK 저해제는 티아조비빈이다.
특정한 실시형태에서, 세포 배양 배지에서 하나 이상의 다능성 세포, 예를 들어 iPSC를 배양하는 것은 다능성의 기저 상태, 생존능력, 정상 핵형, 게놈 안정성, 및 적어도 5회 계대배양, 적어도 10회 계대배양, 적어도 50회 계대배양, 적어도 100회 계대배양, 또는 이것 초과(계대배양의 임의의 개재하는 수 포함) 동안 유지될 수 있는 자발적인 분화의 감소한 속도를 유지하거나 유도한다.
F. 다능성 세포의 규명
본 명세서에서 고려되는 배양 플랫폼을 사용하여 제조된 다능성 세포는 예를 들어 기저 상태 다능성 세포 또는 감소한 자발적인 분화를 가지는 다능성 세포를 포함하는 다능성 세포 생성물의 선택 또는 검증을 추가로 포함할 수 있다. 다능성 세포는 본 명세서에서 고려되는 조성물 및 방법에 의한 재프로그래밍 및 후속하는 배양 후, 또는 다능성 세포가 재프로그래밍되지 않는 경우 다능성 세포가 본 명세서에서 고려되는 배양 방법으로 이행된 후 선택되고/되거나 검증될 수 있다. 세포의 다능성은 다능성과 연관된 관련한 및 검출 가능한 형태학적, 분자적 및/또는 생화학적 변화에 기초하여 규명되고/되거나 선택될 수 있다.
세포의 효력을 평가하는 데 있어서의 별개로 또는 조합으로 모니터링될 수 있는 세포 다능성의 특정한 특징은 유전자 발현, 메틸화, 및 생체내 및 시험관내 특징, 예컨대 i) 둥근 다능성 줄기 세포 형태; ii) 다능성 줄기 세포 마커, 예컨대 SSEA3/4(인간 다능성 줄기 세포); TRA1-60/81; TRA1-85, TRA2-54, GCTM-2, TG343, TG30, CD9, CD29, CD133/프로미닌, CD140a, CD56, CD73, CD105, OCT4, NANOG, SOX2, CD30, SSEA5, CD90 및/또는 CD50, 및 상기의 조합의 발현; iii) 다능성 줄기 세포의 기형종 형성; iv) 배양체 및 시험관내 3계열 분화의 형성: 및 v) 불활성 X 염색체 재활성화를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 소정의 실시형태에서, 임의의 상기 특징의 하위세트는 세포 효력을 모니터링하기 위해 사용된다. 일 실시형태에서, 다능성 세포는 둥근 콜로니 형태, SSEA4, TRA1-81 및 OCT4의 발현, 및 배양체 및 기형종을 형성하는 능력을 가지는 것을 특징으로 한다.
또 다른 실시형태에서, 시험관내 배양에서 감소한 자발적인 분화를 가지는 다능성 세포는 TGFβR 저해제의 존재 하에 배양된 다능성 세포와 비교하여 적어도 약 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%의 하기 분화 마커 유전자 중 하나 이상의 발현의 감소를 포함하는 유전자 발현 서명에 의해 식별될 수 있다: FOXA2, FGF5, SOX17, XIST, NODAL, COL3A1, OTX2, DUSP6, EOMES, NR2F2, NR0B1, CXCR4, CYP2B6, GATA3, GATA4, ERBB4, GATA6, HOXC6, INHA, SMAD6, RORA, NIPBL, TNFSF11, CDH11, ZIC4, GAL, SOX3, PITX2, APOA2, CXCL5, CER1, FOXQ1, MLL5, DPP10, GSC, PCDH10, CTCFL, PCDH20, TSHZ1, MEGF10, MYC, DKK1, BMP2, LEFTY2, HES1, CDX2, GNAS, EGR1, COL3A1, TCF4, HEPH,kDR, TOX, FOXA1, LCK, PCDH7, CD1D FOXG1, LEFTY1, TUJ1, T 유전자(Brachyury) 및 ZIC3.
일 실시형태에서, 감소한 자발적인 분화를 가지는 다능성 세포는 T 유전자, CXCR4, NODAL, GATA4, SOX17, FOXA2, OTX2 및 TUJ1(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는 하나 이상의 분화 마커 유전자의 발현의 감소를 특징으로 한다. 특정한 실시형태에서, 감소한 자발적인 분화를 가지는 다능성 세포는 TGFβR 저해제의 존재 하에 배양된 다능성 세포와 비교하여 적어도 약 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%의 하나 이상의 분화 마커 유전자(예를 들어, T 유전자, CXCR4, NODAL, GATA4, SOX17, FOXA2, OTX2, TUJ1)의 발현의 감소를 포함하는 유전자 발현 서명에 의해 식별될 수 있다. 또 다른 특정한 실시형태에서, 감소한 자발적인 분화를 가지는 다능성 세포는 적어도 약 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%의 하나 이상의 분화 마커 유전자(예를 들어, T 유전자, CXCR4, NODAL, GATA4, SOX17, FOXA2, OTX2, TUJ1)의 발현의 감소를 포함하는 유전자 발현 서명에 의해 식별될 수 있다.
특정한 실시형태에서, 기저 상태 다능성 세포는 Xist 발현 및 분화된 세포, 예를 들어 FOXA2, Sox17 및 Brachyury의 초기 마커의 발현이 상당히 억제되는 한편, 종래의 배양된 다능성 세포는 Xist 발현 및 초기 분화 마커의 상당한 발현의 오직 적당한 억제를 나타낸다.
특정한 실시형태에서, 기저 상태 다능성 세포는 다수의 세포 계대배양, 예를 들어 적어도 1, 3, 5, 7, 10, 15, 20 또는 이것 초과의 계대배양에 대한 기저 상태 다능성의 특징을 보유한다.
G. 폴리뉴클레오타이드
다양한 예시적인 실시형태에서, 본 발명은, 부분적으로, 본 명세서에서 고려되는 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 융합 폴리펩타이드, 및 이를 포함하는 조성물을 고려한다. 다양한 다른 예시적인 실시형태에서, 본 발명은, 하나 이상의 재프로그래밍 인자의 각각을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드에 의해 비다능성 세포를 재프로그래밍하는 것을 고려한다. 본 명세서에 기재된 배양 플랫폼과 사용하기 재프로그래밍 인자는 OCT4, SOX2, NANOG, KLF4, LIN28, C-MYC, SV40LT, hTERT, SALL4, GLIS, ESRRB, DPPA2, ECAT1, SOX1, SOX3, KLF2, KLF5, L-MYC, N-MYC, LRH1, UTF1, HESRG, CDH1, TDGF1, DPPA4, DNMT3B, ZIC3 및 L1TD1을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 바람직한 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 본 명세서에서 기재된 바와 같은 재프로그래밍 인자의 서열을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "유전자"는 인핸서, 프로모터, 인트론, 엑손 등을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 의미할 수 있다. 특정한 실시형태에서, 용어 "유전자"는, 폴리뉴클레오타이드 서열이 폴리펩타이드를 코딩하는 게놈 서열과 동일한지와 무관하게, 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 의미한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "단리된 폴리뉴클레오타이드"는 천연 발생 상태에서 이것을 플랭킹하는 서열로부터 정제된 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 단편에 보통 인접한 서열로부터 제거된 DNA 단편을 의미한다. 특정한 실시형태에서, "단리된 폴리뉴클레오타이드"는 상보성 DNA(cDNA), 재조합 DNA, 또는 자연에 존재하지 않고 사람의 손에 의제 제조된 다른 폴리뉴클레오타이드를 의미한다.
특정한 실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 더 큰 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 벡터 내에 임의의 적합한 순서로 배열될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 벡터는 에피솜 벡터이다.
본 명세서에서 고려되는 폴리뉴클레오타이드는 코딩 서열 자체의 길이와 무관하게 다른 DNA 서열, 예컨대 본 명세서에서 그 외 개시되거나 당해 분야에 공지된 바와 같은 발현 제어 서열, 프로모터 및/또는 인핸서, 비번역된 영역(UTR), 코작(Kozak) 서열, 폴리아데닐화 신호, 추가의 제한 효소 부위, 다중 클로닝 부위, 내부 리보솜 진입 부위(internal ribosomal entry site: IRES), 재조합효소 인식 부위(예를 들어, LoxP, FRT 및 Att 부위), 종결 코돈, 전사 종결 신호 및 자가 절단 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 에피토프 태그와 조합될 수 있어서, 이의 전체 길이는 상당히 변할 수 있다. 따라서, 거의 임의의 길이의 폴리뉴클레오타이드 단편이 사용될 수 있고, 전체 길이는 바람직하게는 제조의 용이성 및 의도된 재조합 DNA 프로토콜에서의 용도에 의해 제한되는 것으로 고려된다.
폴리뉴클레오타이드는 당해 분야에 공지되고 이용 가능한 임의의 다양한 널리 확립된 기법을 이용하여 제조되고/되거나, 조작되고/되거나, 발현될 수 있다. 원하는 폴리펩타이드를 발현하기 위해, 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 적절한 벡터로 삽입될 수 있다. 벡터의 예는 플라스미드, 자가 복제 서열 및 전이성 전이요소이다. 추가의 예시적인 벡터는, 제한 없이, 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 인공 염색체, 예컨대 효모 인공 염색체(yeast artificial chromosome: YAC), 박테리아 인공 염색체(bacterial artificial chromosome: BAC), 또는 P1 유래 인공 염색체(P1-derived artificial chromosome: PAC), 박테리오파지, 예컨대 람다 파지 또는 M13 파지, 및 동물 바이러스를 포함한다. 벡터로서 유용한 동물 바이러스의 카테고리의 예는, 제한 없이, 레트로바이러스(렌티바이러스 포함), 아데노바이러스, 아데노 연관 바이러스, 헤르페스바이러스(예를 들어, 단순 포진 바이러스), 폭스바이러스, 바큘로바이러스, 유두종 바이러스 및 파포바바이러스(예를 들어, SV40)를 포함한다. 발현 벡터의 예는 포유류 세포에서의 발현을 위한 pClneo 벡터(Promega); 포유류 세포에서의 렌티바이러스 매개된 유전자 전달 및 발현을 위한 pLenti4/V5-DEST(상표명), pLenti6/V5-DEST(상표명) 및 pLenti6.2/V5-GW/lacZ(Invitrogen)이다. 특정한 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 폴리펩타이드의 코딩 서열은 포유류 세포에서의 폴리펩타이드의 발현을 위한 이러한 발현 벡터로 결찰될 수 있다.
특정한 실시형태에서, 벡터는 에피솜 벡터 또는 염색체외로 유지되는 벡터이다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "에피솜"은 숙주의 염색체 DNA로 통합됨이 없이 및 분열하는 숙주 세포로부터 점진적 소실 없이 복제할 수 있는 벡터를 의미하고, 이는 또한 상기 벡터가 염색체외로 또는 에피솜으로 복제한다는 것을 의미한다. 벡터는 림프친화성 헤르페스 바이러스 또는 감마 헤르페스바이러스, 아데노바이러스, SV40, 소 유두종 바이러스, 또는 효모로부터의 DNA 복제 또는 "ori"의 기원, 구체적으로 EBV의 oriP에 상응하는 림프친화성 헤르페스 바이러스 또는 감마 헤르페스바이러스의 복제 기원에 대해 코딩하는 서열을 보유하도록 조작된다. 특정한 양태에서, 림프친화성 헤르페스 바이러스는 엡스타인 바 바이러스(Epstein Barr virus: EBV), 카포시 육종 헤르페스 바이러스(Kaposi's sarcoma herpes virus: KSHV), 헤르페스 바이러스 다람쥐원숭이(Herpes virus saimiri: HS) 또는 마레크 질환 바이러스(Marek's disease virus: MDV)일 수 있다. 엡스타인 바 바이러스(EBV) 및 카포시 육종 헤르페스 바이러스(KSHV)는 또한 감마 헤르페스바이러스의 예이다. 통상적으로, 숙주 세포는 복제를 활성화하는 바이러스 복제 전사촉진인자 단백질을 포함한다.
발현 벡터에 존재하는 "발현 제어 서열", "제어 유전요소" 또는 "조절 서열"은 벡터의 비번역된 영역 - 복제 기원, 선택 카세트, 프로모터, 인핸서, 번역 개시 신호(샤인 달가르노(Shine Dalgarno) 서열 또는 코작 서열) 인트론, 폴리아데닐화 서열, 5' 및 3' 비번역된 영역(전사 및 번역을 수행하는 숙주 세포 단백질와 상호작용함)이다. 이러한 유전요소는 이의 강도 및 특이성이 변할 수 있다. 사용된 벡터 시스템 및 숙주에 따라, 유비쿼터스 프로모터 및 유도성 프로모터를 포함하는 임의의 수의 적합한 전사 및 번역 유전요소를 사용할 수 있다.
용어 "작동 가능하게 연결된"은 기재된 성분을 이의 의도된 방식으로 작용하는 허용하는 관계로 있는 이 성분이 있는 병치를 의미한다. 일 실시형태에서, 상기 용어는 발현 제어 서열(예컨대, 프로모터, 및/또는 인핸서)과 제2 폴리뉴클레오타이드 서열 사이의 기능적 연결을 의미하고, 여기서 발현 제어 서열은 제2 서열에 상응하는 핵산의 전사를 지시한다.
본 발명의 특정한 실시형태에서 사용하기에 적합한 예시적인 유비쿼터스 발현 제어 서열은 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉시 초기 프로모터, 바이러스 유인원 바이러스 40(SV40)(예를 들어, 초기 또는 후기), 몰로니 설치류 백혈병 바이러스(MoMLV) LTR 프로모터, 라우스 육종 바이러스(RSV) LTR, 단순 포진 바이러스(HSV)(타이미딘 키나제) 프로모터, 백시니아 바이러스로부터의 H5, P7.5 및 P11 프로모터, 신장 인자 1-알파(EF1a) 프로모터, 초기 성장 반응 1(EGR1), 페리틴 H(FerH), 페리틴 L(FerL), 글라이세르알데하이드 3-포스페이트 탈수소효소(GAPDH), 진핵생물 번역 개시 인자 4A1(EIF4A1), 열 쇼크 70kDa 단백질 5(HSPA5), 열 쇼크 단백질 90kDa 베타, 멤버 1(HSP90B1), 열 쇼크 단백질 70kDa(HSP70), β-키네신(β-KIN), 인간 ROSA 26 유전좌위(Irions et al., Nature Biotechnology 25, 1477 - 1482 (2007)), 유비퀴틴 C 프로모터(UBC), 포스포글라이세레이트 키나제-1(PGK) 프로모터, 사이토메갈로바이러스 인핸서/닭 β-액틴(CAG) 프로모터 및 β-액틴 프로모터를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
유도성 프로모터/시스템의 예시적인 예는 스테로이드 유도성 프로모터, 예컨대 글루코코르티코이드 또는 에스트로겐 수용체를 코딩하는 유전자에 대한 프로모터(상응하는 호르몬에 의한 처리에 의해 유도성), 메탈로티오닌 프로모터(다양한 중금속에 의한 처리에 의해 유도성), MX-1 프로모터(인터페론에 의해 유도성), "진스위치" 미페프리스톤 조절 가능한 시스템(Sirin et al., 2003, Gene, 323:67), 쿠메이트 유도성 유전자 스위치(WO 2002/088346), 테트라사이클린 의존성 조절 시스템 등을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
조건적 발현은 또한 부위 특이적 DNA 재조합효소를 사용하여 달성될 수 있다. 본 발명의 소정의 실시형태에 따라, 폴리뉴클레오타이드는 부위 특이적 재조합효소에 의해 매개되는 재조합을 위한 적어도 1개(통상적으로 2개)의 부위(들)를 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "재조합효소" 또는 "부위 특이적 재조합효소"는 삭제적 또는 통합적 단백질, 효소, 보인자, 또는 야생형 단백질일 수 있는 1개 이상(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 이것 초과)의 재조합 부위를 수반하는 재조합 반응에 관여된 연관 단백질(문헌[Landy, Current Opinion in Biotechnology 3:699-707 (1993)] 참조), 또는 이들의 돌연변이체, 유도체(예를 들어, 재조합 단백질 서열을 함유하는 융합 단백질 또는 이의 단편), 단편 및 변이체를 포함한다. 본 발명의 특정한 실시형태에서 사용하기에 적합한 재조합효소의 예시적인 예는 Cre, Int, IHF, Xis, Flp, Fis, Hin, Gin, ΦC31, Cin, Bxb1, Tn3 레솔바제(resolvase), TndX, XerC, XerD, TnpX, Hjc, Gin, SpCCE1 및 ParA를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
특정한 실시형태에서, 본 명세서에서 고려되는 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 폴리펩타이드를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 특정한 실시형태에서, 복수의 폴리펩타이드의 각각의 효율적인 번역을 달성하기 위해, 폴리뉴클레오타이드 서열은 자가 절단 폴리펩타이드를 코딩하는 하나 이상의 IRES 서열 또는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 분리될 수 있다. 본 명세서에 사용된 바대로, "내부 리보솜 진입 부위" 또는 "IRES"는 시스트론의 개시 코돈, 예컨대 ATG(단백질 코딩 영역)로의 직접적인 내부 리보솜 진입을 촉진하여서, 유전자의 캡 독립적 번역을 발생시키는 유전요소를 의미한다. 예를 들어, 문헌[Jackson et al., 1990. Trends Biochem Sci 15(12):477-83) 및 Jackson and Kaminski. 1995. RNA 1(10):985-1000]을 참조한다. 당해 분야의 숙련자에 의해 일반적으로 사용되는 IRES의 예는 미국 특허 제6,692,736호에 기재된 것을 포함한다. 당해 분야에 공지된 "IRES"의 추가의 예는 피코르나바이러스로부터 얻을 수 있는 IRES를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다(Jackson et al., 1990).
H. 폴리펩타이드
본 발명은, 부분적으로, 폴리펩타이드, 융합 폴리펩타이드 및 폴리펩타이드를 발현하는 벡터를 포함하는 조성물을 고려한다. 바람직한 실시형태에서, 폴리펩타이드는 본 명세서에 기재된 아미노산 서열을 포함한다. "폴리펩타이드", "폴리펩타이드 단편", "펩타이드" 및 "단백질"은, 반대로 기재되지 않은 한, 종래의 의미에 따라, 즉 아미노산의 서열로서 상호 호환 가능하게 사용된다. 일 실시형태에서, "폴리펩타이드"는 융합 폴리펩타이드 및 다른 변이체를 포함한다. 폴리펩타이드는 임의의 다양한 널리 공지된 재조합 및/또는 합성 기법을 이용하여 제조될 수 있다. 폴리펩타이드는 특정한 길이로 제한되지 않고, 예를 들어 이들은 전장 단백질 서열, 전장 단백질의 단편 또는 융합 단백질을 포함할 수 있고, 폴리펩타이드의 번역 후 변형, 예를 들어 글라이코실화, 아세틸화, 인산화 등, 및 당해 분야에 공지된 다른 변형(둘 다 천연으로 발생 및 비천연으로 발생)을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "단리된 펩타이드" 또는 "단리된 폴리펩타이드" 등은 세포 환경 및 세포의 다른 성분과의 연관으로부터 펩타이드 또는 폴리펩타이드 분자의 시험관내 단리 및/또는 정제를 의미하고, 즉 이것은 생체내 물질과 상당히 연관되지 않는다.
일 실시형태에서, 2개 이상의 폴리펩타이드의 발현이 원해지는 경우, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 본 명세서에서 그 외 기재된 바대로 IRES 서열에 의해 분리될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 2개 이상의 폴리펩타이드는 본 명세서에 기재된 인접한 폴리펩타이드 사이에 폴리펩타이드 절단 신호를 포함하는 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 예시적인 폴리펩타이드 절단 신호는 폴리펩타이드 절단 인식 부위, 예컨대 프로테아제 절단 부위, 뉴클레아제 절단 부위(예를 들어, 희귀 제한 효소 인식 부위, 자가 절단 리보자임 인식 부위) 및 자가 절단 바이러스 올리고펩타이드를 포함한다(문헌[deFelipe and Ryan, 2004. Traffic, 5(8); 616-26]을 참조한다).
적합한 프로테아제 절단 부위 및 자가 절단 펩타이드는 숙련자에게 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Ryan et al., 1997. J. Gener. Virol. 78, 699-722; Scymczak et al. (2004) Nature Biotech. 5, 589-594]에서 참조한다). 예시적인 프로테아제 절단 부위는 포티바이러스 NIa 프로테아제(예를 들어, 담배 식각 바이러스 프로테아제), 포티바이러스 HC 프로테아제, 포티바이러스 P1(P35) 프로테아제, 비요바이러스 NIa 프로테아제, 비요바이러스 RNA-2 코딩된 프로테아제, 아프토바이러스 L 프로테아제, 엔테로바이러스 2A 프로테아제, 리노바이러스 2A 프로테아제, 피코르나 3C 프로테아제, 코모바이러스 24K 프로테아제, 네포바이러스 24K 프로테아제, RTSV(벼 퉁그로 구형 바이러스: rice tungro spherical virus) 3C 유사 프로테아제, PYVF(파스닙 노란색 반점 바이러스: parsnip yellow fleck virus) 3C 유사 프로테아제, 헤파린, 트롬빈, Xa 인자 및 엔테로키나제의 절단 부위를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 이의 높은 절단 엄격도로 인해, TEV(담배 식각 바이러스) 프로테아제 절단 부위는 바람직한 일 실시형태에서 예를 들어 EXXYXQ(G/S)(서열 번호 1), 예를 들어 ENLYFQG(서열 번호 2) 및 ENLYFQS(서열 번호 3)(식 중, X는 임의의 아미노산을 나타냄(Q 내지 G 또는 Q 내지 S 사이에 TEV에 의한 절단이 생김))이다.
소정의 실시형태에서, 자가 절단 폴리펩타이드 부위는 2A 또는 2A 유사 부위, 서열 또는 도메인을 포함한다(Donnelly et al., 2001. J. Gen. Virol. 82:1027-1041). 특정한 실시형태에서, 바이러스 2A 펩타이드는 아프토바이러스 2A 펩타이드, 포티바이러스 2A 펩타이드 또는 카디오바이러스 2A 펩타이드이다.
일 실시형태에서, 바이러스 2A 펩타이드는 구제역 질환 바이러스(FMDV) 2A 펩타이드, 말 비염 A 바이러스(ERAV) 2A 펩타이드, 토세아 아시그나 바이러스(TaV) 2A 펩타이드, 테스코바이러스-1(PTV-1) 2A 펩타이드, 테일로바이러스 2A 펩타이드 및 뇌심근염 바이러스 2A 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
Figure pct00002
바람직한 실시형태에서, 하나 이상의 재프로그래밍 인자 폴리펩타이드를 코딩하는 벡터는 각각의 재프로그래밍 인자 사이의 동일한 또는 상이한 프로테아제 절단 부위 중 하나 이상을 포함한다.
본 명세서에 인용된 모든 공보, 특허 출원 및 등록된 특허는, 각각의 개별적인 공보, 특허 출원 및 등록된 특허가 구체적으로 및 개별적으로 참고로 포함되는 것으로 표시되는 것처럼 본 명세서에 참고로 포함된다.
상기 발명이 이해의 명확성의 목적을 위해 예시 및 예에 의해 약간 자세히 기재되어 있지만, 첨부된 청구항의 정신 또는 범위를 벗어나지 않으면서 이것에 소정의 변경 및 변형이 이루어질 수 있다는 것이 본 발명의 교시내용의 면에서 당해 분야의 숙련자에게 용이하게 명확할 것이다. 하기 실시예는 제한이 아니라 오직 예시에 의해 제공된다. 당해 분야의 숙련자는 본질적으로 유사한 결과를 생성시키도록 변경되거나 변형될 수 있는 다양한 중요치 않은 매개변수를 용이하게 인식할 것이다.
실시예
본 명세서에 개시된 실시예는 단계 특이적 배지 조성물에서 소분자 경로 저해제를 사용하는 hiPSC의 신속하고 병렬인 생성, 선택 및 증식을 위한 플랫폼을 기재한다. 플랫폼은 완전히 피더 비함유 환경에서 최소 재프로그래밍 인자를 사용하는 효율적이고 촉진된 에피솜 재프로그래밍을 지지하였다. 생성된 hiPSC는 전이유전자가 없고, 용이하게 배양하고, 균일하고 게놈에 의해 안정한 다능성 집단을 유지시키면서 단일 세포로서 증식시켰다. 실시예에서 고려되는 배지 조성에서 생성되고 유지되는 hiPSC는 다능성의 기저 상태와 연관된 특성을 나타내고, 균일한 산업 또는 임상 등급의 hiPSC의 제조를 위한 탄탄한 고속 시스템을 나타낸다.
실시예 1 - IPSC의 장기간 유지 및 증식을 위한 배지 플랫폼의 식별
개관
SMC4 보충된 배양물에서의 대부분의 렌티바이러스 유래 hiPSC 라인은 미분화된 세포의 균일한 집단을 유지하지만, 라인의 하위세트에서의 형질전환 재프로그래밍 인자의 침묵화는 연장된 배양에서 다양한 정도의 자발적인 분화를 나타냈다(도 1a 및 도 1b). 따라서, 다양한 세포 배양 성분은 잔류 전이유전자 발현과 무관하게 연속 FF 배양 및 단일 세포 효소 계대배양 동안 다능성의 유지를 위한 조건을 확인하기 위해 평가되었다. 재프로그래밍 및 유지 과정의 상이한 단계에서 고유한 경로를 표적화하는 다단계 배양 시스템은 hiPSC 생성에 대한 효율적이고 탄탄한 접근법으로서 확인되었다.
결과
장기간 유지 동안 TGFβ 경로의 저해는 침묵화된 전이유전자 발현을 가지는 hiPSC 라인의 자발적인 분화에서 유의미한 인자로서 식별되었다(도 1c). 자발적인 분화를 겪는 것으로 밝혀진 iPSC 세포주 중 하나를 운명 유지 배지(FMM)인 새로운 배지 제제에서 배양물로 이행하였다(표 1). 자발적인 분화를 제거하고, SSEA4/TRA1-81 양성 세포의 균일한 집단은 2회 내지 3회 계대배양 내에 확립되었다(도 1a).
종래의 배양(MEF 피더 세포에서의 hESC 배지), FF 배양에서의 SMC4 보충된 배지 또는 FF 배양에서의 새로 제제화된 FMM(도 1d)에서의 OCT4/KLF4/SOX2(OKS) 렌티바이러스 재프로그래밍을 또한 비교하였다. 렌티바이러스 재프로그래밍의 유도 후 17일에, SSEA4/TRA1-81 양성 세포를 FAC에 의해 선택하고, 비교를 위해 SMC4 또는 FMM 중에 재플레이팅하였다(도 1d). SMC4는 FMM에 의한 재프로그래밍보다 유도 후 17일에 재프로그래밍의 동역학을 개선하고, 유의미하게 더 많은 SSEA4/TRA1-81 양성 세포를 생성시켰다(FMM에 대해 2.72% 대 0.76% 및 종래의 배양에 대해 0.10%; 도 1d).
초기 분류 후, 세포를 10일 동안 이의 각각의 조건에서 유지시킨 후, 제2의 SSEA4/TRA1-81 양성 유세포분석법 선택을 하였다(도 1d). 배양물을 추가 9일(감염 후 전체 36일) 동안 유지시키고, OCT4 및 NANOG 동시발현에 기초하여 미분화된 콜로니에 대해 스코어링하였다(도 1d 및 도 1e). SMC4에서의 초기 재프로그래밍, 이어서 FMM으로의 이행의 조합은 궁극적으로 더 많은 OCT4/NANOG 양성 콜로니를 생성시키고, SMC4에서의 연속 유지에 비해 OCT4/NANOG 음성 콜로니의 수를 유의미하게 감소시켰다(도 1d 및 도 1e). OCT4/NANOG 양성 콜로니가 배타적으로 FMM에서 유지된 배양물에서 검출되지만, 콜로니의 수 및 크기는 단계 특이적 배지 접근법에 비해 나쁜 것으로 보였다.
이 결과는 재프로그래밍 및 유지 과정의 상이한 단계에서 고유한 경로를 표적화하는 신규한 다단계 배양 시스템이 고품질 hiPSC의 효율적인 제조를 발생시켰다는 것을 보여준다.
실시예 2 - 단일 세포 계대배양 및 FF 포맷에서 전이유전자 비함유 hiPSC를 제조하기 위한 플랫폼
개관
에피솜 벡터 시스템을 사용한 비통합적 재프로그래밍 방법의 효율은 특히 FF 환경에서 극도로 낮다(0.001% 미만)(Narsinh et al., 2011; O'Doherty et al., 2013). SMC4를 함유하는 운명 재프로그래밍 배지(FRM) 및 재프로그래밍을 개선하는 것을 나타난 배지 첨가제 및 FMM의 2개의 배지를 포함하는 다단계 배양 시스템에서 에피솜 유도를 시험하였다(도 2a 및 표 1).
결과
유전자 조합 OCT4/SOX2/NANOG/KLF4/LIN28/MYC/SV40LT(OSNKLMT)로 이루어진 에피솜 발현 시스템을 사용하여 다양한 섬유아세포 세포를 형질감염시켰다. 에피솜 발현의 유도 후 24시간에, 재프로그래밍 배양물을 FRM으로 이행하여 재프로그래밍 동역학을 증대시켰다. 초기 콜로니 형성이 1주 내에 관찰되었고, 10일에 SSEA4/TRA1-81 양성 세포의 큰 집단이 관찰되었다(1% 초과)(도 8a 및 도 8b). 14일에, FRM에 의해 지지된 재프로그래밍 배양물을 FRM 또는 FMM 배지로 분할하였다. 21일에, FACS를 사용하여 배양물 중에 SSEA4/TRA1-81/CD30 양성 세포를 식별하였다(도 8c). FRM 유지된 배양물이 분화된 세포 및 미분화된 세포 둘 다를 함유하는 한편, FMM 배양물은 거의 미분화된 세포를 함유하였다(도 8d).
이 접근법의 쓰루풋 및 탄탄함을 상이한 연령, 성별 및 민족성의 공여자로부터 최소 용적의 제대혈로부터 증식된 섬유아세포 및 CD34+ 세포에 의해 시험하였다(도 9a 및 도 9b). 체세포 재프로그래밍을 도 2a에 기재된 바대로 유도하고, 에피솜 유전자 조합 세트 OSNKLMT 및 96웰 플레이트 유세포분석법은 16일과 21일 사이에 개별 hiPSC에 대해 분류되었다(도 2b). 시험된 대부분의 라인에 대해 SSEA4/TRA1-81/CD30 양성 세포의 큰 집단이 관찰되었다. 종래의 배지 및 피더 세포를 사용한 병렬 재프로그래밍 실험과 비교하여, FRM 및 FMM 배지 시스템은 hiPSC 클론의 수를 유의미하게 증가시켰다(FTC007 섬유아세포주에 대해 FRM/FMM에서의 8.55% 대 종래의 배양에서의 0.02%; 도 2b 및 도 2c). SMC4 배지에 의한 렌티바이러스 재프로그래밍에 불응성인 것으로 이전에 관찰된 섬유아세포 FTC008을 포함하는, 각각의 체성 라인(도 2b, 도 10a 및 도 10b)에 대해 96웰 플레이트마다 평균 22개의 클론성 hiPSC가 보였다. 콜로니는 후속하여 NANOG에 대한 세포내 및 표면 마커 발현의 분석 및 직접적인 qRTPCR에 의해 진짜의 hiPSC 클론으로 확인되었다(도 2d, 도 2e 및 도 10c). 96웰 분류 및 선택 과정을 이용한 재프로그래밍의 효율은 또한 증가하였다(도 2e). 한정된 표면 코팅 비트로넥틴에 의해 유사한 재프로그래밍 효율이 또한 관찰되었다(도 10d).
이 데이터는 플랫폼이 에피솜 재프로그래밍에 적용될 때 탄탄하고 재현 가능하고, 다중 재프로그래밍 실험이 iPSC 최종 생성물의 품질을 손상하지 않으면서 최소 효과로 고속 방식으로 병렬로 수행되게 한다는 것을 보여준다.
실시예 3 - FMM에서 전이유전자 비함유 hiPSC 라인의 장기간 계대배양 및 증식
개관
FRM 및 FMM의 다단계 배지 플랫폼을 사용한 hiPSC의 장기간 계대배양 및 증식을 실시예 2로부터의 hiPSC 클론을 사용하여 연구하고, FF 배양물에서 단일 세포로서 증식시켰다(도 3a 및 도 3b).
결과
실시예 2에 따라 재프로그래밍된 hiPSC 라인은 계대배양 4-7에 의해 전이유전자 기반 재프로그래밍 인자와 독립적으로 에피솜 DNA 및 이에 따라 다능성을 소실하였다(도 3c). hiPSC 라인은 SSEA4, TRA1-81, OCT4 및 NANOG에 양성인 미분화된 세포의 균일한 집단을 유지시켰다. 더구나, 이 라인은 다능성 배양에서 흔히 사용되는(도 3d 및 도 3e) 임의의 클린업 전략의 부재 하에 다능성 특징을 유지시켰다(도 3f). 일상적 단일 세포 계대배양된 배양 동안(도 10e-10g) 마트리겔이 한정된 표면 코팅 비트로넥틴에 의해 대체될 때 균일한 hiPSC 배양의 유사한 증식이 관찰되었다.
FF 환경에서 단일 세포로서 배양된 hESC 및 hiPSC 라인에서 게놈 비정상이 대개 검출되었다(Laurent et al., 2011; Taapken et al., 2011). 모든 분석된 hiPSC 라인의 핵형 분석은 FMM 배양에서 게놈 안정성을 입증하였다(도 4a). 또한, 연장된 기간 동안 FMM에서 유지된 단일 세포 및 FF 배양된 hiPSC 클론(25회 내지 30회 계대배양)은 배양 클리닝 또는 선택에 대한 필요 없이 이의 미분화된 프로필 및 게놈 안정성을 계속해서 유지하였다(도 4b).
FMM에서 유지된 에피솜 유래 hiPSC 클론은 또한 배양체를 통한 모든 3개의 체성 계열, 시험관내 분화 및 기형종 형성에 의한 생체내 분화를 용이하게 발생시켰다(도 4c-e).
이 데이터는 FRM 및 FMM 다단계 배지 플랫폼이, 다능성 및 게놈에 의해 안정한 세포의 균일한 집단을 유지시키면서, 전이유전자가 없는 hiPSC 클론이 FF 및 단일 세포 효소 계대배양 포맷에서 용이하게 생성되고 증식되게 한다는 것을 입증하였다.
실시예 4 - 다단계 배지 플랫폼은 최소 유전자에 의해 에피솜 재프로그래밍이 가능하게 한다
개관
암유전자, 예컨대 KLF4, MYC 및 LIN28에 대한 감소한 의존성 또는 재프로그래밍 과정에서 P53을 넉다운시킬 필요를 가지는 효율적인 발자국이 없는 발현 시스템은 다능성 줄기 세포 치료에 크게 가치가 있을 것이다(Lee et al., 2013; Okita et al., 2011; Yu et al., 2009). 다단계 배지 플랫폼이 OSNKLMT 재프로그래밍 인자를 사용하는 전이유전자가 없는 hiPSC 세포의 생성 및 증식을 위한 매우 효율적이고 탄탄한 플랫폼을 입증하므로, 재프로그래밍 인자에 대한 필요요건에 대해 플랫폼의 탄탄함은 측정하였다.
결과
유전자 발현 조합 및 용량을 변화시키려는 시도로 OCT4/NANOG/SOX2(ONS), OCT4/SOX2(OS) 또는 OCT4/OCT4(2xO)를 포함하는 최소 유전자 세트를 함유하는 몇몇 에피솜-발현 카세트를 작제하였다(도 5a). 섬유아세포 세포주를 OCT4, NANOG, SOX2 및 SV40LT의 조합에 의해 형질감염시키고, FRM/FMM 플랫폼을 사용하여 배양하였다. SV40LT 단독은 재프로그래밍의 13일에 임의의 진정한 SSEA4/TRA1-81 양성 세포를 생성하지 않았지만, 형질감염 후 세포 생존을 개선하였다(도 5b 및 도 11a). 다양한 재프로그래밍 인자 조합은 재프로그래밍 과정에서 초기에 SSEA4/TRA1-81 양성 집단의 출현에 의해 입증된 바대로 효율적인 재프로그래밍을 발생시켰다(13일에 OCT4/SOX2/SV40LT에 대해 0.5% 초과 및 OCT4/NANOG/SOX2/SV40LT에 대해 3.5% 초과; 도 5b). 재프로그래밍 인자 화학량론의 효과는 2xO+ONS+T에 대해 OS+ONS+T를 사용한 재프로그래밍의 효율을 비교하고(0.1% : 1.03%); 2xO+ONS+OS+T에 대해 2xO+ONS+T를 비교하고(1.03% : 3.53%); 2xO+ONS+OS+T에 대해 2xO+OS+T를 비교하고(0.58% : 3.53%); 2xO+ONS+T에 대해 ONS+T를 비교하고(0.6% : 1.03%); 2xO+OS+T에 대해 OS+T를 비교함으로써(0.06% : 0.58%) 나타나고, 이는 일관하여 재프로그래밍에 2xO을 추가하는 것의 값을 보여준다. 재프로그래밍 인자 화학량론의 효과는 벡터 및/또는 벡터의 조합에서의 OCT4를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 수, OCT4를 포함하는 다수의 벡터의 조합, 및/또는 OCT4와 형질감염을 위해 동일한 또는 모든 벡터에 포함된 다른 재프로그래밍 인자 사이의 비율로부터 보인다. 추가의 일 동안 재프로그래밍된 배양은 SSEA4/TRA1-81 양성 집단을 유의미하게 증가시켰다(16일에 OCT4/SOX2/SV40LT에 대해 4.0% 초과; 도 11b). 놀랍게도, 관찰된 재프로그래밍된 세포의 백분율은 암유전자 KLF4 및 MYC를 함유하는 렌티바이러스 및 에피솜 유도된 시스템에 필적하였다(도 2b, 도 5b 및 도 11b).
몇몇 재프로그래밍 인자 조합을 정방향으로 운반하고, 유세포분석법 분류 및 개별 hiPSC 클론의 선택 전에 FMM 배지로 이행하였다. OSNKLMT 에피솜 재프로그래밍과 유사하게, 클론성 hiPSC 라인은 용이하게 최소 유전자 OCT4, SOX2 및 SV40LT를 함유하는 조합(2xO + OS + T), 및 다른 조합으로부터 유래하였다(도 5c). 계대배양 5-7에 의해 전이유전자 및 에피솜 벡터 마커를 소실한 hiPSC 클론을 추가의 분석을 위해 정방향으로 운반하였다(도 5d). 선택된 클론을 FF 환경에서 단일 세포로서 계속해서 계대배양하고, 게놈에 의해 안정한 미분화된 세포의 균일한 집단을 유지시키고, 3개의 체성 계열로 효율적으로 분화하는 능력을 나타냈다(도 5e-j).
종합하면, 이 데이터는 hiPSC가 FRM/FMM, 유세포분석법 기반 재프로그래밍 플랫폼에서 최소 재프로그래밍 유전자의 일시적 발현에 의해 용이하게 생성된다는 것을 나타낸다.
실시예 5 - FMM 플랫폼은 기저 상태 다능성을 지지한다
개관
FMM 플랫폼을 추가로 평가하기 위해, 기존의 방법에 의해 재프로그래밍된 체세포의 유전자 발현 특징을 본 명세서에서 고려되는 FMM 플랫폼을 사용하여 재프로그래밍된 체세포의 유전자 발현 특징과 비교하였다. 소분자 배양과 종래대로 유지된 hiPSC 배양 사이의 유전자 발현 차이(Hanna et al., 2010b; Saha 및 Jaenisch, 2009)를 평가하였다.
결과
실험의 일 세트에서, 소분자 매개된 배양과 종래의 배양 사이의 유전자 발현 패턴을 평가하였다. 렌티바이러스 유도된 hiPSC 클론 FTi111을 소분자 배양에서 생성하고 유지시키고, 다능성인 것으로 밝혀졌다. 클론을 i) 피더 세포를 가지는 종래의 배지 및 ii) 피더 세포를 가지거나 FF 표면에 있는 소분자 저해제 함유 배지를 포함하는 다양한 배양 환경으로 직접적으로 해동하였다(도 12a 및 도 12b). 종래의 배양에서의 hiPSC 콜로니를 ROCK 저해제인 티아조비빈의 존재 하에 오직 회수하고, 후속하여 회수된 세포를 덩어리 배양으로 전환하였다(도 12b 및 도 12c). 배양 조건의 각각의 세트는 고유한 콜로니 형태(도 12d) 및 다능성 마커에 대한 유전자 발현의 구별되는 패턴(도 12e)을 입증하였다. 피더 세포에서 종래대로 유지된 배양물은 소분자에서 유지된 이의 대응 배양물보다 hESC 대조군 H1 및 종래의 배양에서 유지된 HUES9를 더 가깝게 닮았다(도 12e). 이 데이터는 소분자 매개된 배양과 종래의 배양 사이에 구별되는 유전자 발현 패턴이 존재한다는 것을 보여준다.
렌티바이러스 유도 및 종래의 ESC/피더 배양을 사용하여 유래된 hiPSC와 에피솜 유래 라인 사이에 그리고 추가로 FRM/FMM 플랫폼에서 유지된 재프로그래밍 인자의 상이한 조합에 의해 유래된 에피솜 라인 사이에 유전자 발현에서의 차이를 또한 평가하였다. 고함량 qRT-PCR 분석을 이용하여 다능성 및 분화와 연관된 유전자 발현을 정량화하였다. 조사된 대부분의 다능성 유전자는 FMM 배양 또는 피더 세포를 함유하는 종래의 배양에서 유지된 hiPSC 사이에 필적하는 발현 패턴을 나타냈다(도 6a). 그러나, 분화와 연관된 유전자의 평가에서 세포주 사이의 차이가 관찰되었다(도 6b). FMM 유지된 hiPSC는, 종래의 배지에서 및 피더 세포에서 유지된 hiPSC 및 H1 hESC 둘 다와 비교하여, 3개의 체성 계열과 연관된 대부분의 유전자의 더 낮은 발현을 나타냈다. 에피솜 유전자 세트 OSNKLMT에 의해 유도된 라인의 하위세트는 OTX2 및 TUJ1인 외배엽 계열의 발현을 나타내는 것으로 보이는 한편, 이 발현은 Lin28, KLF4 및 c-MYC의 사용 없이 에피솜 유래 hiPSC에서 무시할 만하였다(도 6b). 놀랍게도, 시험된 모든 분화 유전자의 발현은 에피솜 최소 유전자 세트로부터 유래하고 FMM에서 유지된 모든 hiPSC에서 완전히 억제되었다(도 6b). 종합하면, 이 데이터는 FRM/FMM 플랫폼이 아주 적은 에피솜 기반 재프로그래밍 인자를 가지는 세포를 탄탄하게 재프로그래밍할 수 있고, 안정한 기저 다능성 상태에서 hiPSC를 유지할 수 있다는 것을 나타냈다.
하기 방법으로부터 유래된 hiPSC에 대해 전반적인 유전자 발현 패턴을 결정하였다: i) FMM에서 유지된 에피솜 유도, ii) FMM에서 유지되지만 3의 계대배양을 위해 종래의 배지로 전환된 에피솜 유도, iii) SMC4에서 유지된 렌티바이러스 유도; 및 iv) 종래의 배양에서 유지된 렌티바이러스 유도(도 13a, 도 13b). 유전자 발현 프로필을 평가하기 전에, 모든 라인은 다능성이고, 게놈에 의해 안정하고, 모든 3개의 체성 계열로 분화할 수 있다고 결정되었다. 소분자 배양과 종래의 배양 사이에 차등으로 발현된 유전자의 클러스터 분석은 hiPSC 라인이 원래의 유래 방법 및 배양에 의해서가 아니라 현재의 배양 조건에 기초하여 그룹화된다는 것을 밝혀냈다(도 13b). 2.5배 발현 차이를 나타내는 300개의 유전자의 유전자 존재론 분류화는 종래의 배양 그룹에서 매우 농후화된 주요 카테고리로서 분화 및 발육을 식별하는 한편, 소분자 배양 그룹에서 상향조절된 유전자는 대부분 세포 증식 및 성적 발달의 조절과 연관되었다(도 13c 및 도 13d).
유전자 발현 분석을 반복하고, FMM, 종래의, 또는 이행 배양 시스템을 직접적으로 비교하였다(FMM, Conv, FMM→Conv, Conv→FMM; 도 13a). 클러스터 분석은 생성 방법 또는 이전의 배양 시스템과 무관하게 현재의 배양 시스템에 기초하여 분리된 2개의 그룹을 제조하였다(도 7a). 예를 들어, hiPSC 클론 FTC016-c28을 종래의 배양으로 이행 전에 FRM/FMM 플랫폼 하에 생성하고 유지시켰다. 이 클론은 FMM에서 유지된 이의 모 라인에 의해서가 아니라 배타적으로 종래의 배양에서 유지된 배양에 의해 그룹화되고, FMM으로의 이행까지 종래의 배양에서 생성되고 종래의 세트 내에 그룹화된 OKS 렌티바이러스 유도된 hiPSC 클론과 같은 라인에 의해 필적하는 결과가 보였고, 이 이행 시, 이것은 FMM 클러스터 내에 그룹화되었다(도 7a). 유전자 존재론은 분화 및 발육과 연관된 유전자에 의해 농후화된 종래의 배양을 카테고리화하였다(즉, p 값 = 2.2E-10, 패턴 규명 공정; 도 7b 및 도 13e). 총괄하여, 이 데이터는 분화 성향과 연관된 유전자가 FMM 배양에서 유의미하게 감소하고, hiPSC가 FMM 배양 플랫폼에 적응되어 자발적인 분화 잠재력을 감소시킬 수 있다는 것을 보여주었다.
인간 다능성 줄기 세포의 기저 상태 및 준안정한 상태를 나타내도록 유전자 목록을 파일화하였다(De Los Angeles et al., 2012; Han et al., 2011; Hanna et al., 2010a; Hirata et al., 2012; Nichols and Smith, 2012; Valamehr et al., 2012; Zhou et al., 2010)(도 7c). FMM 또는 종래의 배양에서 hiPSC 라인에 대해 이 유전자 목록에 기초한 유전자 클러스터링을 수행하였다(도 7d). 전반적인 유전자 발현 비교와 유사하게, 초점화된 유전자 클러스터링은 이의 현재의 배양 조건에 기초한 세포주의 분리를 보여주었고, 프로필은 양립 가능한 것으로 보인다. 예를 들어, FMM으로부터 종래의 배양으로 이행한 hiPSC 클론 FTC016-c28은 FMM에서 유지된 이의 모 hiPSC 라인에 의해서가 아니라 H1 hESC에 의해 그룹화되었다(도 7d). 유사하게, 종래의 배양에서 유지된 섬유아세포주로부터 유래된 렌티바이러스 hiPSC 클론은 HUES9 hESC 및 종래의 배양에서의 다른 hiPSC 클론에 의해 그룹화되었지만, FMM으로 전환될 때, 이것은 제대혈로부터 유래된 에피솜, 및 다른 FMM 배양된 라인에 의해 그룹화되었다(도 7d). 소분자(SMC4/FMM) 대 종래의 배양과 관련하여 각각의 프로브 세트에 대한 평균 강도를 작도함으로써 2개의 클러스터 내의 기저 상태 및 준안정한 상태를 대표하는 유전자의 분포를 결정하였다(도 7e). 놀랍게도, 기저 상태와 연관된 대부분의 유전자는 소분자 배양 클러스터에서 증가한 발현을 보여주고, 종래의 배양 클러스터에서 준안정한 상태와 연관된 유전자의 증가한 발현이 검출되었다(도 7e).
종래의 배양에서 배양되고 유지된 hiPSC의 X 불활성화 상태를 소분자 배양에 적응되고 10회 계대배양 동안 유지된 이의 대응물과 비교하였다(도 7f). 소분자 배양에서 유지된 hiPSC는 종래의 배양과 비교하여 X 염색체 유전자 발현의 증가를 보여주고, 이는 침묵화된 X 염색체의 재활성화를 제안하였다(도 7f). 주목할만한 예외는 소분자 배양으로의 전환에서 하향조절되는 X 불활성 특이적 전사체(XIST)였다(도 7f). X 활성화의 추가의 증거는 종래의 배지에 적응된 이의 대응 배양에 비해 FMM에서 배양된 hiPSC에서의 H3K27me3의 차등 염색에 의해 제공되었다(도 7g). FMM에서의 대부분의 hiPSC가 H3K27me3 염색이 부족한 한편, 종래의 배양에서의 대부분의 hiPSC는 감소한 핵 크기의 출현으로 H3K27me3 핵 초점을 나타내고, 이는 X 불활성화를 제안하였다(종래의 배양에서의 90% 초과의 H3K27me3 염색과 비교하여 FMM에서의 10% 미만의 H3K27me3 염색; 도 7g).
실시예 6 - 소분자 배양에서의 hiPSC 유지
배양물의 포화상태가 75% 내지 90%에 도달하면, 유래된 hiPSC(OCT4/NANOG/SOX2, OCT4/ECAT1/UTF1 또는 OCT4/ECAT1/UTF1/ESRRB/NANOG를 포함하는 재프로그래밍 인자의 다양한 조합에 의해 유도된 섬유아세포 또는 혈액 세포)를 단일 세포로서 일상적으로 계대배양하였다. 단일 세포 해리를 위해, hiPSC를 포스페이트 완충 식염수(PBS)(Mediatech)에 의해 1회 세척하고, 37℃에서 3분 내지 5분 동안 Accutase(Millipore)에 의해 처리한 후 피펫팅하여 단일 세포 해리를 보장하였다. 이후, 단일 세포 현탁액을 종래의 배지와 동일 용적으로 혼합하고, 225g에서 4분 동안 원심분리하고, 운명 유지 배지(FMM)에서 재현탁시키고, hESC 갖춰진 마트리겔(코닝) 코팅된 표면에서 플레이팅하였다. 마트리겔을 준비하고 사용하여 제조사의 지시에 따라 표면을 코팅하였다. 계대배양은 통상적으로 1:3 내지 1:6이고, 조직 배양 플레이트를 이전에 37℃에서 1 내지 4시간 동안 마트리겔에 의해 코팅하고, FMM에 의해 2일 내지 3일마다 공급하였다. 세포 배양물을 37℃ 및 5% CO2에서 설정된 습윤 항온처리기에서 유지시켰다. 종래의 배지는 DMEM/F12(Mediatech), 20% 넛아웃 혈청 대체(라이프 테크놀로지스), 1x 글루타그로(Glutagro)(Mediatech), 1x 비필수 아미노산(NEAA)(Mediatech), 1x Pen/Strep(Mediatech) 및 100μM β-머캅토에탄올로 이루어진다. FMM은 5μM 티아조비빈(인하우스 합성됨), 0.4μM PD0325901(Biovision), 1μM CHIR99021(Biovision), 100ng/㎖의 bFGF(라이프 테크놀로지스) 및 10ng/㎖의 hLIF(Millipore)가 보충된 종래의 배지로 이루어진다. FMM에서 증식된 배양물에 대한 흐름 분석 및 형태가 도 18a-d 및 도 19a-b에 제시되어 있다. FMM에서 증식된 세포는 또한, 도 20a-d에 도시된 바대로, 다중 계대배양에 걸쳐 정상 핵형을 입증하였다.
실시예 7 - 소분자 배양에서의 최소 유전자에 의한 재프로그래밍
재프로그래밍을 개시하기 위해, NIL을 사용한 렌티바이러스 형질도입, 전통적인 통합 렌티바이러스 또는 에피솜 벡터에 의한 전기천공에 의해 재프로그래밍 인자의 이소성 발현을 유도하였다. 도 14a-b에 예시된 바대로, 렌티바이러스 발현 시스템은 통합된 전이유전자의 CRE 매개된 절제를 허용하도록 EF1α 프로모터, 특정한 유전자 조합(표 3) 및 3' 말단에서의 LOXP 부위를 포함하는 몇몇 특징으로 이루어졌다. CRE 절제 시, 유래된 hiPSC 게놈은 전이유전자를 더 이상 함유하지 않고, 본질적으로 발자국이 없었다. 도 14c-f에 예시된 바대로, 에피솜 작제물은 고유한 특징, 예를 들어 EF1α 프로모터 및 고유한 재프로그래밍 인자를 가졌다. 형질감염 시, 에피솜 작제물은 핵에 있고, 게놈으로 통합하지 않는 트랜스 매개된 방식으로 작용하였다.
렌티바이러스 감염을 위해, 출발 인간 섬유아세포 세포를 제조사의 지시에 따라 마트리겔(코닝)에 의해 코팅된 6웰 플레이트의 웰마다 7x104 내지 1x105개의 세포로 시딩하였다. 293T 세포로부터의 새로운 렌티바이러스 상청액을 1:2의 희석으로(1부의 렌티바이러스 상청액 : 1부의 파트 섬유아세포 배지) 출발 세포에 첨가하였다. NIL 바이러스 상청액을 1x 농도로 사용하고 희석하지 않았다. 이전에 동결된 바이러스를 사용하는 경우, 이것을 희석하지 않고 1x 농도로 사용하였다. 다양한 인자의 바이러스 상청액을 6웰마다 전체 2㎖의 배지까지 합했다(표 3). 이것을 5㎍/㎖의 폴리브렌(Millipore) 및 10mM Hepes(Meditech)에 의해 보충한 후, 스핀 감염시켰다. 6웰 플레이트를 파라필름에 의해 실링하고, 32℃에서 600g에서 90분 동안 원심분리하였다. 이후, 플레이트를 12시간 내지 16시간 동안 37℃ 및 5% CO2 항온처리기로 옮겼다. 렌티바이러스와 항온처리한 후, 세포를 PBS에 의해 세척하고, 배양 배지를 1부의 운명 재프로그래밍 배지(FRM) 및 1부의 섬유아세포 배지를 함유하는 50/50 배지로 전환하였다. 배지를 감염 후 4일 내지 6일에 FRM으로 완전히 전환하였다. FRM은 5μM 티아조비빈(인하우스 합성됨), 0.4μM PD0325901(Biovision), 1μM CHIR99021(Biovision), 2μM SB431542(Biovision), 100ng/㎖의 bFGF(라이프 테크놀로지스), 10ng/㎖의 hLIF(Millipore), 1x N2 보충제(라이프 테크놀로지스) 및 1x B27 보충제(라이프 테크놀로지스)가 보충된 (상기 기재된) 종래의 배지로 이루어진다. 웰이 포화상태가 되면, 세포를 이전에 마트리겔에 의해 코팅된 10㎝ 접시로 계대배양하였다. 계대배양은 (상기 기재된 바와 같은) 마트리겔 코팅된 표면에 Accutase(Millipore)에 의한 해리로 이루어진다. 14일 내지 18일에 또는 iPSC 콜로니가 존재할 때, 배양 배지를 FRM으로부터 FMM으로 전환하였다. 단일 세포 해리된 세포를 FMM을 가지는 마트리겔 코팅된 플레이트로 증식시키고, 유세포분석법 분류까지 유지시켰다. hiPSC 표현형의 발현에 대한 결과가 표 3, 도 15a 내지 도 15c(8-15일에), 도 16a 내지 도 16d 및 도 17a 내지 도 17b(4주에 Oct4/Ecat1/UTF1/Esrrb/NANOG)에 제시되어 있다. 도 24는 SSEA4+/TRA181+/CD30+ 96웰 플레이트 코팅된 클론의 영상을 보여주어서, CRE 매개된 절제 후 iPSC 표현형을 보여준다. 이 콜로니를 원래 인간 섬유아세포 세포로부터 유래된 iPSC 클론으로부터 분류하고, 렌티바이러스 인자 OCT4, ECAT1, UTF1, NANOG 및 ESRRB에 의해 재프로그래밍하고, 이후 전이유전자에 대해 절제하였다. 당해 분야의 숙련자는 본 명세서에 기재된 방법, 조성물 및 생성물이 예시적인 실시형태를 대표하고, 본 발명의 범위에 대한 제한으로서 의도되지 않는다는 것을 용이하게 이해할 것이다. 본 발명의 범위 및 정신으로부터 벗어나지 않으면서 다양한 치환 및 변형이 본 명세서에 개시된 개시내용에 이루어질 수 있다는 것이 당해 분야의 숙련자에게 용이하게 명확할 것이다.
Figure pct00003
에피솜 벡터 재프로그래밍을 위해, NEON 형질감염 시스템(라이프 테크놀로지스)을 사용하여 도 13에 예시된 플라스미드를 사용한 섬유아세포 또는 제대혈 세포의 형질감염을 수행하였다. 대략적으로, 재프로그래밍 인자를 함유하는 전체 3㎍의 에피솜 플라스미드를 제품 매뉴얼에 기재된 바대로 적절한 완충제 중에 세팅 1650v/10ms/3펄스를 이용하여 5x105개의 섬유아세포 세포 또는 2.5x105개의 제대혈 세포로 (mRNA의 형태의 또는 클로닝 플라스미드 pCDNA에서 카세트로서의) EBNA와 동시형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 항생제 없이 4ng/㎖의 bFGF 및 5㎍/㎖의 피브로넥틴(BD Biosciences)이 보충된 (세포 유형에 따라) 섬유아세포 배지 또는 제대혈 배양 배지를 함유하는 마트리겔에 의해 코팅된 6웰 플레이트의 웰에 직접적으로 시딩하였다. 제대혈 배양 배지는 SFMII + CC110(Stem Cell Technologies)으로 이루어진다. 형질감염 후 24시간에, FRM을 동일 용적으로 배양물에 첨가하였다. 섬유아세포 배양을 위해, 형질감염 후 48시간에 50㎍/㎖의 하이그로마이신(코닝)을 배양물에 첨가하였다. 배양 배지를 5일에 완전히 FRM으로 전환하고, 하이그로마이신을 형질감염 후 7일에 제거하였다. 모든 재프로그래밍 배양물을 형질감염 후 14일에 FMM으로 전환하였다. 제대혈 배양을 위해, 형질감염 후 24시간에, FRM을 동일 용적으로 첨가하고, 형질감염 후 14일까지 몇일마다 계속해서 첨가하고, 여기서 배양물을 흡인시키고 완전히 FMM에 의해 대체하였다. 두 경우에, 형질감염 후 대략 5일 내지 7일에 부착성 둥근 세포의 클러스터가 보였다. 일단 FMM에서, 모든 재프로그래밍 배양을 유지시키고, (상기 기재된) 마트리겔 코팅된 표면에서 Accutase를 사용하여 단일 세포를 계대배양하였다. 단일 세포 해리된 세포를 FMM을 가지는 마트리겔 코팅된 플레이트로 증식시키고, 유세포분석법 분류까지 유지시켰다.
실시예 8 - 재프로그래밍 인자 및 이의 화학량론의 영향
몇몇 재프로그래밍 인자를 함유하는 렌티바이러스에 의해 인간 섬유아세포 세포를 스핀 감염시켰다. 항생제 선택 인자를 함유하지 않는 렌티바이러스 플라스미드를 사용하여 OCT4, SOX2, NANOG 및 SV40LT에 의해 모든 샘플을 감염시켰다. 퓨로마이신 선택 카세트, 및 다양한 재프로그래밍 인자를 함유하는 단일 렌티바이러스 플라스미드에 의해 세포를 동시감염시켰다. 이들 인자는 OCT4-P2A-SOX2, OCT4-P2A-NANOG-T2A-SOX2 또는 OCT4-P2A-OCT4를 함유하였다. 감염 후 2일에, 50/50 배지 중의 500ng/㎖의 퓨로마이신(라이프 테크놀로지스)을 웰에 각각에 첨가하였다. 5일에, 퓨로마이신 선택의 3일 후, 배지를 퓨로마이신이 없는 FRM으로 바꿨다. 14일에, 배지를 FMM으로 전환하였다. 24일 내지 27일에, SSEA4+/TRA181+ 집단에 대해 흐름 분석을 수행하였다. 작제물에서 OCT4를 코딩하는 다수의 폴리뉴클레오타이드를 사용하는 것 또는 동일한 벡터에서 반복된 OCT4 폴리뉴클레오타이드를 사용하는 것을 포함하는 증가한 OCT4 발현은 재프로그래밍 효율을 유의미하게 개선한다는 것이 관찰되었다(도 23a).
실시예 9 - 실험 절차
종래의 배양 시스템에서의 hiPSC 유지
종래대로 배양된 hiPSC를 미토마이신 C 처리된 MEF(Millipore) 피더 세포에서 유지시키고, DMEM/F12(Mediatech), 20% v/v 넉아웃 혈청 대체(라이프 테크놀로지스), 1% v/v 비필수 아미노산(Mediatech), 2mM L-글루타민(Mediatech), 100μM β-머캅토에탄올(라이프 테크놀로지스) 및 10ng/㎖의 bFGF(라이프 테크놀로지스)를 함유하는 종래의 배지(텍스트에서 종래의 배지라 칭함)에 의해 배양하였다. 포화상태 시, 종래대로 배양된 hiPSC를 37℃에서 7분 동안 1mg/㎖의 콜라게나제 IV(라이프 테크놀로지스)를 사용하여 효소에 의해 해리한 후, 작은 조각으로 기계적으로 해리하고(클럼프 계대배양이라 칭함), 수집하고, 종래의 배지의 매일의 첨가에 의해 5일 내지 7일마다 새로 시딩된 피더 세포에 1:3-1:4 희석 계대배양하였다. 과도한 자발적인 분화의 경우에, 콜로니를 수동으로 선별하고, 인슐린 주사기(Becton Dickinson)의 선단을 사용하여 작은 조각으로 절단하고, 새로 시딩된 피더 세포로 옮겼다. 세포 배양을 37℃ 및 5% CO2로 설정된 습윤 항온처리기에서 유지시켰다.
체세포의 재프로그래밍
재프로그래밍을 개시하기 위해, 렌티바이러스 형질도입 또는 에피솜 벡터 형질감염에 의해 재프로그래밍 인자의 이소성 발현을 유도하였다. 렌티바이러스 형질감염을 이전에 기재된 바대로 따랐다(Valamehr et al., 2012). 간단하게, 출발 세포를 마트리겔(BD Biosciences) 코팅된 표면에서 6웰 플레이트의 웰마다 1x105개의 세포로 플레이팅하였다. 기재되지 않은 한, 모든 마트리겔 코팅은 조직 배양 표면에 대한 마트리겔 용액(25㎖의 DMEM/F12 중에 재현탁된 마트리겔의 1 액적)의 첨가 및 37℃에서의 2시간 내지 4시간의 항온처리의 허용으로 이루어진다. 전이유전자 OCT4/SOX2/KLF4를 발현하는 렌티바이러스를 생성하는 293T 세포로부터의 상청액을 4㎍/㎖의 폴리브렌(Millipore)이 보충된 1:2의 희석(1부의 렌티바이러스 상청액 : 1부의 섬유아세포 배지)으로 출발 세포에 첨가하고, 12시간 내지 16시간 동안 37℃ 및 5% CO2로 옮겼다. 섬유아세포 배지: DMEM(Mediatech), 10% FBS(라이프 테크놀로지스), 1x 글루타맥스(라이프 테크놀로지스), 1x 비필수 아미노산(Mediatech). 렌티바이러스와 항온처리 후, 세포를 PBS에 의해 3회 세척하고, 섬유아세포 배지에 의해 공급하였다. 형질감염 후 48시간에, 배양 배지를 1부의 FRM(또는 SMC4) 및 1부의 섬유아세포 배지를 함유하는 50/50 배지로 전환하였다. 보통 감염 후 4일 내지 6일에 배양물을 더 큰 용기로 계대배양하면, 배지를 FRM(또는 SMC4)으로 완전히 전환하였다. 계대배양은 (하기 기재된 바와 같은) 마트리겔 코팅된 표면에 대한 Accutase에 의한 해리로 이루어진다. 다음의 적용까지 배양물을 FRM(또는 SMC4)에서 유지시켰다.
에피솜 벡터 재프로그래밍을 위해, NEON 형질감염 시스템(라이프 테크놀로지스)을 사용하여 유전자 세트 OCT4/SOX2/NANOG/KLF4/LIN28/MYC/SV40LT(A14703, 라이프 테크놀로지스)를 사용한 섬유아세포 또는 제대혈 세포의 형질감염을 수행하였다. 대략적으로, 4㎍의 벡터 세트를 제품 매뉴얼에 의해 기재된 바대로 적절한 완충제 중에 세팅 1650v/10ms/3펄스를 이용하여 5x105개의 섬유아세포 세포 또는 2.5x105개의 제대혈 세포로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를, 마트리겔에 의해 코팅되고 10ng/㎖의 bFGF 및 5㎍/㎖의 피브로넥틴(BD Biosciences)이 보충된 (세포 유형에 따라) 섬유아세포 배양 배지 또는 제대혈 배양 배지를 함유하는, 10㎝ 접시(섬유아세포) 또는 6웰 플레이트의 웰(제대혈)로 직접적으로 플레이팅하였다. 제대혈 배양 배지: SFMII + CC110(Stem Cell Technologies). 형질감염 후 24시간에, FRM을 동일 용적으로 배양물에 첨가하였다. 섬유아세포 배양을 위해, 형질감염 후 48시간에 50㎍/㎖의 하이그로마이신(Mediatech)을 배양물에 첨가하였다. 배양 배지를 5일에 완전히 FRM으로 전환하고, 형질감염 후 7일에 하이그로마이신을 제거하였다. 모든 재프로그래밍 배양물을 형질감염 후 14일에 FMM으로 전환하였다. 제대혈 배양을 위해, 형질감염 후 24시간에, FRM을 동일 용적으로 첨가하고, 형질감염 후 14일까지 수일마다 계속해서 첨가하고, 여기서 배양물을 흡인시키고 완전히 FMM에 의해 대체하였다. 두 경우에, 형질감염 후 5일 내지 7일마다 부착성 둥근 세포의 클러스터가 보였다. 일단 FMM에서 모든 재프로그래밍 배양물을 유지시키고, Accutase를 사용하여 단일 세포 계대배양하였다. 단일 세포 해리된 세포를 FMM을 가지는 마트리겔 코팅된 플레이트로 증식시키고, 유세포분석법 분류까지 유지시켰다. 비트로넥틴(라이프 테크놀로지스) 표면 코팅 연구에서, 비트로넥틴에 대한 마트리겔의 치환을 제외하고 모든 양태를 동일하게 유지시켰다. 감소한 인자 에피솜 재프로그래밍에 대해, EF1α 프로모터의 제어 하에 OCT4-P2A-OCT4, OCT4-P2A-SOX2 또는 OCT4-P2A-NANOG-T2A-SOX2를 함유하도록 pCEP4(라이프 테크놀로지스) 벡터 골격을 작제하였다. 감소한 인자 에피솜 벡터의 형질감염은 몇몇 변형을 제외하고 상기 기재된 바와 같은 동일한 프로토콜을 따랐다. EBNA를 EBNA mRNA(20㎍) 또는 벡터 카세트(2㎍)로서 동시형질감염시켰다(Howden et al., 2006). 하이그로마이신 선택을 10일 동안 유지시키고, FMM을 16일에 도입하였다.
렌티바이러스의 생성
293T(ATCC)를 항생제가 없는 섬유아세포 배지에서 유지시키고, 80% 초과의 포화상태에 도달하게 하지 않았다. 섬유아세포 배지는 DMEM(Mediatech), 10% 소 태아 혈청(FBS)(라이프 테크놀로지스), 1x 글루타그로(Mediatech) 및 1x NEAA(Mediatech)로 이루어진다. 세포를 처음에 PBS에 의해 세척한 후 37℃에서 0.05% 트립신(Mediatech)과 4분 항온처리함으로써 계대배양하였다. 해리된 세포를 섬유아세포 배지 중에 재현탁시키고, 225g에서 4분 동안 원심분리하고, 원하는 플레이트로 시딩하였다. 통합 렌티바이러스를 생성하기 위해, 293T를 1일에 각각의 바이러스 제제에 대해 10㎝ 접시마다 3.5x106개의 세포로 계대배양하였다. 2일에, 배지를 형질감염 전 1시간에 10㎖의 새로운 섬유아세포 배지로 바꿨다. CalPhos 키트(Clontech)를 사용하여 DNA를 형질감염시켰다. 형질감염을 위해 하기를 합했다: 관심 있는 유전자(들)를 함유하는 5㎍의 렌티바이러스 클로닝 플라스미드, 3.2㎍의 패키징 플라스미드 pPAX, 630ng의 패키징 플라스미드 pMDG, 87㎕의 칼슘 용액 및 700㎕ 이하의 물. 700㎕의 HBS 용액을 1㎖의 혈청학적 피펫을 사용하여 버블을 생성하면서 첨가하였다. 이것을 실온에서 15분 동안 항온처리하고, 이후 293T의 10㎝ 플레이트에 적하로 첨가하였다. 3일에, 바이러스 상청액을 제거하고, 버리고, 15㎖의 새로운 섬유아세포 배지를 플레이트에 첨가하였다. 4일에, 형질감염 후 48시간에, 바이러스 상청액을 수집하고, 4℃에서 저장하였다. 15㎖의 섬유아세포 배지를 플레이트에 첨가하였다. 5일에, 형질감염 후 72시간에, 바이러스 상청액을 수집하고, 4일 상청액에 첨가하였다. 0.45㎛ 필터를 사용하여 이 바이러스 풀을 여과시키고, Lenti-X GoStix(Clontech)를 사용하여 역가에 대해 확인하였다. 바이러스를 감염에 사용하거나, -80℃에서 액적으로 동결시켰다. 비통합 렌티바이러스(NIL)(Invivogen)를 생성하기 위해, 각각의 바이러스 제제에 대해 T75 플라스크를 사용하여 제조사의 지시에 따라 프로토콜을 따랐다. 형질감염 후 48시간, 72시간 및 96시간에 상기 기재된 바와 같이 바이러스 상청액을 수집하고 혼주하고 여과시키고 적정하였다. NIL 바이러스를 감염에 사용하거나, -80℃에서 액적으로 동결시켰다.
소분자 배양에서의 hiPSC 유지
배양물의 포화상태가 75% 내지 90%에 도달하면, 유래된 hiPSC를 단일 세포로서 일상적으로 계대배양하였다. 과포화상태가 분화를 발생시킬 수 있다는 것에 주목한다. 단일 세포 해리를 위해, hiPSC를 포스페이트 완충 식염수(PBS)(Mediatech)에 의해 1회 세척하고, 37℃에서 3분 내지 5분 동안 Accutase에 의해 처리한 후 피펫팅하여 단일 세포 해리를 보장하였다. 이후, 단일 세포 현탁액을 종래의 배지와 동일 용적으로 혼합하고, 225g에서 4분 동안 원심분리하고, FMM에서 재현탁시키고, 마트리겔 코팅된 표면에서 플레이팅하였다. 계대배양은 통상적으로 1:4-1:8이고, 이전에 37℃에서 2시간 내지 4시간 동안 마트리겔에 의해 코팅된 조직 배양 플레이트로 옮기고, FMM에 의해 격일로 공급하였다. 세포 배양물을 37℃ 및 5% CO2에서 설정된 습윤 항온처리기에서 유지시켰다. FMM 및 FRM에 대한 배지 제제는 표 1에 기재되어 있다. SMC4 배양물은 이전에 기재되어 있다(Valamehr et al., 2012). 간단하게, 소분자 0.4mM PD0325901(Biovision), 1mM CHIR99021(Biovision), 5mM 티아조비빈 및 2mM SB431542(Biovision)를 종래의 배양 배지에 첨가하고, 프로토콜에 따라 계대배양하였다.
유세포분석법 분석 및 분류
단일 세포 해리된 (상기 기재된) 재프로그래밍 풀을 행크스(Hanks) 평형 염 용액(MediaTech), 4% 소 태아 혈청(Invitrogen), 1x 페니실린/스트렙토마이신(Mediatech) 및 10 mM Hepes(Mediatech)를 함유하는 차가운 염색 완충제 중에 재현탁시켰다. SSEA4-FITC, TRA1-81-Alexa Fluor-647 및 CD30-PE(BD Biosciences)를 포함하는 접합된 1차 항체를 세포 용액에 첨가하고, 15분 동안 얼음에서 항온처리하였다. 모든 항체를 100만 개의 세포당 100㎕의 염색 완충제 중의 7 내지 10㎕로 사용하였다. 용액을 염색 완충제 중에 1회 세척하고, 225g에서 4분 동안 스핀 다운하고, 10μM 티아조비빈을 함유하는 염색 완충제 중에 재현탁시키고, 유세포분석법 분류를 위해 얼음에서 유지시켰다. 상기 기재된 게이팅 전략을 이용하여 FACS Aria II(BD Biosciences)에서 유세포분석법 분류를 수행하였다. 분류된 세포를 웰마다 3개 및 9개의 사건의 농도로 100μM 노즐을 사용하여 96웰 플레이트로 직접적으로 분출시켰다. 본 발명자들이 분류된 사건이 분류 후 각각의 웰에서 보인 세포의 실제 수와 반드시 상관되지 않고, 웰마다 3개의 세포가 개별 콜로니를 함유하는 웰의 바람직한 수를 본 발명자들에게 제공한다는 것을 주목하면서, 웰마다 3개의 세포의 분류는 본 발명자들의 바람직한 농도이다. 각각의 웰을 5㎍/㎖의 피브로넥틴 및 1x 페니실린/스트렙토마이신(Mediatech)이 보충된 200㎕의 FMM에 의해 예비충전하고, 5x 마트리겔에 의해 이전에 밤새 코팅하였다. 5x 마트리겔 예비코팅은 5㎖의 DMEM/F12로 마트리겔의 1액적을 첨가하는 것을 포함하고, 이후 4℃에서 밤새 항온처리하여서, 적절한 재현탁을 허용하고, 마지막으로 웰마다 50㎕로 96웰 플레이트에 첨가한 후, 37℃에서 밤새 항온처리하였다. 각각의 웰에 배지를 첨가하기 직전에 5x 마트리겔을 흡인시켰다. 분류의 완료 시, 96웰 플레이트를 항온처리 전에 225g에서 1분 내지 2분 동안 원심분리하였다. 플레이트를 7일 동안 방해하지 않고 두었다. 제7일에, 150㎕의 배지를 각각의 웰로부터 제거하고, 100㎕의 FMM에 의해 대체하였다. 웰을 분류 후 10일에 추가 100㎕의 FMM에 의해 재공급하였다. 콜로니 형성을 초기 2일에 검출하고, 대부분의 콜로니를 분류 후 7일 내지 10일에 증식시켰다. 제1 계대배양에서, 웰을 PBS에 의해 세척하고, 37℃에서 대략 10분 동안 30㎕의 Accutase에 의해 해리하였다. 확장된 Accutase 처리에 대한 수요는 연장된 기간 동안 배양에서 한가로이 있는 콜로니의 압축성을 반영한다. 세포가 해리된 것으로 보인 후, 200㎕의 FMM을 각각의 웰에 첨가하고, 수회 피펫팅하여 콜로니를 파괴하였다. 해리된 콜로니를 5x 마트리겔에 의해 이전에 코팅된 96웰 플레이트의 또 다른 웰로 옮기고, 이후 항온처리 전에 225g에서 2분 동안 원심분리하였다. 초기 콜로니를 분산시키도록 이 1:1 계대배양을 수행하였다. 후속하는 계대배양을 3분 내지 5분 동안 Accutase 처리 및 FMM에서 1x 마트리겔에 의해 이전에 코팅된 더 큰 웰로 1:4의 확장에 의해 일상적으로 수행하였다. 유세포분석법 분석을 Guava EasyCyte 8 HT(Millipore)에서 수행하고, FCS Express 4(De Novo 소프트웨어)를 사용하여 분석하였다.
실시간 RT-PCR 및 플루다임 분석
Pico Pure RNA 단리 키트(라이프 테크놀로지스)를 사용하여 전체 RNA를 단리하였다. iScript cDNA 합성 키트(Bio-Rad)를 사용하여 100ng의 단리된 전체 RNA로부터 상보성 DNA(cDNA)를 역전사시켰다. 이후, TaqMan PreAmp 마스터 믹스 키트(라이프 테크놀로지스) 및 풀링된 TaqMan 검정의 0.2x 농도를 사용하여 22개의 특이적 표적 유전자 및 2개의 기준 제어 유전자의 예비증폭에 cDNA를 사용하였다. 제조사의 프로토콜에 기재된 표준 사이클링 조건에 의해 증폭의 14회 사이클을 이용하여 cDNA로부터의 특이적 표적 증폭(STA)을 수행하였다. 예비증폭된 cDNA 반응물(n=48)을 (무균수) 중에 1:5 희석하고, 실시간 정량적 PCR 반응을 위한 주형으로서 사용하였다. 2회 반복으로 로딩된 TaqMan 검정에 의해 NanoFlex IFC 컨트롤러 MX(플루다임)를 사용하여 48.48 다이나믹 어레이(플루다임)를 로딩하고, BioMark 실시간 PCR 시스템(플루다임)을 사용하여 실시간 반응을 수행하였다. BioMark 실시간 PCR 분석 소프트웨어(플루다임)를 사용하여 결과를 분석하였다. 계산으로부터 32 초과의 사이클 한계치(Ct)를 가지는 샘플을 배제하였다. 평균 Ct를 검정 2회 반복으로부터 계산하고, 6개의 대조군 MEF 세포주(MEF에서 OSK hiPSC 및 H1 ESC)의 중앙치에 대해 2개의 기준 유전자(GAPDH 및 HPRT1)의 평균으로서 델타-델타 Ct(ΔΔCt)를 계산하였다. 상대 유전자 발현(RQ) 결과가 열 지도 포맷으로 Excel(Microsoft)에 표시되어 있다.
Figure pct00004
Figure pct00005
전이유전자의 존재의 시험
QIAamp(등록상표) DNA 미니 키트 및 단백분해효소 K 분해(Qiagen)를 이용하여 게놈 DNA를 단리하였다. Taq PCR 마스터 믹스 키트(Qiagen)를 사용하여 전이유전자 특이적 프라이머 세트(하기 표 5)(Yu et al., 2007)를 사용하여 100ng의 게놈 DNA를 증폭시켰다. 하기와 같이 35회 사이클 동안 PCR 반응을 실행하였다: 30초 동안 94℃(변성), 30초 동안 60-64℃(어닐링) 및 1분 동안 72℃(연장). 렌티바이러스 방법을 이용하여 생성된 섬유아세포 및 hiPSC로부터의 게놈 DNA를 음성 대조군으로서 사용하였다. 에피솜 작제물의 DNA를 양성 대조군으로서 사용하였다.
Figure pct00006
면역세포화학 분석
세포를 4% v/v 파라폼알데하이드(Alfa Aesar)를 사용하여 고정하고, 0.2% v/v Tween(PBST)(Fisher Scientific)을 함유하는 PBS에 의해 3회 세척하고, 25℃에서 1시간 동안 PBS 중의 0.15% v/v TritonX-100(Sigma-Aldrich)을 사용하여 투과성화시켰다. 투과성화 후, 세포를 25℃에서 30분 동안 PBST(PBSTB)(Fisher Scientific) 중의 1% v/v BSA(Invitrogen)에 의해 차단하였다. PBSTB의 온화한 제거 후, 세포를 4℃에서 밤새 PBSTB 중의 1차 항체와 항온처리하였다. 이 연구에서 사용된 1차 항체는 OCT4(Santa Cruz), NANOG(Santa Cruz), TRA160(Millipore), TRA1-81(Millipore), SSEA4(Millipore), β-III 투뷸린(TUJ1, 알앤디 시스템즈), α-평활근 액틴(Sigma), FOXA2(알앤디 시스템즈), Sox17(알앤디 시스템즈), NESTIN(Abcam) 및 알파-1-태아단백질(Dako)을 포함한다. 밤샘 항온처리 후, 세포를 PBST에 의해 3회 세척하고, 37℃에서 1시간 동안 PBSTB 중에 1:250 희석된 2차 항체(Alexa Fluor 488 또는 555; Invitrogen)에 의해 염색하였다. 세포를 PBST 중에 3회 세척하고, Hoechst 염료(Invitrogen)에 의해 염색하였다. H3K27me3 염색 분석을 위해, hiPSC를 커버 슬립에서 72시간 내지 96시간 동안 성장시키고, 25℃에서 15분 동안 PBS 중의 4% 파라폼알데하이드(Electron Microscopy Science, EMS)에 의해 고정하였다. 세포 투과성화를 25℃에서 1시간 동안 PBS 중의 0.1% Triton X-100에 의해 수행하고, 이후 세포를 25℃에서 30분 동안 차단 용액(PBS 중의 1% BSA)과 항온처리하였다. 차단 후, 카버 슬립을 4℃에서 밤새 차단 용액 중의 항-트라이메틸-히스톤 H3(Lys27) 항체(Millipore 07-449, H3K27me3)의 1:1600 희석물과 항온처리하였다. 2차 항체는 Alexa Fluor 555 염소-항-토끼 IgG(라이프 테크놀로지스, A21429)였다. 핵을 DAPI에 의해 대조염색하고, Axio Observer Inverted 현미경(Carl Zeiss)에 의해 조망하였다. AxioVS40 v4.8.1.0(Carl Zeiss Imaging Solutions Gmbh)에 의해 영상을 포획하였다.
실시예 7에 따라 재프로그래밍된 세포를 4% v/v 파라폼알데하이드(Alfa Aesar)를 사용하여 고정하고, PBS(Mediatech)에 의해 세척하고, 25℃에서 1시간 동안 PBS 중에 0.15% v/v TritonX-100(Sigma-Aldrich)을 사용하여 투과성화시켰다. 투과성화 후, 세포를 25℃에서 30분 동안 PBS(PBSB) 중의 1% v/v BSA(Sigma)에 의해 차단하였다. PBSB의 온화한 제거 후, 세포를 4℃에서 밤새 PBSB 중의 1차 항체와 항온처리하였다. 이 연구에서 사용된 1차 항체는 OCT4(Santa Cruz) 및 TRA181(Millipore)을 포함한다. 밤샘 항온처리 후, 세포를 PBS에 의해 3회 세척하고, 37℃에서 1시간 동안 PBSB 중에 1:250 희석된 2차 항체(Alexa Fluor 488 또는 555; 라이프 테크놀로지스)에 의해 염색하였다. 세포를 PBS 중에 3회 세척하고, Hoechst 염료(Invitrogen)에 의해 염색하였다. Axio 관찰자 도립 현미경(Carl Zeiss)에 의해 염색된 세포를 조망하였다. AxioVS40 v4.8.1.0(Carl Zeiss Imaging Solutions Gmbh)에 의해 영상을 포획하였다.
분화 분석(EB 및 지시된)
hiPSC를 DMEM/F12(Mediatech), 20% 소 태아 혈청(Invitrogen), 1% 비필수 아미노산(Mediatech), 2mM L-글루타민(Mediatech) 및 100μM β-머캅토에탄올을 함유하는 분화 배지에서 EB로서 분화시켰다. 간단하게, EB 형성을 위해, hiPSC를 FMM에서 시딩하고 다음날 종래의 배지로 전환시켜 세포를 프라이밍하였다. 종래의 배지에서 3일 내지 4일 후, 배양물은 Accutase(Millipore)에 의해 해리되고 10μM Y27632를 포함하는 분화 배지 중에 100,000 세포/㎖의 최종 농도로 재현탁된 단일 세포였다. EB 형성을 위해, 티아조비빈 대신에 ROCK 저해제 Y27632가 사용된다는 것에 주목한다. 세포를 V-바닥 96웰 비조직 배양 플레이트(Nunc)에서 100㎕/웰로 시딩하고, 950g에서 5분 동안 항온처리하였다. 다음날 촘촘한 "볼 유사 덩어리"를 분화 배지에서 대략 30 내지 40의 EB/웰로 P1000을 사용하여 초저 결합 6웰 플레이트(코닝)로 옮겼다. 7일 후, EB를 1:1 내지 마트리겔 코팅된 6웰 플레이트로 1:1로 옮기고, 3일마다 분화 배지에 의해 공급하였다. 배양에서 3주 후, 세포를 고정하고 염색하였다. 지시된 단층 분화를 위해, hiPSC를 FMM에서 마트리겔 코팅된 겔에 시딩하여, 다음날 50% 및 90% 포화상태를 전달하였다. 밀도 둘 다가 구별되도록 유도되었다. 신경 유도를 위해, FMM 배지를 10μM SB431542 및 100nM LDN-193189(둘 다 SMAD 저해제, Biovision)가 보충된 hESC 배지에 의해 대체하였다. 2일 후, 분화 배지를 이중 SMAD 저해제 이외에 3μM CHIR99021(Biovision)에 의해 보충하였다. 세포를 2일 후 고정하고, Nestin(Abcam)에 대해 염색하였다. 중배엽 분화를 위해, 배지를 1x B27 배지 첨가제(라이프 테크놀로지스), 3μM CHIR99021, 4ng/㎖의 bFGF 및 10ng/㎖의 BMP4가 보충된 RPMI(Mediatech)에 의해 대체하였다. 배지를 격일로 바꾸고, 세포를 4일째에 고정하고, αSMA(Sigma)에 대해 염색하였다. Human Pluripotent Stem Cell Functional Identification Kit(알앤디 시스템즈)를 사용하여 내배엽 분화를 수행하였다. hiPSC를 3일 동안 내배엽 분화 배지와 항온처리하고, 고정하고, SOX17(알앤디 시스템즈)에 대해 염색하였다.
유전자 발현 분석
제조사의 추천된 프로토콜을 이용하여 Pico Pure RNA 단리 키트(라이프 테크놀로지스)를 사용하여 RNA를 추출하였다. 나노드롭 2000 분광광도계(Thermo Scientific)를 사용하여 전체 RNA를 정량화하였다. 간단하게, 바이오티닐화 aRNA를 임의의 제2회 증폭을 이용하여 MessageAmp II aRNA 증폭 키트(Applied Biosystems/Ambion(텍사스주 오스틴))에 대해 표준 프로토콜을 이용하여 거의 100ng의 전체 RNA로부터 제조하고, 이후 MessageAmp II Biotin Enhanced Kit(Applied Biosystems/Ambion(텍사스주 오스틴))를 사용하여 표준 프로토콜을 이용하여 바이오틴 표지된 aRNA로 전사하였다. Affymetrix 추천에 따라 바이오틴 표지된 aRNA를 정제하고 단편화하였다. 20㎍의 단편화된 aRNA를 사용하여 45℃에서 16시간 동안 인간 게놈 U133-플러스-2.0 칩(Affymetrix Inc.(캘리포니아주 산타 클라라))으로 혼성화하였다. 어레이를 세척하고, Affymetrix Fluidics 스테이션 450에서 염색하고, Affymetrix GeneChip Scanner 3000 7G를 사용하여 스캐닝하였다. Gene Expression Omnibus(GSE50868)에서 원 발현 데이터 파일이 이용 가능하다. 디폴트 분석 세팅을 이용하여 Affymetrix Expression Console 소프트웨어를 사용하여 영상 데이터를 분석하였다. 어레이를 대규모 탄탄한 멀티-어레이 분석(RMA, Affymetrix)에 의해 정규화하고, Genomics 4.5(Tibco Spotfire(캘리포니아주 팔로 알토))에 대해 Spotfire에서 가시화하였다. 주석, 가시화 및 통합 디스커버리에 대한 데이터베이스(DAVID v6.7)를 이용하여 유전자 존재론(GO) 데이터베이스(GO 생물학적 과정에 대한 단일 농후화 및 p 값 < 0.01)에 대해 차등으로 발현된 프로브의 생물학적 경로 농후화 분석을 수행하였다. 계층적 클러스터링을 수행하여, 유클리드 거리 측정(Genomics 4.5에 대한 Spotfire)에 의한 완전한 연결 클러스터링 방법을 이용하여 Log2 발현 수준에 기초하여 샘플 사이의 유전자 발현 프로필을 비교하였다. 발현 수준의 전체 차이(>< 2.5배) 또는 기저 상태 또는 준안정한 상태를 한정하는 표적화된 유전자 목록에 대한 존재에 의해 클러스터링에 대한 프로브 세트를 선택하였다. X 염색체 유전자 발현 비교를 위해, RMA 정규화된 Affymetrix 유전자 칩 강도를 2^[RMA log2 강도]를 취함으로써 직선 발현 값으로 전환하였다. 직선 발현 비율은 프라이밍된 발현 세트에 의해 나눈 나이브 발현 세트로서 계산되었다. X 염색체로 맵핑된 모든 프로브 세트에 대한 발현 비율을 Spotfire 4.5에서 가시화하고, 2배 초과 또는 미만 농후화 비율의 프로브 세트가 강조된다.
핵형 분석
WiCell Research Institute(위스콘신주 메디슨)에 의해 20개 내지 40개의 G 밴딩된 중기 세포에서 세포유전학적 분석을 수행하였다.
기형종 형성
200㎕의 용액(100㎕의 FMM 및 100㎕의 마트리겔)마다 50만 개 및 300만 개의 세포의 농도로 단일 세포 해리된 hiPSC를 NOD/SCID/γ 눌 마우스로 피하로 주사하였다. 5주 내지 6주(300만 개의 세포 주사) 및 7주 내지 8주(50만 개의 세포 주사) 후, 기형종을 PBS에서 수확하고, 실온에서 밤새 4% 파라폼알데하이드 중에 고정하고, 이후 프로세싱을 위해 실온에서 70% 에탄올 중에 유지시켰다. 절편화 및 헤마톡실린 및 에오신 염색을 위해 샘플을 UCSD Histology Core Facility에 제출하였다. 절편을 조사하고, 해석하고, Nikon DS-Fi1 카메라가 장착된 Nikon Eclipse TS100 현미경을 사용하여 사진을 찍었다.
통계 분석
표준 편차에 관한 통계 평가를 위해 스튜던츠 t 시험을 이용하였다. qRTPCR 데이터에 관한 RQ 최소 및 최대 값(오차 막대)을 결정하도록 StepOne Software v2.2(라이프 테크놀로지스)를 이용하였다.
일반적으로, 하기 청구항에서, 사용된 용어는 본 명세서 및 청구항에 개시된 구체적인 실시형태에 대한 청구항을 제한하도록 구성되지 않아야 하지만, 이러한 청구항이 권한 부여한 등가물의 완전한 범위와 함께 모든 가능한 실시형태를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 청구항은 본 개시내용에 의해 제한되지 않는다.
실시예 10 - 재프로그래밍 인자로서 사용을 위해 식별된 유전자
상기 기재된 바와 같은 Affymetrix 분석에 의해 재프로그래밍 인자로서 사용하기 위한 다수의 유전자를 식별하였다. 모든 7개의 유전자는 재프로그래밍 동안 상향조절되고 분화 동안 하향조절되는 것으로 관찰되었다(표 6). 표 6에서, "다능성"은 이의 모 섬유아세포주와 비교할 때 iPSC에서 유전자의 증가한 발현의 배수 변화를 나타내는 한편, iPSC가 분화되고 다능성을 느슨하게 하면서 "분화"는 유전자의 감소한 발현의 배수 변화를 나타낸다. 자발적인 분화 개시 후 3일 및 8일에 유전자 발현을 평균함으로써 분화를 계산하고, 다능성 iPSC 유전자 발현과 비교하였다. 더 높은 값은 분화 시 더 큰 유전자 발현 소실을 나타낸다.
Figure pct00007
HESRG(hES 세포 관련된 유전자 단백질; UniProtKB 수탁 번호: Q1W209)는 태아 난소 및 미분화된 ES 세포에서 발현하는 것으로 공지되어 있고, ES 세포의 분화 동안 하향조절된다. 칼슘 의존적 세포 부착 단백질을 코딩하는 CDH1(카데린-1; UniProtKB 수탁 번호: P12830)은 세포-세포 부착, 이동도 및 상피 세포의 증식을 조절하는 기전에 관여된다. TDGF1(기형암종 유래 성장 인자 1; UniProtKB 수탁 번호: P13385)은 외배반성 세포의 결정에서 역할을 한다고 생각되고, 이 세포는 후속하여 중배엽을 생성시킨다. DPPA4(발생적 다능성 연관된 단백질 4; UniProtKB 수탁 번호: Q7L190)는 아마도 표적 유전자의 후성적 상태의 유지 및 원시적 외배엽 계열로의 배아 세포의 분화를 저해하는 데 있어서 관여된다. DNMT3B(DNA(사이토신-5-)-메틸전환효소 3 베타; UniProtKB 수탁 번호: Q9UBC3)는 게놈 방식 신생 메틸화에 필요하고, 발생 동안 DNA 메틸화 패턴의 확립에 필수적이다. ZIC3(아연 핑거 단백질 ZIC 3; UniProtKB 수탁 번호: O60481)은 전사 활성인자로서 작용하는 것으로 공지되어 있고, 축 정중선 발생 및 왼쪽-오른쪽(LR) 비대칭 규정 둘 다에서 가장 초기 단계에 필요하다. L1TD1(라인-1 유형 전위효소 도메인 함유 단백질 1; UniProtKB 수탁 번호: Q5T7N2)은 인간 배아 줄기 세포의 자기 재생 및 분화와 관련될 수 있다. 상기 유전자 중 어느 것도 체세포 재프로그래밍에 대한 잠재적 전사 인자로서 당해 분야에 개시되어 있지 않다.
표 6에서 식별된 재프로그래밍 유전자의 조합을 함유하는 예시적인 작제물은 표 7에 기재되어 있다.
Figure pct00008
다양한 섬유아세포 세포를 형질감염시킴으로써 재프로그래밍 효율에 대해 표 7로부터 선택된 하나 이상의 발현 작제물로부터 유래된 유전자 조합으로 이루어진 각각의 에피솜, 렌티바이러스 및 센다이 바이러스 발현 시스템을 시험하였다. 표 7에서의 작제물 1 및 3; 1 및 4; 1 및 5; 1 및 6; 1, 4 및 5; 1, 4, 5 및 6; 1, 4 및 6; 1, 5, 및 6; 1, 2 및 4; 1, 3 및 4; 2, 5 및 6; 1, 2, 3, 5 및 6; 및 작제물의 임의의 다른 조합을 선택함으로써 재프로그래밍 인자의 다양한 조합을 얻었다. 설계된 작제물은 재프로그래밍 효율을 증가시키기 위한 재프로그래밍 인자의 적절한 또는 최적 화학량론을 달성하기 위해 OCT4를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 수, OCT4를 포함하는 다수의 벡터의 조합, 및/또는 OCT4와 다른 재프로그래밍 인자 사이의 비율을 고려한다. 개시된 바와 같은 작제물의 다양한 조합은 높은 효율로 재프로그래밍을 달성하는 데 있어서의 SOX2 및 Klf4의 용도를 배제하여, SOX2 및 Klf4가 OCT4, NANOG, ECAT1, ESRRB, UTF1, HESRG, CDH1, TDGF1, DPPA4, DNMT3B, ZIC3 및 L1TD1 중 하나 이상을 포함하는 작제물의 예시적인 조합에 의해 필요 없거나 대체 가능하다는 것을 보여주고, OCT4는 다른 포함된 인자와 비교하여 작제물(들)에서 더 높은 비율이다.
에피솜 발현 시스템을 사용할 때, 하나 또는 다수의 작제물의 에피솜 발현의 유도 후 24시간에, 재프로그래밍 배양을 FRM으로 이행하여 재프로그래밍 동역학을 증대시켰다. 초기 콜로니 형성이 1주 내에 관찰되었고, 14일에 유세포분석법을 이용하여 SSEA4/TRA1-81 양성 세포의 집단을 검출하였다. 14일에, FRM에 의해 지지된 재프로그래밍 배양물을 FMM 배지로 옮겼다. 21일에, FACS를 사용하여 SSEA4/TRA1-81/CD30 양성 클론을 96웰 플레이트로 분류하였다. 세포를 증식시키고, FMM에서 유지시켰다. NANOG에 대한 세포내 및 표면 마커 발현의 분석 및 직접적인 qRTPCR에 의해 hiPSC 클론의 수를 확인하였다. 표 7에 도시된 바와 같은 에피솜 작제물의 특정한 조합에 의한 96웰 분류 및 선택 과정을 이용한 재프로그래밍의 효율을 또한 평가하였다.
이 에피솜 접근법, 및 렌티바이러스 및 센다이 바이러스 접근법의 쓰루풋 및 탄탄함(하기 참조)을 상이한 연령, 성별 및 민족성의 공여자로부터 최소 용적의 제대혈로부터 증식된 섬유아세포 및 CD34+ 세포에 의해 추가로 시험하였다. 시험된 모든 라인에서 SSEA4/TRA1-81/CD30 양성인 세포 집단의 존재가 관찰되었다. NANOG에 대한 세포내 및 표면 마커 발현의 분석 및 직접적인 qRTPCR에 의해 hiPSC 클론의 수를 확인하였다. 표 7에 도시된 바와 같은 에피솜 작제물의 특정한 조합에 의한 96웰 분류 및 선택 과정을 이용한 재프로그래밍의 효율을 또한 평가하였다.
렌티바이러스 발현 시스템을 사용할 때, 하나 또는 다수의 작제물을 사용한 렌티바이러스 발현의 유도 후 24시간에, 재프로그래밍 배양물을 FRM으로 이행하여 재프로그래밍 동역학을 증대시킨다. 초기 콜로니 형성이 1주 내에 관찰되었고, 14일에 유세포분석법을 이용하여 SSEA4/TRA1-81 양성 세포의 집단을 검출하였다. 14일에, FRM에 의해 지지된 재프로그래밍 배양물을 FMM 배지로 옮겼다. 20일 내지 30일 사이에, FACS를 사용하여 96웰 플레이트로 SSEA4/TRA1-81/CD30 양성 클론을 분류하였다. 대안적으로, 20일 내지 24일에, 세포를 접시로 SSEA4/TRA1-81/CD30 양성 세포에 대해 벌크 분류하였다. 포화상태일 때, 보통 10일 내지 14일에, 세포를 SSEA4/TRA1-81/CD30 양성 세포에 대해 FACS를 사용하여 96웰 분류하였다. 세포를 FMM에서 증식시키고 유지하였다. NANOG에 대한 세포내 및 표면 마커 발현의 분석 및 직접적인 qRTPCR에 의해 hiPSC 클론의 수를 확인하였다. 표 7에 기재된 바와 같은 렌티바이러스 작제물의 특정한 조합에 의해 96웰 분류 및 선택 과정을 이용한 재프로그래밍의 효율을 또한 평가하였다. 이 렌티바이러스 접근법의 쓰루풋 및 탄탄함에 대해 최소 용적의 제대혈로부터 증식된 섬유아세포 및 CD34+ 세포를 시험하였다.
센다이 바이러스 발현 시스템을 사용할 때, 하나 또는 다수의 작제물을 사용한 센다이 바이러스의 유도 후 24시간에, 재프로그래밍 배양물을 FRM으로 이행하여 재프로그래밍 동역학을 증대시킨다. 초기 콜로니 형성이 1주 내에 관찰되었고, 14일에 유세포분석법을 이용하여 SSEA4/TRA1-81 양성 세포의 집단을 검출하였다. 14일에, FRM에 의해 지지된 재프로그래밍 배양물을 FMM 배지로 옮겼다. 20일 내지 30일 사이에, FACS를 사용하여 96웰 플레이트로 SSEA4/TRA1-81/CD30 양성 클론을 분류하였다. 대안적으로, 20일 내지 24일에, 세포를 접시로 SSEA4/TRA1-81/CD30 양성 세포에 대해 벌크 분류하였다. 포화상태일 때, 보통 10일 내지 14일에, 세포를 SSEA4/TRA1-81/CD30 양성 세포에 대해 FACS를 사용하여 96웰 분류하였다. 세포를 FMM에서 증식시키고 유지하였다. NANOG에 대한 세포내 및 표면 마커 발현의 분석 및 직접적인 qRTPCR에 의해 hiPSC 클론의 수를 확인하였다. 표 7에 기재된 바와 같은 센다이 바이러스 작제물의 특정한 조합에 의해 96웰 분류 및 선택 과정을 이용한 재프로그래밍의 효율을 또한 평가하였다. 이 센다이 바이러스 접근법의 쓰루풋 및 탄탄함에 대해 최소 용적의 제대혈로부터 증식된 섬유아세포 및 CD34+ 세포를 시험하였다.
실시예 11 - 센다이 바이러스 벡터를 통해 화학량론적 인자를 사용하는 재프로그래밍
재프로그래밍 인자를 발현하는 센다이 바이러스를 사용하여 섬유아세포로부터 iPSC를 생성하였다. 표 7에 도시된 바대로, 작제물 1-5를 센다이 바이러스 벡터(ID Pharma(일본 쓰쿠바))로 혼입하였다. 섬유아세포를 각각의 바이러스 벡터 및 다양한 벡터 조합에 의해 형질유도하여 이전에 기재된 바와 같은 조건 하에 재프로그래밍을 개시하였다(표 8).
Figure pct00009
재프로그래밍 배양물을 FRM으로 이행하여 재프로그래밍 동역학을 증대시킨다. 감염 후 7일에, iPSC 마커 SSEA4/TRA181의 발현에 대해 세포를 분석하였다. 센다이 바이러스 벡터 NANOG-P2A-ESRRB-T2A-OCT4(NEO)와 CDH1-P2A-ZIC3-T2A-HESRG(CZH)의 조합은 약 1%의 비율로 7일에 초기에 SSEA4 및 TRA181에 양성인 세포의 집단을 효율적으로 제조하여서, Sox 및 Klf 없이 성공적이고 효율적인 iPSC 재프로그래밍을 나타낸다(도 25). 추가로, Myc+NEO +OO +EcU는 또한 Sox 및 Klf 없이 성공적이고 효율적인 iPSC 재프로그래밍을 제시한다(데이터 비도시).
또한, 재프로그래밍 인자 Oct4, Klf 및 Sox2를 함유하는 센다이 바이러스가 7일에 비교적 낮은 효율(0.25%)로 iPSC로 섬유아세포를 재프로그래밍한다는 것이 관찰되었다(도 26a). 그러나, 표 7에 기재된 재프로그래밍 인자에 의해 센다이 벡터 OKS를 보충함으로써, 재프로그래밍의 효율은 심지어 감염 후 7일에 유의미하게 증가한다. 섬유아세포를 iPSC 마커 SSEA4+/TRA181+의 발현에 대해 형질감염 후 7일에 유세포분석법에 의해 분석하였다. 도 26b-d에 도시된 바대로, 7일에 초기에, OKS가 각각 EcU, LDT1 및 CZH에 의해 보충될 때 iPSC 재프로그래밍 속도는 42.9%, 67% 및 74.3%이다. iPSC 마커 유도는 섬유아세포 마커 CD13의 하향조절이 수반된다(데이터 비도시). 형질감염 후 20일에, 도 27에 도시된 바대로, 재프로그래밍에서의 종래의 인자에 의한 CZH의 상승 효과는 안정하게 유지되고 심지어 개선되었다. EcU(2.01%) 및 LDT1(45.8%)의 상승 효과는 OKS 단독을 사용한 재프로그래밍(0.21%)과 비교하여 여전하였지만, 그 효과는 7일로부터의 데이터와 비교하여 감소하였다. 이론에 의해 제한되지 않으면서, 이러한 감소는 아마도 각각의 인자 조합을 보유하는 바이러스의 비교적 불량한 안정성과 관련되었다. 그리고 하기 기재된 바대로, 몇몇 바이러스 벡터에서 보이는 안정성 논의는 적어도 부분적으로 다중 바이러스 형질도입에 의해 해결될 수 있다.
체세포 재프로그래밍에 대해 (1) Oct4 및 Sox2, (2) Oct4 및 Klf, 및 (3) Oct4 단독과 사용될 때 EcU, LDT1 및 CZH 중 하나 이상의 증대 효과를 또한 평가하였다. 하나 또는 다수의 작제물을 사용한 센다이 바이러스의 유도 후 24시간에, 재프로그래밍 배양물을 FRM으로 이행하여 재프로그래밍 동역학을 증대시킨다. 콜로니 형성이 1주 내에 관찰될 때, 유세포분석법을 이용하여 7일 및/또는 14일에 SSEA4/TRA1-81 양성 세포의 집단을 검출한다. Oct4 및 Sox2, Oct4 및 Klf 및 Oct4 단독은 각각 다양한 효율에 의해 재프로그래밍을 달성하는 것으로 이전에 나타났다. EcU, LDT1 및 CZH의 강한 효과를 고려하면, Oct4 및 Sox2, Oct4 및 Klf 또는 Oct4에 대한 이들의 임의의 첨가가 Oct4, Sox2 및 Klf를 사용할 때 보이는 성공적이고 효율적인 재프로그래밍을 유사하게 발생시킬 것이라는 것을 예상하는 것이 합당하다.
재프로그래밍 인자를 함유하는 바이러스를 안정화시키고, 이에 따라 재프로그래밍 효율을 추가로 개선하기 위한 전략으로서 다중 형질도입을 시험하였다. 0일에 처음에 형질유도된 섬유아세포를 6일에 2개의 샘플로 분할하고, 이들 중 1개를 0일에 사용된 동일한 MOI(감염의 다중도)를 이용하여 7일에 재형질유도하였다. 25일에 검출된 iPSC 마커는, 약 0.1% 내지 0.5%로 흔히 보이는 수준과 비교하여 SSEA4 및 TRA181에 양성인 세포의 집단이 10.3%에 도달하면서(도 28), 다양한 시험된 재프로그래밍 인자 조합 중에, OO+EcU+NEO+CZH+LDT1에 의한 이중 형질도입이 가장 높은 효율을 가진다는 것을 보여준다. 또한, 각각의 벡터에 대한 상이한 MOI에서의 형질도입은 표 9에서 다양한 인자 조합을 사용한 단일 또는 다중 형질도입 재프로그래밍을 최적화하도록 변했다.
Figure pct00010
그러므로, ECAT1, ESRRB, UTF1, LDT1, CDH1, ZIC3, DPPA4, TDGF1 및 HESRG는, OCT4, KLF4, SOX2, NANOG 및 MYC를 포함하는 하나 이상의 종래의 재프로그래밍 인자가 사용될 때, 재프로그래밍을 효율적으로 및 효과적으로 증대시킬 수 있는 재프로그래밍 인자로서 확인되었다.
당해 분야의 숙련자는 본 명세서에 기재된 방법, 조성물, 및 생성물이 예시적인 실시형태를 대표하고, 본 발명의 범위에 대한 제한으로서 의도되지 않는다는 것을 용이하게 이해할 것이다. 다양한 치환 및 변형이 본 발명의 범위 및 정신으로부터 벗어나지 않으면서 본 명세서에 개시된 개시내용에 이루어질 수 있다는 것이 당해 분야의 숙련자에게 용이하게 명확할 것이다.
명세서에 언급된 모든 특허 및 공보는 본 개시내용이 속하는 분야의 숙련자의 수준을 나타낸다. 모든 특허 및 공보는, 각각의 개별 공보가 구체적으로 및 개별적으로 참고로 포함된 것으로 표시된 것과 동일한 정도로, 본 명세서에서 참고로 포함된다.
본 명세서에 예시적으로 기재된 본 개시내용은 본 명세서에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 부재 또는 부재들, 제한 또는 제한들의 부재 하에 적합하게 실행될 수 있다. 따라서, 예를 들어 각각의 경우에 본 명세서에서 임의의 용어 "포함하는", "본질적으로 이루어지는" 및 "이루어지는"은 다른 2개의 용어 중 하나에 의해 대체될 수 있다. 사용되는 용어 및 표현은 제한이 아니라 설명의 면에서 사용되고, 도시되고 기재된 특징의 임의의 균등물 및 또는 이의 부분을 배제하는 것의 이러한 용어 및 표현의 사용에서 의도가 없지만, 다양한 변형이 청구된 개시내용의 범위 내에 가능하다는 것이 인식된다. 따라서, 본 개시내용이 바람직한 실시형태 및 본 명세서에 개시된 개념의 임의의 특징에 의해 구체적으로 개시되어 있지만, 변형 및 변경이 당해 분야의 숙련자에 의해 재분류될 수 있고, 이러한 변형 및 변경이 첨부된 청구항에 의해 정의된 바대로 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 고려되는 것으로 이해되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> FATE THERAPEUTICS, INC. <120> PLATFORM FOR THE INDUCTION & MAINTENANCE OF GROUND STATE PLURIPOTENCY <130> WO2017/066634 <140> PCT/US2016/057136 <141> 2016-10-14 <150> US 62/242,842 <151> 2015-10-16 <160> 31 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypeptide cleavage recognition site <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa represent any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa represent any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa represent any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa = Gly or Ser <400> 1 Glu Xaa Xaa Tyr Xaa Gln Xaa 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypeptide cleavage recognition site <400> 2 Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypeptide cleavage recognition site <400> 3 Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser 1 5 <210> 4 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic made in lab <400> 4 Leu Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn 1 5 10 15 Pro Gly Pro <210> 5 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic made in lab <400> 5 Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn 1 5 10 15 Pro Gly Pro <210> 6 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic made in lab <400> 6 Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro 1 5 10 <210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic made in lab <400> 7 Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly 1 5 10 15 Pro <210> 8 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic made in lab <400> 8 Gln Leu Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser 1 5 10 15 Asn Pro Gly Pro 20 <210> 9 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic made in lab <400> 9 Ala Pro Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly 1 5 10 15 Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro 20 <210> 10 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic made in lab <400> 10 Val Thr Glu Leu Leu Tyr Arg Met Lys Arg Ala Glu Thr Tyr Cys Pro 1 5 10 15 Arg Pro Leu Leu Ala Ile His Pro Thr Glu Ala Arg His Lys Gln Lys 20 25 30 Ile Val Ala Pro Val Lys Gln Thr 35 40 <210> 11 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic made in lab <400> 11 Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro 1 5 10 15 Gly Pro <210> 12 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic made in lab <400> 12 Leu Leu Ala Ile His Pro Thr Glu Ala Arg His Lys Gln Lys Ile Val 1 5 10 15 Ala Pro Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly 20 25 30 Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro 35 40 <210> 13 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic made in lab <400> 13 Glu Ala Arg His Lys Gln Lys Ile Val Ala Pro Val Lys Gln Thr Leu 1 5 10 15 Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly 20 25 30 Pro <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequenceq <220> <223> Primer <400> 14 gggtttttgg gattaagttc ttca 24 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 15 gcccccaccc tttgtgtt 18 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 16 agcctaaatg atggtgcttg gt 22 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 17 ttgaaaactt tggcttcctt gtt 23 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 18 caggcccgaa agagaaagcg 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 19 ggagggcctt ggaagcttag 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 20 tatacacagg ccgatgtggg 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 21 ttgaccggga ccttgtcttc 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 22 gtggtccgag tgtggttctg 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 23 gttctcctgg gccatcttgc 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 24 aagcgcagat caaaaggaga 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 25 ccccctgaac ctgaaacata 20 <210> 26 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 26 tgcttcccgt atggctttc 19 <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 27 aaagggagat ccgactcgtc tg 22 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 28 atcgtcaaag ctgcacacag 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 29 cccaggagtc ccagtagtca 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 30 gtggacctga cctgccgtct 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 31 ggaggagtgg gtgtcgctgt 20

Claims (51)

  1. 비다능성 세포(non-pluripotent cell)를 재프로그래밍하는 방법으로서,
    a) 상기 비다능성 세포로 (ⅰ) OCT4, SOX2, NANOG, KLF4, LIN28, C-MYC, ECAT1, UTF1, ESRRB, SV40LT, HESRG, CDH1, TDGF1, DPPA4, DNMT3B, ZIC3 및 L1TD1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 폴리펩타이드를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드; 및 (ⅱ) HESRG, CDH1, TDGF1, DPPA4, DNMT3B, ZIC3 및 L1TD1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 폴리펩타이드를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 단계, 또는
    b) 상기 비다능성 세포를 (ⅰ) OCT4, SOX2, NANOG, KLF4, LIN28, C-MYC, ECAT1, UTF1, ESRRB, SV40LT, HESRG, CDH1, TDGF1, DPPA4, DNMT3B, ZIC3 및 L1TD1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 폴리펩타이드; 및 (ⅱ) HESRG, CDH1, TDGF1, DPPA4, DNMT3B, ZIC3 및 L1TD1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 폴리펩타이드와 접촉시키는 단계를 포함하는, 비다능성 세포를 재프로그래밍하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 a) (ⅰ) 및 a) (ⅱ)의 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 벡터에 의해 도입되고; 각각의 벡터에서의 상기 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 동일한 또는 상이한 폴리펩타이드를 코딩하는, 비다능성 세포를 재프로그래밍하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 비다능성 세포로 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 단계는 하나 이상의 벡터를 도입하는 단계를 포함하고, 각각의 벡터는 (ⅰ) 적어도 2개의 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅱ) 적어도 1개의 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 NANOG 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅲ) 적어도 1개의 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 ESRRB 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅳ) 적어도 1개의 ECAT1 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 UTF1 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅴ) 적어도 1개의 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드, 적어도 1개의 ESRRB 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 NANOG 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅵ) 적어도 1개의 CDH1, ZIC3 및 HESRG 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅶ) 적어도 1개의 L1TD1, DPPA4 및 TDGF1 코딩 폴리뉴클레오타이드; 또는 (ⅷ) 적어도 1개의 DNMT3B 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 비다능성 세포를 재프로그래밍하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 비다능성 세포로 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 단계는,
    (a) 하나 이상의 벡터를 도입하는 단계로서, 각각의 벡터는 (ⅰ) 적어도 2개의 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅱ) 적어도 1개의 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 NANOG 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅲ) 적어도 1개의 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 ESRRB 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅳ) 적어도 1개의 ECAT1 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 UTF1 코딩 폴리뉴클레오타이드; 또는 (ⅴ) 적어도 1개의 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드, 적어도 1개의 ESRRB 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 NANOG 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 상기 하나 이상의 벡터를 도입하는 단계; 및
    (b) 하나 이상의 벡터를 도입하는 단계로서, 각각의 벡터는 (1) 적어도 1개의 CDH1 코딩 폴리뉴클레오타이드, 적어도 1개의 ZIC3 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 HESRG 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅱ) 적어도 1개의 L1TD1 코딩 폴리뉴클레오타이드, 적어도 1개의 DPPA4 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 TDGF1 코딩 폴리뉴클레오타이드; 또는 (ⅲ) 적어도 1개의 DNMT3B 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 상기 하나 이상의 벡터를 도입하는 단계를 포함하는, 비다능성 세포를 재프로그래밍하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는
    (a) NANOG, ESRRB 및 Oct4 중 하나 이상을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드;
    (b) ECAT1 및 UTF1 중 하나 또는 둘 다를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드;
    (c) L1TD1, DPPA4 및 TDGF1 중 하나 이상을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드; 또는
    (d) CDH1, ZIC3 및 HESRG 중 하나 이상을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 중 적어도 하나에 의해 유도되는, 비다능성 세포를 재프로그래밍하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 Oct4를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터, 및
    (a) NANOG, ESRRB 및 Oct4를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터;
    (b) ECAT1 및 UTF1을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터;
    (c) L1TD1, DPPA4 및 TDGF1을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터; 및
    (d) CDH1, ZIC3 및 HESRG를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터
    중 적어도 하나에 의해 도입되는, 비다능성 세포를 재프로그래밍하는 방법.
  7. 제3항에 있어서, 상기 하나 이상의 벡터는 레트로바이러스, 센다이 바이러스(Sendai virus), 아데노바이러스, 에피솜, 미니-서클(mini-circle), 발현 카세트를 가지는 벡터 시스템 또는 mRNA에 의해 도입되는, 비다능성 세포를 재프로그래밍하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 벡터 중 적어도 하나는 센다이 바이러스에 의해 도입되는, 비다능성 세포를 재프로그래밍하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 적어도 하나의 자가 절단 폴리펩타이드에 의해 연결된, 비다능성 세포를 재프로그래밍하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 비다능성 세포는 다능성 세포로 재프로그래밍되는, 비다능성 세포를 재프로그래밍하는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 비다능성 세포는 체세포인, 비다능성 세포를 재프로그래밍하는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 비다능성 세포를 재프로그래밍하는 것은 SOX2, Klf4 및 c-Myc 중 하나 이상을 사용하는 것을 배제하는, 비다능성 세포를 재프로그래밍하는 방법.
  13. 다능성 세포를 제조하는 방법으로서,
    a) 비다능성 세포로 (ⅰ) OCT4, SOX2, NANOG, KLF4, LIN28, C-MYC, ECAT1, UTF1, ESRRB, SV40LT, HESRG, CDH1, TDGF1, DPPA4, DNMT3B, ZIC3 및 L1TD1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 폴리펩타이드를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드; 및 (ⅱ) HESRG, CDH1, TDGF1, DPPA4, DNMT3B, ZIC3 및 L1TD1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 폴리펩타이드를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드롤 도입하는 단계, 또는
    b) 상기 비다능성 세포를 (ⅰ) OCT4, SOX2, NANOG, KLF4, LIN28, C-MYC, ECAT1, UTF1, ESRRB, SV40LT, HESRG, CDH1, TDGF1, DPPA4, DNMT3B, ZIC3 및 L1TD1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 폴리펩타이드; 및 (ⅱ) HESRG, CDH1, TDGF1, DPPA4, DNMT3B, ZIC3 및 L1TD1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 폴리펩타이드와 접촉시키는 단계를 포함하고,
    이로써 상기 비다능성 세포를 다능성 세포로 재프로그래밍하는, 다능성 세포를 제조하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 a) (ⅰ) 및 a) (ⅱ)의 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 벡터에 의해 도입되고; 각각의 벡터에서의 상기 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 동일한 또는 상이한 폴리펩타이드를 코딩하는, 다능성 세포를 제조하는 방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 비다능성 세포로 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 단계는 하나 이상의 벡터를 도입하는 단계를 포함하고, 각각의 벡터는 (ⅰ) 적어도 2개의 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅱ) 적어도 1개의 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 NANOG 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅲ) 적어도 1개의 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 ESRRB 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅳ) 적어도 1개의 ECAT1 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 UTF1 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅴ) 적어도 1개의 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드, 적어도 1개의 ESRRB 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 NANOG 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅵ) 적어도 1개의 CDH1, ZIC3 및 HESRG 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅶ) 적어도 1개의 L1TD1, DPPA4 및 TDGF1 코딩 폴리뉴클레오타이드; 또는 (ⅷ) 적어도 1개의 DNMT3B 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 다능성 세포를 제조하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 비다능성 세포로 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 단계는
    (a) 하나 이상의 벡터를 도입하는 단계로서, 각각의 벡터는 (ⅰ) 적어도 2개의 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅱ) 적어도 1개의 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 NANOG 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅲ) 적어도 1개의 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 ESRRB 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅳ) 적어도 1개의 ECAT1 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 UTF1 코딩 폴리뉴클레오타이드; 또는 (ⅴ) 적어도 1개의 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드, 적어도 1개의 ESRRB 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 NANOG 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 상기 하나 이상의 벡터를 도입하는 단계; 및
    (b) 하나 이상의 벡터를 도입하는 단계로서, 각각의 벡터는 (1) 적어도 1개의 CDH1 코딩 폴리뉴클레오타이드, 적어도 1개의 ZIC3 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 HESRG 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅱ) 적어도 1개의 L1TD1 코딩 폴리뉴클레오타이드, 적어도 1개의 DPPA4 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 TDGF1 코딩 폴리뉴클레오타이드; 또는 (ⅲ) 적어도 1개의 DNMT3B 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 상기 하나 이상의 벡터를 도입하는 단계를 포함하는, 다능성 세포를 제조하는 방법.
  17. 제13항에 있어서, 상기 다능성 세포를 제조하는 것은 SOX2, Klf4 및 c-Myc 중 하나 이상을 사용하는 것을 배제하는, 다능성 세포를 제조하는 방법.
  18. 제13항에 있어서, 상기 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는,
    (a) NANOG, ESRRB 및 Oct4 중 하나 이상을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드;
    (b) ECAT1 및 UTF1 중 하나 또는 둘 다를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드;
    (c) L1TD1, DPPA4 및 TDGF1 중 하나 이상을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드; 또는
    (d) CDH1, ZIC3 및 HESRG 중 하나 이상을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드
    를 포함하는 벡터 중 적어도 하나에 의해 도입되는, 다능성 세포를 제조하는 방법.
  19. 제13항에 있어서, 상기 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 Oct4를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터, 및
    (a) NANOG, ESRRB 및 Oct4를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터;
    (b) ECAT1 및 UTF1을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터;
    (c) L1TD1, DPPA4 및 TDGF1을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터; 및
    (d) CDH1, ZIC3 및 HESRG를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터
    중 적어도 하나에 의해 도입되는, 다능성 세포를 제조하는 방법.
  20. 제13항에 있어서, 상기 하나 이상의 벡터는 레트로바이러스, 센다이 바이러스, 아데노바이러스, 에피솜, 미니-서클, 발현 카세트를 가지는 벡터 시스템 또는 mRNA에 의해 도입되는, 다능성 세포를 제조하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 벡터 중 적어도 하나는 센다이 바이러스에 의해 도입되는, 다능성 세포를 제조하는 방법.
  22. 비다능성 세포를 비다능성 세포의 집단을 포함하는 다능성 세포로 재프로그래밍하기 위한 조성물로서, 상기 비다능성 세포는 (ⅰ) OCT4, SOX2, NANOG, KLF4, LIN28, C-MYC, ECAT1, UTF1, ESRRB, SV40LT, HESRG, CDH1, TDGF1, DPPA4, DNMT3B, ZIC3 및 L1TD1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 폴리펩타이드를 코딩하는 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드; 및 (ⅱ) HESRG, CDH1, TDGF1, DPPA4, DNMT3B, ZIC3 및 L1TD1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 폴리펩타이드를 코딩하는 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 조성물.
  23. 제16항에 있어서, 상기 비다능성 세포는 OCT4, ESRRB, ECAT1, UTF1 및 NANOG로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 폴리펩타이드를 코딩하는 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하고; CDH1, ZIC3, HESRG, L1TD1, DPPA4, TDGF1 및 DNMT3B로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 폴리펩타이드를 코딩하는 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하는, 조성물.
  24. 제16항에 있어서, 상기 비다능성 세포는 (ⅰ) 적어도 2개의 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅱ) 적어도 1개의 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 NANOG 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅲ) 적어도 1개의 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 ESRRB 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅳ) 적어도 1개의 ECAT1 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 UTF1 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅴ) 적어도 1개의 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드, 적어도 1개의 ESRRB 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 NANOG 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅵ) 적어도 1개의 CDH1, ZIC3 및 HESRG 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅶ) 적어도 1개의 L1TD1, DPPA4 및 TDGF1 코딩 폴리뉴클레오타이드; 및/또는 (ⅷ) 적어도 1개의 DNMT3B 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하고; 상기 폴리뉴클레오타이드는 외인성인, 조성물.
  25. 제16항에 있어서, 상기 비다능성 세포는 (ⅰ) 적어도 2개의 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅱ) 적어도 1개의 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 NANOG 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅲ) 적어도 1개의 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 ESRRB 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅳ) 적어도 1개의 ECAT1 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 UTF1 코딩 폴리뉴클레오타이드; 및/또는 (ⅴ) 적어도 1개의 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드, 적어도 1개의 ESRRB 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 NANOG 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하고; 상기 비다능성 세포는 SOX2, Klf4 및 c-Myc 중 하나 이상을 포함하지 않는, 조성물.
  26. 제19항에 있어서, 상기 비다능성 세포는,
    (ⅰ) 적어도 1개의 CDH1 코딩 폴리뉴클레오타이드, 적어도 1개의 ZIC3 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 HESRG 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅱ) 적어도 1개의 L1TD1 코딩 폴리뉴클레오타이드, 적어도 1개의 DPPA4 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 TDGF1 코딩 폴리뉴클레오타이드; 및/또는 (ⅲ) 적어도 1개의 DNMT3B 코딩 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하는, 조성물.
  27. 다능성 세포를 제조하기 위한 키트로서,
    a) 하나 이상의 벡터이되, 각각의 벡터는 HESRG, CDH1, TDGF1, DPPA4, DNMT3B, ZIC3 및 L1TD1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 펩타이드를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 상기 하나 이상의 벡터; 또는
    b) HESRG, CDH1, TDGF1, DPPA4, DNMT3B, ZIC3 및 L1TD1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함하는, 키트.
  28. 제27항에 있어서, 하나 이상의 벡터를 포함하되, 각각의 벡터는 (ⅰ) 적어도 2개의 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅱ) 적어도 1개의 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 NANOG 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅲ) 적어도 1개의 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 ESRRB 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅳ) 적어도 1개의 ECAT1 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 UTF1 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅴ) 적어도 1개의 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드, 적어도 1개의 ESRRB 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 NANOG 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅵ) 적어도 1개의 CDH1, ZIC3 및 HESRG 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅶ) 적어도 1개의 L1TD1, DPPA4 및 TDGF1 코딩 폴리뉴클레오타이드; 또는 (ⅷ) 적어도 1개의 DNMT3B 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 키트.
  29. 제27항에 있어서,
    (a) 하나 이상의 벡터로서, 각각의 벡터는 (ⅰ) 적어도 2개의 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅱ) 적어도 1개의 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 NANOG 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅲ) 적어도 1개의 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 ESRRB 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅳ) 적어도 1개의 ECAT1 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 UTF1 코딩 폴리뉴클레오타이드; 또는 (ⅴ) 적어도 1개의 OCT4 코딩 폴리뉴클레오타이드, 적어도 1개의 ESRRB 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 NANOG 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 상기 하나 이상의 벡터; 및
    (b) 하나 이상의 벡터로서, 각각의 벡터는 (1) 적어도 1개의 CDH1 코딩 폴리뉴클레오타이드, 적어도 1개의 ZIC3 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 HESRG 코딩 폴리뉴클레오타이드; (ⅱ) 적어도 1개의 L1TD1 코딩 폴리뉴클레오타이드, 적어도 1개의 DPPA4 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 1개의 TDGF1 코딩 폴리뉴클레오타이드; 또는 (ⅲ) 적어도 1개의 DNMT3B 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 상기 하나 이상의 벡터를 포함하는, 키트.
  30. 제27항에 있어서, 상기 벡터는
    (a) NANOG, ESRRB 및 Oct4 중 하나 이상을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드;
    (b) ECAT1 및 UTF1 중 하나 또는 둘 다를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드;
    (c) L1TD1, DPPA4 및 TDGF1 중 하나 이상을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드; 또는
    (d) CDH1, ZIC3 및 HESRG 중 하나 이상을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 키트.
  31. 제27항에 있어서, 상기 키트는 Oct4를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터, 및
    (a) NANOG, ESRRB 및 Oct4를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터;
    (b) ECAT1 및 UTF1을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터;
    (c) L1TD1, DPPA4 및 TDGF1을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터; 및
    (d) CDH1, ZIC3 및 HESRG를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터
    중 적어도 하나를 포함하는, 키트.
  32. 제27항에 있어서, 상기 벡터는 레트로바이러스, 센다이 바이러스, 아데노바이러스, 플라스미드, 미니-서클 또는 mRNA에 의해 운반되는, 키트.
  33. 제27항에 있어서, 상기 벡터는 센다이 바이러스에 의해 운반되는, 키트.
  34. 재프로그래밍 조성물로서,
    (a) (ⅰ) OCT4, SOX2, NANOG, KLF4, LIN28, C-MYC, ECAT1, UTF1, ESRRB, SV40LT, HESRG, CDH1, TDGF1, DPPA4, DNMT3B, ZIC3 및 L1TD1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 펩타이드; 및 (ⅱ) HESRG, CDH1, TDGF1, DPPA4, DNMT3B, ZIC3 및 L1TD1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 펩타이드를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드; 또는
    (b) (ⅰ) OCT4, SOX2, NANOG, KLF4, LIN28, C-MYC, ECAT1, UTF1, ESRRB, SV40LT, HESRG, CDH1, TDGF1, DPPA4, DNMT3B, ZIC3 및 L1TD1; 및 (ⅱ) HESRG, CDH1, TDGF1, DPPA4, DNMT3B, ZIC3 및 L1TD1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함하는, 재프로그래밍 조성물.
  35. 제34항에 있어서,
    (a) OCT4, NANOG, ECAT1, ESRRB 및 UTF1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 펩타이드를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드; 또는
    (b) OCT4, NANOG, ECAT1, ESRRB 및 UTF1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 폴리펩타이드를 추가로 포함하는, 재프로그래밍 조성물.
  36. 제34항에 있어서, 상기 조성물은,
    (a) NANOG, ESRRB 및 Oct4 중 하나 이상을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드;
    (b) ECAT1 및 UTF1 중 하나 또는 둘 다를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드;
    (c) L1TD1, DPPA4 및 TDGF1 중 하나 이상을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드; 또는
    (d) CDH1, ZIC3 및 HESRG 중 하나 이상을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 적어도 하나의 벡터를 포함하는, 재프로그래밍 조성물.
  37. 제36항에 있어서, 상기 조성물은 Oct4를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터, 및
    (a) NANOG, ESRRB 및 Oct4를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터;
    (b) ECAT1 및 UTF1을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터;
    (c) L1TD1, DPPA4 및 TDGF1을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터; 및
    (d) CDH1, ZIC3 및 HESRG를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터
    중 적어도 하나를 포함하는, 재프로그래밍 조성물.
  38. 제36항에 있어서, 상기 벡터는 레트로바이러스, 센다이 바이러스, 아데노바이러스, 플라스미드, 미니-서클 또는 mRNA에 의해 운반되는, 재프로그래밍 조성물.
  39. 제36항에 있어서, 상기 벡터는 센다이 바이러스에 의해 운반되는, 재프로그래밍 조성물.
  40. 비다능성 세포를 재프로그래밍하는 방법으로서,
    (a) 상기 비다능성 세포로 Oct4, 및 임의로 Klf, Sox2, Myc, NANOG 및 ESRRB 중 하나 이상을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 단계; 및
    (b) 상기 비다능성 세포로 ECAT1, UTF1, L1TD1, DPPA4, TDGF1, CDH1, ZIC3 및 HESRG 중 적어도 하나를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 단계를 포함하되;
    이로써 다능성 세포를 수득하는, 비다능성 세포를 재프로그래밍하는 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 (a) 및 (b)의 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 벡터에 의해 도입되고; 각각의 벡터에서의 상기 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 동일한 또는 상이한 폴리펩타이드를 코딩하는, 비다능성 세포를 재프로그래밍하는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 하나 이상의 벡터는,
    (a) NANOG, ESRRB 및 Oct4 중 하나 이상을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드;
    (b) ECAT1 및 UTF1 중 하나 또는 둘 다를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드;
    (c) L1TD1, DPPA4 및 TDGF1 중 하나 이상을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드; 또는
    (d) CDH1, ZIC3 및 HESRG 중 하나 이상을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드
    를 포함하는 적어도 하나의 작제물을 포함하는, 비다능성 세포를 재프로그래밍하는 방법.
  43. 제40항에 있어서, 상기 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 Oct4를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터, 및
    (a) NANOG, ESRRB 및 Oct4를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터;
    (b) ECAT1 및 UTF1을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터;
    (c) L1TD1, DPPA4 및 TDGF1을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터; 및
    (d) CDH1, ZIC3 및 HESRG를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터
    중 적어도 하나를 통해 도입되는, 비다능성 세포를 재프로그래밍하는 방법.
  44. 제40항에 있어서, 상기 벡터 중 하나 이상은 레트로바이러스, 센다이 바이러스, 아데노바이러스, 플라스미드, 미니-서클 또는 mRNA에 의해 도입되는, 비다능성 세포를 재프로그래밍하는 방법.
  45. 제40항에 있어서, 상기 벡터 중 하나 이상은 센다이 바이러스에 의해 도입되는, 비다능성 세포를 재프로그래밍하는 방법.
  46. 센다이 바이러스를 사용하여 비다능성 세포를 재프로그래밍하는 방법으로서,
    (a) 상기 비다능성 세포로 Oct4, 및 임의로 Klf, Sox2, Myc, NANOG 및 ESRRB 중 하나 이상을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드을 도입하는 단계; 및
    (b) 상기 비다능성 세포로 ECAT1, UTF1, L1TD1, DPPA4, TDGF1, CDH1, ZIC3 및 HESRG 중 적어도 하나를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 단계를 포함하되;
    이로써 다능성 세포를 수득하는, 센다이 바이러스를 사용하여 비다능성 세포를 재프로그래밍하는 방법.
  47. 제46항에 있어서, 상기 (a) 및 (b)의 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 벡터에 의해 도입되고; 상기 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 동일한 또는 상이한 폴리펩타이드를 코딩하는, 센다이 바이러스를 사용하여 비다능성 세포를 재프로그래밍하는 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 벡터 중 하나 이상은,
    (a) NANOG, ESRRB 및 Oct4 중 하나 이상을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드;
    (b) ECAT1 및 UTF1 중 하나 또는 둘 다를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드;
    (c) L1TD1, DPPA4 및 TDGF1 중 하나 이상을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드; 또는
    (d) CDH1, ZIC3 및 HESRG 중 하나 이상을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 작제물을 포함하는, 센다이 바이러스를 사용하여 비다능성 세포를 재프로그래밍하는 방법.
  49. 제46항에 있어서, 상기 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 Oct4를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터, 및
    (a) NANOG, ESRRB 및 Oct4를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터;
    (b) ECAT1 및 UTF1을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터;
    (c) L1TD1, DPPA4 및 TDGF1을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터; 및
    (d) CDH1, ZIC3 및 HESRG를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 중 적어도 하나를 통해 도입되고;
    상기 벡터는 센다이 바이러스에 의해 운반되는, 센다이 바이러스를 사용하여 비다능성 세포를 재프로그래밍하는 방법.
  50. 센다이 바이러스를 사용하여 비다능성 세포를 재프로그래밍하는 방법으로서,
    (a) 상기 비다능성 세포로 Oct4, 및 임의로 Klf, Sox2, Myc, NANOG 및 ESRRB 중 하나 이상을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 단계; 및
    (b) 상기 비다능성 세포로
    (ⅰ) ECAT1 및 UTF1 중 하나 또는 둘 다를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드;
    (ⅱ) L1TD1, DPPA4 및 TDGF1 중 하나 이상을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 또는
    (ⅲ) CDH1, ZIC3 및 HESRG 중 하나 이상을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 작제물 중 하나를 도입하는 단계를 포함하되,
    이로써 다능성 세포를 수득하는, 센다이 바이러스를 사용하여 비다능성 세포를 재프로그래밍하는 방법.
  51. 제50항에 있어서, 상기 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 Oct4를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터, 및
    (a) NANOG, ESRRB 및 Oct4를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터;
    (b) ECAT1 및 UTF1을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터;
    (c) L1TD1, DPPA4 및 TDGF1을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터; 및
    (d) CDH1, ZIC3 및 HESRG를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터
    중 적어도 하나를 통해 도입되고;
    상기 벡터는 센다이 바이러스에 의해 운반되는, 센다이 바이러스를 사용하여 비다능성 세포를 재프로그래밍하는 방법.
KR1020187013539A 2015-10-16 2016-10-14 기저 상태 다능성의 유도 및 유지를 위한 플랫폼 KR20180055918A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562242842P 2015-10-16 2015-10-16
US62/242,842 2015-10-16
PCT/US2016/057136 WO2017066634A1 (en) 2015-10-16 2016-10-14 Platform for the induction & maintenance of ground state pluripotency

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20180055918A true KR20180055918A (ko) 2018-05-25

Family

ID=58517947

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020187013539A KR20180055918A (ko) 2015-10-16 2016-10-14 기저 상태 다능성의 유도 및 유지를 위한 플랫폼

Country Status (9)

Country Link
US (2) US11441126B2 (ko)
EP (1) EP3362570A4 (ko)
JP (3) JP7263005B2 (ko)
KR (1) KR20180055918A (ko)
CN (2) CN108291237B (ko)
AU (2) AU2016338680B2 (ko)
CA (1) CA3001917A1 (ko)
SG (2) SG11201802957PA (ko)
WO (1) WO2017066634A1 (ko)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102703637B1 (ko) 2010-12-22 2024-09-05 페이트 세러퓨틱스, 인코포레이티드 단세포 분류 및 iPSC의 증강된 재프로그래밍을 위한 세포 배양 플랫폼
EP3114214B1 (en) 2014-03-04 2023-11-01 Fate Therapeutics, Inc. Improved reprogramming methods and cell culture platforms
WO2019165320A1 (en) * 2018-02-22 2019-08-29 Celularity, Inc. Post partum tissue-derived induced pluripotent stem cells and uses thereof

Family Cites Families (149)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4797368A (en) 1985-03-15 1989-01-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector
US5506337A (en) 1985-03-15 1996-04-09 Antivirals Inc. Morpholino-subunit combinatorial library and method
US5139941A (en) 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
US5010175A (en) 1988-05-02 1991-04-23 The Regents Of The University Of California General method for producing and selecting peptides with specific properties
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
IE66205B1 (en) 1990-06-14 1995-12-13 Paul A Bartlett Polypeptide analogs
US5650489A (en) 1990-07-02 1997-07-22 The Arizona Board Of Regents Random bio-oligomer library, a method of synthesis thereof, and a method of use thereof
US5384253A (en) 1990-12-28 1995-01-24 Dekalb Genetics Corporation Genetic transformation of maize cells by electroporation of cells pretreated with pectin degrading enzymes
AU2515992A (en) 1991-08-20 1993-03-16 Genpharm International, Inc. Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs
CA2117096C (en) 1991-09-06 1997-11-04 Masafumi Arita 4-amino(alkyl)cyclohexane-1-carboxamide compound and use thereof
US5573905A (en) 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
US5702932A (en) 1992-07-20 1997-12-30 University Of Florida Microinjection methods to transform arthropods with exogenous DNA
US5288514A (en) 1992-09-14 1994-02-22 The Regents Of The University Of California Solid phase and combinatorial synthesis of benzodiazepine compounds on a solid support
WO1995003402A1 (en) 1993-07-22 1995-02-02 Merck & Co., Inc. EXPRESSION OF HUMAN INTERLEUKIN-1β IN A TRANSGENIC ANIMAL
US5519134A (en) 1994-01-11 1996-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Pyrrolidine-containing monomers and oligomers
US5593853A (en) 1994-02-09 1997-01-14 Martek Corporation Generation and screening of synthetic drug libraries
US5539083A (en) 1994-02-23 1996-07-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Peptide nucleic acid combinatorial libraries and improved methods of synthesis
US5656610A (en) 1994-06-21 1997-08-12 University Of Southern California Producing a protein in a mammal by injection of a DNA-sequence into the tongue
US5525735A (en) 1994-06-22 1996-06-11 Affymax Technologies Nv Methods for synthesizing diverse collections of pyrrolidine compounds
US5549974A (en) 1994-06-23 1996-08-27 Affymax Technologies Nv Methods for the solid phase synthesis of thiazolidinones, metathiazanones, and derivatives thereof
US5736524A (en) 1994-11-14 1998-04-07 Merck & Co.,. Inc. Polynucleotide tuberculosis vaccine
US5843780A (en) 1995-01-20 1998-12-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Primate embryonic stem cells
AU6113396A (en) 1995-06-14 1997-01-15 Regents Of The University Of California, The Novel high affinity human antibodies to tumor antigens
US5569588A (en) 1995-08-09 1996-10-29 The Regents Of The University Of California Methods for drug screening
US6013516A (en) 1995-10-06 2000-01-11 The Salk Institute For Biological Studies Vector and method of use for nucleic acid delivery to non-dividing cells
US5780448A (en) 1995-11-07 1998-07-14 Ottawa Civic Hospital Loeb Research DNA-based vaccination of fish
GB9807935D0 (en) 1998-04-14 1998-06-10 Univ Edinburgh Lineage specific cells and progenitor cells
US5945100A (en) 1996-07-31 1999-08-31 Fbp Corporation Tumor delivery vehicles
DE69737631T3 (de) 1996-08-12 2011-08-18 Mitsubishi Tanabe Pharma Corp. MEDIKAMENTE ENTHALTEND Rho-KINASE INHIBITOREN
US5981274A (en) 1996-09-18 1999-11-09 Tyrrell; D. Lorne J. Recombinant hepatitis virus vectors
EP0981352B8 (en) 1997-05-07 2009-06-17 Pharma Mar, S.A. Use of aplidine for the treatment of cardiovascular diseases
ATE394484T1 (de) 1997-06-13 2008-05-15 Ludwig Inst Cancer Res Smad 6 und dessen anwendungen
CN1163475C (zh) 1997-07-01 2004-08-25 沃尼尔·朗伯公司 4-溴或4-碘苯基氨基苯氧肟酸衍生物及其作为mek抑制剂的用途
US5994624A (en) 1997-10-20 1999-11-30 Cotton Incorporated In planta method for the production of transgenic plants
US5994136A (en) 1997-12-12 1999-11-30 Cell Genesys, Inc. Method and means for producing high titer, safe, recombinant lentivirus vectors
US20060263382A1 (en) 1998-06-20 2006-11-23 Richard Hotchkiss Membrane-permeant peptide complexes for treatment of sepsis
JP2002521025A (ja) 1998-07-24 2002-07-16 ザ カーネギー インスチチューション オブ ワシントン 増殖因子のＴＧＦ−βファミリーのメンバーを使用する、生殖系列幹細胞の維持および増殖のための方法。
GB9819912D0 (en) 1998-09-11 1998-11-04 Univ Edinburgh Propagation and/or derivation of embryonic stem cells
JP2002534380A (ja) 1999-01-07 2002-10-15 ワーナー−ランバート・カンパニー Ｍｅｋ阻害剤による喘息の治療
US6703420B1 (en) 1999-03-19 2004-03-09 Bristol-Myers Squibb Pharma Company Amino-thio-acrylonitriles as MEK inhibitors
WO2000078351A1 (fr) 1999-06-18 2000-12-28 Mitsubishi Pharma Corporation Promoteurs de l'osteogenese
US6730293B1 (en) 1999-08-24 2004-05-04 Cellgate, Inc. Compositions and methods for treating inflammatory diseases of the skin
AU6865100A (en) 1999-09-02 2001-04-10 Mitsubishi Pharma Corporation Osteogenesis promoting agents
US20020142457A1 (en) 1999-12-28 2002-10-03 Akihiro Umezawa Cell having the potentiality of differentiation into cardiomyocytes
US6692736B2 (en) 2000-03-24 2004-02-17 Cell Genesys, Inc. Cell-specific adenovirus vectors comprising an internal ribosome entry site
ES2461854T3 (es) 2000-07-19 2014-05-21 Warner-Lambert Company Llc Ésteres oxigenados de ácidos 4-yodofenilamino-benzhidroxámicos
WO2008108741A1 (en) 2007-03-07 2008-09-12 S*Bio Pte Ltd Combination of benzimidazole anti-cancer agent and a second anti-cancer agent
US20030087919A1 (en) 2001-03-23 2003-05-08 Bayer Corporation Rho-kinase inhibitors
US20030125344A1 (en) 2001-03-23 2003-07-03 Bayer Corporation Rho-kinase inhibitors
CA2446110C (en) 2001-05-01 2013-06-25 National Research Council Of Canada A system for inducible expression in eukaryotic cells
AU2002330465B2 (en) 2001-09-21 2006-07-27 Kyoto University Screening method for a reprogramming agent, reprogramming agent screened by the method, method for using the reprogramming agent, method for differentiating an undifferentiated fusion cell, and production method of cells, tissues and organs.
PT1456380E (pt) 2001-11-02 2012-07-23 Giuliani Int Ltd Inibidores smad7 para o tratamento de doenças do snc
AU2003202263A1 (en) 2002-01-10 2003-07-30 Bayer Healthcare Ag Roh-kinase inhibitors
JP4469179B2 (ja) 2002-01-23 2010-05-26 バイエル ファーマセチカル コーポレーション Ｒｈｏキナーゼ阻害剤としてのピリミジン誘導体
CA2473910C (en) 2002-01-23 2011-03-15 Bayer Pharmaceuticals Corporation Pyrimidine derivatives as rho-kinase inhibitors
AU2003210405A1 (en) 2002-03-05 2003-09-16 Artemis Pharmaceuticals Gmbh Inbred embryonic stem-cell derived mice
SI2130537T1 (sl) 2002-03-13 2013-01-31 Array Biopharma, Inc. N3-alkilirani derivati benzimidazola kot inhibitorji mek
US20050182040A1 (en) 2002-04-03 2005-08-18 Naonori Imazaki Benzamide derivatives
GB0210539D0 (en) 2002-05-08 2002-06-19 Univ Edinburgh Control of es cell self renewal and lineage specification, and medium therefor
CA2503646C (en) 2002-10-28 2011-09-27 Bayer Healthcare Ag Heteroaryloxy-substituted phenylaminopyrimidines as rho-kinase inhibitors
MXPA05003431A (es) 2002-11-15 2005-07-05 Warner Lambert Co Quimioterapia de combinacion.
CA2515215A1 (en) 2003-02-10 2004-08-26 Amgen Inc. Vanilloid receptor ligands and their use in treatments
AU2003901099A0 (en) 2003-03-11 2003-03-27 Es Cell International Pte Ltd. Methods of inducing differentiation of stem cells
US20050075276A1 (en) 2003-03-14 2005-04-07 Christopher Rudd Use of inhibitors of glycogen synthase-3 to augment CD28 dependent -T-cell responses
US20070010008A1 (en) 2005-06-29 2007-01-11 Tissuetech, Inc. Ex vivo expansion of primary animal cells
AU2004316996A1 (en) 2003-06-20 2005-09-15 The Regents Of The University Of California Polypeptide transduction and fusogenic peptides
CN1863904B (zh) 2003-10-03 2014-05-28 福田惠一 由干细胞分化诱导心肌细胞的方法
ES2426288T3 (es) 2003-10-15 2013-10-22 Ube Industries, Ltd. Novedoso derivado de imidazol
AU2004281309A1 (en) 2003-10-16 2005-04-28 The University Court Of The University Of Edinburgh Control of ES cell self-renewal and lineage specification, and medium therefor
WO2005051302A2 (en) 2003-11-19 2005-06-09 Array Biopharma Inc. Bicyclic inhibitors of mek and methods of use thereof
WO2005049812A1 (en) 2003-11-19 2005-06-02 Australian Stem Cell Centre Limited Methods for producing blood products from pluripotent cells in cell culture
US20070269412A1 (en) 2003-12-02 2007-11-22 Celavie Biosciences, Llc Pluripotent cells
JP2007519754A (ja) 2004-01-30 2007-07-19 スミスクライン ビーチャム コーポレーション 化合物
JP2008501640A (ja) 2004-04-21 2008-01-24 ザ ユニヴァーシティー オヴ シカゴ ミオシン軽鎖キナーゼ阻害剤及びその使用
US8187878B2 (en) 2004-08-13 2012-05-29 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Methods for increasing definitive endoderm differentiation of pluripotent human embryonic stem cells with PI-3 kinase inhibitors
US20080268533A1 (en) 2004-08-25 2008-10-30 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Methods and Compositions Utilizing Myc and Gsk3Beta to Manipulate the Pluripotency of Embryonic Stem Cells
US20060182724A1 (en) 2005-02-15 2006-08-17 Riordan Neil H Method for expansion of stem cells
CA2608201C (en) 2005-05-18 2013-12-31 Array Biopharma Inc. Heterocyclic inhibitors of mek and methods of use thereof
CA2617611A1 (en) 2005-08-01 2007-02-08 Nupotential, Llc Production of reprogrammed cells with restored potential
US20080242594A1 (en) 2005-09-08 2008-10-02 Mckay Ronald D G Methods for Promoting Stem Cell Proliferation and Survival
US8217042B2 (en) 2005-11-11 2012-07-10 Zentaris Gmbh Pyridopyrazines and their use as modulators of kinases
US8048999B2 (en) 2005-12-13 2011-11-01 Kyoto University Nuclear reprogramming factor
US20090227032A1 (en) 2005-12-13 2009-09-10 Kyoto University Nuclear reprogramming factor and induced pluripotent stem cells
GB0601538D0 (en) 2006-01-26 2006-03-08 Univ Birmingham Epigenetic analysis
WO2007088651A1 (ja) 2006-02-01 2007-08-09 The University Of Tokyo ＴＧＦ－βシグナル阻害剤と抗腫瘍剤の組み合せ使用
US7541186B2 (en) 2006-02-22 2009-06-02 University Of Washington Method of generating human retinal progenitors from embryonic stem cells
GB0615327D0 (en) 2006-03-30 2006-09-13 Univ Edinburgh Culture medium containing kinase inhibitors and uses thereof
GB2436737B (en) 2006-03-30 2008-07-09 Univ Edinburgh Culture medium containing kinase inhibitors,and uses thereof
US8741643B2 (en) 2006-04-28 2014-06-03 Lifescan, Inc. Differentiation of pluripotent stem cells to definitive endoderm lineage
SE534150C2 (sv) 2006-05-02 2011-05-10 Wisconsin Alumni Res Found Förfarande för differentiering av stamceller till celler av den endodermala och pankreatiska utvecklingslinjen
EP2035416A1 (en) 2006-06-30 2009-03-18 Schering Corporation Substituted piperidines that increase p53 activity and the uses thereof
AU2007271964B2 (en) 2006-07-14 2012-01-19 Novartis Ag Pyrimidine derivatives as ALK-5 inhibitors
US20080020014A1 (en) 2006-07-19 2008-01-24 Paul Consigny Implantable devices containing nuclear receptor ligands for the treatment of vascular and related disorders
CN101563449A (zh) 2006-09-22 2009-10-21 理化学研究所 干细胞培养基及干细胞培养方法
JP2008099662A (ja) 2006-09-22 2008-05-01 Institute Of Physical & Chemical Research 幹細胞の培養方法
GB0622395D0 (en) 2006-11-09 2006-12-20 Univ Cambridge Tech Methods relating to pluripotent cells
JP5419279B2 (ja) 2007-01-17 2014-02-19 ウィスコンシン アラムニ リサーチ ファンデーション 改良された幹細胞の培養
US20100172883A1 (en) 2007-01-19 2010-07-08 Bruneau Benoit Gaetan Methods of generating cardiomyocytes
EP2126045A4 (en) 2007-01-30 2010-05-26 Univ Georgia EARLY MESODERM CELLS, STABLE POPULATION OF MESENDODERM CELLS WITH THE ABILITY TO GENERATE ENDODERM AND MESODERM CELL LINES AND MULTIPOTENTIAL MIGRATION CELLS
WO2008105630A1 (en) 2007-02-27 2008-09-04 Procell Therapeutics Inc. Combined use of cell permeable nanog and oct4 for increasing self-renewal and suppressing differentiation of stem cells
WO2008126932A2 (en) 2007-04-09 2008-10-23 Riken Epigenetical regulation of brain plasticity
CN101688178B (zh) 2007-04-18 2013-12-04 哈达锡特医学研究服务及发展有限公司 干细胞衍生的视网膜色素上皮细胞
US7878210B2 (en) 2007-06-04 2011-02-01 Philip Morris Usa Inc. Cellulose acetate fiber modification
US8648069B2 (en) 2007-06-08 2014-02-11 Abbvie Inc. 5-substituted indazoles as kinase inhibitors
US9213999B2 (en) 2007-06-15 2015-12-15 Kyoto University Providing iPSCs to a customer
JP2008307007A (ja) 2007-06-15 2008-12-25 Bayer Schering Pharma Ag 出生後のヒト組織由来未分化幹細胞から誘導したヒト多能性幹細胞
CA2691793A1 (en) 2007-06-29 2009-01-08 Cellular Dynamics International, Inc. Automated method and apparatus for embryonic stem cell culture
WO2009032456A2 (en) 2007-08-01 2009-03-12 Primegen Biotech Llc Non-viral delivery of transcription factors that reprogram human somatic cells into a stem cell-like state
RU2492232C2 (ru) 2007-08-31 2013-09-10 Уайтхэд Инститьют Фор Байомедикал Рисерч СТИМУЛЯЦИЯ ПУТИ Wnt ПРИ ПЕРЕПРОГРАММИРОВАНИИ СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТОК
CA2660123C (en) 2007-10-31 2017-05-09 Kyoto University Nuclear reprogramming method
US20110151447A1 (en) 2007-11-06 2011-06-23 Children's Medical Center Corporation Method to produce induced pluripotent stem (ips) cells from non-embryonic human cells
JP4604076B2 (ja) 2007-11-07 2010-12-22 国立大学法人静岡大学 燃料電池用電解質膜
WO2009073523A2 (en) 2007-11-29 2009-06-11 Children's Hospital Of Orange County De-differentiation of human cells
US20110190729A1 (en) 2007-11-30 2011-08-04 Cytomatrix Pty Ltd Methods of inducing pluripotency involving sox2 protein
WO2009067757A1 (en) 2007-11-30 2009-06-04 Cytomatrix Pty Ltd Methods of inducing pluripotency involving oct4 protein
JP2011516042A (ja) 2008-03-17 2011-05-26 へルムホルツ・ツェントルム・ミュンヘン−ドイチェス・フォルシュングスツェントルム・ヒューア・ゲズントハイト・ウント・ウムヴェルト（ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング） 部位特異的組み換えを用いて無ベクター誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞を作製するベクターおよびその方法
WO2009117439A2 (en) 2008-03-17 2009-09-24 The Scripps Research Institute Combined chemical and genetic approaches for generation of induced pluripotent stem cells
CN101550406B (zh) 2008-04-03 2016-02-10 北京大学 制备多潜能干细胞的方法,试剂盒及用途
CA2697621C (en) 2008-07-30 2017-01-17 Kyoto University Method of efficiently establishing induced pluripotent stem cells
US8298825B1 (en) 2008-08-25 2012-10-30 The General Hospital Corporation TGF-beta receptor inhibitors to enhance direct reprogramming
DK2356213T3 (da) 2008-11-04 2019-09-09 Viacyte Inc Stamcelleaggregatsuspensionssammensætninger og fremgangsmåder til differentiering deraf
EP2370445B1 (en) 2008-12-03 2014-07-23 The Scripps Research Institute Stem cell cultures
WO2010077955A1 (en) 2008-12-17 2010-07-08 The Scripps Research Institute Generation and maintenance of stem cells
WO2010102267A2 (en) 2009-03-06 2010-09-10 Ipierian, Inc. Tgf-beta pathway inhibitors for enhancement of cellular reprogramming of human cells
CN102395672A (zh) 2009-04-13 2012-03-28 加利福尼亚大学董事会 用于干细胞培养的方法和组合物
US20100303775A1 (en) 2009-05-27 2010-12-02 The Salk Institute For Biological Studies Generation of Genetically Corrected Disease-free Induced Pluripotent Stem Cells
US8524498B2 (en) 2009-05-29 2013-09-03 The General Hospital Corporation Methods and compositions for homologous recombination in human cells
WO2010137348A1 (en) 2009-05-29 2010-12-02 Keio University Method for selecting clone of induced pluripotent stem cells
JP5376478B2 (ja) 2009-08-07 2013-12-25 国立大学法人京都大学 効率的な人工多能性幹細胞の樹立方法
ES2638464T3 (es) 2009-10-16 2017-10-20 The Scripps Research Institute Inducción de células pluripotentes
CA2779310C (en) 2009-10-31 2021-11-30 New World Laboratories Inc. Methods for reprogramming cells and uses thereof
CN102597221B (zh) 2009-11-04 2015-03-11 细胞动力国际有限公司 使用化学品的游离重编程
CA3174901A1 (en) 2009-11-12 2011-05-19 Technion Research & Development Foundation Ltd. Culture media, cell cultures and methods of culturing pluripotent stem cells in an undifferentiated state
JP5827220B2 (ja) 2010-01-22 2015-12-02 国立大学法人京都大学 人工多能性幹細胞の樹立効率改善方法
US20130011918A1 (en) * 2010-02-17 2013-01-10 Biotime Inc. Methods for telomere length and genomic dna quality control and analysis in pluripotent stem cells
WO2011109695A1 (en) 2010-03-05 2011-09-09 Texas Heart Institute Ets2 and mesp1 generate cardiac progenitors from fibroblasts
CN102959076B (zh) 2010-03-31 2015-09-16 斯克里普斯研究所 重编程细胞
CN103003416B (zh) 2010-06-15 2016-11-16 细胞动力学国际有限公司 从小体积的外周血产生诱导性多潜能干细胞
US20110306516A1 (en) * 2010-06-15 2011-12-15 The New York Stem Cell Foundation Methods for producing induced pluripotent stem cells
JPWO2011158852A1 (ja) 2010-06-15 2013-08-19 国立大学法人 東京大学 誘導型多能性幹細胞の製造方法
US8765470B2 (en) 2010-08-04 2014-07-01 Cellular Dynamics International, Inc. Reprogramming immortalized B-cells to induced pluripotent stem cells
KR102703637B1 (ko) 2010-12-22 2024-09-05 페이트 세러퓨틱스, 인코포레이티드 단세포 분류 및 iPSC의 증강된 재프로그래밍을 위한 세포 배양 플랫폼
WO2013070852A2 (en) 2011-11-08 2013-05-16 Emory University Compounds and compositions used to epigenetically transform cells and methods related thereto
AU2012347534B2 (en) 2011-12-08 2018-01-25 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods for enhanced generation of hematopoietic stem/progenitor cells
WO2013159103A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Whitehead Institute For Biomedical Research Programming and reprogramming of cells
WO2013176197A1 (ja) 2012-05-22 2013-11-28 国立大学法人 東京大学 抗原特異的ｔ細胞の製造方法
US9166832B1 (en) 2013-10-04 2015-10-20 Altera Corporation Methods and apparatus for decision feedback equalization adaptation
EP3114214B1 (en) 2014-03-04 2023-11-01 Fate Therapeutics, Inc. Improved reprogramming methods and cell culture platforms
ES2953925T3 (es) * 2015-11-04 2023-11-17 Fate Therapeutics Inc Ingeniería genómica de células pluripotentes

Also Published As

Publication number Publication date
US11441126B2 (en) 2022-09-13
CN108291237B (zh) 2023-11-21
JP7263005B2 (ja) 2023-04-24
US20220325249A1 (en) 2022-10-13
AU2016338680B2 (en) 2022-11-17
JP2024023419A (ja) 2024-02-21
AU2016338680A1 (en) 2018-05-10
JP2022036950A (ja) 2022-03-08
SG10202111851YA (en) 2021-12-30
JP2018534922A (ja) 2018-11-29
CA3001917A1 (en) 2017-04-20
CN117737124A (zh) 2024-03-22
SG11201802957PA (en) 2018-05-30
US20190218520A1 (en) 2019-07-18
EP3362570A4 (en) 2019-03-20
WO2017066634A1 (en) 2017-04-20
CN108291237A (zh) 2018-07-17
AU2023200879A1 (en) 2023-03-16
EP3362570A1 (en) 2018-08-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7516452B2 (ja) 改善された再プログラム方法及び細胞培養基盤
US10023879B2 (en) Minimal volume reprogramming of mononuclear cells
US20220325249A1 (en) Platform for the induction &amp; maintenance of ground state pluripotency

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right