SE534150C2 - Förfarande för differentiering av stamceller till celler av den endodermala och pankreatiska utvecklingslinjen - Google Patents

Description

534 150 2

[0005] Embryonala stamceller (singular: ESC, plural: ESCs) från primater och människor har isolerats och prolifererats i odling. Embryonala stamceller är stamceller som kan upprätthållas utan begränsning genom sj älvfórnyelse och prolíferation i odling, men som även kan bibehålla fórinågan att differentiera spontant till celler av flera olika utvecklingslinjer. I ickeselektiva förhållanden har det tidigare visats att ett brett urval av stamceller, inklusive mus och humana ESC kommer att differentiera spontant till celler av flera utvecklingslinjer inklusive den pankreatiska utvecklingslinj en. Det har tidigare visats att sådana differentierade celler kan uttrycka pankreatisk duodenal homeobox (PDXl)- gen, som är en transkriptionsfaktor som bestämmer den pancreatiska utveeklingslinjen och kan även uttrycka insulinhormonet.

Emellertid, utan selektiva förhållanden, kommer stamcellema att spontant differentiera till ett bredd urval av olika utvecklingslinjer och endast en liten andel av cellerna kommer att differentiera mot någon särskild utvecklingslinje.

[0006] Odlingssystem som möjliggör den spontana differentieringen av hESC till insulin-infárgande celler har rapporterats (Assady, S. et al., Insulin production by human embryonic stem cells. Diabetes 50, 1691-1697 (2001); och Segev, H. et al, Differentiation of human embryonic stem cells into insulin-producing clusters. Stem Cells 22, 265-274 (2004)). Dessa studier har dock varken studerad endoderrnmarköruttryck eller visat utveckling av celler som har stereotypa egenskaper av ß-celler: samtidig uttryck av C-peptid och pankreatisk duodenal homeobox (PDXl), som krävs for bildandet av pankreas och samaktiverar insulinpromotorn (Jonsson, J. et al., Insulin-promoter-factor 1 is required for pancreas development in mice. Nature 371, 606-609 (1994)). Eftersom icke-ß celler såsom neuronala celler kan uttrycka insulin (Sipione, S. et al., Insulin expressing cells from differentiated embryonic stem cells are not beta cells. Díabetología 47, 499-508 (2004)), och insulin närvarande i odlingsmediet kan tas upp i andra celltyper i vissa förhållanden in vitro (Raj agopal, J. e: al., Insulin staining of ES cell progeny from insulin uptake. Science 299, 363 (2003)), är det viktigt att det endoderrnala och pankreatiska ursprunget av insulin- infärgande celler som härstammar från hESC säkerställs. 534 150

[0007] Det rapporterades nyligen att spontan differentiering av humana ESCs producerade PDXl-l-/FOXA2+ celler och samtransplantation av dessa differentierade celler med mus dorsal pankreas (El3,5) resulterade i PDXl+/insulin+ celler, och saminfärgning av insulin och C-peptid observerades (Brolen, G. K. et al., Signals from the embryonic mouse pancreas induce differentiation of human embryonic stem cells into insulin-producing beta-cell-like cells. Diabetes 54, 2867- 2874 (2005)). Denna rapport visade att den pankreatiska utvecklingslinjens celler kan induceras från spontandifferentierande humana ESCs med hjälp av signaler som härstammar från embryonal pankreas. De experimentella förfarandena skulle dock vara opraktiska för att anpassas till en odlingsprotokoll med hög genomströmning och de molekylära signalemas natur avslöjades inte i denna studie. Dessutom, ickeselekterade stamcellspopulationer är tumorigena, vilken betyder att de kommer att framkalla icke- elakartade tumörer kända som teratomer i immundeñcienta djur på samma sätt som odifferentierade ES-celler gör.

[0008] Flera studier har utvärderat tillväxtfaktoremas effekter på human ESC differentiering till endoderrn (Schuldiner, M. et al., Effects of eight growth factors on the differentiation of ceils derived from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 97, 11307-11312 (2000) och D'Amour, K. A. et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endodenn. Nat. Biotechnol. 23, 1534-1541 (2005). Trots detta kan inte en sådan teknisk nivå som är reproducerbar, högt effektivt differentiering till pankreatiska prekursorer och öceller uppnås rutinmässigt. Dessutom är de insulin-producerande cellerna genererade med tidigare beskrivna förfaranden mindre responsiva till glukos (d.v.s. mindre funktionellt mogna) än vuxna humana betaceller och man tror att de har en fenotyp som är mer likt omogna betaceller.

Sammanfattningsvis visar dessa studier att ytterligare signaler kan vara nödvändiga för att omvandla endoderrn till pankreatiska progcnitorer och insulinuttryckande celler till mogna funktionella betaceller. Studier av tillväxtfaktorreglering av pankreasutveckling i embryomodeller kan ge viktiga insikter för riktande av hESC differentiering mot den pankreatiska utvecklingslinjen (Wells, J .M. & Melton, D.A. Early mouse endoderrn is patterned by soluble factors from adjacent germ layers. Development 127, 1563-1572 (2000)). Exempelvis, i höns-vaktel kimärsystem visades det att BMP4 inducerar pdxl- 534 150 uttryck i icke linjebestämd endoderm och noggin blockerar pdx] uttryck i linjebestämd endoderm (Kumar, M. et al., Signals from lateral plate mesoderm instruct endoderm toward a pancreatic fate. Dev. Biol. 259, 109-122 (2003)).

[0009] Förfaranden fór differentiering av humana ESC, eller andra humana pluripotenta celltyper, till pankreatiska eller pankreatiska öceller har diskuterats i patentlitteratur. Medan stamcellsodlingsteknikema skrider fram är dock förbättringar i teknikerna för odling av olika differentierade celltyper är nödvändiga för den slutliga kommersiella användningen av differentierade celler. De tidigare kända teknikerna som rapporterats för odlandet av humana ESC till celler av den pankreatiska utvecklingslinjen, medan de är lämpliga för studier i laboratorieskala kan inte lätt skalas upp till att pålitligt och konsistent producera stora antal av pankreatiska celltyper fór forskning eller för terapeutiska användningar. Därmed, en enkel, reproducerbar odlingsmetod som använder definierade komponenter som främjar öcellsdifferentiering från humana pluripotenta stamceller är en önskvärd bidrag till teknikområdet.

KORT SAMNIANFATTNIN G AV UPPFINNINGEN

[00010] Föreliggande uppfinning kan i breda drag sammanfattas som nya förfaranden fór direkt in vítro differentiering av humana pluripotenta stamceller till celler av den endodermala och pankreatiska utvecklingslinjen. Förfarandet innefattar att man odlar stamcellerna med en effektiv mängd av ett benmorfogenesprotein för att inducera differentiering i riktningen av mesendoderm. Dessa mesendodermceller odlas vidare för att bilda embryoida kroppar (singulär: EB; plural EBs) som under definierade förhållanden terminalt differentierar till celler av den pankreatiska utvecklingslinjen.

Genom att använda sig av definierade komponenter som främjar pankreatisk cellödifferentiering från humana pluripotenta stamceller tillhandahåller uppfmningens förfaranden en enkel, reproducerbar odlingsprotokoll som möjliggör storskalig produktion av pankreatiska celltyper för forskning eller terapeutiska användningar. [0001 1] l en besläktad aspekt inkluderar förfarandet odling av humana pluripotenta celler i en effektiv mängd av ett benmorfogenesprotein och en fibroblasttillväxtfaktor 534 150 för att inducera differentiering i riktning av mesendoderrn. Detta initiala odlingssteg är åtföljd av ytterligare odling av cellerna under definierade förhållanden för att inducera differentiering av celler till pankreatisk utvecklingslinje.

[00012] Ett ytterligare särdrag av de direkta differentieringsförfarandena som beskrivs häri är förmågan att isolera på stor skala endodennala och pankreatiska celler, såsom betaceller.

[00013] Förfarandena som beskrivs häri kan dessutom övervinna ett av de största hindren mot möjlig användning av stamcellshärledda celler för transplantation, den tumörbildande karaktären av odifferentierade stamceller. Dessa förfaranden kan användas för att härleda populationer av pankreatiska öceller som inte bildar teratomer vid transplantation i värdar.

[00014] I en aspekt beskrivs isolerade cellpopulationer härledda från humana pluripotenta stamceller som har linjebestämts till de mesendodermala och endodermala utvecklingslinjerna. Cellerna av denna utvecklingslinje kännetecknas av deras förmåga att differentiera vidare till pankreatiska öceller, lämpligen betaceller. I en besläktad aspekt, åtminstone 50 % av de tenninalt differentierade cellema av den pankreatiska utvecklingslinjen kännetecknas av deras förmåga att samtidigt uttrycka åtminstone en eller flera av insulin, C-peptid, och PDX1-markörer.

[00015] Om inte definierade på annat sätt, har alla tekniska och vetenskapliga termerna som används häri samma betydelser som vanligtvis uppfattas av en fackman inom denna uppfinnings teknikområde. Även om lämpliga förfaranden och material för utövandet eller testandet av föreliggande uppfinning beskrivs nedan, kan man använda även andra förfaranden och material, som är liknande eller ekvivalenta med den som beskrivs häri, som är välkända inom teknikområdet.

[00016] Andra syftesärdrag och fördelar av föreliggande uppfinning kommer att vara uppenbara från följande beskrivning.

KORT BESKRIVNING AV DE FLERTALIGA RITNINGARNA 534 150

[00017] FIG. 1 är ett flödesschema som sammanfattar det allmänna förfarandet av framställning av celler av pankreatisk utvecklingslinje från humana ES-celler.

[00018] FIG. 2, innefattande figurerna 2(a-f), visar en tidsfóljd av genuttrycken: (a) utsöndrade hCG-proteinnivåerna från odlingar av BMP4/bFGF-behandlade hESC; (b) human korionisk gonadotropin (hCG), (c) brachyury (T), (d) oct4, (e) sox17 och (i) foxa2.

[00019] FIG. 3, innefattande figurema 3(a-t) visar att BMP4-initierad mesendodermdifferentiering kännetecknad av uttryck av Brachyury, Foxa2 and Sox17.

Figurerna 3 (a-n) är mikroskopfotografier av BMP-4 behandlade hESCs och figurerna 3 (o-q) är mikroskopfotografier av obehandlade hESCs: (a) Homogena kolonier av hESC odlad på MEF i 4 dagar, (b) hESC odlade på MEF och behandlade med 50 ng/ml BMP4 i 4 dagar blir heterogena och visar en ändrad cellmorfologi (Stadium 1). (c-e) BMP-4 behandlade hESCs visar klustrar av brachyury (BRACH) positiva celler bland FOXA2-positiva celler. (f-h) F OXA2 celler saminfárgar med SOX17. (i-k) I BRACH-positiva cellklustrar i BMP4-behandlade hESCs saminfárgas många celler med OCT4. (l-n) Ingen saminfargníng av FOXA2 och OCT4 observeras. (o-q) Obehandlade hESCs infargas med OCT4, men inte med BRACH. Figurerna 3 (r-t): RT-PCR (r) och Q-PCR (s, t) visar förändringar i rnRNA-nivåerna av brachyury (T) och Foxa2. Storleksindikator för (a-b), 100 pm; for (c-q): 50 um.

[00020] FIG. 4, innefattande figurerna 4 (a-g) visar effekterna av BMP4- och bFGF- behandling av hESC pâ endodenn- och pankreasassocierad genuttryck och på EB- morfologi. Figurerna 4 (a) RT-PCR- och (b) Q-PCR-analys visar förändringar i uttryck av endodenn- (sox17, foxa2, pdxI) och pankreas-associerade (pdxI, glut2, insulin) gener vid EB14 för hESCs som antingen var obehandlade, behandlade med 50 ng/ml BMP4, eller behandlade med både 50 ng/ml BMP4 och 300 ng/ml Noggin. Figur 4 (c) visar mRNA-nivåer från antingen hESCs odlade på MEF behandlade med 50 ng/ml BMP4 eller hESCs odlade på MatrigelTM behandlade med endast 50 ng/ml BMP4, eller behandlade med både 50 ng/ml BMP4 och 100 ng/ml bFGF och analyserade vid EB14-stadiet. Figurerna 4 (d-g) är representativa faskontrastbilder av 14 dagars EB 534 150 suspensionsodlingar från obehandlade eller behandlade hESC enligt följ ande; (d) EB från obehandlade hESCs odlade på MEF; (e) EBs från BMP4-behandlade hESCs odlade på MEF; (t) EBs från BMP4-behandlade BMP4-behandlade hESCs odlade på MatrigelTM; (g) EBs från hESCs odlade på MatrigelTM behandlade med både BMP4 och bFGF. Storleksindikator, 100 um. [0002l] FIG. 5, innefattande figurema 5 (a-o), karakteriserar EBs eller stadium 2- celler. Figurema 5 (a-c) är diagram som visar uttrycksnivåer av endodenn och pankreas-associerade gener i hESC-härledda EB 14. Figurema 5 (d-o) visar immunofargning av EB14s där bFGF tillsattes under EB-stadiet och mer än 50 % av cellerna är infargade med PDX1.

[00022] FIG. 6 visar en tidsfórlopp av genuttryck efter sådd av intakta EB och odling i 14, 21 och 28 dagar i tillväxtfalrtorkomplementerat serumfritt ITSFNE-media (stadium 3). EBs var från obehandlade (-) eller BMP4-behand1ade(+) hESCs odlade på MEF: Uttrycket av gener som markerar tidig neural (soxl), mesendoderm (I), odifferentierade ESC (oct4), trofoblaster (human korionisk gonadotropin, hCG), defmitiv endoderrn (foxa2, pdxI), lever (tyrosin amínotransfefras, TA T), och cellö endokrina celltyper (ngn3, insulin, glucagon, glut2) analyserades med hjälp av RT- PCR.

[00023] FIG. 7, innefattande figurema 7 (a-p), är mikroskopfotografier som visar att PDX1+/insulin+ celler är närvarande i odlingar vid stadium 3, dvsxefier BMP4- behandling av odifferentierade celler, en 14 dagars EB-formningsperiod, och vidare differentiering av sådda EBs. Figurema 7 (a-c) visar att EBs sådda i ITSFNE-medium i 14 dagar visar saminfargriing av PDX1 och insulin. Figurema 7 (d-t) visar att de flesta PDXl-positiva celler inte längre saininfargar med KI67 vid denna stadium. Figurema 7 (g-i) visar större kluster av PDX1+ insulin+ saminfargande celler som uppkommer vid EB 144-28. Figurema 7 (j-l) visar att ingen PDX1- eller insulininfärgning observeras i odlingar som inte tidigare behandlats med BMP4. Figurema 7 (m-p) visar att cellema saminfargade med insulin, C-peptid och PDXl vid EBl4+2 8. Detta mönster är indikativ av normala betaceller. Storleksmarkör, 50 pm. 534 150 8

[00024] FIG. 8, innefattande figurema 8 (a-h), är mikroskopfotografier som visar att glukagon-positiva och somatostatin-positiva celler är närvarande vid EB l4+28 i odlingar som tidigare behandlats med BMP4. F igurerna 8 (a-d) visar att glukagon- positiva celler inte saminfärgas med C-peptid och PDX1, som skulle förväntas av normala vuxna alfaceller. F igurerna 8 (e-h) visar att somatostatin-positiva celler saminfärgas inte med C-peptid men några verkar saininfárgas med PDX1 som skulle förväntas av normala vuxna deltaceller. Storleksmarkör, 50 um.

[00025] FIG. 9 är ett diagram som visar hur olika koncentrationer av tillväxtfaktorer (BMP4 och bFGF) leder till olika utvecklingslinjer: (vänster) högt bFGF och lågt - BMP4 (eller med Noggin för att hämma endogena källor avBMP) bibehåller hESCs i odifferentierad status; (mitt) högt bFGF och medium BMP4 leder till differentiering till endodermala och pankreatiska utvecklingslirijeceller; och (höger) lågt bFGF och högt BMP4 leder till trofektoderrn/trofoblastceller.

[00026] FIG. 10, innefattande figurerna 10 (a-c), visar att MACS-sortering för EpCAM+ celler resulterar i berikning av odlingar för EpCAM och endoderm- och pankreas-associerade transkripter. (A) Differentierade hESC samuttrycker EpCAM (grön) och PDXl (röd). Nästan alla PDX1+ celler samuttrycker EpCAM; några EpCAM+ celler som inte saniuttrycker PDXl syns också. (B) Gånger-íörändring- värden från QPCR-analys av differentierade EpCAM-sorterade celler jämförda med osorterade celler från två oberoende försök. (C) FACS-analys av EpCAM-uttryck efter differentiering av hESC med BNlP4/bFGF-protokollet. Cellema analyserades före och efter MACS-sortering för EpCAM. Procentandelen EpCAM+ celler ökar från ~ 35 % till ~ 95 % åtföljande MACS-sortering för EpCAM.

{OOO27] FIG. ll är en tabell av Applied Biosystems TaqMan-analyser som användes för kvantitativ och icke-kvantitativ PCR-analys av genuttryck.

[00028] FIG. 12 är en tabell som listar primersekvenser som användes för kvantitativ och icke-kvantitativ PCR-analys av genuttryck. 534 150 DETALJERAD BESKRIVNING AV UPPFINNINGEN [0O029] Föreliggande uppfinning avser i breda drag nya förfaranden för direkt in vítro differentiering av pluripotenta stamceller från däggdjur till celler av den pankreatiska utvecklingslinjen. Förfarandena involverar odlande av stamcellema i närvaro av en effektiv mängd av benmorfogenesprotein för att inducera differentiering i riktningen av mesendoderm. Dessa mesendodermceller odlas vidare för att bilda embryoida kroppar (singulär: EB, plural: EBs) berikade för definitiva endoderm- utvecklingslinjebestämda celler, som i definierade förhållanden terminalt differentiera: till celler av den pankreatiska utvecklingslinj en. Genom att utnyttja definierade mediumkomponenter som främjar pankreatisk cellödifferentiering tillhandahåller de beskrivna förfarandena en enkel, reproducerbar tillvägagångssätt för att möjliggöra storskalig produktion av pankreatiska celltyper för forskning och terapeutiska ändamål.

[00030] I ett försök att bättre förstå förfarandena beskrivna häri och den vetenskapliga litteraturen som finns runtom, påpekas det att nyligen utkomna studier med humana embryoniska stamceller (singulär: hESC; plural: hESCs) har börjat fokusera på differentiering av definitiv endoderm som ett första steg mot utveckling av celler av pankreatisk utvecklingslinje. Andra har rapporterat i ämnet Activin A-induktion av definitiv endoderm från hESC (se D'Amour, K. A., et al. (2005)). Celler av pankreatisk utvecklingslinje inducerades dock inte med detta protokoll. Dessutom talar preliminära resultat från tester med Activin A (vid 5 ng/ml, 50 mg/ml eller 100 ng/ml) i serumfritt medium för att denna behandling kan inte ensam inducera pankreatisk celldifferentiering. Detta är inte överraskande med tanke på att det har visats att Activin A kan upprätthålla pluripotens av hESCs i frånvaro av feederceller (Beattie, G.M. et al, Activin A maintains pluripotency of human embryonic stem cells in the absence of feeder layers. Stein Cells 23, 489-495 (2005)). Andra hESC-studier som evaluerar pankreatisk diñerentiering har antigen varit icke konklusiva med avseende på ursprunget av insulin-infargande celler eller krävt en period av in vivo tillväxt i odefinierade förhållanden (Brolen. G.K. et al., (2005)). 534 150

[00031] Med syflet att identifiera odlingsförhållanden som främjar effektiv differentiering av ß-celler från hESC utfördes en serie av pilotfórsök för att pröva ett antal tillväxtfaktorer, cytokiner och utvecklingsmässigt relevanta molekyler, inklusive FGF4 (10 eller 50 ng/ml), retinoinsyra (l0'9 M), FGF 10 (10 ng/ml), activin A (5 ng/ml, 50 ng/ml eller 100 ng/ml), cyklopamin (1 uM eller 10 uM) och BMP4 (5 ng/ml, 50 ng/ml eller 100 ng/ml) vid olika stadiurnr av hESC differentiering. Av faktorerna som testades gav BMP4-behandling av hESCs odlade på MEF med stor marginal den starkaste fórstärkande effekten på pdx1-uttryck.

[00032] Den intercellulära signalmolekylen BMP4 är känt for att ha en viktig roll i ödesbestämningen och skapandet av utvecklingslinjer i embryogenesen. Flera studier hos andra däggdjur har visat att BMP4 hämmar tidig neurogenes i ESC-odlingar och främjar pankreatisk endodermspecificering från icke ödesbestämd endoderm (Kumar, et al., Signals from lateral plate mesoderm instruct endoderm toward a pancreatic fate.

Dev. Biol. 259, 109-122 (2003) och Finley, et al., BMP-4 inhibits neural differentiation of murine embryonic stem cells. J. Neurobiol. 40, 271-287 (1999)). På basis av dessa studier formulerade uppfinnarna hypotesen att BMP4 skulle kunna främja endodermal och pankreatisk differentiering från hESCs.

[00033] Återigen, genom experimentering, har uppfinnama visat att BMP4-behandling av hESCs främjar mesendodermdifferentiering och därefter understöder pankreatisk differentiering. Uppfinnarnas data, tillsammans med data från Xu et al., användes for att identifiera en doseffekt av BMP4 på hESCs. Det upptäcktes att behandling med 100 ng/ml ensam transformerar nästa alla cellerna till trofoblastceller, medan lägre doser kan rikta differentiering av hESCs till mesendoderrn och definitiv endoderm.

[00034] Det är känt att vissa induktiva händelser in vivo som medieras av rnesoderm- härledda embryonala vävnader (d.v.s. notochord, dorsala aortan, lamina lateralis mesoderm) spelar en viktig roll i mönsterformationen av icke ödesbestämd framtarm endodem och specificering av en pankreatisk öde (Wells, JM. & Melton, D.A. (2000); och Kumar, et al. (2003)). Uppfinnarna tror att effekter från andra cclltyper och groddblad kan vara nödvändiga for vidare mognad av endodermceller och produktion av PDXl+ celler från hESCs: Produktionen av pankreatiska celltyper från ESCs är 534 150 ll troligen en process med flera steg som sannolikt involverar de sekventiella stegen av induktion av definitiv endoderm, mönsterfonnation av endoderm och induktion av pankreasepitel, varav var och en kräver rätta signaler från omgivningen, såsom lösliga tillväxtfaktorer och cytokiner, och möjligen direkt kontakt med andra celltyper. [00O35] Andra rapporterar att PDX1+/FoxA2+ celler producerades när hESCs hade direkt kontakt med MEF och insulin-producerande celler producerades från PDXl+lFoxA2+ celler efter in vivo exponering till signaler från mus dorsal pankreas (Brolen, et al., (2005)). Å andra sidan reporterades det nyligen att i hög grad renade definitiva endodermala celler från mus inte uttryckte pankreatiska markörer efter korttidsodling (Tada, S. et al., Characterization of mesendoderm: a diverging point of the definitive endoderm and mesoderm in embryonic stem cell differentiation culture.

Development 132, 4363-4374 (2005)). På samma sätt visades det att renade odlingar av Activin A-inducerade hESC-härledda endoderrnalceller inte uttrycker pdx] och andra signaler kan vara nödvändiga (se D'Amour, et al., (2005)).

[00036] Tvärtom, uppfinnarna upptäckte att användning av medelhög nivå av BMP4 resulterar i antagande av en mesendodermal öde (brachyury+) av många celler. Den endodermala markören FoxA2 uppkominer under den initiala behandlingen av hESC med BMP4 och MEF eller med BMP4 och bFGF. Dessutom, F oxA2 uttryck gradvis ökar genom hela differentieringsprocessen och är förknippad med kanalliknande strukturer i EB. Efierföljande pclx] genuttryck och uppkomsten av PDXl+ celler skedde också under EB-fasen. Även om FoxA2 uttryck inte är unik för definitiv endoderm, talar ändå (1) närheten av cellerna till brachyury+ celler, (2) observerad saminfargning med Soxl7, (3) frånvaro av neurala markörer, såsom soxl, (4) låg mängd av trofoblastmarkörer i dessa EBs, och (5) samtidig uttryck av PDXl för att FoxA2+ cellerna sannolikt representerar pre-pankreatisk endodem eller endoderm- härledda cellpopulationer. Dessa resultat talar för att genom att använda ett procedur med flera steg involverande tidig BMP4-och bFGF-induktion av mesendodem med definierade odlingsbetingelser, som illustreras i FIG. 1, kan definitiva endodermala och pankreatiska utvecklingslinjeceller sckventiellt härledas från hESCs. 534 150 12

[00037] 1 enlighet därmed, i en bred utföringsform av uppfinningen, tillhandahåller förfarandet ett förfarande av att odla humana pluripotenta stamceller i ett medium innehållande en effektiv mängd av benmorfogenesprotein för att inducera differentieríng till mesendoderrnal riktning. Såsom det används häri, inkluderar pluripotenta stamceller från däggdjur primat- och företrädesvis humana embryonala stamceller (hESCs) enligt beskrivning av Thomson et al. (Science 2821145, 1998).

Dessa celler kännetecknas av deras förmåga att i lämpliga betingelser producera flera olika celltyper som är härledda från de alla tre groddbladen (endoderrn, mesoderrn, och ektoderm). Enligt en standardtest godkänt inom teknikområdet har dessa pluripotenta celler även förmågan att bilda en teratom i 8-12 veckor gamla SCID-möss.

[O0038] Enligt vissa aspekter av denna utföringsfonn odlas de pluripotenta stamcellerna på en gelatin-ytbelagd vävnadsodlingsyta med bestrålade mus embryonala fibroblaster (singulär: MEF; plural: MEFs) som feederceller. F eederceller är celler av en typ som samodlas med celler av en annan typ, för att tillhandahålla en omgivning i vilken cellerna av den andra typen kan växa. Längden av odlingstid för detta steg varierar från cirka 1 dag till cirka 10 dagar, föredraget 4 dagar. Inducerarna av benmorfogenes-signaleringsväg inkluderar men är inte begränsade till benmorfogenetiska proteiner (singulär: BMP; plural: BMPs), lämpligen BMP2 och BMP7 och mest lämpligt BMP4,

[00039] Såsom det används häri, en effektiv mängd av en BMP omfattar en koncentration från cirka 10 ng/ml till cirka 100 ng/ml. Det påpekas att medan högre doser av BMP4 har visats inducera differentiering av humana pluripotenta stamceller mot trofektoderrnala utvecklingslinj er, visas det häri att odlandet av stamcellskolonier med låga till intermediära mängder av BMP4, lämpligen 50 ng/ml, fungerar synergistiskt med MEF eller höga koncentrationer av bFGF, såsom 100 ng/ml, varvid differentiering av stamcellerna i mesendodermal riktning främjas.

[00040] Såsom det används häri, definieras mesendodermala celler genom, och är inte begränsade till, uttryck av Brachyury och Oct4 nukleära transkriptionsfaktonnarkörer (se stadium 1 i FIG. 1). Mesendodermala celler kan också kännetecknas av uttryck av 534 'l50 13 Wnt3 och FGF4 (D'Amour et al. 2005) och/eller goosecoid (Gsc), E-cadherin, Mixl l, och F oxA2, och möjligen Sox17 (Yasunaga et al. Nat. Biotechnol. 2005).

[00041] I den andra fasen av denna utforingsfonn induceras odlingama till att bilda embryoida kroppar från små pluripotenta stamcellskolonier i MEF-konditionerad medium. Lärnpligen är EBs intakta och omges av en lager av Visceral gulesäck (Visceral yolk sac, VYS) som uttrycker stadium-specifik embryonal antigen-IS (SSEA- 3). Längden av odlingstid för detta steg varierar från cirka 1 dag till cirka 4 veckor, föredraget 14 dagar. Såsom det används häri, EBs är tredimensionella strukturer av grupper av celler som interagerar på ett sådant sätt att de inducerar en vidare differentiering bland cellerna i EB (se stadium 2 i figur 1). Lämpliga EBs inkluderar definitiva endodermceller med rörliknande strukturer, som inkluderar celler som uttrycker Foxa2, Sox17 och PDX1. Man tror att dessa endodennala celler ger upphov till celler av den pankreatiska utvecklingslinjen Såsom det används häri inkluderar pankreatiska utvecklingslinjens celler exempelvis celler som samuttrycker PDXl och Nkx6.1, som är välkända för att representera antingen pankreatiska epitelprogenitorceller eller betaceller. Dessa celler är de enda två celltyperna i kroppen som uttrycker denna kombination av markörer eller PDXl, insulin, och C-peptid, som är välkända attvara samtidigt uttryckta i normala betaceller; eller celler som uttrycker somatostatin vilka i allmänhet anses representera deltaceller.

[00042] Celler inom EBs härledda från BlV[P4-behand1ade hESCs karakteriserades med hjälp av immunofärgning och kvantitativ PCR som innehållande en signifikant. delpopulation som samuttrycker både PDXl- och Nkx6. 1-markörema (se Fig. 4).

Några av cellerna verkar också uttrycka Ki67-markör vilket indikerar att de prolifererar. En annan delpopulation verkar vara kapabel till att ödesbestämmas till en terminalt differentierad endokrin utvecklingslinje.

[00043] I den trejde fasen av denna utforingsform sås cellema från EBs till vävnadsodlingsplattor i ett serumfritt medium (utan fetal kalvserum (FB S)) avsedd att inducera terminal differentiering till celler av den endokrina utvecklingslinj en. I denna steg varierar varierar längden av tid cellema odlas från cirka 7 dagar till cirka 56 dagar, lämpligen 28 dagar. Lämpliga terminalt differentierade celler kännetecknas av 534 150 14 det samtidiga uttrycket av insulin, C-peptid och PDXl. Andra celltyper av den endokrina utvecklingslinjen, såsom glukagon-uttryckande celler och somatostatin- uttryckande celler uppkommer också i denna sammanhang och i dessa regioner av odlingarna. En väsentlig del av PDXl+ cellerna vid dessa stadiumr (stadium 2 och stadium 3) kan ses samuttrycka cellytmarkören epitelial celladhesionsmolekyl (EpCAM).

[00044] Såsom det används häri betyder serumfritt medium serumfritt DMEM/F 12 (17,5 mM glukos) medium med ITS-tillsats (BD, 5 ug/ml insulin + 5 ug/ml transferrin + 5 ng/ml selensyra), 10 ng/ml FGF7 (R&D), 10 mM nikotinamid (Sigma), 10 nM exendin-4 (Sigma), och 2 g/L BSA (Sigma). På grund av detta benämns det serumfria mediet ITSF NE för insulin-transferrin-selen-FGF7-nikotinmide-exendin 4 (se stadium 3 i fig. 1). En lämplig koncentration för exendin-4 varierar från cirka 0,1 mM till cirka 1 mM. Dessutom kan koncentrationen av nikotinamid variera mellan cirka l och cirka mM.

[00045] Altemativt, i en besläktad och mer lämplig utföringsform kan de humana pluripotenta stamcellerna odlas initialt utan feederceller, lämpligen på MatrigelTM. När hESC odlas på Matrigel upptäckte uppñnnarna att utöver inducerare av den benmorfogenetiska signalvägen, en effektiv mängd av fibroblasttillväxtfaktorer (FGF) behövdes för att inducera cellerna till att differentiera i den mesendodermala riktningen. FGF-koncentrationen varierar från cirka 10 till cirka 200 ng/ml. En lämplig bFGF-koncentration är 100 ng/ml. Vid detta stadium upptäckte uppfinnama också att MEF och faktorcma de alstrar eller producerar kan ersätta FGFzs funktion i detta induktionsprotokoll. Att tillföra bFGF till odlingama vid stadium 2 leder till väsentligt fler celler av endodennala och pankreatiska utvecklingslinjerna, som uttrycker de tillbörliga markörerna. Mediet kan kompletteras med andra lämpliga fibroblasttillväxtfaktorer, såsom FGF2. För att karakterisera cellerna av dessa tre utvecklingsstadiumr, en RNA-expressionstidsförlopp för ett urval av endoderm- och pankreas-förknippade gener utfördes och beskrivs nedan.

[00046] I vissa utföringsforrner är uppfinningen också riktad mot förfaranden för att härleda cellpopulationer berikade i pankreatiska celler, lämpligen betaceller som inte 534 '150 bildar teratomer vid transplantation i värdar. I enlighet därmed, avses det att stadium 3 cellerna av pankreatisk utvecklingslinje kan göras icke tumörbildande genom att sortera celler på basis av cellytmarkörer såsom beskrivet i publicerad US-ansökan nr. 2005 0260749 av uppfinnarna. Specifikt, de differentierade cellerna sorteras på basis av positivt uttryck av den epiteliala celladhesionsmolekylen (EpCAM), en cellytmarkör vars uttryck kan användas för positivt selektion för att identifiera humana celler som är ödesbestämda till endodermala-, pankreatiska- eller framtarrn-utvecklingslinjerna. För att utföra denna selektion, vilken som helst instrument som är kapabel till att sortera enskilda celler såsom en fluorescensaktiverad cellsorterare (FACS) eller magnetaktiverad cellsortering (MACS) bör kunna anpassas för användning i denna sort av cellsorteringsprocedur. Med hjälp av EpCAM/ MACS selektionsprotokoll för att avlägsna odifferentierade celler som är kvar i senare odlingsstadiumr, men även genom att använda antikroppar till cellytmarkörer av odifferentierade stamceller såsom SSEA3 eller SSEA4, har uppfinnama upptäckt att den tumorigena tendensen av stamcellsodlingar kan minskas effektivt.

[00047] Det är klart från stamcellslitteraturen att vid injektion i immunokomprometterade möss kommer ickedifferentierade ES-celler att bilda teratomer, som är ickemaligna tillväxter eller tumörer som utgörs av många olika vävnadstyper i en dåligt organiserad struktur. Medan skapandet av teratomer inte anses vara livshotande för värden kan teratomerna växa till stor storlek, vara anskrämliga och slösande av metabolisk energi för värden. En karakterisering av teratomer bildade av humana ES-celler finns i Gertow et al., Stem Cells and Development, 132421-435 (2004). Om humana ES-celler ska slutligen användas för cell- eller vävnadstranslantation är det antagligen föredraget att cellerna som på ett sådant sätt tillförs kroppen ska vara fria av tumörbildande förmåga. Inom teknikområdet är huvudteknikerna som har beskrivits eliminera denna förmåga baserade på att sätta in exogena genkonstrukter i ES-cellema och att sedan selektera för differentierade celler på basis av uttryckskarakteristika av de introducerade generna. Användning av exogena genes insatta i humana ES-cellodlingar medför dock en annan uppsättning av säkerhetsproblem som helst ska undvikas. 534 150 16

[00048] Genom att kombinera cellytsorteringsteknologi med de direkta differentieringfórfarandena som beskrivs häri, förväntar uppfinnarna att på en praktisk nivå kunna producera stamcellsderiverade cellodlingar som inte är tumörbildande och som inte bildar teratomer. Trots risk av upprepning, och för att undvika missförstånd, är användningen av frasen tumörbildande avsedd att avse de teratom-bildande karakteristika av ickedifferentierade humana ickedifferentierade stamceller, såsom ES- celler och avses inte antyda malignitet av något slag. Detta på grund av att ES-cellema inte producerar typiska maligniteter vid injektion i möss. Avlägsnandet av det tumörbildande draget helt enkelt genom direkt differentiering och selektion är ett ytterligare viktigt steg i framskridandet av stamcellsderivat från laboratoriemodell till användbar human terapi.

[00049] I en annan utföringsforrn tillhandahåller uppfinningen en isolerad cellpopulation härstammande från humana pluripotenta stamceller som har tenninalt differentierade celler av den pankreatiska utvecklingslinj en. Åtminstone 50 % av denna cellpopulation uttrycker samtidigt ett eller flera av insulin, C-peptid och PDX1.

[00050] I en ytterligare annan utföringsforrn tillhandahåller uppfinningen en isolerad icketumörbildande cellpopulation härstammande från humana pluripotenta stamceller.

Denna cellpopulation har terminalt differentierade celler av den pankreatiska utvecklingslinjen, vari åtminstone 70 % av cellema samtidigt uttrycker ett eller flera av insulin, C-peptid, PDX1, NKX6.l och EpCAM, och vari cellema inte bildar teratomer vid injektion i immunokomprometterade möss. Eftersom dessa celler, lämpligen Beta-celler, utvecklas från odlingar som innefattar celler som har en fenotyp av endodermala (FoxA2 och Soxl7) och pankreatiska progenitorer (PDX1+, NKX6.l+ och insulin-proliferativa), förväntas det att de uttrycker andra markörer, såsom NKX2.2, NeuroD, Pax4 och Isll.

{O005 l] De följande exemplen tillhandahålls som ytterligare ickebegränsande illustrationer av uppfinningens specifika utföringsfonner. 534 150 17 EXEMPLEN

[00052] Exempel 1. Cellodling och differentiering

[00053] Det allmänna differentieringsfórfarandet illustreras på ett simplistiskt sätt i FIG. 1. NlH-godkända hESC-linj er H1(WA01) och H9 (WA09) användes mellan odlingsomgångarna 24 till 40. Medium for ickedifferentierade ESC utgjordes av 80 % DMEM/F 12 och 20 % Knockout serumersättning kompletterad med 1 mM L- glutamin, 1 % icke-essentiella aminosyror, 0,1 mM Z-merkaptoetanol och 4 ng/ml bFGF (alla från Invitrogen). hESCs odlades i 6-brunnsplattor på en feederlager av bestrâlade musembryofibroblaster (MEFs) i antingen ESC-media (kontrollgrupp), ESC-media plus 50 ng/ml BMP4 (BMP4-grupp; R&D Systems), eller ESC-media plus 50 ng/ml BMP4 plus 300 ng/ml noggin (noggin-grupp; R&D Systems) i 4 dagar.

[00054] I försök med MatrigelTM odlades hESCs på tillväxtfaktorfattig MatrigelTM (BD Biosciences) istället av MEF och odlingsmedia var MEF-konditionerad media (CM, kontrollgrupp), CM plus 50 ng/ml BMP4 eller CM plus 50 ng/ml BMP4 plus 100 ng/ml bFGF. Koloniema överfördes genom inkubation med 2 mg/ml dispas (Invitrogen), efter vilket cellerna skölj des från plattoma, pipetterades i små bitar, och filtrerades genom en 70 um cellfilter. Filtraterna som innehöll små bitar av kolonier sattes i 100 mm ickebehandlade suspensionsodlingsskål med CM på en skakapparat i 14 dagar for att bilda embryoida kroppar (EBs). EBs såddes sedan om i serumfritt DMEM/F-l2 (17.5 mM glukos) medium med ITS-tillsats (BD, 5 ug/ml insulin + 5 tig/ml transferrin + 5 ng/ml selensyra), 10 uM nikotinamid (Sigma), 10 ng/ml FGF7 (R&D), 10 nM exendin-4 (Sigma), och 2 g/L BSA (Sigma) i 14, 21 eller 28 dagar, och skördades därefter. En fraktion av varje odling användes for RT-PCR och Q-PCR och de kvarvarande cellerna antingen bäddades in i OCT (EB 14; Tissue-Tek) eller ñxerades på täckglas (EB 14 + 14, EB14 + 21 och EB14 + 28) för immunfárgning.

[00055] Exempel 2. Kvantitativ PCR och RT-PCR.

[00056] Cellulärt total-RNA extraherades med TriZol (Invitrogen). cDNA syntetiserades från 1 ug av total-RNA med hjälp av Superscript First-Strand Synthesis kit (Invitrogen). Kvantitativ realtids RT-PCR (Q-PCR) utfördes med hjälp av Assays- 534 150 18 on-demand reagenser (Applied Biosystems) på en ABI PRISM 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems) för följ ande transkripter: foxa2, sox17, brachyury, ngn3, PDX 1, insulin, glukagon, glut2, och en endogen kontroll, ß-aktin. Q- PCR utfördes enligt apparattillverkarens instruktioner. Relativ kvantiñering utfördes med hjälp av komparativ cykeltröskel (Cfl-förfarande som rekommenderas av tillverkaren. Gånger förändring beräknades som: ZMCT. Medel AACT-värden från Q- PCR-analyser jämfördes med hjälp av ickeparvis, tvåsvansad Students t-test. P-värden av < 0,05 betraktades som signifikanta.

[00057] För ickekvantitativ RT-PCR skapades oligonukleotidprimerpar mot humana transkripter med hjälp av Genbanksekvenser (se FIG. 12). Primers valdes från två olika exoner och sträckte sig över åtminstone en intronsekvens. PCR utfördes med hjälp av HotStarTaq DNA-polymeras (Qiagen) och reaktionsförhållandena var enligt följ ande: initial denaturering vid 95°C i 15 min, sedan cykler av 94°C i 30 s, 30 s vid hybridiseringstemperatur, 1 min vid 72°C, och en slutlig 10 min vid 72°C. Prirnrarna hybridiserades vid 53°C utom för pdxl (56°C), sox17 (55°C) och foxa2 (50°C; med Qiagens Q-lösning). Ett kontrollprov utan omvänd transkriptas (-RT) amplifierades med GAPDH-primrar i varje fall, och human vuxen pankreas RNA användes som en positiv kontroll.

[00058] Exempel 3. Immunofluorescensiärgning.

[00059] Immunofluorescensfárgning av täckglas utfördes som beskrivits tidigare (Kahan, B.W. et al., Pancreatic precursors and differentiated islet cell types from murine embryonic stem cells: an in vitro model to study islet differentiation. Diabetes 52, 2016- 2024 (2003)). De följande primärantikroppar användes i angivna spädningama: PDX1 kanin antimus serum 124000 (gåva från C. Wright); insulin mus monoklonal 10 ug/ml (ATCC No: HB 124); glukagon mus monoklonal l:2000 (Sigma); somatostatin mus monoklonal l:2000 (Novonordisk); Ki-67 mus monoklonal 1:25 (BD Pharmingen); C-peptid råtta monoklonal 123000 (BCBC 1921); Brachyury get antihuman 1:20 (R&D); OCT4 get antimus l:100 (Santa Cruz); Soxl7 get antihuman 534 150 19 1:40 (R&D); FOXA2 kanin antiråtta 1:4000 (gåva från R. Costa).

Sekundärantikropparna (get antimus IgG Alexa Fluor 488, l:2000; get antikanin Alexa Fluor 568, 1:4000; get antiråtta Alexa Fluor 488, l:2000; get antikanin Alexa Fluor 647, 1:4000; get antimus 568, l:2000; åsna antiget alexa Fluor 568, l:2000; åsna antimus Alexa Fluor 48 8, 112000) erhölls från Molecular Probes (Eugene, OR).

[00060] Exempel 4. Mesendoderminduktion genom behandling av hESCs med BMP4 på MEFs

[00061] Process av hESCs differentiering initierades genom att behandla hESCs med BMP4 på MEFs, som illustreras i allmänna drag i F IG. 1. Det är värt att lägga märke till att en tidigare studie visade att behandling av hESCs på MatrigelTM med 100 ng/ml BMP4 i 7 dagar förorsakar att nästan 100 % av cellerna differentierar till human koriongonadotropin (hCG)-uttryckande trofoblastceller (Xu, R.H. et al. BMP4 initiates human embryonic stem cell differentiation to trophoblast. Nature Biotechnology. 20, 1261-1264 (2002)).

[00062] Dessa resultat reproducerades också som illustreras i FIG.2, var efter 7 dagars behandling med endast BMP4 100 ng/ml på Matrigel producerade celltyper som i hög utsträckning uttryckte hCG och utsöndrade hCG-protein (FIG. 2a och b). I närmare detalj delades ickedifferentierade hESCs odlade på Matrigel (MG) i 7 grupper och behandlades med: (1) 10 ng/ml BMP4 (Bl0); (2) 50 ng/ml BMP4 (B50); (3) 100 ng/ml BMP4 (B100); (4) 10 ng/ml BMP4 + 100ng/ml bFGF (Bl0F); (5) 50 ng/ml BMP4 + 100 ng/ml bFGF (B50F); (6) 100 ng/ml BMP4 + 100 ng/ml bF GF (B100F); (7) kontroll (ctrl): utan några tillsatta tillväxtfaktorer -i 1 dag, 4 dagar och 7 dagar.

Som indikerats ovan ökade hCG-sekretion och genuttryck stort i B100-gruppen (FIG. 2a-b). Vid dag 7 var genomsnittlig hCG-sekretion 21000 mIU/ml i odlingsmediet och hCG-genuttryck visade en 13 000-faldig ökning jämfört med kontrollgruppen (statistisk analys i FIG. 2 är gjorda med värdenjämfört med första dagens kontroll i samma grupp). Lägre koncentration av BMP4 (10 ng/ml, 50 ng/ml) hade faktiskt inte samma grad av hCG-induktionseffekt. Å andra sidan, bFGF uppenbarligen hämmar hCG-induktionseffekten av BMP4. Till exempel, den genomsnittlige hCG-sekretionen vid dag 7 i B10-gruppen var 29 000 mIU/ml medan i BIOF-gruppen den var 51 534 150 mIU/ml (FIG. 2a). Samtidigt, uttryck av T inducerades i hög grad i BMP4/bFGF- behandlade hESCs på samma tidsberoende sätt (FIG. 2c). Induktionen nådde sin topp vid dag 4 i B IOF-gruppen med en 1000-faldig ökning och BSOF cirka 200-faldig ökning. Soxl 7 och fOxaZ-uttrycken var också förhöjda i BMP4/bFGF-behandlade hESCs (Fig. Ze-l). Oct4 uttryck å andra sidan var signifikant nedsatt särskilt i endast BMP4-behandlade grupper vid dag 4 (FIG. 2d).

[O0063] Uppfinnarna behandlade också odifferentierade hESCs med 50 ng/ml BMP4 i 4 dagar i närvaro av antingen MEFs eller bFGF (100 ng/ml). Denna behandling ändrade cellerna morfologiskt varvid obehandlade celler bibehöll ett homogent utseende, och behandlade celler blev heterogena och tydligt ändrade sin morfologi (FIG. 3a-b). BMP4-behandling resulterar i att några celler differentierar till Brachuyry+ celler, som är blandade med relativt sett färre FoxA2+ celler i samma cellkluster (FIG. 3c-e). Uppfinnama såg ett genomsnitt av l0 sådana kluster per 15 mm-täckglas i BMP4-behandlade odlingar, medan inga detekterades i obehandlade hESCs. Brachyury+ celler är även OCT4+ åtminstone övergående (FIG. 3i-k).

Däremot är FoxA2+ celler inte OCT4+ (FIG. 3 l-n), och nästan alla FoxA2+ celler är saminfärgade med Soxl 7 (FIG: 3f-h).

[00064] Figur 2 visar att i motsats till celler behandlade med endast BMP4 uttryckte celler behandlade med låga eller intermediära doser av BMP4 (10 ng/ml och 50 ng/ml) i 4 dagar inte hCG eller producera hCG-protein; istället uttryckte cellema väsentligt högre mängder av brachyury- och sox17-transkripter medan de uttryckte väsentligt lägre nivåer av Oct4-transkripter jämfört med kontrollceller vid samma tidpunkt (FIG. 2 c-e).

[00065] Cellema i odlingar som inte behandlats med BMP4 var OCT4+ men uttryckte inte Brachuyry (FIG: 3o-q). Dessa OCT4-infärgningsdata är samstämmiga med nyligen publicerade rapporter som visar att minskad OCT4-uttryck inducerar förlust av pluripotens och dedifferentiering till trofektoderm medan ökade OCT4-nivåer framkallar differentiering till primitiv endoderm och mesoderm (N iwa, H. et ah, Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self- renewal of ES cells. Nat. Gener. 24, 372-376 (2000)). Nivåerna av Brachyury- och 534 150 21 FoxaZ-transkripter stödjer infárgningsdata. Både ickekvantitativ (FIG. 3r) och kvantitativ RT-PCR (F ig 3 s och t) visar en ökning i brachyury och Foxa2-transkripter när odlingar på MEFs behandlas med Blvfl>4. Uppfinnarna såg en cirka 170-faldig ökning i brachyury genuttryck (FIG. 3s) och en ungefär 5-faldig ökning i foxa2 uttryck med BMP4-behandling (FIG. 3t). Tillsammans förutsäger dessa data att sekventiella serier av embryonala stadiumr uppstår från hESCs. Först uppstår celler som är brachyury+ eller samuttrycker brachyury och Oct4 (vilket möjligen motsvarar en övergångsfas), vilket motsvarar mesendoderm. Sedan genomgår cellerna en ytterligare snabb övergång inom några få dagar till att samuttrycka FoxA2 och Sox17, medan de förlorar brachyury-utnyck.

[00066] Exempel 5. Flera ytterligare nödvändiga komponenter för tidig celldífferentiering mot pankreatísk utvecklingslinje från hESCs in vitro identifieras.

[00067] För att ytterligare definiera odlingsförhållanden och mediatillsatser som främjar utveckling av pankreatiska celler från hESCs in vitro evaluerade uppfinnama behovet av MEFs under BMP4-behandlingsperioden. Hos celler behandlade med BMP4 som odlades .på MatrigelTM detekterades inte transskripter För någon av generna som studerades, inklusive brachyuzy, foxa2, pdx] och glut2 (F ig. 4c), medan de detekterades lätt i BMP4-behandlade celler odlade på MEFs. Dessutom var hEBs som härstamrnande från celler odlade på MEFs jämfört med MatrigelTM morfologiskt olika (FIG: 4d-g). Celler odlade på MatrigelTM resulterade i EBs som var mindre, mer kompakta och mer ogenomskinliga är EBs som härstammar från BMP4-behandlade celler odlade i närvaro av MEFs. Därmed har MEFs en viktig roll i pankreatisk utvecklingslinj ebestämning i detta protokoll.

[00068] Eftersom en hög concentration av bFGF nyligen har rapporterats ha en MEF- liknande effekt på tillväxten av hESCs (Ludwig, T.E., et al, Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat. Biotechnol. 24, 185-187 (2006) och Levenstein, M_E., et al, Basic FGF Support of Human Embryonic Stem Cell Self- Renewal. Stem Cells (2005)), undersökte uppfinnarna huruvida bFGF kunde ersätta MEFs i odlingsprotokollet. För att bestämma detta, 50 ng/ml BMP4 och 100 ng/ml 534 150 22 bFGF sattes till hESCs odlade på MatrigelTM i 4 dagar, sedan skördades cellerna för i genuttrycksanalys. Jämfört med obehandlade hESCs var brachyury-genuttryck 1000- fald större i BMP4- och bFGF -behandlade hESCs. EBs härstammande från BlVlP4- och bFGF-behandlade celler visade liknande inorfologier och nivåer av brachyury, foxaZ, pdxI och glut2 genuttryck jämförbara med EBs från hESCs odlade på MEFs och behandlade med BMP4 (FIG. 4c och 4e, 4g), vilket talar för bFGF spelar en tidig, essentiell roll i endodennspecificeringen och/eller celldifferentiering mot pankreatisk utvecklingslinje.

[00069] För att bestämma huruvida den induktiva effekten av BMP4 på mesendoderrnbildning från hESCs var beroende på kanonisk BMP-signalering prövade uppfinnama huruvida tillsättning av lösli gt noggin till odlingen kunde motverka effekten av BMP4-behandling. Genuttryck undersöktes vid EBl4 med hjälp av RT- PCR (Fig. 4a) och Q-PCR (Fig. 4b) efter behandling av hESCs i 4 dagar med antingen endast 50 ng/ml BMP4 eller BMP4 plus 300 ng/ml noggin. Den samtidiga tillsättningen av noggin och BMP4 kan helt blockera genuttryck av brachyury, sox] 7, foxa2, pdx] och glut2 i BMP4-behandlade hESC-odlingar. Effekten av noggin var dosberoende (data visas inte). Det är anmärkningsvärt att transkriptnivåema av foxa2 och glut2 i noggin-behandlade cellema var ännu lägre än i icke-BMP4-behandlade celler, vilket talar för att det finns en minimal BMP4-liknande effekt som finns i hESC mediet eller som alstras sj älva hESCs.

[00070] Exempel 6. Embryoidkropp (EB) suspensionsodling av BMP4- behandlade hESCs främjar celldifferentiering mot endodermala och pankreatiska utvecklíngslinjer.

[0007]] På basis av den definierade rollen av BMP4 i pankreasspecifikation i hönsembryos siktade uppfinnarna mot att bestämma huruvida BMP4 behandling skulle främja differentiering av rnesodennala och pankreatiska celler från hESCs. EBs bildades därför från antingen obehandlade hESCs eller hESCs behandlade med 50 ng/ml BMP4 i 4 dagar. Uppfinnarnas tidigare försök visade att differentiering genom en EB-stadium, i vilken induktiva vävnadsinteraldioner kan ske i tre dimensioner bland de tidiga embryonala groddbladen, positivt påverkar utveckling av celler av 534 '150 23 pankreatisk utvecklingslinje jänifört med differentiering under tvådimensionella förhållanden (Xu et al, Endoderm and pancreatic lineage differentiation from human embryonic stem cells, Cloníng and Stem Cells, 8, 96-107, (2006))).

[00072] Transkriptanalys visade ingen detekterbar pdx] -uttryck i obehandlade hESCs.

Efter att cellerna odlades som EBs i 14 dagar började pdxl mRNA uppkomma i kontrollgruppen. Jämfört med den obehandlade gruppen vid EB14 inducerade BMP4- behandling väsentlig uppreglering av gener inklusive soxI 7 (1 1-faldig),foxa2 (12- faldig), tat (7-faldig),pdx1 (22-faldig), brachyury (8-faldig) och glut2 (19-faldig).

Trots att brachyury-induktion av BMP4 var fortfarande signifikant när cellerna analyserades vid EB 14 (14-faldig) var ökningens storleksordning mycket mindre än vid ESC-stadiet (170-faldig, behandlade hESCs jämfört med obehandlade hESCs).

Uppfinnama observerade upprepade gånger BMP4-effekten i f1ertaliga(fler än 15) oberoende försök och med två olika hESC-linjer (H1 och H9).

[OOO7 3] I detta hänseende visar figurema 5 (a-c) uttrycksnivåema av endoderm- och pankreasförknippade gener i hESC-härstammande EB l4s. Figurerna 5 (b-c) visar att BMP4/bFGF-behandling inducerar väsentligt uttryck av endoderm och pancreas- förknippade gener i hESC-härstammande EBs efter 14 dagar av tillväxt (EB l4+BF jämfört med EB 14, kontroll). Dessutom ledde tillsats av 100 ng/ml bFGF under EB- stadiet (+P) till en reduktion i brachyurjf (T)-transkripter (a) å andra sidan och å andra sidan starkt förstärkt foxa2 och pdx] uttryckt (b och c); b) foxa2 transkriptnivåerna ökade från 219 gånger högre än odifferentierade hESCs (utan bFGF under EB-fasen) till 873 gånger högre än odifferentierade hESCs (med bFGF under EB-fasen), och c) pdx] transkriptnivåerna ökade från 26-faldig jämfört med odifferentierade hESCs (utan bFGF under EB-stadiet) till 312 gånger högre jäinfört med odifferentierade hESCs (med bFGF under EB-stadiet). Det är slående att medel delta Ct-värdet av pdx] från QPCR var 7,7 vilket är jämförbart med pdxI uttrycksnivân i humana cellöpreparater (cirka 50 % rena).

[00074] Dessutom visar figurerna 5 (d-o) immunofärgning av EB14s, där bFGF tillsattes under EB-stadiet och mer än 50 % av cellerna är infärgade med PDX1.

Infärgningama är mycket starka och lokaliserade i cellkärnan och cellerna är ofta 534 150 24 formade i klustrar. PDXl+ cellerna är inte saininfärgade med SOX17 antikroppen (FIG. Sd-f), några PDXl+ celler är dock saminfärgade med NKXól-antikroppen (FIG. 5 g-i). Några av PDXl+ cellerna är även Ki67+ (FIG. Sj-i), vilket talar för att det finns prolifererande PDXl+ celler.

[00075] Immunofargriing av EB14-celler visade också att hESCs kunde differentiera till mitotiskt aktiva pankreatiska progenitorceller som uttryckte PDX1 och Ki67 (FIG: Sj-l). Många PDXl+ celler sågs i den BMW-behandlade gruppen, varav de flesta var även Ki67+, vilket talar för att dessa celler var aktivt prolifererandc. Dessutom samuttryckte en väsentlig andel av cellema som uttryckte PDXl även Nkx6.l (FIG.

Sg-i) men flertalet uttryckte inte insulin vid detta stadium (FIG. 'Sm-o). PDXl/insulin i saminfargning börjar uppkomma vid EB 14 (FIG. Sm-o). Det är värt att lägga märke på att under EB-stadiet verkar bFGF främja en övergång från brachyury-uttryckande celler till pankreasutvecklingslinjebestämda celler.

[00076] Ovan nämnd konstellation av markörer talar för att cellerna representerar en pankreatisk progenitorstadium som liknar det prolifererande pankreatiska epitelet som växer och expanderar vid mitten av fosterperioden innan eller runt tiden för den sekundära övergången då de flesta betacellerna bildas. Dessutom sågs flertaliga F oxA2+ celler i kanalliknande strukturer, och några celler var även Ki67+. Dessa strukturer som bildades under EB-stadiet kan spela en viktig roll i induktionen av PDXl+ celler. Däremot, PDXl+ och FoxA2+ celler sågs inte vid dessa stadiumr av hESC-differentiering utan BMP4-behandling (data visas inte).

[00077] Serum är känt för att ha en hämmande effekt på differentiering av definitiv endodenn från ESCs (D'Amour, K.A., et al. (2005)) och utveckling av celler av pankreatisk utvecklingslinje (Gao, R., et ah, Characterization of endocrine progenitor cells and critical factors for their differentiation in human adult pancreatic cell culture.

Diabetes 52, 2007-2015 (2003)). Odlingar i vilka EBs sås med 15 % serum- innehållande medium visar en gradvis minskning av pdxI-uttryck, såväl som uttryck av andra endoderm- och pankreatisk utvecklingslinje-törknippade gener (Xu et al., Cloníng and Stem Cells, 2006). Däremot pdxI-transkriptnivåer bibehölls och/eller ökade i tillväxtfaktorkompletterad serumfritt medium. 534 'ISO

[00078] Exempel 7. Humana ESCs ger celler med PDXl/lNSULlN/C-PEPTID saminfárgning.

[00079] För att bestämma om BMP4-behand1ade hESCs har förmågan att bli fullständigt differentierade, hormoninnehållande pankreatiska öceller sådde uppfinnarna 14 dagars EBs på gelatiii-ytbelagda täckglas i serumfritt ITSFNE-medium för odling i ytterligare 14, 21 och 28 dagar. Transkriptionella profiler över denna tidsíörlopp bestämdes med hjälp av RT-PCR (FIG. 6) och Q-PCR. Efter sådd (EB14+14, EBl4+21 och EB l4+28), var endoderrn och pankreas-förknippade gentranskripter, inklusive foxaZ, pdxI, ngn3, insulin, glukagon och glut2 berikade i hög grad i BMP4-behandlade celler jämfört med obehandlade celler. Q-PCR-data visade de ökande transkriptnivåema av jbxa2 (18-, 21- och 37-faldig ökning over tídsförloppet EB 14+l4, EBl4+21 respektive EB l4+28, jäintört med obehandlad EB 14), pdx] ( 17 9-, 155- och 54l-faldig ökning) och glut2 (47-, 97- och 224-faldig ökning). Väsentligt, insulin- och glukagon-transkripter var inte detekterbara i obehandlade EB14-celler. [0O080] Däremot ökade insulin och glukagon mRNA-nivåerna i BMP4-behandlade odlingar dramatiskt över tiden. Q-PCR-reaktioncykler för insulin mRNA förändras från 50 (icke detekterbar) iEB14 obehandlade celler till 28, 27 och 25 cykler i BMP4- behandlade celler över tidstörloppet av post-EB-differentiering. För glukagon var förändringen från 46 cykler till 22, 21 och 20 cykler, i alla försök, ß-aktin cykeltiderna var cirka 15 cykler. I motsats till den ökande mängden av cellöhormontranskripter minskade brachyury mRNA kontinuerligt över tiden under dessa sena stadiumr och var inte väsentligt olika järntört med nivån i EB 14 obehandlade celler. Överensstämmande med tidigare studier med hESCs var trofoblastmarkören hCG uttryckt i BMP4-behandlade celler vid EB 14 (Xu, R.H., et al. (2002)), men inte i EBs som genererats från hESCs som inte hade behandlats med BMP4. Efter EBs såddes i serumfritt medium ökade hCG mRNA-nivåerna dramatiskt (FIG. 6).

[00081] Också samstämmigt med tidigare observationer i embryos och mESCs detekterades neuroektodermmakören sax] inte i BMP4-behandlade celler, medan den var inducerad i differentieringsodlingar som hade ínitierats med obehandlade hESC- 534 150 26 kolonier (FIG. 6). Dessa data talar för att: 1) serum-fria förhållanden främjar cellöhorrnon-genuttryck till bekostnad av trofoblastdifferentiering (t.ex. kvarhållen cellöhonnon-genuttryck över tiden jämfört med förlorad hCG genuttryck över tiden i serumfria förhållanden); 2) neural differentiering hämmas sannolikt av BMP4- behandling och/eller neurala prekursorer selekteras inte av BMP4-behandling, 3) serumfria förhållanden hindrar överlevnad och/eller expansion av Oct4-uttryckande odifferentierade celler, och 4) TAT-uttryckande celler, såsom leverceller stöds eller uppehålls inte av dessa serumfria förhållanden.

[00082] Samstämrnigt med genuttrycksresultat visar immunofargningsdata att BMP4- behandlade odlingar innehöll stora kluster av PDXl+ celler efter sådd. I motsats till PDXl+ funna i EBs sarninfargade de flesta cellerna inte längre med Ki67 (FIG. 7d-í), vilket talar för att cellerna hade påbörjat terminal differentiering. Cellema som saminfárgade för antingen PDXl eller insulin, eller PDXl, insulin och C-peptid uppkom inom de stora klustren av PDXl+ celler. Vid 14 efter EB-sådd visade 5 av 17 (29 %) EBs insulin+ celler som ökade över tiden så att vid 28 dagar efter sådd innehöll av 16 (63 %) av EBs insulin+ celler och det genomsnittliga antalet av positiva celler per EB ökade. Faktumet att uppfinnama observerade flertaliga insulin/C-peptid- immunofárgade celler, som alltid samuttrycker PDXl och är lokaliserade i PDXl+ klustren, såväl som en väsentlig ökning i insulin mRNA talar för ett fenotypiskt mönster kännetecknande av riktiga ß-celler. Glukagon+ och somatostatin+ celler samintärgade inte för C-peptid såsom skulle förväntas av vuxna endokrina celltyper.

Celler som infargar för antingen PDXl eller cellöhormoner observerades inte i kontrollgruppceller.

[00083] Exempel 8. EpCAM-baserad MACS-sortering ytterligade berikade odlingar för endoderm- och pankreasbestämda celler.

[00084] Uppfinnarna upptäckte att när BMP4/bFGF-behandlade odlingar färgas för EpCAM och PDX1 kan flertaliga cellkluster innehållande celler som samuttrycker båda markörer ses (FIG. lOa). Denna detektion tillhandahöll ett tillfälle för att preferentiellt selektera PDXl+ celler på basis av EpCAM-uttryck och MACS- sortering. För att testa denna hypotes märks celler som differentierats enligt 534 150 27 BMP4/bFGF-behandlingsprotokollet in med en anti-EpCAM-antikropp åttöljd av inmärkníng med en lämplig sekundärantikropp och sorteras. Efter EpCAM+ sortering av differentierad hESC-avkomma är transkriptnivåema av sox] 7 och foxa2 ökade, såväl som nivåerna av pdxI och EpCAM (FIG. 10b). I denna avseende kan MACS- sortering för EpCAM användas för att berika eller rena differentierade ESC-odlingar för att eliminera icke-endodermala celler som uppkommer som följd av ickeselektiva odlingsförhållanden. Sortering för EpCAM resulterar i en population i vilken ~ 95 % av cellerna är EpCAM+ (FIG. 7c). Uppfinnarna hypotiserar att genom att kombinera två eller flera sorteringsomgångar (selektering för EpCAM och avlägsnande av SSEA3 eller 4+ celler) kommer man att ytterligare berika odlingarna för endoderm / pankreatiska progenitorceller och samtidigt avlägsna odifferentierade, teratomabildande celler från odlingama.

[O0085] Sammantaget är uppfinningens förfaranden kapabla till att främja reprodueerbar differentiering av hESCs till celler som i hög grad påminner om betaeeller eller betaliknande celler. De differentierade cellerna är en lovande källa av pankreatiska betaeeller som kan användas till att behandla diabetespatienter.

Emellertid vet man mycket lite om cellulära och molekylära händelser som reglerar pankreatisk differentiering hos människor. Som sådan, beskrivs det häri flera komponenter av den direkta differentieringsprocessen som resulterar i pålitlig och robust induktion av PDXl-positiva celler och genererar cellkluster som samuttrycker PDXl och insulin/C-peptid. Hela differentieringsprocessen utförs in vítro i serumfritt medium. Det upptäcktes att mesendoderm, vilket markeras av tidig brachyury-uttryck induceras när hESCs behandlas med 50 ng/ml BMP4 och 100 ng/ml bFGF, och att endoderm och tidiga proliferativa celler av pankreatisk utvecklingslinje specificeras i EBs som framställs av dessa odlingar. Vidare differentiering sker efier cellerna överförs till serumfritt medium innehållande insulin, transferrin, selen, FGF7, nikotinamid och exendin-4. De in vítro-genererade pankreatiska cellema uttrycker PDX1 och C-peptid, kännetecknande av ß-eeller. Dessa rön från uppfinningen flyttar teknikområdet ett steg närmare mot produktion av pankreatiska ß-cellpopulationer lärnpliga för terapeutiska ändamål och främjar användning av humana pluripotenta stamceller som en in vitro modell av pankreasutveckling. 534 150 28

[00086] De isolerade populationerna av endodermala eller pankreatiska progenitorpopulationer kan förbättra terapi för vuxna. Till exempel kan dessa progenitorceller samtransplanteras med humana vuxna cellöar eller hepatocyter. Dessa progenitorpopulationer kan också transplanteras för sig, utan att först gå genom det terminala differentieringssteget. In denna terapeutiska strategi förväntas det att progenitorcellema kommer att differentiera i patienten till de önskade funktionella cellerna eller vävnaderna. Återbildande av hela vävnader kan också föreställas med utgångspunkt av sådana endodermala eller pankreatiska progenitorceller.

[00087] Beskrivning av varje patent, patentansökan och publikation som citeras häri inkorporeras härmed genom referens i sin helhet.

[00088] Det är underförstått att vissa adaptationer av uppfinningen som beskrivits i denna beskrivning är en fråga av rutinoptimering för fackmannen, och kan implementeras utan att lämna uppfinningens anda, eller de bifogade patentkravens omfång.

Claims (23)

534 150 27 PATENTKRAV

1. Förfarande för odling av humana pluripotenta stamceller för att producera celler av den pankreatiska utvecklingslinjen som innefattar stegen av att man: (a) odlar stamcellema i förhållanden som inducerar differentiering i mesendoderrnal riktning, vari förhållandena inkluderar närvaro av en effektiv mängd av benmorfogenesprotein; (b) odlar cellema från steg (a) i förhållanden som gynnar bildning av intakta embryoida kroppar, vari nämnda embryoida kroppar är omgivna av ett lager av visceral gulesäck; och (c) odlar cellema från de embryoida kropparna enligt steg (b) i förhållanden som gynnar terminal differentiering av cellema mot den pankreatiska utvecklingslinjen.

2. Förfarande enligt krav l, vari odlingsförhållandena i steg (c) inkluderar att man odlar embryoid kropp-cellerna i ett serumfritt medium innehållande insulin, transferrin, selen, FGF7, nikotinamid och exendin-4.

3. Förfarande enligt krav 1, vari mängden benmorfogenesprotein är i intervallet från omkring 10 ng/ml till omkring 100 ng/ml.

4. Förfarande enligt krav 1, vari benmorfogenesproteinet är BMP4.

5. Förfarande enligt krav 4, vari en effektiv mängd av BMP4 är omkring 50 ng/ml.

6. Förfarande enligt krav 1, vari stamcellerna av steg (a) är dessutom odlade i närvaro av en effektiv mängd av en fibroblasttillväxtfaktor för att inducera mesendodennal riktning.

7. Förfarande enligt krav 6, vari mängden ñbroblasttillväxtfalaor är i intervallet från omkring 10 ng/ml till omkring 200 ng/ml.

8. Förfarande enligt krav 7, vari fibroblasttillväxtfaktom är bFGF. 534 150 30

9. Förfarande enligt krav 8, vari den effektiva mängden av bFGF är omkring 100 ng/ml.

10. Förfarande enligt krav 1, som dessutom innefattar steget av att man (d) selekterar cellema av steg (c) som är positiva för uttrycket av den epiteliala celladhesionsmarkören (EpCAM) för att kvarhålla celler av pankreatisk utvecklingslinje som visar en minskning i tumorigenicitet.

11. ll. Förfarande enligt krav 10 vari selekteringen utförs genom magnetiskt aktiverad cellsortering.

12. Förfarande enligt krav 1, vari mesendodermcellema samuttrycker Oct4 och Brachyury (T) i enskilda celler.

13. Förfarande enligt krav l, vari de embryoída kropparna inkluderar definitiva endodermceller med kanalliknande strukturer som innehåller Foxa2+, Soxl 7+ och PDX1+ celler.

14. Förfarande enligt krav l, vari de terminalt differentierade cellerna samtidigt uttrycker insulin, C-peptid och PDXl.

15. Förfarande för att sekventiellt anrika en odling härstammande från humana pluripotenta stamceller med avseende på celler av endodermala och pankreatiska utvecklingslinjer, vilket förfarande innefattar stegen av att man: (a) odlar stamcellema i förhållanden som inducerar differentiering i mesendoderrnal riktning, vari förhållandena inkluderar närvaro av en effektiv mängd av en benmorfogenesprotein och fibroblasttillväxtfaktor; (b) odlar cellema från steg (a) i förhållanden som gynnar bildning av intakta embryoída kroppar, vari nämnda embryoída kroppar är omgivna av ett lager av Visceral gulesäck; 534 150 31 (c) odlar cellema från de embryoida kropparna enligt steg (b) i förhållanden som gynnar terminal differentiering av cellerna mot den pankreatiska utvecklingslinjen.

16. F örfarande enligt krav 15, vari odlingsförhâllandena i steg (c) inkluderar att man odlar embryoid kropp-cellema i ett serumfritt medium innehållande insulin, transferrin, selen, FGF7, nikotinamid och exendin-4.

17. Förfarande enligt krav 15, som dessutom innefattar steget av att man (d) selekterar cellerna av steg (c) som är positiva för uttrycket av den epiteliala celladhesionsmarkören (EpCAM) för att kvarhålla celler av pankreatisk utvecklingslinje som visar en minskning i tumorigenicitet.

18. Förfarande enligt krav 17 vari selekteringen utförs genom magnetiskt aktiverad cellsortering.

19. Förfarande enligt krav 15, vari en effektiv mängd av benmorfogenesprotein är i intervallet från omkring 10 ng/ml till omkring 100 ng/ml och en effektiv mängd av fibroblasttillväxtfaktor är i intervallet från omkring 20 ng/ml till omkring 200 ng/ml.

20. Förfarande för odling av humana pluripotenta stamceller för att framställa en cellpopulation av den pankreatiska utvecklingslinjen som inte har tumörbíldande egenskaper, vilket förfarande innefattar stegen av att man: (a) odlar stamcellema i förhållanden som inducerar differentiering i riktning av mesendoderm, vari förhållandena inkluderar närvaro av en effektiv mängd av en benmorfogenesprotein; (b) odlar cellema från steg (a) i förhållanden som gyrmar bildning av intakta embryoida kroppar, vari nämnda embryoida kroppar är omgivna av ett lager av Visceral gulesäck; (c) odlar cellema från EBs enligt steg (b) i förhållanden som gynnar terminal differentiering av cellema mot den pankreatiska utvecklingslinjen; och 534 150 32 (d) selekterar för uttryck av en cellytmarkör som indikerar linjebestämning till en särskilt differentierad utvecklingslinje, vari markören är EpCAM, varvid den resulterande cellodlingen inte bildar teratomer vid injektion till immunokomprometterade möss.

21. Isolerad cellpopulation enligt krav 20, steg (b), varvid de embryoida kropparna inkluderar definitiva endoderrnceller med kanalliknande strukturer som innehåller Foxa2+, Soxl7+ och PDXl+ celler.

22. Isolerad cellpopulation enligt krav 20, steg (c), varvid de differentierade cellerna samuttrycker PDXI i kombination med insulin och C-peptid.

23. Isolerad cellpopulation enligt krav 20, steg (d), varvid de differentierade celler uttrycker EpCAM och inte bildar teratomer vid injektion till immunokomprometterade möss.