JP6412868B2 - 多能性幹細胞の心室心筋細胞へのインビトロでの分化を誘導するための方法 - Google Patents

Description

技術分野
ある特定の態様では、本発明は、多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、ＰＳＣ）分化およびシグナル伝達の分野に関する。特定の実施形態では、本発明は、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で心室筋細胞（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｍｙｏｃｙｔｅ、ＶＭ）へのＰＳＣの分化を誘導する方法を伴う。

背景
哺乳動物では、心筋細胞（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ、ＣＭ）は、誕生する前に細胞分裂および増殖をすることができる。しかし、これらの増殖する能力は、誕生後、急速に低下する。成体ＣＭは一般に、増殖する能力が非常に乏しい。心筋梗塞などの心臓組織ネクローシスに関連する心臓疾患では、結果として起こる心機能の低下は、一般に非可逆性であり、その理由は、成体ＣＭは、増殖する自己の能力を失っており、壊死組織を修復することができないためである。薬物療法は、心筋収縮性を増大させ、血液を送り出す心臓の能力を改善するのに使用することができるが、心臓へのより重い負担がひいては状態を悪化させうる。正常ＣＭの移植による壊死細胞の交換は、心臓梗塞および同様の疾患または状態を処置するための方法の１つである。成体ＣＭは、増殖する能力をほとんどまったく有していないので、ヒトＣＭの源が、例えば、心筋梗塞を処置するための再生医療にとって明らかに必要とされている。

多能性幹細胞（ＰＳＣ）には、胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、ＥＳＣ）および人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、ｉＰＳＣ）が含まれる。Ｔｈｏｍｓｏｎ ＪＡら、Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９８年、２８２巻：１１４５〜１１４７頁；Ｙｕ Ｊら、Ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００７年、３１８巻：１９１７〜１９２０頁；およびＴａｋａｈａｓｈｉ Ｋら、Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ａｄｕｌｔ ｈｕｍａｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｂｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｆａｃｔｏｒｓ、Ｃｅｌｌ、２００７年、１３１巻：８６１〜８７２頁を参照。これらの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。これらの多能性幹細胞は、自己再生する強い能力を持つだけでなく、ＣＭに分化する潜在性も有する。したがって、効率的な心臓分化方法が確立される場合、ＰＳＣは、ＣＭの最も有望な細胞源の１つである。

一般に、ＰＳＣからのＣＭの分化を誘導するのに２つの方法が存在する。一方の方法では、ＰＳＣが懸濁液中で培養されて、ＣＭを含む多数の細胞型に分化する胚様体が形成される。他方の方法では、通常の培養条件下での単層ＰＳＣがＣＭに直接分化される。様々なサイトカインが、心臓分化の効率を改善することが報告されており、これらの投与量および作用の継続時間は、異なる分化システムに基づいて変動する。

ヒトＰＳＣ由来ＣＭは一般に、３つの主なタイプ：結節細胞、ＶＭ、および心房筋細胞（ａｔｒｉａｌ ｍｙｏｃｙｔｅ、ＡＭ）を含む。Ｈｅ ＪＱら、Ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｄｅｖｅｌｏｐ ｉｎｔｏ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｔｙｐｅｓ ｏｆ ｃａｒｄｉａｃ ｍｙｏｃｙｔｅｓ： Ａｃｔｉｏｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ、Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ．、２００３年、９３巻：３２〜３９頁を参照。その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。これらの機能的性質によれば、完全に成熟したＣＭは、作業ＣＭおよび自発拍動結節細胞（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｂｅａｔｉｎｇ ｎｏｄａｌ ｃｅｌｌｓ）に細分されうる。心房および心室の筋肉壁の大部分を構成するＡＭおよびＶＭを含めた作業ＣＭは、豊富な筋原線維を含有し、伝導性および興奮性の性質を持ち、心臓の収縮機能を遂行する。結節細胞は、心臓の拍動活動をコントロールする興奮性を自発的に生じさせる。作業ＣＭと同様に、結節細胞は、伝導性および興奮性の性質を持つが、一般に、収縮性を失っている。ＡＭ、ＶＭ、および結節細胞は、細胞内筋原線維の組成およびイオンチャネルタンパク質の細胞膜発現において著しい差異を呈し、これらの活動電位（ａｃｔｉｏｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ、ＡＰ）およびこれらの律動収縮において実質的な差異をもたらす。心臓疾患に対する細胞移植療法については、高純度の適切なサブタイプを伴った心筋細胞を移植することが本質的である。例えば、心室組織の修復は、高純度のＶＭの移植を必要とし、それは、細胞がレシピエントの心臓組織に順調に一体化し、心臓機能を改善し、移植細胞によって引き起こされる不整脈などの副作用を低減することができるかどうかを決定する。移植される心筋細胞のサブタイプが、これらが移植される組織のタイプとマッチしない、または移植されるＣＭの純度が十分でない場合、不整脈が起こり得、レシピエントの心臓の機能を損なう。体への血液供給を主に担う左心室は、最大の体積、最厚の筋肉壁、および最強のポンピング能力を有する。さらに、心筋梗塞は、左心室で主に起こる。したがって、ＣＭの３つのタイプの中で、ＶＭは、心筋梗塞の細胞移植療法にとって最も重要なものである。Ｃｈｅｎ ＨＳら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｏｆ ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｒｅｐａｉｒ、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、２００９年、１２０巻：２４９６〜２５０頁を参照。その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。

多数のヒトＣＭを得ることは、心臓疾患用薬物の開発、および薬物の心毒性の評価にとって重要である。ヒト成体ＣＭは、インビトロで増殖することができず、適切な実験的研究のための相当な数のヒトＣＭの欠如をもたらす。ほとんどすべての心毒性学的試験および心臓疾患用薬物の実験的研究は、動物または一次動物ＣＭを使用して実施される。ヒトＣＭと他の動物に由来するＣＭとの間のこれらの生理的差異のために、動物またはこれらのＣＭを使用してヒトに対する薬物の効果を予測する精度は、わずかに約６０％である。したがって、薬物開発における心臓関連分析の既存の方法に対する改善の必要性がある。幹細胞またはトランス分化に由来するヒトＣＭは、心毒性学的分析のためのツールを提供する。ＰＳＣ由来ヒトＣＭは、細胞レベルでの毒性学的分析のための方法を確立するのに使用することができる。これは、分析の精度を改善するだけでなく、動物の使用量も低減する。この手法は現在、バイオ製薬業界において広範に研究されている。薬物登録についての関連した国際規制および規定（ＩＣＨ Ｓ７Ｂ）は、心室、特に、心室心臓リズムに対する試験される薬物の効果を評価するための心毒性学的分析を要求している。したがって、ＣＭの３つのタイプの中で、ＶＭは、ヒトＣＭを使用する心毒性学的分析に関する新しい方法を開発するためのＣＭの最も重要なサブタイプである。Ｈａｒｔｕｎｇ Ｔ、Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｗｅｎｔｙ−ｆｉｒｓｔ ｃｅｎｔｕｒｙ、Ｎａｔｕｒｅ、２００９年、４６０巻：２０８〜２１２頁を参照。

要約すると、心筋梗塞の細胞移植療法または心毒性学的分析のために高度に均質な幹細胞由来ヒトＶＭを生成する必要性がある。したがって、心臓前駆細胞（ｃａｒｄｉａｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ、ＣＰＣ）のＶＭへの分化の基礎をなす制御機構を明らかにすることは、高度に均質なＶＭを生成するための重要な意義を有する。

幹細胞の心臓分化についての以前に報告された方法は、いくつかの欠点を有する。主な問題は、心臓分化の効率が低く、得られるＣＭが、結節細胞、ＡＭ、およびＶＭが混合した不均質集団であることである。Ｈｅ ＪＱら、Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ．、２００３年、９３巻：３２〜３９頁を参照。２００７年に、Ｍｕｒｒｙらは、ヒトＥＳＣの単層培養を使用して心臓分化を直接誘導した。ＣＭの平均分化効率は、約３０％であった。Ｌａｆｌａｍｍｅ ＭＡら、Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｐｒｏ−ｓｕｒｖｉｖａｌ ｆａｃｔｏｒｓ ｅｎｈａｎｃｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆａｒｃｔｅｄ ｒａｔ ｈｅａｒｔｓ、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２００７年、２５巻：１０１５〜１０２４頁を参照。その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。密度勾配遠心分離で分離および精製した後、得られたＣＭ集団は、純度がおよそ８０％であった。２００８年に、Ｋｅｌｌｅｒらは、懸濁培養を実施して胚様体を形成し、次いで蛍光活性化細胞分類によって分化の６日目にＣＰＣを単離した。これらの前駆細胞を連続的に培養し、分化させて、心臓分化効率は、有意に改善され、最大で５０％に到達した。Ｙａｎｇ Ｌら、Ｈｕｍａｎ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｄｅｖｅｌｏｐ ｆｒｏｍ ａ ｋｄｒ＋ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ−ｓｔｅｍ−ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２００８年、４５３巻：５２４〜５２８頁を参照。その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。しかし、上記方法のいずれも、ＰＳＣを高度に均質なＡＭまたはＶＭに直接分化させることができない。要約すると、これらの方法は、ＡＭまたはＶＭの定方向分化を促進せず、これらの方法を使用して得られる心筋細胞集団は、ＣＭの３つすべてのタイプの混合物である。現時点では、ＣＭの３つのサブタイプのそれぞれを特異的に分化させる方法についての関連した研究はまったくない。２００７年に、一研究により、ヒトＥＳＣのレンチウイルストランスフェクションが使用されて、心室特異的ミオシン軽鎖２ｖ（ｍｙｏｓｉｎ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ２ｖ、ＭＬＣ−２ｖ）遺伝子の保存されたプロモーターのコントロール下で高感度緑色蛍光タンパク質を発現する細胞系が樹立された。これにより、ＶＭの精製が促進され、９０％超の純度が実現された。しかし、この方法は、幹細胞のゲノム内に導入遺伝子を挿入することを必要とし、これらのトランスジェニックＣＭは、臨床移植用途に不適当である。２０１０年に、Ｍａらは、幹細胞の心臓分化の中期の間、すなわち、中胚葉細胞がＣＭに変換する期間中に（心臓分化の初期は、ＰＳＣから中胚葉細胞への分化の段階を指す）、レチノイン酸で処理すると、幹細胞のＡＭへの分化が誘導されることを発見した。同時に、レチノイン酸経路を阻害すると、その細胞をＶＭに分化させることが有効に誘導される。Ｚｈａｎｇ Ｑら、Ｄｉｒｅｃｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ａｔｒｉａｌ ａｎｄ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｍｙｏｃｙｔｅｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ ｒｅｔｉｎｏｉｄ ｓｉｇｎａｌｓ、Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．、２０１１年、２１巻：５７９〜５８７頁を参照。その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。しかし、心室分化の誘導における活性制御因子は、未知のままである。

Ｔｈｏｍｓｏｎ ＪＡら、Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９８年、２８２巻：１１４５〜１１４７頁 Ｙｕ Ｊら、Ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００７年、３１８巻：１９１７〜１９２０頁 Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｋら、Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ａｄｕｌｔ ｈｕｍａｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｂｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｆａｃｔｏｒｓ、Ｃｅｌｌ、２００７年、１３１巻：８６１〜８７２頁 Ｈｅ ＪＱら、Ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｄｅｖｅｌｏｐ ｉｎｔｏ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｔｙｐｅｓ ｏｆ ｃａｒｄｉａｃ ｍｙｏｃｙｔｅｓ： Ａｃｔｉｏｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ、Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ．、２００３年、９３巻：３２〜３９頁 Ｃｈｅｎ ＨＳら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｏｆ ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｒｅｐａｉｒ、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、２００９年、１２０巻：２４９６〜２５０頁 Ｈａｒｔｕｎｇ Ｔ、Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｗｅｎｔｙ−ｆｉｒｓｔ ｃｅｎｔｕｒｙ、Ｎａｔｕｒｅ、２００９年、４６０巻：２０８〜２１２頁 Ｈｅ ＪＱら、Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ．、２００３年、９３巻：３２〜３９頁 Ｌａｆｌａｍｍｅ ＭＡら、Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｐｒｏ−ｓｕｒｖｉｖａｌ ｆａｃｔｏｒｓ ｅｎｈａｎｃｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆａｒｃｔｅｄ ｒａｔ ｈｅａｒｔｓ、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２００７年、２５巻：１０１５〜１０２４頁 Ｙａｎｇ Ｌら、Ｈｕｍａｎ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｄｅｖｅｌｏｐ ｆｒｏｍ ａ ｋｄｒ＋ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ−ｓｔｅｍ−ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２００８年、４５３巻：５２４〜５２８頁 Ｚｈａｎｇ Ｑら、Ｄｉｒｅｃｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ａｔｒｉａｌ ａｎｄ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｍｙｏｃｙｔｅｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ ｒｅｔｉｎｏｉｄ ｓｉｇｎａｌｓ、Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．、２０１１年、２１巻：５７９〜５８７頁

説明
一態様では、本発明の目的は、インビトロでＰＳＣのＶＭへの分化を誘導する方法を提供することである。

この目的を実現するために、ある特定の実施形態では、提案される方法は、ＰＳＣの心臓分化の中期の間にＳｍａｄ１／５／８シグナル伝達経路を直接または間接的に活性化する因子でＰＳＣをインビトロで処理することによってＰＳＣのＶＭへの分化を誘導し、それによってＶＭに向けた定方向分化を実現する。ここで、ある特定の実施形態では、Ｓｍａｄ１／５／８シグナル伝達経路の活性化は、Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ５、およびＳｍａｄ８を含めた細胞質内の１種または複数のＳｍａｄタンパク質のリン酸化を含む。ある特定の実施形態では、心臓分化の中期は、中胚葉細胞または心臓前駆細胞からＣＭへの分化段階を指す。具体的には、ある特定の実施形態では、この段階は、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ（Ｔ）および／またはＭｅｓｐ１遺伝子の発現によって開始され、自発的に収縮することができるＣＭの分化の前に終わる。

前述の実施形態のいずれにおいても、ＰＳＣとして、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、胚性生殖細胞、または成体幹細胞を挙げることができる。前述の実施形態のいずれにおいても、これらの細胞は、ヒトまたは動物由来でありうる。

前述の実施形態のいずれにおいても、Ｓｍａｄ１／５／８シグナル伝達経路を直接または間接的に活性化する因子は、約０．０１から約１２００ｎｇ／ｍＬの間の最終濃度で適用される骨形成因子、例えば、ＢＭＰ２および／またはＢＭＰ４でありうる。

前述の実施形態のいずれにおいても、本方法は、ＰＳＣの心臓分化の初期の間、すなわちＰＳＣが中胚葉細胞または心臓前駆細胞に分化する段階の間にＣＭの分化を促進する１種または複数の因子を添加するステップを含みうる。一部の実施形態では、ＣＭの分化を促進する因子は、以下のうちの少なくとも１種を含みうる：ＢＭＰ４、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ｂＦＧＦ）、アクチビンＡ、ノギン、ドルソモルフィン、および６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（６−ｂｒｏｍｏｉｎｄｉｒｕｂｉｎ−３’−ｏｘｉｍｅ、ＢＩＯ）、またはこれらの組合せ。前述の実施形態のいずれにおいても、１種または複数の増殖因子を約０．０１〜約１２００ｎｇ／ｍＬの範囲の最終濃度で培養培地に添加することができる。前述の実施形態のいずれにおいても、１種または複数の小分子を約０．００１〜約１００μＭの範囲の最終濃度で添加することができる。

前述の実施形態のいずれにおいても、Ｗｎｔシグナル伝達経路の１種または複数の阻害剤も、心臓分化の中期の間に培養培地に添加することができる。前述の実施形態のいずれにおいても、Ｗｎｔ阻害剤は、以下のうちの少なくとも１種を含みうる：ｄｉｃｋｋｏｐｆホモログ１（ＤＫＫ１）、Ｗｎｔ産生の阻害剤（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ Ｗｎｔ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、ＩＷＰ）、およびＷｎｔ応答の阻害剤（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ Ｗｎｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅ、ＩＷＲ）、またはこれらの組合せ。前述の実施形態のいずれにおいても、阻害剤は、約０．００１〜約１００μＭの最終濃度で添加することができる。前述の実施形態のいずれにおいても、ＤＫＫ１は、約０．０１〜約１２００ｎｇ／ｍＬの最終濃度で添加することができる。

前述の実施形態のいずれにおいても、１種または複数の他の制御分子も心臓分化の中期の間に添加することができ、この他の制御分子としては、ｉ）レチノイン酸またはその前駆体を含まない培養培地へのレチノイン酸受容体（ＲＡＲγ）の活性化剤、ならびにｉｉ）レチノイン酸またはその前駆体を含有する培養培地へのＲＡＲαおよび／またはＲＡＲβのアンタゴニストが挙げられる。前述の実施形態のいずれにおいても、制御分子の最終濃度は、約０．００１〜約１００μＭでありうる。

いくつかの態様では、本発明は、３つの技術的解決策を提供する。

技術的解決策Ｉ：
（１）未分化ＰＳＣの懸濁または単層培養。
（２）心臓分化を開始するために、培養物に、ＣＭの分化を促進する１種または複数のサイトカイン（例えば、ＢＭＰ４、ｂＦＧＦ、アクチビンＡ、およびノギン）を添加する、および／またはＢＭＰ経路の小分子阻害剤（例えば、ドルソモルフィン）を添加する、および／またはＷｎｔ３ａシグナル経路を活性化する小分子（例えば、ＢＩＯおよびＣＨＩＲ９９０２１）を添加する。
（３）心臓分化の中期の間に、ＶＭへの細胞の定方向分化を誘導するために、培養培地に、１種もしくは複数の増殖因子および／もしくはＷｎｔシグナル伝達経路を阻害する小分子（例えば、ＤＫＫ１、ＩＷＰ、およびＩＷＲ）を添加し、ならびに／またはＳｍａｄ１／５／８リン酸化を活性化する１種もしくは複数のシグナル伝達分子（例えば、ＢＭＰ２および／もしくはＢＭＰ４）を添加する。一部の実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達経路の阻害剤およびＳｍａｄ１／５／８リン酸化の活性化剤は、実質的に同時に添加される。

技術的解決策ＩＩ：
（１）未分化ＰＳＣの懸濁または単層培養。
（２）心臓分化を開始するために、培養物に、ＣＭの分化を促進する１種もしくは複数のサイトカイン（例えば、ＢＭＰ４、ｂＦＧＦ、アクチビンＡ、およびノギン）を添加する、および／またはＢＭＰシグナル伝達経路の１種もしくは複数の小分子阻害剤（例えば、ドルソモルフィン）を添加する、および／またはＷｎｔ３ａシグナル経路を活性化することができる１種もしくは複数の小分子（例えば、ＢＩＯ）を添加する。
（３）心臓分化の中期の間に、Ｗｎｔシグナル伝達経路を阻害するために培養培地に１種もしくは複数の増殖因子もしくは小分子（例えば、ＤＫＫ１、ＩＷＰ、およびＩＷＲ）を添加し、ならびに／またはＳｍａｄ１／５／８リン酸化を活性化するシグナル伝達分子の細胞発現および分泌を活性化しうる１種もしくは複数の因子を添加する。例えば、ＲＡＲγ活性化剤（例えば、ＢＭＳ９６１）を、レチノイン酸またはその前駆体もしくは基質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）（例えば、ビタミンＡ）を含まない培養培地に添加することができる。これらのステップは、幹細胞のＶＭへの定方向分化を誘導する。

技術的解決策ＩＩＩ：
（１）実質的に未分化なＰＳＣの懸濁または単層培養。
（２）心臓分化を開始するために、培養物に、ＣＭの分化を促進する１種もしくは複数のサイトカイン（例えば、ＢＭＰ４、ｂＦＧＦ、アクチビンＡ、およびノギン）を添加する、および／またはＢＭＰ経路の１種もしくは複数の小分子阻害剤（例えば、ドルソモルフィン）を添加する、および／またはＷｎｔ３ａシグナル経路を活性化する１種もしくは複数の小分子（例えば、ＢＩＯ）を添加する。
（３）心臓分化の中期の間に、Ｗｎｔシグナル伝達経路を阻害するために、培養培地に１種もしくは複数の増殖因子もしくは小分子（例えば、ＤＫＫ１、ＩＷＰ、およびＩＷＲ）を添加する、ならびに／またはＲＡＲαおよび／もしくはＲＡＲβの１種もしくは複数のアンタゴニスト（例えば、ＲＡＲαについてＲｏ４１−５２５３、およびＲＡＲβについてＬＥ１３５）をレチノイン酸もしくはその前駆体を含有する培養培地に添加する。これらのステップは、幹細胞由来ＣＭの主にＶＭへの定方向分化を誘導する。

一部の実施形態では、分化の約１４日目から増殖因子不含培地が使用され、３日毎に置きかえられる。分化の約６０〜約９０日後に、分化ＣＭ中のＶＭのパーセンテージが、ＣＭのＡＰの分析（パッチクランプ技法によって記録される）、カルシウムイメージング試験、ならびに／またはフローサイトメトリー分析のためのＭＬＣ−２ｖおよび心臓トロポニンＴ（ｃａｒｄｉａｃ ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｔ、ｃＴＮＴ）二重免疫蛍光染色にて決定された。

一部の実施形態では、本発明は、前述の実施形態のいずれかの方法を使用して調製されるＶＭを心毒性学的分析および心臓疾患に対する薬物スクリーニングに適用することを可能にする。

一部の実施形態では、本発明は、前述の実施形態のいずれかの方法を使用して調製されるＶＭを、損傷した心臓組織を修復するための幹細胞療法に適用することを可能にする。

他の実施形態では、本発明は、ＶＭへの幹細胞分化を促進する方法を提供する。いくつかの態様では、本方法は、幹細胞に由来する中胚葉細胞におけるＳｍａｄ１／５／８シグナル伝達経路の活性化を含む。

前述の実施形態のいずれにおいても、幹細胞として、全能性幹細胞、多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、多能性幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、寡能性幹細胞（ｏｌｉｇｏｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、および／または単能性幹細胞を挙げることができる。

前述の実施形態のいずれにおいても、幹細胞として、ＥＳＣ、ｉＰＳＣ、胎児幹細胞、および／または成体幹細胞を挙げることができる。

前述の実施形態のいずれにおいても、幹細胞は、哺乳動物幹細胞を含みうる。

前述の実施形態のいずれにおいても、幹細胞は、ヒト幹細胞を含みうる。

前述の実施形態のいずれにおいても、幹細胞は、ヒトＥＳＣおよび／またはｉＰＳＣを含みうる。

前述の実施形態のいずれにおいても、中胚葉細胞への幹細胞分化は、以下のうちの少なくとも１種で未分化幹細胞を処理することによって誘導することができる：ｂＦＧＦ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、アクチビンＡ、ＢＭＰアンタゴニスト、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、もしくはＷｎｔ３ａシグナル伝達経路活性化剤、またはこれらの組合せ。

前述の実施形態のいずれにおいても、ＢＭＰアンタゴニストは、ＢＭＰ４アンタゴニストでありうる。前述の実施形態のいずれにおいても、ＢＭＰアンタゴニストは、ノギンでありうる。

前述の実施形態のいずれにおいても、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤は、ＢＭＰシグナル伝達経路の小分子阻害剤でありうる。

前述の実施形態のいずれにおいても、ＢＭＰシグナル伝達経路の小分子阻害剤は、ドルソモルフィンでありうる。

前述の実施形態のいずれにおいても、Ｗｎｔ３ａシグナル経路活性化剤は、Ｗｎｔ３ａシグナル伝達経路の小分子活性化剤でありうる。

前述の実施形態のいずれにおいても、Ｗｎｔ３ａシグナル伝達経路の小分子活性化剤は、ＧＳＫ−３α／βのＡＴＰ競合阻害剤でありうる。

前述の実施形態のいずれにおいても、ＧＳＫ−３α／βのＡＴＰ競合阻害剤は、細胞透過性ビス−インドロ（インジルビン）化合物でありうる。

前述の実施形態のいずれにおいても、細胞透過性ビス−インドロ（インジルビン）化合物は、ＢＩＯでありうる。

前述の実施形態のいずれにおいても、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、アクチビンＡ、ＢＭＰアンタゴニスト、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、および／またはＷｎｔ３ａシグナル伝達経路活性化剤は、約０．０１〜約１２００ｎｇ／ｍＬの最終濃度で添加され、一方、他の因子は、約０．００１〜約１００μＭの最終濃度で添加することができる。

前述の実施形態のいずれにおいても、幹細胞は、ＢＭＰ２および／またはＢＭＰ４で処理してＳｍａｄ１／５／８シグナル伝達経路を活性化することができる。

前述の実施形態のいずれにおいても、ＢＭＰ２および／またはＢＭＰ４は、約０．０１から約１２００ｎｇ／ｍＬの間の最終濃度で適用することができる。

前述の実施形態のいずれにおいても、幹細胞は、レチノイン酸またはその前駆体を含まない培地中で培養し、ＲＡＲγ活性化剤で処理してＳｍａｄ１／５／８シグナル伝達経路を活性化することができる。

前述の実施形態のいずれにおいても、レチノイン酸の前駆体は、ビタミンＡでありうる。

前述の実施形態のいずれにおいても、ＲＡＲγ活性化剤は、ＢＭＳ９６１、パロバロテン（ｐａｌｏｖａｒｏｔｅｎｅ）、および／またはＣＤ４３７（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入される）を含みうる。

前述の実施形態のいずれにおいても、ＲＡＲγ活性化剤は、約０．００１〜約１００μＭの最終濃度で適用されうる。

前述の実施形態のいずれにおいても、幹細胞は、１種または複数のＲＡＲαアンタゴニストおよび／またはＲＡＲβアンタゴニストで処理してＳｍａｄ１／５／８シグナル伝達経路を活性化することができる。

前述の実施形態のいずれにおいても、ＲＡＲαアンタゴニストは、Ｒｏ４１−５２５３、ＢＭＳ１９５６１４、またはＥＲ５０８９１であり得、ＲＡＲβアンタゴニストは、ＬＥ１３５でありうる。

前述の実施形態のいずれにおいても、ＲＡＲαおよび／またはＲＡＲβのアンタゴニストは、約０．００１〜約１００μＭの最終濃度で適用されうる。

前述の実施形態のいずれにおいても、幹細胞は、Ｗｎｔ阻害剤でさらに処理して、ＶＭへの分化を誘導することができる。

前述の実施形態のいずれにおいても、Ｗｎｔ阻害剤は、以下のうちの少なくとも１種でありうる：ＤＫＫ１、ＩＷＰ、またはＩＷＲ。

前述の実施形態のいずれにおいても、Ｗｎｔ阻害剤ＤＫＫ１は、約０．０１〜約１２００ｎｇ／ｍＬの最終濃度で使用することができ、一方、他の阻害剤は、約０．００１〜約１００μＭで使用することができる。

いくつかの態様では、本発明は、前述の実施形態のいずれかにおける方法に従って生成されるＶＭを開示する。

前述の実施形態のいずれにおいても、ＶＭは、心室特異的遺伝子発現の増加したレベルもしくは比、胚性心室様ＡＰ、および／またはＶＭ特異的Ｃａ^２＋活動の代表的な特徴（例えば、Ｃａ^２＋スパーク）を有しうる。

前述の実施形態のいずれにおいても、心室特異的遺伝子は、イロコイホメオボックス（Ｉｒｏｑｕｏｉｓ ｈｏｍｅｏｂｏｘ）遺伝子４（ＩＲＸ−４）および／またはＭＬＣ−２ｖでありうる。

他の実施形態では、本発明は、中胚葉細胞に分化した幹細胞であって、幹細胞におけるＳｍａｄ１／５／８シグナル伝達経路を活性化することができる外因性因子で処理した幹細胞を含有する組成物を提供する。

前述の実施形態のいずれにおいても、幹細胞におけるＳｍａｄ１／５／８シグナル伝達経路を活性化する外因性因子は、ＢＭＰ２および／またはＢＭＰ４でありうる。

前述の実施形態のいずれにおいても、幹細胞におけるＳｍａｄ１／５／８シグナル伝達経路を活性化する外因性因子は、ＲＡＲγ活性化剤でありうる。

前述の実施形態のいずれにおいても、幹細胞におけるＳｍａｄ１／５／８シグナル伝達経路を活性化する外因性因子はＲＡＲαアンタゴニストおよび／またはＲＡＲβアンタゴニストでありうる。

さらに他の実施形態では、本発明は、幹細胞からＶＭを得る方法であって、１）幹細胞をｂＦＧＦおよびＢＭＰ４で処理して分化を誘導するステップと、２）ｂＦＧＦおよびＢＭＰ４で処理した幹細胞をアクチビンＡに曝露して中胚葉細胞を誘導するステップと、３）中胚葉細胞に分化した幹細胞をノギンで処理してＣＭに向けた幹細胞分化の効率を改善するステップと、４）ノギンで処理した幹細胞におけるＳｍａｄ１／５／８シグナル伝達経路を活性化してＶＭの分化を促進するステップと、５）ノギンで処理した幹細胞を１種または複数の因子に曝露してＶＭへの幹細胞分化を誘導するステップとを含む、方法を提供する。いくつかの態様では、１種または複数の因子は、以下のうちの少なくとも１種を含む：ＤＫＫ１、ＩＷＰ、およびＩＷＲ。

前述の実施形態のいずれにおいても、幹細胞は、ＢＭＰ２および／またはＢＭＰ４で処理してＳｍａｄ１／５／８シグナル伝達経路を活性化することができる。

前述の実施形態のいずれにおいても、幹細胞は、レチノイン酸またはその前駆体、ビタミンＡを含まない培地中で培養することができ、培養細胞を１種または複数のＲＡＲγ活性化剤で処理してＢＭＰ２／４発現レベルを増加させることによってＳｍａｄ１／５／８シグナル伝達経路を活性化することができる。

前述の実施形態のいずれにおいても、幹細胞は、ＲＡＲαアンタゴニストおよび／またはＲＡＲβアンタゴニストで処理してＳｍａｄ１／５／８シグナル伝達経路を活性化することができる。

他の態様では、本発明は、前述の実施形態のいずれかにおける方法によって生成するＶＭを開示する。

いくつかの態様では、本発明は、それを必要とする被験体、例えば、心臓の損傷または疾患を有する被験体を処置するための医薬組成物であって、前述の実施形態のいずれかによる有効量のＶＭ、および薬学的に許容されるキャリアまたは賦形剤を含み、これらから本質的になり、またはこれらからなる、医薬組成物を提供する。いくつかの態様では、それを必要とする被験体に、前述の実施形態のいずれかによる有効量の医薬組成物を投与するステップを含む方法が本明細書で提供される。いくつかの態様では、それを必要とする被験体に、前述の実施形態のいずれかによる有効量のＶＭを投与するステップを含む方法が本明細書で提供される。

前述の実施形態のいずれにおいても、被験体は、ヒトでありうる。

前述の実施形態のいずれにおいても、本方法は、心臓の損傷、疾患、または状態の幹細胞療法において使用することができる。

一部の実施形態では、本発明は、心臓の損傷、疾患、または状態の処置および／または予防用の医薬を調製または製造するための、前述の実施形態のいずれかによるＶＭの使用を提供する。

一部の実施形態では、本発明はまた、心臓の損傷、疾患、または状態の処置および／または予防用の薬物をスクリーニングおよび／または開発するための、前述の実施形態のいずれかによるＶＭの使用を提供する。

他の実施形態では、本発明は、薬物安全性に関する心毒性学的分析のための、前述の実施形態のいずれかによるＶＭの使用を提供する。

さらに他の実施形態では、本発明は、ａ）前述の実施形態のいずれかによるＶＭを１種または複数の候補制御因子で処理し、ＶＭの機能に対する候補制御因子の効果を決定すること、および、２）候補制御因子で処理しないＶＭの機能を決定することによって、ＶＭの制御因子を同定する方法を提供する。候補制御因子で処理したＶＭの機能が、候補制御因子で処理しないＶＭの機能と異なる場合、その候補制御因子は、ＶＭの機能的制御因子として同定される。

一部の実施形態では、本発明は、インビトロでＰＳＣのＶＭへの分化を誘導する方法を提供する。いくつかの態様では、幹細胞の直接誘導に基づいて、Ｓｍａｄ１／５／８シグナル伝達経路を活性化することができる因子（例えば、ＢＭＰ２および／またはＢＭＰ４）は、心臓分化の中期の間に培養系に直接添加され、それによって幹細胞のＣＭへの分化が誘導される。いくつかの態様では、ＣＭは、主にＶＭである。レチノイン酸もしくはその前駆体（例えば、ビタミンＡ）を含有する培養系では、Ｓｍａｄ１／５／８シグナル伝達経路を活性化することができる因子（複数可）（例えば、ＢＭＰ２および／またはＢＭＰ４）を添加すると、ＣＰＣのＡＭへの分化を有効に阻害する一方、ＶＭに向けて分化を誘導することができる。一部の実施形態では、レチノイン酸またはビタミンＡがＳｍａｄ１／５／８シグナル伝達経路を活性化することができる因子（複数可）（例えば、ＢＭＰ２および／またはＢＭＰ４）とともに同時添加される場合、分化ＣＭの中でのＡＭの割合は、ＢＭＰ４の濃度の増加とともに減少する一方、分化ＣＭの中でのＶＭの割合は、ＢＭＰ４濃度の増加とともに増加する。いくつかの態様では、レチノイン酸もしくはその前駆体が培養培地に入れないで、ＢＭＰ２／４のみが心臓分化の中期の間に添加される場合、心臓前駆細胞は、ＶＭへの定方向分化を効率的に起こす。いくつかの態様では、幹細胞の心臓分化の中期の間に、培養培地にＲＡＲαまたはＲＡＲβの活性化剤を添加すると、初期マーカー遺伝子ＩＲＸ−４の心室特異的発現の阻害によって反映されるように、ＶＭの分化が有効に阻害される。いくつかの態様では、レチノイン酸またはその前駆体ビタミンＡの非存在下で、ＲＡＲγ活性化剤を添加すると、ＶＭへの幹細胞分化が有効に誘導される。いくつかの態様では、レチノイン酸またはビタミンＡを含有する培養培地では、ＲＡＲαアンタゴニストおよびＲＡＲβアンタゴニストの添加は、ＩＲＸ−４発現レベルを改善し、ＶＭへの幹細胞分化を誘導するのに有効である。

いくつかの態様では、本発明は、ＢＭＰおよびＳｍａｄ１／５／８経路は、幹細胞の心臓分化の中期の間にＶＭの分化を正に制御することを例示する。いくつかの態様では、本発明は、望ましい生物活性または機能を有する高度に均質なＶＭの生成を可能にする。

いくつかの態様では、一利点として、本発明は、いずれの精製ステップも必要としない。いくつかの他の態様では、本発明は、心臓前駆細胞のＶＭへの分化の基礎をなす制御機構を明らかにするプラットフォームを提供する。さらに他の態様では、本発明は、ヒト幹細胞由来ＣＭを使用する心筋梗塞の細胞移植療法ならびに薬物の研究および開発に対する重要な意義を有する。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
インビトロで多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）を維持する、増幅する、および／または培養するステップを含む、心室心筋細胞（複数可）への多能性幹細胞分化を誘導するための方法であって、Ｓｍａｄ１／５／８経路を直接または間接的に活性化することができる作用物質が、多能性幹細胞分化の中期で該多能性幹細胞の培養培地に添加され、該中期は、中胚葉細胞または心臓前駆細胞が心筋細胞に分化するときであることを特徴とする、方法。
（項目２）
前記多能性幹細胞が、ヒトまたは哺乳動物の胚性幹細胞または人工多能性幹細胞であることを特徴とする、項目１に記載の方法。
（項目３）
Ｓｍａｄ１／５／８経路を直接または間接的に活性化することができる前記作用物質が、最終濃度が０．０１〜１２００ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ２またはＢＭＰ４であることを特徴とする、項目１に記載の方法。
（項目４）
心筋細胞の分化を促進する１種または複数の因子が、多能性幹細胞分化の初期の間に前記培養培地に添加され、該初期が、多能性幹細胞が中胚葉細胞に分化するときであることを特徴とする、項目１から３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
心筋細胞の分化を促進する前記１種または複数の因子が、ＢＭＰ４、ｂＦＧＦ、アクチビンＡ、ノギン、ドルソモルフィン、およびＢＩＯのうちの少なくとも１種を含み、前記培養培地に添加される増殖因子の最終濃度が０．０１〜１２００ｎｇ／ｍＬであり、増殖因子以外の別の物質の最終濃度が０．００１〜１００μＭであることを特徴とする、項目４に記載の方法。
（項目６）
多能性幹細胞分化の前記中期で、前記培養培地にＷｎｔシグナル伝達経路の阻害剤を添加するステップをさらに含むことを特徴とする、項目１から３のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
Ｗｎｔシグナル伝達経路の前記阻害剤が、ｄｉｃｋｋｏｐｆホモログ１（ＤＫＫ１）、ＩＷＰ、およびＷｎｔ応答（Ｗｎｔｒｅｓｐｏｎｓｅ）の阻害剤（ＩＷＲ）のうちの少なくとも１種を含み、前記培養培地に添加されるＤＫＫ１の最終濃度が０．０１〜１２００ｎｇ／ｍＬであり、ＤＫＫ１以外の別の物質の最終濃度が０．００１〜１００μＭであることを特徴とする、項目６に記載の方法。
（項目８）
１種または複数の制御分子が、多能性幹細胞分化の前記中期の間に前記培養培地に添加され、前記１種または複数の制御分子が、ｉ）前記培養培地がレチノイン酸もしくはその前駆体を含有しないとき、レチノイン酸受容体（ＲＡＲγ）の活性化剤を含み、ならびに／またはｉｉ）該培養培地がレチノイン酸もしくはその前駆体を含有するとき、ＲＡＲαおよび／もしくはＲＡＲβのアンタゴニストを含み、
ｉ）の活性化剤、およびｉｉ）のアンタゴニストが０．００１〜１００μＭの最終濃度を有する
ことを特徴とする、項目６に記載の方法。
（項目９）
心臓の疾患または状態に対する薬物スクリーニングのための、項目１から８のいずれかに記載の方法によって得られる心室心筋細胞の使用。
（項目１０）
薬物開発における心毒性試験のための、項目１から８のいずれかに記載の方法によって得られる心室心筋細胞の使用。
（項目１１）
損傷した心臓組織を修復するための幹細胞療法のための、項目１から８のいずれかに記載の方法によって得られる心室心筋細胞の使用。
（項目１２）
心室心筋細胞（複数可）への多能性幹細胞分化を促進するための方法であって、幹細胞から分化した中胚葉細胞においてＳｍａｄ１／５／８シグナル伝達経路を活性化するステップを含む、方法。
（項目１３）
前記幹細胞が、多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、全能性幹細胞、多能性幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、寡能性幹細胞、または単能性幹細胞であることを特徴とする、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記幹細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、胎児幹細胞、または成体幹細胞であることを特徴とする、項目１２に記載の方法。
（項目１５）
前記幹細胞が哺乳動物幹細胞であることを特徴とする、項目１２に記載の方法。
（項目１６）
前記哺乳動物幹細胞がヒト幹細胞であることを特徴とする、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記幹細胞が、ヒト胚性幹細胞またはヒト人工多能性幹細胞であることを特徴とする、項目１２に記載の方法。
（項目１８）
前記幹細胞が、未分化幹細胞を塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、骨形成因子２（ＢＭＰ２）、骨形成因子４（ＢＭＰ４）、アクチビンＡ、ＢＭＰアンタゴニスト、ＢＭＰ経路阻害剤、およびＷｎｔ３ａ経路活性化剤のうちの１種または複数と接触させることによって、分化して中胚葉を形成していることを特徴とする、項目１２から１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記ＢＭＰアンタゴニストがＢＭＰ４アンタゴニストであることを特徴とする、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記ＢＭＰアンタゴニストがノギンであることを特徴とする、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記ＢＭＰ経路阻害剤が小分子ＢＭＰ経路阻害剤であることを特徴とする、項目１８に記載の方法。
（項目２２）
前記小分子ＢＭＰ経路阻害剤がドルソモルフィンであることを特徴とする、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記Ｗｎｔ３ａ経路活性化剤が小分子Ｗｎｔ３ａ経路活性化剤であることを特徴とする、項目１８に記載の方法。
（項目２４）
前記小分子Ｗｎｔ３ａ経路活性化剤が、ＧＳＫ−３α／βのＡＴＰ競合阻害剤であることを特徴とする、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
ＧＳＫ−３α／βの前記ＡＴＰ競合阻害剤が、細胞透過性ビス−インドロ（インジルビン）化合物であることを特徴とする、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記細胞透過性ビス−インドロ（インジルビン）化合物が、６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ）であることを特徴とする、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記培養培地に添加される増殖因子の最終濃度が０．０１〜１２００ｎｇ／ｍＬであり、増殖因子以外の別の物質の最終濃度が０．００１〜１００μＭであることを特徴とする、項目１８から２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記Ｓｍａｄ１／５／８経路が、前記幹細胞をＢＭＰ２および／またはＢＭＰ４と接触させることによって活性化されることを特徴とする、項目１２から２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
前記ＢＭＰ２および／またはＢＭＰ４が、０．０１〜１２００ｎｇ／ｍｌの最終濃度で使用されることを特徴とする、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記Ｓｍａｄ１／５／８経路が、レチノイン酸またはその前駆体を含まない培地中で前記幹細胞を培養し、該幹細胞をレチノイン酸受容体γ（ＲＡＲγ）のアゴニストと接触させることによって活性化されることを特徴とする、項目１２から２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
前記レチノイン酸前駆体がビタミンＡであることを特徴とする、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記ＲＡＲγアゴニストが、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ製のＢＭＳ９６１、パロバロテン、またはＣＤ４３７であることを特徴とする、項目３０または３１に記載の方法。
（項目３３）
前記ＲＡＲγアゴニストが、０．００１〜１００μＭの最終濃度で使用されることを特徴とする、項目３０から３２のいずれかに記載の方法。
（項目３４）
前記Ｓｍａｄ１／５／８経路が、前記幹細胞をレチノイン酸受容体α（ＲＡＲα）および／またはレチノイン酸受容体β（ＲＡＲβ）のアンタゴニストと接触させることによって活性化されることを特徴とする、項目１２から２７のいずれかに記載の方法。
（項目３５）
ＲＡＲαの前記アンタゴニストが、Ｒｏ４１−５２５３、ＢＭＳ１９５６１４、またはＥＲ５０８９１であり、ＲＡＲβの前記アンタゴニストがＬＥ１３５であることを特徴とする、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
ＲＡＲαおよび／またはＲＡＲβの前記アンタゴニストが、０．００１〜１００μＭの最終濃度で使用されることを特徴とする、項目３３から３５のいずれかに記載の方法。
（項目３７）
前記幹細胞をＷｎｔ阻害剤と接触させて該幹細胞を心室心筋細胞に分化させるステップをさらに含むことを特徴とする、項目１２から３６のいずれかに記載の方法。
（項目３８）
前記Ｗｎｔ阻害剤が、ｄｉｃｋｋｏｐｆホモログ１（ＤＫＫ１）、ＩＷＰ、およびＷｎｔ応答の阻害剤（ＩＷＲ）のうちの少なくとも１種を含むことを特徴とする、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記Ｗｎｔ阻害剤が、０．０１〜１２００ｎｇ／ｍｌの最終濃度で使用され、他の物質が、０．００１〜１００μＭの最終濃度で使用される、項目３７または３８に記載の方法。
（項目４０）
項目１２から３９のいずれかに記載の方法によって生成する心室心筋細胞。
（項目４１）
心室特異的遺伝子の上昇した発現レベル、胚性心室様活動電位（ＡＰ）および／または心室心筋細胞に一般的なＣａ ^２＋ スパークパターンを有する、項目４０に記載の心室心筋細胞。
（項目４２）
前記心室特異的遺伝子がＩＲＸ−４および／またはＭＬＣ−２ｖである、項目４１に記載の心室心筋細胞。
（項目４３）
幹細胞を含む組成物であって、該幹細胞が、分化して中胚葉を形成しており、該幹細胞におけるＳｍａｄ１／５／８経路を活性化する外因性作用物質で処理された、幹細胞を含む組成物。
（項目４４）
前記幹細胞におけるＳｍａｄ１／５／８経路を活性化する前記外因性作用物質が、ＢＭＰ２および／またはＢＭＰ４である、項目４３に記載の組成物。
（項目４５）
前記幹細胞におけるＳｍａｄ１／５／８経路を活性化する前記外因性作用物質が、ＲＡＲγアゴニストである、項目４３に記載の組成物。
（項目４６）
前記幹細胞におけるＳｍａｄ１／５／８経路を活性化する前記外因性作用物質が、ＲＡＲαおよび／またはＲＡＲβのアンタゴニストである、項目４３に記載の組成物。
（項目４７）
幹細胞から心室心筋細胞を生成するための方法であって、
１）幹細胞をｂＦＧＦおよびＢＭＰ４と接触させて幹細胞分化を開始するステップと、
２）ｂＦＧＦおよびＢＭＰ４によって処理された該幹細胞をアクチビンＡと接触させて中胚葉を形成するステップと、
３）分化して中胚葉を形成した前記幹細胞をノギンと接触させて該幹細胞の心臓分化効率を増強するステップと、
４）ノギンによって処理された前記幹細胞におけるＳｍａｄ１／５／８経路を活性化して心室心筋細胞形成を促進するステップと、
５）ノギンによって処理された前記幹細胞をＤＫＫ１、ＩＷＰ、およびＷｎｔ応答の阻害剤（ＩＷＲ）のうちの１種または複数と接触させて該幹細胞を心室心筋細胞に分化させるステップと
を含む、方法。
（項目４８）
前記Ｓｍａｄ１／５／８経路が、前記幹細胞をＢＭＰ２および／またはＢＭＰ４と接触させることによって活性化される、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記Ｓｍａｄ１／５／８経路が、レチノイン酸またはその前駆体を含まない培地中で前記幹細胞を培養し、該幹細胞をＲＡＲγのアゴニストと接触させることによって活性化される、項目４７に記載の方法。
（項目５０）
前記Ｓｍａｄ１／５／８経路が、前記幹細胞をＲＡＲαおよび／またはＲＡＲβのアンタゴニストと接触させることによって活性化される、項目４７に記載の方法。
（項目５１）
項目４７から５０のいずれかに記載の方法によって生成される心室心筋細胞。
（項目５２）
心外傷または心障害を処置するための医薬組成物であって、有効量の項目４０または５１に記載の心室心筋細胞、および薬学的に許容されるキャリアまたは賦形剤を含む、医薬組成物。
（項目５３）
被験体における心外傷または心障害を処置するための方法であって、そのような処置を必要とする、またはそのような処置が望ましい被験体に有効量の項目５２に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
（項目５４）
前記被験体がヒトである、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
幹細胞に基づく心臓修復療法に使用される、項目５３または５４に記載の方法。
（項目５６）
被験体における心外傷または心障害の処置および／または予防用の医薬を製造するための、項目４０または５１に記載の心室心筋細胞の使用。
（項目５７）
被験体における心外傷または心障害の処置および／または予防用の薬物をスクリーニングおよび／または開発するための、項目４０または５１に記載の心室心筋細胞の使用。
（項目５８）
薬物開発における心毒性試験のための、項目４０または５１に記載の心室心筋細胞の使用。
（項目５９）
心室心筋細胞のモジュレーターを同定するための方法であって、
１）項目４０または５１に記載の心室心筋細胞をモジュレーター候補と接触させ、該心室心筋細胞の性質に対する該モジュレーター候補の効果を測定するステップと、
２）該モジュレーター候補と接触させていない該心室心筋細胞の該性質を測定するステップと
を含み、該モジュレーター候補と接触させた該心室心筋細胞の該性質が、該モジュレーター候補と接触させていない該心室心筋細胞のものと異なる場合、該心室心筋細胞の該性質のモジュレーターとして該モジュレーター候補を同定する、方法。

図１は、幹細胞の心臓分化の中期の間にＢＭＰシグナル伝達経路に関与する分子の発現、および心室特異的マーカー遺伝子ＩＲＸ−４の発現に対する効果を示す図である。図１Ａは、心臓分化の５日目および６日目におけるＢＭＰ２、ＢＭＰ４、およびこれらの受容体の発現の逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＲＴ−ＰＣＲ）分析を示す。図１Ｂは、ＢＭＰ経路の下流シグナル伝達分子［リン酸化Ｓｍａｄ１／５／８（Ｐ−Ｓｍａｄ１／５／８）］のウエスタンブロット分析を示す。Ｔ−Ｓｍａｄ１／５／８は、総Ｓｍａｄ１／５／８タンパク質を表す。β−アクチンは、内部負荷対照の働きをした。図１Ｃ中のヒストグラムは、分化の１４日目におけるＩＲＸ−４遺伝子発現レベルの定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析の実験結果を提示する。結果は、分化の異なる段階中に１μＭレチノイン酸および２００ｎｇ／ｍＬ ＢＭＰ４で処理した細胞におけるＩＲＸ−４発現レベルを示す。結んだ線は、対応する誘導条件下での幹細胞の心臓分化効率を示す。Ｎは、ノギンを表し、Ｂは、ＢＭＰ４を表し、ＮＶａは、ビタミンＡ不含培地で培養した分化細胞を表し、ＲＡは、レチノイン酸を表し、数値は、濃度を表す（ＢＭＰ４についての単位はｎｇ／ｍＬである）。データは、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ＧＡＰＤＨ）の発現レベルと比較した相対値として表されている。

図２は、様々な処理で分化させた培養物の１４日目における心室特異的初期マーカー遺伝子ＩＲＸ−４の発現レベルの定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を提示する図である。図２Ａは、培養物にＢＭＰ４を様々な濃度で添加した後、ＩＲＸ−４発現レベルは、ＢＭＰ４の濃度の増加とともに上昇することを示す。しかし、発現レベルは、ＢＭＰアンタゴニスト、ノギンの添加により低下する。図２Ｂは、ＩＲＸ−４発現レベルが、レチノイン酸前駆体、ビタミンＡを含まない培地に様々な用量のノギンを添加することによって有効に低下することを例示する。図２Ｃは、１μＭレチノイン酸の存在下で、ＩＲＸ−４発現レベルが、培養物に添加されるＢＭＰ４の濃度の増加とともに上昇することを示す。図２Ｄは、レチノイン酸の存在下でのＢＭＰ４によるＩＲＸ−４発現レベルの上昇が、培養物中のノギンの漸増濃度の添加とともに低下することを示す。Ｎは、ノギンを表し、Ｂは、ＢＭＰ４を表し、ＮＶａは、ビタミンＡ不含培地中で処理した分化細胞を表し、ＲＡは、レチノイン酸を表し、数値は、濃度を表す（単位はｎｇ／ｍＬである）。定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果は、ＧＡＤＰＨの発現レベルと比較した相対値として示されている。

図３は、分化の１４日目におけるＩＲＸ−４遺伝子発現レベルの定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を提示する図である。結果は、心臓分化の５〜８日目に幹細胞を処理することによって、ＢＭＰファミリーの他のメンバーも、ＩＲＸ−４発現に対するレチノイン酸の阻害作用に有効に拮抗したことを示す。拮抗作用（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔ）は、漸増用量のＢＭＰファミリーメンバー増殖因子で増強される。ＲＡは、レチノイン酸を表し、数値は、増殖因子の濃度を表し（単位はｎｇ／ｍＬである）、レチノイン酸の濃度は、１μＭである。定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果は、ＧＡＰＤＨの発現レベルと比較した相対値として示されている。

図４は、レチノイン酸、ＢＭＰ４、およびノギンで別々に処理した、長期の培養物における心室特異的ＭＬＣ−２ｖ発現を示す図である。図４Ａは、レチノイン酸、ノギン、およびＢＭＰ４を様々な組合せで用いて処理した、分化の９０日目の幹細胞由来ＣＭにおけるＭＬＣ−２ｖ発現のウエスタンブロット分析を示す。図４Ｂは、レチノイン酸、ＢＭＰ４、およびノギンで処理した後の、分化の９０日目のＣＭ内におけるｃＴＮＴおよびＭＬＣ−２ｖの二重免疫蛍光染色の結果を提示する。図中の文字Ｂは、ＢＭＰ４を表し、ＮＶａは、ビタミンＡ不含培地中で培養された分化細胞を表し、ＲＡは、１μＭレチノイン酸を表し、数値は、濃度を表す（ｎｇ／ｍＬ）。

図５は、共焦点レーザー走査顕微鏡観察からの画像、ならびに分化ＣＭにおけるカルシウム活動のＡＰおよび様々なタイプのＣＭにおける特定のカルシウム活動パターンによる分化ＣＭの分類の同時の記録を提示する図である。図５Ａは、心室様ＡＰを有するＣＭにおけるＣａ^２＋スパーク、心房様ＡＰを有する細胞におけるＣａ^２＋トランジェント（Ｃａ^２＋ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）、および結節様ＡＰを有する細胞におけるＣａ^２＋オシレーション（Ｃａ^２＋ ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎ）の特徴を示す。図５Ｂは、ＡにおけるＣＭの様々なサブタイプのカルシウムシグナル伝達パターンによって分類された、異なる処理におけるＣａ^２＋スパーク、Ｃａ^２＋トランジェント、およびＣａ^２＋オシレーションを有するＣＭの割合を提示する。縦軸は、３つの異なるカルシウム活動を有するＣＭの割合を表し、ＲＡは、１μＭレチノイン酸を表し、文字Ｂは、ＢＭＰ４を表し、ＮＶａは、ビタミンＡ不含培地を表し、Ｎは、ノギンを表し、数値は、濃度を表す（ｎｇ／ｍＬ）。

図６は、分化の６日目にＲＡＲγ活性化剤で処理した細胞におけるＢＭＰ２発現の定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果は、ＧＡＰＤＨのものと比較した相対値として示されている。ＮＶａは、ビタミンＡ不含培地を表す。

図７は、幹細胞の心臓分化の中期の間にビタミンＡ不含培地に様々な制御因子（ＲＡＲ活性化剤または阻害剤）を添加した後の、幹細胞分化の１４日目における心室特異的ＩＲＸ−４発現の定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を示す図である。ＲＡは、レチノイン酸を表し、ＲＡｉは、レチノイン酸阻害剤、ＢＭＳ１８９４５３を表し、ＮＶａは、ビタミンＡ不含培地を表し、ＲＡＲパン−アンタゴニスト（ｐａｎ−ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）は、ＢＭＳ４９３である。定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果は、ｃＴＮＴ発現と比較した相対値として表現されている。

図８は、様々な分化条件下で分化した総心筋細胞集団内の異なるＡＰ特性を有する心筋細胞、およびＭＬＣ−２ｖ（成熟ＶＭ特異的マーカー遺伝子）発現細胞の割合を示す図である。図８Ａは、様々な誘導条件下で分化したＣＭにおける心房−、心室−、および結節−様ＡＰを有する細胞の割合を示す（ｎ＞３０）。図８Ｂは、様々な条件下で処理した９０日培養物の中の総心筋細胞集団（ｃＴＮＴ陽性細胞）におけるＭＬＣ−２ｖ発現細胞の割合についてのフローサイトメトリー分析を示す。ＲＡは、１μＭレチノイン酸を表し、Ｂは、ＢＭＰ４を表し、ＮＶａは、ビタミンＡ不含培地を表し、Ｎは、ノギンを表し、数値は、濃度を表す（単位は、ｎｇ／ｍＬである）。ＲＡＲγ濃度は、０．１μＭである。

図９は、本発明の実施例２（以下の）におけるインビトロでＰＳＣのＶＭへの分化を誘導するプロセスを例示する図である。

図１０は、本発明の実施例３（以下の）におけるインビトロでＰＳＣのＶＭへの分化を誘導するプロセスを例示する図である。

図１１は、本発明の実施例４（以下の）におけるインビトロでＰＳＣのＶＭへの分化を誘導するプロセスを例示する図である。

図１２は、レチノイン酸で処理した後の分化ＣＭにおけるｃＴｎＴおよびＭＬＣ−２ｖの二重免疫蛍光染色の結果を表す図である。

図１３は、レチノイン酸および２００ｎｇ／ｍＬ ＢＭＰ４で処理した後の分化ＣＭにおけるｃＴｎＴおよびＭＬＣ−２ｖの二重免疫蛍光染色の結果を表す図である。

図１４は、ビタミンＡ不含培地中で１２００ｎｇ／ｍＬノギンで処理した後の分化ＣＭにおけるｃＴｎＴおよびＭＬＣ−２ｖの二重免疫蛍光染色の結果を表す図である。

図１５は、実施例２（以下の）から得た分化ＣＭにおけるｃＴｎＴおよびＭＬＣ−２ｖの二重免疫蛍光染色の結果を表す図である。

図１６は、ビタミンＡ不含培地中で培養した後の分化ＣＭにおけるｃＴｎＴおよびＭＬＣ−２ｖの二重免疫蛍光染色の結果を表す図である。

図１７は、実施例３（以下の）から得た分化ＣＭにおけるｃＴｎＴおよびＭＬＣ−２ｖの二重免疫蛍光染色の結果を表す図である。

図１２〜１７において、「^＊」は、非心室ＣＭを示し、「＾」は、ＭＬＣ−２ｖ発現ＶＭを示す。

実施例
以下の実施例は、本発明を記述するために提供されているが、本発明の範囲を制限しない。別段の指定のない限り、実施形態で使用される技術用語は、市販されている材料を使用する当業者に公知の従来の用語である。

以下の実施例において、ヒトＥＳＣ系Ｈ７は、ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＵＳＡから購入し、Ｂ２７サプリメントおよびＲＰＭＩ１６４０培地は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入し、アクチビンＡ、ｂＦＧＦ、ＤＫＫ１、ＢＭＰ４、およびノギンは、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。

（実施例１）
心臓前駆細胞のＶＭへの分化の誘導におけるＢＭＰ／Ｓｍａｄ１／５／８シグナル伝達経路の役割
１）以前の研究により、幹細胞の心臓分化の間に、ＣＭのサブタイプを決定する分化段階で培養培地にレチノイン酸もしくはその前駆体（例えば、ビタミンＡ）を添加すると、幹細胞のＡＭへの定方向分化が誘導されることが示された。他方、培養培地にレチノイン酸阻害剤を添加し、または培養培地においてビタミンＡを除外すると、幹細胞のＶＭへの定方向分化が誘導される。Ｚｈａｎｇ Ｑら、Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．、２０１１年、２１巻：５７９〜５８７を参照。ＲＴ−ＰＣＲを使用して、分化したヒトＥＳＣにおけるＢＭＰ２／４およびそれらの対応する受容体の発現を、心臓分化の中期の間に分析した。図１に示したように、ＢＭＰ経路のリガンドおよび受容体はともに、培養細胞で発現する。ＢＭＰ２／４の下流のシグナル伝達分子（リン酸化Ｓｍａｄ１／５／８）のウエスタンブロット分析は、レチノイン酸を添加した培養条件下、およびレチノイン酸またはビタミンＡの非存在下で、Ｓｍａｄ１／５／８分子は、リン酸化されることを示した（図１）。これらの結果は、幹細胞の心臓分化の中期の間におけるＢＭＰ経路の活性化を実証した。これらの結果は、幹細胞分化の５〜８日目中に、ＢＭＰ経路は、心臓前駆細胞のＶＭへの分化を制御することに関与していることを示した。

２）ＣＭサブタイプの定方向分化におけるＢＭＰ経路の役割を、幹細胞の心臓分化中にさらに分析した。ＩＲＸ−４は、ＶＭの初期分化中に発現するマーカー遺伝子である。したがって、ＩＲＸ−４発現レベルを測定して、ＣＭサブタイプの分化におけるＢＭＰ経路の役割をさらに研究した。

図２に示したように、ビタミンＡ不含培地において、ＩＲＸ−４発現レベルは、分化の５日目〜８日目中に、ＢＭＰ２／４経路阻害剤、ノギンを添加することによって有効に低下した。ＩＲＸ−４の発現レベルは、ノギンの用量の増加（３００、６００、および１２００ｎｇ／ｍＬ）とともに減少した。

３）ＩＲＸ−４発現レベルは、分化の５日目〜８日目中にレチノイン酸を添加することによって抑制された。さらに、レチノイン酸を、分化の５日目〜８日目中に様々な用量のＢＭＰ４と同時に添加したとき、定量的ＲＴ−ＰＣＲによってＩＲＸ−４の発現レベルを測定すると、レチノイン酸で処理した培養物におけるＩＲＸ−４発現レベルは、ＢＭＰの添加によって上昇することが示された。ＢＭＰ４の用量が増加するにつれて、ＩＲＸ−４の発現レベルは、対応して増加した（図２）。

さらに、ＢＭＰファミリーの他のメンバーは、ＩＲＸ−４発現に対するレチノイン酸の阻害作用に拮抗する。ほとんどのＢＭＰファミリーメンバーは、同様の機能を有する。定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析（図３）は、心臓分化の中期の間に、ＩＲＸ−４発現レベルが、１μＭレチノイン酸の存在下で他のＢＭＰファミリーメンバーによって様々な程度に上昇することを示した。ＩＲＸ−４の発現レベルは、培地に添加されるこれらのＢＭＰファミリーメンバーの濃度の増加とともに増加した。

要約すると、分化させた培養物での初期の特異的ＩＲＸ−４発現の分析により、ＢＭＰシグナル伝達経路は、分化ＣＭにおけるＩＲＸ−４発現を有効に改善することが示された。この知見は、幹細胞の分化中に、ＢＭＰシグナル伝達経路は、ＶＭへの幹細胞の初期分化に関与し、このプロセスの促進に役割を果たすことを示す。

４）幹細胞からのＶＭの分化の制御におけるＢＭＰ経路の役割を検証するために、心筋細胞のカルシウム活動を、分化の６０〜９０日間において共焦点レーザー走査顕微鏡観察を用いて記録した。ＶＭ内のカルシウム活動は、ＡＭおよび結節細胞（ｎｏｄｅｌ ｃｅｌｌ）におけるものと明らかに異なる。ＶＭ内のカルシウム活動は、Ｃａ^＋スパークとして公知のより高いイメージング周波数（ｉｍａｇｉｎｇ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）を有する。ＡＭカルシウム活動のイメージングは、Ｃａ^＋トランジェントと呼ばれる、大きいシグナルを伴ったより低い周波数を示し、一方、結節細胞におけるカルシウム活動のイメージングは、Ｃａ^＋オシレーションと呼ばれる明らかな周期性を実証した。最初に、共焦点レーザー走査顕微鏡観察と併せて単一細胞パッチクランプ技法を使用して、心室様ＡＰを有する２０個の細胞におけるパッチクランプで記録されたカルシウム活動は、もっぱらＣａ^＋スパークを示すことが見出された。心房様ＡＰを有する２０個の細胞におけるパッチクランプで記録されたカルシウム活動は、もっぱらＣａ^＋トランジェントを示し、一方、結節様ＡＰを有する２０個の細胞におけるパッチクランプで記録されたカルシウム活動は、もっぱらＣａ^＋オシレーションを示す。したがって、ＣＭにおけるカルシウム活動のイメージパターンの比較は、ＡＭおよび結節細胞からＶＭを区別するのに有効な方法である。カルシウムイメージングデータは、レチノイン酸で処理した分化ＣＭの大部分は、Ｃａ^＋トランジェントを有し、一方、Ｃａ^＋トランジェントを有する細胞の割合は、ＢＭＰ４の濃度の増加とともに減少することを示した。対照的に、分化ＣＭの中でのＣａ^＋スパークを有する細胞の割合は、ＢＭＰ４の濃度の増加とともに増加した。この結果は、ＢＭＰシグナル伝達経路を活性化すると、幹細胞をＶＭに分化させることが有効に誘導されることを示す（図５）。

５）上述したように、ＣＭの初期分化の間に、ＩＲＸ−４は、分化ＶＭにおいて特異的発現を伴う重要な遺伝子である。ＣＭが成熟するにつれて、ＶＭは、ＭＬＣ−２ｖ遺伝子を特異的に発現し始める。したがって、様々な増殖因子で処理した後、培養の９０日目に、ＭＬＣ−２ｖ発現レベルを分化細胞において測定した。ウエスタンブロット分析は、９０日目の分化細胞におけるＭＬＣ−２ｖタンパク質発現レベルも、ＢＭＰ４の濃度の増加とともに増加することを示した（図４）。さらに、フローサイトメトリーを実施して、９０日目における分化ＣＭ（ｃＴＮＴ発現細胞）の中でのＭＬＣ−２ｖ発現ＶＭの割合を決定した。結果（図８）は、レチノイン酸で処理した後に分化細胞にＢＭＰ４を添加すると、分化ＣＭの中でのＭＬＣ−２ｖ発現細胞の割合が有効に増加し、最高の割合は、ＢＭＰ４処理単独によって得られることを示した。ＣＭのサブタイプを同定するための最も古典的な方法は、ＣＭのＡＰを測定することである。分化ＣＭの中での心房−、心室−、および結節−様ＡＰを有する細胞の割合を、レチノイン酸および様々な用量のＢＭＰ４で処理した後に分析した（図８）。レチノイン酸で処理した後の分化ＣＭの中で、心室様ＡＰを有する細胞の割合は、ＢＭＰ４の用量の増加とともに有意に増加した。ＢＭＰ４単独で処理した分化細胞の中で、ＣＭの９０％超が心室様ＡＰを有し、このことは、ＣＭの９０％超がＶＭであることを示した。

６）ＥＳＣの初期心臓分化の間にＢＭＰ２／４、アクチビンＡ、ｂＦＧＦおよび／またはノギンを添加し、心臓分化の中期の間にＤＫＫ１などの増殖因子を添加すると、幹細胞をＣＭに分化させることが効率的に誘導された。定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析により、心室特異的ＩＲＸ−４発現は、心臓分化の中期の間にＤＫＫ１とともにＲＡＲα活性化剤およびＲＡＲβ活性化剤を添加することによって低下することが示された（図７）。しかし、ＢＭＰ２およびＩＲＸ−４の高い発現は、ＲＡＲγ活性化剤とともにＤＫＫ１を添加することによって誘導された（図６および図７）。さらに、ビタミンＡ含有培地では、ＶＭにおける初期の特異的ＩＲＸ−４発現が、ＤＫＫ１ならびにＲＡＲαおよびＲＡＲのアンタゴニストの添加によって活性化された。これは、幹細胞のＶＭへの分化の誘導を示した。レチノイン酸は、３種のＲＡＲ受容体（ＲＡＲα、ＲＡＲβ、およびＲＡＲγ）を有するので、ビタミンＡまたはレチノイン酸の存在下でのＲＡＲαおよびＲＡＲβの同時阻害は、ＲＡＲγ単独の独立した活性化のものと同様の機構および効果を有する。

フローサイトメトリー分析（図８）により、心筋細胞集団（ｃＴＮＴ発現細胞）におけるＭＬＣ−２ｖ発現心筋細胞の割合は、ＲＡＲγによって誘導された分化の９０日目において最大で８０％に到達することが実証された。さらに、ＡＰの電気生理学的同定により、９０日目におけるＲＡＲγで誘導された分化ＣＭの９２％が心室様ＡＰを有することが示された。

（実施例２）
インビトロでのＰＳＣのＶＭへの分化の誘導（技術的解決策Ｉ）
ヒトＥＳＣ系Ｈ７を、ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃にて、Ｂ２７を補充したＲＰＭＩ１６４０培地中でゼラチン被覆ペトリ皿にて培養した。心臓分化のプロセスを図９に提示する。分化の最初の３日の間、分化培地は、アクチビンＡ（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＢＭＰ４（６ｎｇ／ｍＬ）、およびｂＦＧＦ（６ｎｇ／ｍＬ）を含有していた。３日目の最後に、培地にＢＭＰ２／４阻害剤、ノギン（３００ｎｇ／ｍＬ）添加して培地を交換した。５日目の最後に、培地をビタミンＡ不含Ｂ２７補充ＲＰＭＩ１６４０培地で置きかえた。Ｗｎｔ３ａ阻害剤、ＤＫＫ１（３００ｎｇ／ｍＬ）、およびＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍＬ）も、培地に添加した。８日目の最後に、培地を３００ｎｇ／ｍＬ ＤＫＫ１のみを含有する培地で置きかえた。１０日目の最後に、培地を増殖因子不含培地で置きかえた。その後、３日毎に培地をＢ２７含有ＲＰＭＩ１６４０培地で置きかえた。多数の拍動するＣＭが分化の１４日目に観察された。この技術的解決策のワークフローを図９に示す。

（実施例３）
インビトロでのＰＳＣのＶＭへの分化の誘導（技術的解決策ＩＩ）
ヒトＥＳＣ系Ｈ７を、ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃にて、１×Ｂ２７を含むＲＰＭＩ１６４０培地中でゼラチン被覆ペトリ皿にて培養した。心臓分化のプロセスを図１０に提示する。分化の最初の３日の間、分化培地は、アクチビンＡ（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＢＭＰ４（６ｎｇ／ｍＬ）、およびｂＦＧＦ（６ｎｇ／ｍＬ）を含有していた。３日目の最後に、培地をＢＭＰ２／４阻害剤、ノギン（３００ｎｇ／ｍＬ）を含有する分化培地と交換した。５日目の最後に、培地を、Ｗｎｔ３ａ阻害剤、ＤＫＫ１（３００ｎｇ／ｍＬ）、およびＲＡＲγ活性化剤、ＢＭＳ９６１（０．１μＭ、Ｔｏｃｒｉｓ）を含有するビタミンＡ不含Ｂ２７含有ＲＰＭＩ１６４０培地で置きかえた。８日目の最後に、培地を３００ｎｇ／ｍＬ ＤＫＫ１のみを含有する培地で置きかえた。１０日目の最後に、培地を増殖因子不含培地で置きかえた。その後、３日毎に培地をＢ２７含有ＲＰＭＩ１６４０培地で置きかえた。多数の拍動するＣＭが分化の１４日目に観察された。この技術的解決策のワークフローを図１０に示す。

（実施例４）
インビトロでのＰＳＣのＶＭへの分化の誘導（技術的解決策ＩＩＩ）
ヒトＥＳＣ系Ｈ７を、ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃にて、１×Ｂ２７含有ＲＰＭＩ１６４０培地中でゼラチン被覆ペトリ皿にて培養した。心臓分化のプロセスを図１１に提示する。分化の最初の３日の間、分化培地は、アクチビンＡ（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＢＭＰ４（６ｎｇ／ｍＬ）、およびｂＦＧＦ（６ｎｇ／ｍＬ）を含有していた。３日目の最後に、培地をＢＭＰ２／４阻害剤、ノギン（３００ｎｇ／ｍＬ）を含有する分化培地と交換した。５日目の最後に、培地を、Ｗｎｔ３ａ阻害剤、ＤＫＫ１（３００ｎｇ／ｍＬ）、ならびにＲＡＲαおよびＲＡＲβのアンタゴニスト、ＢＭＳ１９５６１４（０．１μＭ）、およびＬＥ１３５（０．５μＭ）をそれぞれ含有するビタミンＡ不含Ｂ２７含有ＲＰＭＩ１６４０培地で置きかえた。８日目の最後に、培地を３００ｎｇ／ｍＬ ＤＫＫ１のみを含有する培地で置きかえた。１０日目の最後に、培養培地を増殖因子不含培地で置きかえた。その後、３日毎に培地をＢ２７含有ＲＰＭＩ１６４０培地で置きかえた。多数の拍動するＣＭが分化の１４日目に観察された。この技術的解決策のワークフローを図１１に示す。

図１２は、レチノイン酸で処理した後の分化ＣＭにおけるｃＴｎＴおよびＭＬＣ−２ｖの二重免疫蛍光染色の結果を示す。

図１３は、レチノイン酸および２００ｎｇ／ｍＬ ＢＭＰ４で処理した後の分化ＣＭにおけるｃＴｎＴおよびＭＬＣ−２ｖの二重免疫蛍光染色の結果を示す。

図１４は、ビタミンＡ不含培地において１２００ｎｇ／ｍＬノギンで処理した後の分化ＣＭにおけるｃＴｎＴおよびＭＬＣ−２ｖの二重免疫蛍光染色の結果を示す。

図１５は、実施例２から得た分化ＣＭにおけるｃＴｎＴおよびＭＬＣ−２ｖの二重免疫蛍光染色の結果を示す。

図１６は、ビタミンＡ不含培地中で培養した後の分化ＣＭにおけるｃＴｎＴおよびＭＬＣ−２ｖの二重免疫蛍光染色の結果を示す。

図１７は、実施例３から得た分化ＣＭにおけるｃＴｎＴおよびＭＬＣ−２ｖの二重免疫蛍光染色の結果を示す。

図１２〜１７において、「^＊」は、非心室ＣＭを示し、「＾」は、ＭＬＣ−２ｖ発現ＶＭを示す。

共焦点レーザー走査顕微鏡観察を実施して、６０〜９０日間で実施例２および実施例３から得た分化ＣＭにおけるカルシウム活動を分析した。カルシウムイメージングの結果を図５に示す。この図から、総分化ＣＭの中でのＣａ^２＋スパークを有する細胞の割合を、直接計算することができる。

上記実施例では、培地中の該当する添加物の最終濃度の有効範囲は、増殖因子について０．０１〜１２００ｎｇ／ｍＬおよび小分子について０．００１〜１００μＭである。

いくつかの態様では、本発明で開示した方法により、生物学的に活性で機能的なＶＭが順調に生成される。これらの方法は、ＶＭへのＣＰＣ分化の制御機構を明らかにするのに使用することができ、一方、得られる分化ヒトＶＭは、心筋梗塞の細胞移植療法、心臓用薬物の毒性学的分析、および心臓用薬物開発において広範な用途を有する。

本発明を一般的な指示および具体的な実施形態とともに十分に記載してきたが、様々な変更および改変が当業者に明らかになることが留意される。したがって、本発明の本質から逸脱することなく本発明に対して行われる変更および改変は、特許請求した本発明の範囲内で保護されている。

産業上の利用可能性
いくつかの態様では、本発明は、インビトロでのＰＳＣのＶＭへの分化を誘導する方法であって、生物学的に活性で機能的なＶＭを順調に生成する、方法を提供する。これは、ＣＳＣからのＶＭの分化の基礎をなす制御機構を明らかにすることができるだけでなく、心筋梗塞の細胞移植療法、ならびに薬物安全性の心毒性学的分析、および心臓疾患に対する薬物開発において広い用途を有するヒトＶＭも生成することができる。

Claims (27)

1. 心室心筋細胞への多能性幹細胞分化を誘導するためのインビトロの方法であって、
   多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）を維持する、増幅する、および／または培養するステップと、
   Ｓｍａｄ１／５／８経路を直接または間接的に活性化することができる作用物質を、多能性幹細胞分化の中期で該多能性幹細胞の培養培地に添加するステップであって、該中期は、中胚葉細胞または心臓前駆細胞が心筋細胞に分化するときであるステップと、
   を含み、
   ｉ）該作用物質がＢＭＰファミリーのメンバーを含むか、または
   ｉｉ）該多能性幹細胞の該培養培地がレチノイン酸もしくはその前駆体を含有せず、該作用物質がレチノイン酸受容体γ（ＲＡＲγ）のアゴニストを含む、
   方法。
2. 前記多能性幹細胞が、ヒトまたは哺乳動物の胚性幹細胞または人工多能性幹細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. Ｓｍａｄ１／５／８経路を直接または間接的に活性化することができる前記作用物質が、最終濃度が０．０１〜１２００ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ２またはＢＭＰ４であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
4. 心筋細胞の分化を促進する１種または複数の因子が、多能性幹細胞分化の初期の間に前記培養培地に添加され、該初期が、多能性幹細胞が中胚葉細胞または心臓前駆細胞に分化するときであることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
5. 心筋細胞の分化を促進する前記１種または複数の因子が、ＢＭＰ４、ｂＦＧＦ、アクチビンＡ、ノギン、ドルソモルフィン、およびＢＩＯのうちの少なくとも１種を含み、前記培養培地に添加される増殖因子の最終濃度が０．０１〜１２００ｎｇ／ｍＬであり、増殖因子以外の別の物質の最終濃度が０．００１〜１００μＭであることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
6. 多能性幹細胞分化の前記中期で、前記培養培地にＷｎｔシグナル伝達経路の阻害剤を添加するステップをさらに含むことを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
7. Ｗｎｔシグナル伝達経路の前記阻害剤が、ｄｉｃｋｋｏｐｆホモログ１（ＤＫＫ１）、ＩＷＰ、およびＷｎｔ応答（Ｗｎｔｒｅｓｐｏｎｓｅ）の阻害剤（ＩＷＲ）のうちの少なくとも１種を含み、前記培養培地に添加されるＤＫＫ１の最終濃度が０．０１〜１２００ｎｇ／ｍＬであり、ＤＫＫ１以外の別の物質の最終濃度が０．００１〜１００μＭであることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
8. レチノイン酸受容体γ（ＲＡＲγ）の前記アゴニストが０．００１〜１００μＭの最終濃度を有することを特徴とする、請求項６に記載の方法。
9. 心室心筋細胞への多能性幹細胞分化を促進するためのインビトロの方法であって、幹細胞から分化した中胚葉細胞または心臓前駆細胞においてＳｍａｄ１／５／８シグナル伝達経路を活性化するステップを含み、
   該Ｓｍａｄ１／５／８経路が、
   （ｉ）該中胚葉細胞または心臓前駆細胞をＢＭＰファミリーのメンバーと接触させること、または
   （ｉｉ）該中胚葉細胞または心臓前駆細胞をレチノイン酸もしくはその前駆体を含有しない培養培地中で培養し、該中胚葉細胞をレチノイン酸受容体γ（ＲＡＲγ）のアゴニストと接触させること、
   によって活性化されることを特徴とする、
   方法。
10. 前記多能性幹細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、ヒト胚性幹細胞またはヒト人工多能性幹細胞であることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
11. 前記多能性幹細胞が、未分化多能性幹細胞を塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、骨形成因子２（ＢＭＰ２）、骨形成因子４（ＢＭＰ４）、アクチビンＡ、ＢＭＰアンタゴニスト、ＢＭＰ経路阻害剤、およびＷｎｔ３ａ経路活性化剤で構成される１種または複数の増殖因子と接触させることによって、分化して中胚葉または心臓前駆細胞を形成していることを特徴とする、請求項９または１０に記載の方法。
12. 前記ＢＭＰアンタゴニストがＢＭＰ４アンタゴニストであり、前記ＢＭＰ経路阻害剤が小分子ＢＭＰ経路阻害剤であり、前記Ｗｎｔ３ａ経路活性化剤が小分子Ｗｎｔ３ａ経路活性化剤であることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
13. 前記ＢＭＰアンタゴニストがノギンであり、前記小分子ＢＭＰ経路阻害剤がドルソモルフィンであり、前記小分子Ｗｎｔ３ａ経路活性化剤がＧＳＫ−３α／βのＡＴＰ競合阻害剤であることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
14. ＧＳＫ−３α／βの前記ＡＴＰ競合阻害剤が、細胞透過性ビス−インドロ（インジルビン）化合物であることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
15. 前記細胞透過性ビス−インドロ（インジルビン）化合物が、６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ）であることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
16. 前記培養培地に添加される増殖因子の最終濃度が０．０１〜１２００ｎｇ／ｍＬであり、増殖因子以外の別の物質の最終濃度が０．００１〜１００μＭであることを特徴とする、請求項１１から１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記Ｓｍａｄ１／５／８経路が、前記中胚葉細胞または前記心臓前駆細胞をＢＭＰファミリーメンバーと接触させることによって活性化されることを特徴とする、請求項９から１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記ＢＭＰファミリーメンバーが、ＢＭＰ２および／またはＢＭＰ４を含み、該ＢＭＰ２および／またはＢＭＰ４が、０．０１〜１２００ｎｇ／ｍｌの最終濃度で使用されることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
19. 前記Ｓｍａｄ１／５／８経路が、レチノイン酸またはその前駆体を含まない培地中で前記幹細胞を培養し、該中胚葉細胞または心臓前駆細胞をレチノイン酸受容体γ（ＲＡＲγ）のアゴニストと接触させることによって活性化されることを特徴とする、請求項９から１６のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記レチノイン酸前駆体がビタミンＡであることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
21. 前記ＲＡＲγアゴニストが、ＢＭＳ９６１、パロバロテン、またはＣＤ４３７であることを特徴とする、請求項１９または２０に記載の方法。
22. 前記ＲＡＲγアゴニストが、０．００１〜１００μＭの最終濃度で使用されることを特徴とする、請求項１９から２１のいずれかに記載の方法。
23. 前記幹細胞をＷｎｔ阻害剤と接触させて該幹細胞を心室心筋細胞に分化させるステップをさらに含むことを特徴とする、請求項９から２２のいずれかに記載の方法。
24. 前記Ｗｎｔ阻害剤が、ｄｉｃｋｋｏｐｆホモログ１（ＤＫＫ１）、ＩＷＰ、およびＷｎｔ応答の阻害剤（ＩＷＲ）のうちの少なくとも１種を含み、該Ｗｎｔ阻害剤が、０．０１〜１２００ｎｇ／ｍｌの最終濃度で使用され、他の物質が、０．００１〜１００μＭの最終濃度で使用されることを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
25. 幹細胞から心室心筋細胞を生成するためのインビトロの方法であって、
    １）幹細胞をｂＦＧＦおよびＢＭＰ４と接触させて幹細胞分化を開始するステップと、
    ２）ｂＦＧＦおよびＢＭＰ４によって処理された該幹細胞をアクチビンＡと接触させて中胚葉を形成するステップと、
    ３）分化して中胚葉を形成した前記幹細胞をノギンと接触させて該幹細胞の心臓分化効率を増強するステップと、
    ４）ノギンによって処理された前記幹細胞におけるＳｍａｄ１／５／８経路を活性化して心室心筋細胞形成を促進するステップであって、
    ここで、前記Ｓｍａｄ１／５／８経路は、
    （ｉ）ノギンによって処理された前記幹細胞をＢＭＰファミリーのメンバーと接触させること、または（ｉｉ）ノギンによって処理された前記幹細胞をレチノイン酸もしくはその前駆体を含有しない培養培地中で培養し、ノギンによって処理された前記幹細胞をレチノイン酸受容体γ（ＲＡＲγ）のアゴニストと接触させること、によって活性化される、
    ステップと、
    ５）ノギンによって処理された前記幹細胞をＤＫＫ１、ＩＷＰ、およびＷｎｔ応答の阻害剤（ＩＷＲ）のうちの１種または複数と接触させて該幹細胞を心室心筋細胞に分化させるステップと
    を含む、方法。
26. 前記Ｓｍａｄ１／５／８経路が、前記幹細胞をＢＭＰ２および／またはＢＭＰ４と接触させることによって活性化される、請求項２５に記載の方法。
27. 前記Ｓｍａｄ１／５／８経路が、レチノイン酸またはその前駆体を含まない培地中で前記幹細胞を培養し、該幹細胞をＲＡＲγのアゴニストと接触させることによって活性化される、請求項２５に記載の方法。