CN104508121A - 体外诱导多能干细胞分化为心室肌细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供体外诱导多能干细胞分化为心室肌细胞的方法，其是通过在体外维持、扩增、培养多能干细胞，在多能干细胞心肌分化的中期即由中胚层细胞或心肌前体细胞向心肌细胞分化的时期，向培养基中加入可直接或间接激活Smad1/5/8信号通路的物质，使干细胞定向分化为心室肌细胞。利用本发明方法，成功获得了具有生物学活性及功能的心室肌细胞，不仅揭示了心肌前体细胞向心室肌细胞分化过程中的调节机制，而且分化得到的人心室肌细胞对细胞移植治疗心肌梗死和心脏毒理分析及心脏相关药物的研发有广泛的应用。

Description

体外诱导多能干细胞分化为心室肌细胞的方法
技术领域
本发明涉及多能干细胞分化及细胞信号转导领域， 具体地说， 涉 及体外诱导多能干细胞分化为心室肌细胞的方法。
背景技术
对于人类和哺乳动物而言，心肌细胞在出生前具有分裂增殖的能 力， 而出生以后， 这一能力迅速降低。 成年人的心肌细胞几乎不具备 分裂增殖的能力。 在发生诸如心肌梗塞等心脏组织坏死性疾病时， 由 于成体心肌细胞已失去增殖分裂的能力，不能通过心肌细胞的再生来 修复坏死的组织， 所以这类疾病引起的心脏功能衰退是不可逆转的。 虽然可以通过药物的使用增加心肌收缩力， 提高心脏的泵血能力， 但 心脏负担的加重反而可能使病情恶化。用正常的心肌细胞移植替换已 经坏死的细胞是从根本上治疗这类心脏病的方法之一。因为成体心肌 细胞几乎已失去分裂增殖能力，寻找人心肌细胞的来源成为目前再生 医学治疗心肌梗塞首要解决的问题。
能性干细胞（ Pluripotent stem cells ),如胚胎干细胞 (embryonic stem cells)1 , 诱导的多能干细胞（Induced Pluripotent Stem cells, iPSC ) 2' 3, 不但具有较强的自我复制能力,而且还具有分化成心肌细胞的潜能。 因 此， 例如胚胎干细胞的多能干细胞是目前最具潜力的心肌细胞来源， 而 建立高效的， 心肌细胞定向分化方法是获得心肌细胞的关键。
利用多能干细胞如胚胎干细胞，诱导分化心肌细胞一般包括两种 方法：一种是悬浮培养胚胎干细胞，使其形成胚状体（embryoid body ) 进而继续分化成心肌细胞；另一种方法是直接诱导一般培养条件下的 单层贴壁胚胎干细胞， 使其向心肌细胞分化。 已有文献报道多种细胞 因子具有提高心肌分化效率的作用，其用量及作用时间因不同的诱导 分化体系而异。
人的多能干细胞分化的心肌细胞主要分为三类：起搏细胞（Nodal cell ), 心室肌细胞 （ Ventricular myocytes cell ) 和心房肌细胞 （Atrial myocyte cell ) 完全成熟的心肌细胞根据其功能属性又可分为工作 心肌细胞和自律性的起搏心肌细胞两大类。工作心肌细胞的肌原纤维 丰富， 具有传导性和兴奋性， 执行收缩功能。 它们是心房和心室壁的 主要构成部分， 即心房肌细胞和心室肌细胞。 具有自律性的起搏心肌 细胞丧失了收缩性， 但它们和工作心肌细胞一样具有传导性和兴奋 性。 而且它们还具有独特的自律性。 心房肌细胞、 心室肌细胞和起搏 细胞这三类细胞的胞内肌原纤维的组成以及细胞膜上的离子通道蛋 白表达有明显区别，这也就造成它们的动作电位和收缩的节律性有很 大差别。 对于心肌细胞移植而言， 至关重要的是要移植适当种类且纯 度较高的单一亚型的心肌细胞。 例如， 修复心室组织需要移植高纯度 的心室肌细胞， 这关系到其能否顺利整合到受体心脏、 能否真正提高 心脏功能和是否能够减少移植细胞所带来的心律不齐等副作用。如果 移植细胞种类不匹配或纯度不高的心肌细胞， 会造成心律不齐， 损害 受体的原有心脏功能。 由于左心室主要负担全身的血液供给， 其体积 最大， 细胞壁也最厚， 泵血能力最强， 而心肌梗死导致的心肌细胞坏 死也多发于该区域。 因此， 对于三类心肌细胞来说， 获得心室肌细胞 对细胞移植治疗心肌梗死具有更为重要的意义 5。
心脏是人体最重要的器官，获取大量的人心肌细胞对心脏病药物 的研制和药物的安全性评估具有重要意义和应用价值。由于成年人的 心肌细胞几乎没有分裂生长能力， 不能进行体外培养扩增。 因此， 目 前没有人的心肌细胞可以大量地用于实验研究。几乎所有的心脏毒理 实验和心脏病药物的实验研究都是利用动物或原代分离的动物心肌 细胞来完成。 但是， 由于动物心脏及其细胞与人心脏及心肌细胞的生 理差异，利用动物或动物的心肌细胞来进行药物的毒理分析的准确率 只有 60%左右， 因此目前的药物毒理分析方法还有待进一步改进和提 高。利用干细胞或转分化而获得的人的心肌细胞可以为药物的心脏毒 理分析提供一种有效的新工具。利用细胞工程获取的人的心肌细胞可 以在细胞水平上建立人心脏的毒理分析方法，从而减少心脏毒理分析 中动物的使用， 提高分析的准确率， 这是目前生物医药工业研究的一 个热点。 由于国际上药物注册的相关规定条款（ICH S7B ) 要求药物 的心脏毒理分析必须出具药物对心室， 特别是对心室心率影响的数 据， 因此， 利用细胞工程获取的心肌细胞中， 心室肌细胞对发展利用 人心肌细胞药物毒理分析方法具有最为重要的意义 6。
综上，无论是利用干细胞分化的心肌细胞治疗进行细胞移植治疗 心肌梗死， 还是利用获取的心肌细胞进行药物的心脏毒理分析， 都需 要获得高纯度的人的心室肌细胞。 因此， 揭示心肌前体细胞向心室肌 细胞分化过程中的调节机制不仅对高效诱导获得心室肌细胞具有重 要的意义，而且还对细胞移植治疗心肌梗死和利用人干细胞分化的心 肌细胞进行药物研发具有重要意义。
现已报道的利用干细胞分化心肌的各种方法主要存在以下缺陷： 诱导心肌细胞分化的效率不高， 且得到的心肌细胞是起搏细胞、 心房 肌细胞和心室肌细胞的混合细胞群体， 不能实现不同心肌细胞的定向 分化 4。 2007年， C.E. Murry等利用单层培养的人类胚胎干细胞直接诱 导分化心肌细胞用于小鼠的心脏移植， 其平均的分化效率只有大约 30%, 即最后心肌细胞占总细胞数的 30%7。 经过密度梯度离心的分离 纯化，最终可以获得纯度 80%左右的心肌细胞群体。 2008年， GM. Keller 等利用悬浮培养类胚体进行分化， 在分化第六天用流式细胞术分离出 心肌的前体细胞继续培养分化， 大幅提高了分化效率， 最终分化效率 可以达到 50%以上 8。 但此法同样没能实现心房和心室肌细胞的定向分 化。 总之， 上述的分化心肌细胞方法中均尚未述及分化过程对心房细 胞和心室细胞发育的影响， 最终的分化产物大多报道是含有三类心肌 细胞的混合物， 而且目前没有分离这三类心肌细胞的特异分离方法的 相关报道。 2007年， 有报道利用慢病毒转染人类胚胎干细胞， 构建心 室细胞特异表达的 MLC-2v基因一段保守的启动子所启动的绿色荧光 蛋白（EGFP )插入的细胞系， 将其分化为表达绿色荧光蛋白的心肌细 胞。 该方法有利于心肌细胞的纯化， 纯度能达到 90%以上， 但由于该 类细胞需插入 MLC-2v诱导的 GFP或其他筛选基因的 DNA到干细胞的 基因组中， 因而这类具有转基因的心肌细胞并不适用于临床的细胞移 植。 2010年， 中国科学院生物物理研究所马跃实验室的研究发现， 在 干细胞心肌分化的中期， 即从中胚层细胞到心肌细胞的阶段（从干细 胞到中胚层细胞的阶段为分化初期；)，利用维甲酸处理分化的细胞可以 有效地将分化的干细胞诱导成心房肌细胞； 于此同时抑制维甲酸通路 则可以有效地将细胞分化成心室肌细胞 9。 虽然这一研究成果首次解释 了干细胞心肌分化是诱导获得心房肌细胞和心室肌细胞的方法， 但对 于如何诱导心室肌的分化尚未找出明确的主动调节分子。
发明内容
本发明的目的是提供体外诱导多能干细胞分化为心室肌细胞的 方法。
为了实现本发明目的，本发明的体外诱导多能干细胞分化为心室 肌细胞的方法是通过在体外维持、 扩增、 培养多能干细胞， 并于多能 干细胞分化的中期向培养基中加入可直接或间接激活 Smadl/5/8信号 通路的物质，使其定向分化为心室肌细胞。其中，所述激活 Smadl/5/8 信号通路是指使胞质中的 Smadl、 Smad5、 Smad8蛋白中的一种或几 种磷酸化。所述多能干细胞分化的中期即由中胚层细胞或心肌前体细 胞向心肌细胞分化的时期， 具体指从细胞开始表达 Brachyury (T)基因 和 /或 Mespl基因， 到分化成能自主收缩的心肌细胞之前的时期。
前述方法中， 所述的多能干细胞为胚胎干细胞 （embryonic stem cells )、 诱导的多能干细胞（induced pluripotent stem cells)、胚胎生殖细 胞或成人多能干细胞， 且这些多能干细胞来自于人类或哺乳动物。
前述方法中， 所述可直接或间接激活 Smadl/5/8信号通路的物质 和 /或骨 其终浓 度为 0.01-1200ng/mL。
前述方法中， 在多能干细胞分化的初期， 即从干细胞分化成心肌 前体细胞的时期， 向培养基中加入具有促进心肌细胞分化的物质。 所 述具有促进心肌细胞分化的物质为 BMP4、 碱性成纤维细胞生长因子 ( bFGF )、 激活素 A ( Activin A )、 Noggin, Dorsomorphin、 6-溴靛玉 红 -3'-肟 ( 6-bromoindirubin-3'-oxime, BIO ) 等中的至少一种。 其中， 添加的细胞生长因子的终浓度为 0.01-1200ng/mL, 其它小分子化合物 的终浓度为 0.001-100μΜ。
前述方法中， 在多能干细胞分化的中期， 还向培养基中添加具有 抑制 Wnt信号通路的物质。 所述具有抑制 Wnt信号通路的物质为 dickkopf同源物 1 ( dickkopf homolog 1 , DKKl ), IWP、 IWR ( inhibitors of Wntresponse ) 等中的至少一种， 添加的小分子化合物的终浓度为 0.001-100μΜ , DKKl的终浓度为 0.01 - 1200ng/mL。
前述方法中， 在多能干细胞分化的中期， 还包括 i ) 当培养基中 不含有维甲酸或其合成所需的底物时， 向其中加入维甲酸受体 γ ( RARy )的激活剂； 或 ii )当培养基中含有维甲酸或其合成所需的底 物时， 向其中加入维甲酸受体 a ( RARa )和 /或维甲酸受体 β ( RARJ3 ) 的拮抗剂。 i ) 中所述激活剂以及 ii ) 中所述拮抗剂的终浓度为 0.001-100μΜ。
具体地， 本发明提供三套技术方案：
技术方案 I：
(1)悬浮培养或单层培养实质上未分化的多能干细胞；
(2)在分化过程的初期加入具有促进心肌细胞分化的细胞因子，如 BMP4、 bFGF、 ActivinA, Noggin等； 或加入具有抑制 BMP通路的小 分子化合物， 如 Dorsomorphin等； 或加入能够激活 Wnt3a的小分子化 合物， 如 BIO、 CHIR99021等；
(3)在分化过程的中期通过向培养基中添加例如 DKK1、 IWP或 IWR等抑制 Wnt通路的蛋白生长因子或小分子化合物以抑制 Wnt信号 通路， 与此同时加入 BMP2和 /或 BMP4等能够激活 Smadl/5/8磷酸化的 信号分子， 定向诱导细胞分化成为心室肌细胞。
技术方案 II：
(1)悬浮培养或单层培养实质上未分化的多能干细胞；
(2)在分化过程的初期加入具有促进心肌细胞分化的细胞因子，如 BMP4、 bFGF、 ActivinA, Noggin等； 或加入具有抑制 BMP通路的小 分子化合物， 如 Dorsomorphin等； 或加入能够激活 Wnt3a的小分子化 合物， 如 BIO等；
(3)在分化过程的中期通过向培养基中添加例如 DKK1、 IWP或 IWR等抑制 Wnt通路的蛋白生长因子或小分子化合物以抑制 Wnt信号 通路， 与此同时加入能够刺激细胞表达分泌能激活 Smadl/5/8磷酸化 (1)悬浮培养或单层培养实质上未分化的多能干细胞；
(2)在分化过程的初期加入具有促进心肌细胞分化的细胞因子，如 BMP4、 bFGF、 Activin A, Noggin等； 或加入具有抑制 BMP通路的小 分子化合物， 如 Dorsomorphin等； 或加入能够激活 Wnt3a的小分子化 合物， 如 BIO等；
(3)在分化过程的中期通过向培养基中添加例如 DKK1、 IWP或 IWR等抑制 Wnt通路的蛋白生长因子或小分子化合物以抑制 Wnt信号 通路， 与此同时， 在含有维甲酸或其合成底物的培养基中加入维甲酸 受体 RARa和 /或 RARP的拮抗剂（如 RARa的拮抗剂 Ro41-5253和 RARJ3 的拮抗剂 LE135 )。 利用这些步骤可以将干细胞分化的心肌细胞定向 诱导成以心室肌为主的心肌细胞。
分化过程从第 14天以后， 每 3天更换一次无因子的培养基； 培养 60-90天后， 利用膜片钳技术检测心肌细胞的动作电位， 钙信号影像 记录， MLC-2v和 cTNT双染并进行流式细胞分析等方法确定分化的心 室肌细胞及非心室肌的心肌细胞 （包括心房肌细胞和起搏细胞）。
本发明进一步提供釆用上述方法制备的心室肌细胞在筛选治疗 心脏病药物及药物的心脏毒理检测中的应用。
本发明进一步提供釆用上述方法制备的心室肌细胞在受损心脏 的干细胞治疗中的应用。
本发明还提供了一套促进干细胞分化为心室肌细胞的方法，该方 法包括激活中胚层细胞中的 Smadl/5/8信号通路； 其中， 所述中胚层 细胞由干细胞分化而来。
前述方法中， 所述干细胞为全能干细胞 （ Totipotent stem cell )、 多能干细胞 ( Pluripotent stem cell )、 专能干细胞 ( Multipotent stem cell ), 寡能干细胞 （ Oligopotent stem cell )或单能干细胞 （ Unipotent stem cell )。
前述方法中， 所述干细胞为胚胎干细胞、 诱导的多能干细胞、 胎 儿干细胞或成体干细胞。
前述方法中， 所述干细胞为哺乳动物干细胞。
前述方法中， 所述哺乳动物干细胞为人类干细胞。
前述方法中， 所述干细胞为人胚胎干细胞或诱导的人多能干细胞。 前述方法中， 由干细胞分化成中胚层细胞是通过使未分化的干细 胞与以下物质中的至少一种发生接触； 所述物质为 bFGF、 骨形态发 生蛋白 2 ( BMP2 )、 BMP4、 Activin A、 BMP拮抗剂、 BMP信号通路 抑制剂、 Wnt3a信号通路激活剂等。
前述方法中， 所述 BMP拮抗剂为 BMP4拮抗剂。
前述方法中， 所述 BMP拮抗剂为 Noggin。
前述方法中， 所述 BMP信号通路抑制剂为小分子 BMP信号通路 抑制剂。
前述方法中， 所述小分子 BMP信号通路抑制剂为 Dorsomorphin。 前述方法中， 所述 Wnt3a信号通路激活剂为小分子 Wnt3a信号通 路激活剂。
前述方法中， 所述小分子 Wnt3a信号通路激活剂为 GSK-3a/p的 ATP-竟争性抑制剂。
前述方法中， 所述 GSK-301/β的 ATP-竟争性抑制剂为细胞渗透双 吲哚并 （靛玉红） 化合物 （ cell-permeable bw-indolo (indirubin) compound )。
前述方法中， 所述细胞渗透双吲哚并 （靛玉红） 化合物为 BIO。 前述方法中， 所述 bFGF、 BMP2、 BMP4、 Activin A、 BMP拮抗 剂、 BMP信号通路抑制剂、 Wnt3a信号通路激活剂等， 添加的生长因 子的终浓度为 0.01-1200ng/mL, 其它物质的终浓度为 0.001-100μΜ。
前述方法中， 使干细胞与 ΒΜΡ2和 /或 ΒΜΡ4接触从而激活 Smadl/5/8信号通路。
前述方法 中 ， BMP2和 I或 BMP4使用 的终浓度为 约 0.01-1200ng/mL。 前述方法中，通过在不含有维甲酸或其前体的培养基中培养干细 胞， 并使干细胞与维甲酸受体 γ ( RARy )激活剂发生接触， 从而激活 Smadl/5/8信号通路。
前述方法中， 所述维甲酸前体为维生素 A。
前述方法中， 所述 RARy激活剂为 BMS961、 Palovarotene或购自
SIGMA-ALDRICH的 CD437等。
前述方法中， RARy激活剂使用的终浓度为约 0.001-100μΜ。
前述方法中， 使干细胞与维甲酸受体 a ( RARa )和 /或维甲酸受 体 β ( RAR )拮抗剂发生接触， 从而激活 Smadl/5/8信号通路。
前述方法中， 所述 RARa拮抗剂为 Ro41-5253、 BMS 195614或 ER50891等， 所述 RARJ拮抗剂为 LE135等。
前述方法中， RARa和 I或 RARP拮抗剂使用的终浓度为 0.001-100μΜ。
前述方法中， 进一步包括使所述干细胞与 Wnt抑制剂发生接触， 从而使干细胞分化成心室肌细胞。
前述方法中， 所述 Wnt抑制剂为 DKK1、 IWP、 Wntresponse抑制 剂等中的至少一种。
前述方法中， Wnt抑制剂 DKK1使用的终浓度为 0.01-1200ng/mL, 其它抑制剂的终浓度为 0.001 - 100μΜ。
本发明还提供按照上述方法制备得到的心室肌细胞。
前述的心室肌细胞， 心室特异表达基因、 心室肌动作电位 ( embryonic ventricular-like action potentials , AP )和 /或心室肌细胞的 代表性特征 Ca2+火花 （Ca2+ spark ) 的表达水平或比率升高。
前述的心室肌细胞， 所述心室特异表达基因为 IRX-4和 /或 MLC-2v。
本发明还提供一种组合物， 其包括已分化成中胚层细胞的， 且用 能够激活干细胞中 Smadl/5/8信号通路的外源性物质处理的干细胞。
前述的组合物， 所述能够激活干细胞中 Smadl/5/8信号通路的外 源性物质为 BMP2和 /或 BMP4等。
前述的组合物， 所述能够激活干细胞中 Smadl/5/8信号通路的外 源性物质为 RARy激活剂。
前述的组合物， 所述能够激活干细胞中 Smadl/5/8信号通路的外 源性物质为 RARa和 /或 RARJ拮抗剂。
本发明还提供由干细胞生成心室肌细胞的方法， 该方法包括： 1 ) 使干细胞与 bFGF和 BMP4接触， 从而引发细胞分化； 2 ) 经 bFGF和 BMP4处理后的干细胞与 ActivinA接触， 从而形成中胚层细胞； 3 )将 已分化成中胚层细胞的干细胞与 Noggin接触，从而提高干细胞向心肌 细胞分化的效率； 4 )激活经 Noggin处理后的干细胞中的 Smadl/5/8信 号通路， 从而促进心室肌细胞的形成； 5 )将经 Noggin处理后的干细 胞与以下物质中的至少一种接触， 使干细胞分化成心室肌细胞； 所述 物质为 DKK1、 IWP、 IWR等中的至少一种。
前述方法中， 通过使所述干细胞与 BMP2和 /或 BMP4接触， 从而 激活 Smadl/5/8信号通路。
前述方法中， 通过在不含有维甲酸或其前体维生素 A的培养基中 培养干细胞， 并使干细胞与 RARy激活剂发生接触， 以提高培养细胞 中 BMP2/4的表达水平， 从而激活 Smadl/5/8信号通路。
前述方法中，通过使所述干细胞与 RARa和 /或 RARP拮抗剂接触， 从而激活 Smadl/5/8信号通路。
本发明还提供按照上述方法制备得到的心室肌细胞。
本发明还提供用于治疗心脏受损或心脏病的药物组合物，其包括 有效量的前述心室肌细胞以及药用载体或赋形剂。
本发明还提供治疗心脏受损或心脏病的方法，该方法包括对需要 进行此类治疗的个体施以有效量的上述药物组合物。
前述方法中， 所述个体为人类。
前述方法用于心脏受损的干细胞治疗。
本发明还提供前述心室肌细胞在制备用于治疗和 /或预防心脏受 损或心脏病的药物中的应用。
本发明还提供前述心室肌细胞在筛选和 /或开发用于治疗和 /或预 防心脏受损或心脏病的药物中的应用。
本发明还提供前述心室肌细胞在药物的心脏毒理检测中的应用。 本发明进一步提供鉴定心室肌细胞调节因子的方法， 该方法包 括： 1 )使前述心室肌细胞与候选的调节因子接触， 并测定该候选调 节因子对心室肌细胞功能的影响； 2 ) 测定未与该候选调节因子接触 的心室肌细胞的功能；如果与该候选调节因子接触的心室肌细胞的功 能较未与该候选调节因子接触的心室肌细胞的功能不同，则确定该候 选调节因子为所述心室肌细胞的功能调节因子。
本发明提供的体外诱导多能干细胞分化为心室肌细胞的方法，通 过对干细胞的直接诱导， 在干细胞心肌分化的中期， 通过向培养体系 中直接加入 BMP2和 /或 BMP4等能够激活 Smadl/5/8信号通路的物质， 可以使干细胞定向分化成以心室肌细胞为主的心肌细胞。在培养体系 中， 在含有维甲酸或其合成所需的前体（如维生素 A ) 的条件下， 添 加 BMP2和或 BMP4等能够激活 Smad 1/5/8信号通路的物质可以有效地 抑制心肌前体细胞向心房肌细胞的分化， 并诱导心室肌细胞的分化。 在加入维甲酸或维生素 A的同时加入 BMP2和 /或 BMP4等能够激活 Smadl/5/8信号通路的物质， 则分化的心肌细胞中心房肌细胞的比率 随着加入 BMP4浓度的增加而降低， 而分化的心肌细胞中心室肌细胞 的比率却随之增加。 如果在干细胞心肌分化的中期， 只加入 BMP2/4, 同时在培养基中去除维甲酸或其合成所需的前体，则可以使心肌前体 细胞高效定向分化成心室肌细胞。 在干细胞分化的中期， 利用在培养 基中添加维甲酸的受体 RARa或 RARP的激活剂，可以有效地抑制 ι 室 肌细胞的分化， 表现为心室肌细胞的早期标记基因 IRX-4的表达受到 抑制。 但是在无维甲酸或其前体维生素 A的条件下， 加入 RARy的激 活剂可以有效地将干细胞诱导分化成心室肌细胞。 另外， 在含有维生 素 A或维甲酸的培养基中添加 RARa和 RARJ的拮抗剂也可以有效地 提升 IRX-4的表达水平， 诱导干细胞分化成心室肌细胞。
在本发明中， 明确阐明了干细胞心肌分化时， BMP、 Smadl/5/8 通路正向地调节心室肌细胞的分化，为后续利用干细胞分化获取高纯 度的心室肌细胞奠定了基础。
本发明的优点在于：
利用本发明提供的体外诱导多能干细胞分化为心室肌细胞的方 法， 无需通过任何纯化步骤， 即可成功获得高纯度的、 具有生物学活 性及功能的心室肌细胞，不仅为揭示心肌前体细胞向心室肌细胞分化 过程中的调节机制奠定了坚实的理论基础，而且对于细胞移植治疗心 肌梗死和利用人干细胞分化的心肌细胞进行药物研发具有重要意义。 附图说明
图 1为在干细胞分化中期， BMP信号通路的表达及对心室肌细胞 特异标记基因 IRX-4表达的作用； 其中， A为在干细胞心肌分化的第 5 和第 6天时利用 RT-PCR技术检测 BMP2、 BMP4及其受体的表达； B为 Westen blot 检测 BMP通路的下游信号 Smadl/5/8被磷酸化激活的情 况， P-Smadl/5/8为磷酸化的 Smadl/5/8蛋白分子， T- Smadl/5/8为总的 Smadl/5/8蛋白分子， β-肌动蛋白为内参蛋白； C中柱状图表示在分化 的第 14天定量 RT-PCR检测 IRX-4基因表达水平的实验结果，该结果显 示出在不同的时间段内向培养基中加入 ΙμΜ的维甲酸和 200ng/mL的 BMP4时 IRX-4的表达水平，连线标记显示相应条件下干细胞心肌分化 的效率； 其中， N表示 Noggin, B表示 BMP4, NVa为不含有维生素 A 的培养基处理的分化细胞， RA表示维甲酸， 数字表示浓度， BMP4 的浓度单位为 ng/mL, 定量 PCR的结果是与 GADPH表达量比较的相 对值。
图 2为定量 PCR检测分化的第 14天心室肌细胞早期特异表达基因 IRX-4在不同处理的分化干细胞中的表达水平； 其中， A显示在培养 基中加入不同浓度的 BMP4后， IRX-4的表达随着 BMP的浓度增加而 升高， 但在加入 BMP的拮抗剂 Noggin后表达水平下降； B为在不含维 甲酸前体维生素 A的培养基中加入不同剂量的 Noggin可以有效地降 低 IRX-4的表达水平； C为在 ΙμΜ维甲酸存在时， IRX-4的表达水平随 着加入 ΒΜΡ4的浓度的升高而增力口； D显示 ΒΜΡ4在维甲酸存在时提高 IRX-4表达的现象随着向培养体系中加入 Noggin的浓度的增加而降 低； 其中， N表示 Noggin, B表示 BMP4, NVa为无维生素 A培养基处 理的分化细胞， RA表示维甲酸， 数字表示浓度， 单位为 ng/mL。 定量 PCR的结果是与 GADPH表达量比较的相对值。
图 3为定量 RT-PCR分析 IRX-4基因在分化的第 14天的表达水平， 结果显示 BMP家族的其他成员在干细胞心肌分化的第 5-8天处理干细 胞同样可以有效地拮抗维甲酸对心室肌细胞早期表达基因 IRX-4的抑 制作用， 而且拮抗作用随加入 BMP家族生长因子的剂量的增加而加 大。 RA表示维甲酸， 数字表示生长因子的浓度， 单位为 ng/mL, 维甲 酸的浓度为 1μΜ。 定量 PCR的结果是与 GADPH表达量比较的相对值。
图 4显示经过维甲酸、 ΒΜΡ4和 Noggin处理的干细胞分化为成熟的 心室肌细胞时特异表达基因 MLC-2v的表达； 其中， A为利用 Westen blot检测经维甲酸、 BMP4诱导的干细胞分化的心肌细胞在分化 90天后 MLC-2v的表达； B为经维甲酸、 BMP4和 Noggin分别处理的分化 90天 后心肌细胞 cTNT和 MLC-2v双染的免疫荧光染色结果； 其中， B表示 BMP4, NVa为无维生素 A培养基处理的分化细胞， RA表示 ΙμΜ维甲 酸， 数字表示浓度， 单位为 ng/mL。
图 5为对分化的心肌细胞的钙活动进行共聚焦图像扫描和动作电 位联用记录并利用各类心肌细胞特异钙活模式对分化的心肌细胞分 类的结果； A显示具有心室肌动作电位 (ventricular-like action potential) 的心肌细胞具有钙火花 (Ca2+ Spark), 具有心房肌动作电位 (atrial-like action potential)的心肌细胞具有钙瞬变 (Ca2+Transient)的特征， 而具有 起搏细胞动作电位 (Nodal-like action potential)的心肌细胞具有钙震荡 (Ca2+ Oscillation)的特征； B为利用 A中得到的不同亚型心肌细胞的钙 信号模式，对不同处理组得到的心肌细胞进行分类所得到的各组中心 肌细胞具有钙火花、 钙瞬变和钙震荡的比率， 纵坐标为检测到的心肌 细胞中具有三种不同类型钙活动所占比率； RA表示 ΙμΜ的维甲酸， Β 表示 ΒΜΡ4, NVa表示无维生素 Α培养基， N表示 Noggin, 数字表示浓 度， 单位为 ng/mL。
图 6为定量 RT-PCR检测在细胞分化第 6天时在经 RARy激活剂处 理的细胞中 BMP2的表达水平。其中，定量 PCR的结果是与 GADPH表 达量比较的相对值。 NVa表示无维生素 A培养基。
图 7为在干细胞心肌分化中期， 向不含有维生素 A的培养基中加 入不同的维甲酸受体的激活剂或抑制剂等调节剂后， 在分化的第 14 天定量 RT-PCR分析心室肌特异基因 IRX-4在分化 14天的表达水平。其 中， RA表示维甲酸， RAi表示维甲酸的抑制剂 BMS189453 , NVa表示 培养基中不含有维生素八。 RAR-pan拮抗剂为 BMS493。定量 PCR的结 果是与 cTNT表达量比较的相对值。
图 8为对经不同诱导分化的心肌细胞的单细胞动作点位和成熟心 室肌细胞特异标记基因 MLC-2v的鉴定。 A为经不同诱导条件分化的 心肌细胞中具有心房肌、 心室肌和起搏细胞动作电位的细胞的比率 ( n>30 )。 B为流式细胞分析仪检测经不同条件处理的 90天分化细胞 群体内心肌细胞 （cTNT阳性细胞） 中表达 MLC-2v细胞的比率。 RA 表示 ΙμΜ的维甲酸， Β表示 ΒΜΡ4, NVa表示无维生素 Α培养基， N表 示 Noggin, 数字表示浓度， 单位为 ng/mL。 RARy的浓度为 0.1μΜ。
图 9为本发明实施例 2的体外诱导多能干细胞分化为心室肌细胞 的过程。
图 10为本发明实施例 3中体外诱导多能干细胞分化为心室肌细胞 的过程。
图 11为本发明实施例 4中体外诱导多能干细胞分化为心室肌细胞 的过程。
图 12为经维甲酸处理后分化的心肌细胞， 作 cTnT和 MLC-2v免疫 荧光共染色的结果。
图 13为经维甲酸和 200ng/mL BMP4处理后分化的心肌细胞， 作 cTnT和 MLC-2v免疫荧光共染色的结果。
图 14为经无维生素 A的培养基及 1200ng/mL Noggin处理后分化的 心肌细胞， 作 cTnT和 MLC-2v免疫荧光共染色的结果。
图 15为实施例 2中最终获得的分化的心肌细胞，作 cTnT和 MLC-2v 免疫荧光共染色的结果。
图 16为经无维生素 A的培养基处理后分化的心肌细胞，作 cTnT和 MLC-2v免疫荧光共染色的结果。
图 17为实施例 3中最终获得的分化的心肌细胞，作 cTnT和 MLC-2v 免疫荧光共染色的结果。
图 12-图 17中， 带" *"标记的细胞为非心室肌心肌细胞， 带" Λ "标记 的细胞为表达 MLC-2v的心室肌细胞。 具体实施方式
以下实施例用于说明本发明， 但不用来限制本发明的范围。 若未 特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规 手段， 所用原料均为市售商品。
以下实施例中使用的人胚胎干细胞系 H7购自 WiCell Research Institute,美国； B27培养基添加物和 RPMI1640培养基，购自 Invitrogen; Activin A, bFGF、 DKK1、 BMP4及 Noggin均购自 R&D systems。
实施例 1 BMP/Smadl/5/8信号通路在诱导心肌前体细胞向心室肌 细胞分化中的作用
1 研究发现， 在干细胞心肌分化的过程中， 在决定心肌细胞亚型 分化时期， 向培养基中加入维甲酸或其合成所需的底物如维生素 A, 可以将干细胞定向诱导成为心房肌细胞；若在此时向培养基中加入维 甲酸的抑制剂或在培养基中去除维甲酸的合成底物维生素 A, 可以定 向地将干细胞分化成心室肌细胞 9。 通过 RT-PCR反应， 分析分化的人 胚胎干细胞在分化的中期表达 BMP2/4及其相应的受体， 结果如图 1所 示， BMP通路的配体和受体都存在于培养的细胞中。利用 Western blot 检测 BMP2/4下游的信号分子磷酸化 Smadl/5/8, 实验发现在添加维甲 酸以及无维甲酸或无维生素 A的培养条件下， 分化细胞的 Smadl/5/8 都被磷酸化 （图 1 ), 证明 BMP通路在干细胞心肌分化的中期被激活。 这些实验结果显示在干细胞分化的第 5至第 8天 BMP通路有可能参与 调节新机前体细胞向心室肌细胞的分化。
2 进一步检测 BMP通路在干细胞心肌分化中心肌亚型定向分化 的作用。已知 IRX-4是心室肌细胞分化过程中早期表达的标志性基因。 因此本发明通过检测 IRX-4的表达水平来进一步研究 BMP信号通路在 心肌亚型决定时的作用。
实验发现， 在干细胞分化的中期在无维生素 A培养基分化的干细 胞中加入 BMP2/4通路的抑制剂 Noggin , 可以有效地降低分化细胞中 IRX-4的表达， 并且 IRX-4的表达水平随着 Noggin的用量加大 ( 300ng/mL、 600ng/mL和 1200ng/mL ) 而降低， 如图 2所示。 3 实验表明，在干细胞心肌分化的中期加入维甲酸可以抑制心室 肌特异表达基因 IRX-4的表达。 在干细胞心肌分化的中期， 在加入维 甲酸的同时加入不同剂量的 BMP4, 然后在第 14天时利用定量 PCR检 测 IRX-4的表达。 结果（图 2 )表明， 在经维甲酸处理的干细胞心肌分 化中加入 BMP可以提高 IRX-4的表达， 且随着添加 BMP4量的提高， IRX-4的表达水平亦随之增加。
BMP家族的其他成员也能够拮抗维甲酸对 IRX-4的抑制作用。 BMP家族的成员多具有相似的功能， 如图 3所示， 定量 RT-PCR实验证 明， 在干细胞心肌分化的中期， 在有 ΙμΜ维甲酸的情况下， BMP家族 的其他成员也能够不同程度地提高 IRX-4的表达水平，而且 IRX-4的表 达水平随着加入生长因子的浓度的升高而升高。
综上所述， 通过对心室肌细胞早期特异性表达基因 IRX-4的研究 发现， BMP信号通路可以有效地提高分化的心肌细胞中 IRX-4的表达， 从而揭示 BMP信号通路参与了干细胞分化过程中心室肌细胞早期分 化， 促进心室肌细胞的分化。
4 为了进一步验证 BMP通路调节心室肌细胞的分化功能，本发明 对分化 60-90天的心肌细胞的钙活动进行了共聚焦图像扫描研究。 心 室肌细胞与心房肌细胞和起搏细胞的钙活动有着明显的区别。心室肌 细胞的钙活动的成像频率较快， 被称之为"钙火花（Ca+ sparks ) "； 而 心房肌细胞的钙活动的成像显示其频率较慢， 且信号较大， 被称之为 "钙瞬变 （Ca+ transients ) "； 起搏细胞钙活动的成像显示其具有明显 的周期性， 被称之为"钙震荡"。 首先通过单细胞膜片钳与共聚焦图像 扫描连用，发现在膜片钳记录的具有心室肌动作电位的 20个细胞的钙 活动全部为钙火花；在膜片钳记录的具有心房肌动作电位的 20个细胞 全部具有钙瞬变；在膜片钳记录的具有起搏细胞动作电位的 20个细胞 全部具有钙震荡。 因此， 比较心肌细胞的钙活动的成像可以有效地区 分心室肌细胞与心房肌细胞和起搏细胞。 钙成像结果显示， 经维甲酸 处理的分化的心肌细胞中多数具有钙瞬变，且钙瞬变的比率随着加入 BMP4浓度的增加而降低， 相反地， 分化的心肌细胞中具有钙火花的 细胞比率随着添加 BMP4浓度的增加而增加。 该结果表明， 激活 BMP 信号通路可以有效地诱导干细胞分化成心室肌细胞 (图 5 )。
5 如前所述， 在心肌细胞分化的早期， IRX-4是心室肌细胞分化 的重要的特异表达基因。 随着心肌细胞的成熟， 心室肌细胞开始特异 性地表达 MLC-2v (肌球蛋白轻链 2 )基因。 因此， 本发明还检测了经 不同生长因子处理的培养 90天的分化细胞中 MLC-2v的表达水平。 Western blot显示， 在分化 90天的细胞中 MLC-2v的蛋白表达水平也随 着添加 BMP4的浓度的增加而增加 （图 4 ); 本发明还利用流式细胞仪 检测了 90天分化的细胞中表达 MLC-2v的心室肌细胞占所分化的心肌 细胞（表达 cTNT的细胞）的比率。 从图 8的结果可以看出， 在经维甲 酸处理的分化的细胞中加入 BMP处理可以有效地提高心肌细胞中表 达 MLC-2v细胞的比率， 并且在单独用 BMP4处理的条件下， 表达 MLC-2v细胞的比率达到最高。 鉴别心肌细胞亚型最经典的方法是测 量心肌细胞的动作点位。 通过检测经过维甲酸和不同剂量的 BMP4处 理的分化的心肌细胞中具有心房、心室肌细胞和起搏细胞动作电位的 比率发现（图 8 ), 在经维甲酸处理的分化细胞中， 随着添加 BMP4剂 量的增加， 具有心室肌动作点位的细胞的比率显著增加。 在单独加入 BMP4的分化细胞中 90%以上的心肌细胞具有心室肌动作电位， 即 90%以上的心肌细胞为心室肌细胞。
6研究表明，在胚胎干细胞心肌分化的早期加入 BMP2/4、 Activin A、 bFGF和 /或 Noggin, 并在分化的中期加入 DKK1等生长因子可以将 干细胞高效诱导分化成心肌细胞。 定量 RT-PCR实验结果显示在干细 胞心肌分化的中期， 在加入 DKK1的同时， 在不含维生素 A的 B27/RPMI1640培养基中， 如果加入维甲酸受体 RARa和 RARJ的激活 剂， 可以降低心室特异表达基因 IRX-4的表达水平（图 7 ); 但是在加 入 DKK1的同时加入 RARy的激活剂， 则可以诱导 BMP2和 IRX-4的高 表达（图 6和 7 ); 另外在培养基中有维生素 A的条件下， 在加入 DKK1 时同时抑制维甲酸受体 RARa和 RARP,则可以激活心室肌早期特异表 达基因 IRX-4的表达， 显示将干细胞诱导成为心室肌细胞。 由于维甲 酸共有三个 RAR受体， RARou RARp和 RARy, 在有维生素 A或维甲 酸的情况下， 同时抑制 RARa和 RARP, 与单独激活 RARy有相似的机 制与效果。
流式细胞仪检测实验证明 （图 8 ), 在经 RARy诱导的 90天分化的 心肌细胞中表达 MLC-2v的心室肌细胞占所分化的心肌细胞 （表达 cTNT的细胞） 的比率可以达到 80%以上。 另外对经 RARy诱导的 90天 分化的心肌细胞进行电生理动作电位的鉴别， 显示分化细胞中 92%的 心肌细胞具有心室肌动作电位， 是心室肌细胞。
实施例 2 体外诱导多能干细胞分化为心室肌细胞（技术方案一） 将人胚胎干细胞 H7平铺于含明胶（Gelatin )的培养皿中， 加入含 B27(l X浓度）的 RPMI1640培养基在 37 °C C02细胞培养箱中培养。 心 肌分化的过程如图 9所示，从第 0天到第 3天，向培养基中加入 Activin A ( 10ng/mL ) ,BMP4(6ng/mL)和 bFGF(6ng/mL)。 在第 3天结束时更换培 养基， 同时加入 BMP2/4的抑制剂 Noggin ( 3 OOng/mL )。 在第 5天结束 时， 将培养基更换为不添加维生素 A的含 B27的 RPMI1640培养基。 同 时在培养基中加入 Wnt3a的抑制剂 DKK1 ( 300ng/mL ) 和 BMP4(10ng/mL)。 在分化的第 8天结束时， 将培养基更换为只含有 300ng/mL DKKl的培养基， 在分化第 10天结束时更换培养基， 不添加 任何生长因子。 以后每 3天更换一次添加 B27的 RPMI1640培养基。 14 天时可以观察到大量跳动的心肌细胞。 方案流程见图 9。
实施例 3 体外诱导多能干细胞分化为心室肌细胞（技术方案二） 将人胚胎干细胞 H7平铺于含明胶（Gelatin )的培养皿中， 加入含 B27 ( 1 X浓度 ) 的 RPMI1640培养基在 37°C C02细胞培养箱中培养。 心肌分化的过程如图 10所示， 从第 0天到第 3天， 向培养基中加入 Activin A ( 10ng/mL ), BMP4(6ng/mL)和 bFGF(6ng/mL)。 在第 3天结 束时， 更换培养基， 同时加入 BMP2/4的抑制剂 Noggin ( 300ng/mL )。 在第 5天结束时， 将培养基更换为不添加维生素 A的含 B27的 RPMI1640培养基。 同时在培养基中加入 Wnt3a的抑制剂 DKK1 ( 300ng/mL ) 和维甲酸受体 RARy的激活剂 BMS961 ( Ο. Ι μΜ , 购自 Tocris )。 在分化的第 8天结束时， 将培养基更换为只含有 300ng/mL DKKl的培养基， 在分化第 10天结束时更换培养基， 不添加任何生长 因子。 以后每 3天更换一次添加 B27的 RPMI1640培养基。 14天时可以 观察到大量的跳动心肌细胞。 方案流程见图 10。
实施例 4 体外诱导多能干细胞分化为心室肌细胞（技术方案三） 将人胚胎干细胞 H7平铺于含明胶（Gelatin ) 的培养皿中， 加入含 B27 ( 1 X浓度 ) 的 RPMI1640培养基在 37°C C02细胞培养箱中培养。 心肌分化的过程如图 11所示， 从第 0天到第 3天， 向培养基中加入 Activin A ( 10ng/mL ), BMP4(6ng/mL)和 bFGF(6ng/mL)。 在第 3天结 束时， 更换培养基， 同时加入 BMP2/4的抑制剂 Noggin ( 300ng/mL )。 在第 5天结束时， 使用含有维生素 A的含 B27的 RPMI1640培养基。 同 时在培养基中加入 Wnt3a的抑制剂 DKKl ( 300ng/mL ) 和维甲酸受体 RARa和 β的拮抗剂 BMS 195614和 LE135 (浓度分别为 0.1 μΜ和 0.5μΜ )。 在分化的第 8天结束时， 将培养基更换为只含有 300ng/mL DKKl的培养基， 在分化第 10天结束时更换培养基， 不添加任何生长 因子。 以后每 3天更换一次添加 B27的 RPMI1640培养基。 14天时可以 观察到大量跳动的心肌细胞。 方案流程见图 11。
图 12为经维甲酸处理后分化的心肌细胞， 作 cTnT和 MLC-2v免疫 荧光共染色的结果。
图 13为经维甲酸和 200ng/mL BMP4处理后分化的心肌细胞， 作 cTnT和 MLC-2v免疫荧光共染色的结果。
图 14为经无维生素 A的培养基及 1200ng/mL Noggin处理后分化的 心肌细胞， 作 cTnT和 MLC-2v免疫荧光共染色的结果。
图 15为实施例 2中最终获得的分化的心肌细胞，作 cTnT和 MLC-2v 免疫荧光共染色的结果。
图 16为经无维生素 A的培养基处理后分化的心肌细胞，作 cTnT和 MLC-2v免疫荧光共染色的结果。
图 17为实施例 3中最终获得的分化的心肌细胞，作 cTnT和 MLC-2v 免疫荧光共染色的结果。
以上图 12-图 17中， 带" *"标记的细胞为非心室肌心肌细胞， 带" Λ" 标记的细胞为表达 MLC-2v的心室肌细胞。
对实施例 2和 3中分化 60-90天的心肌细胞的钙活动进行了共聚焦 图像扫描研究， 钙成像结果如图 5所示， 从图 5可以直接计算得出分化 的心肌细胞中具有钙火花的细胞占分化细胞总数的比率。
以上实施例中涉及到的培养基中各添加物的终浓度，其有效范围 为生长因子的终浓度在 0.01-1200ng/mL , 小分子化合物的浓度在 0.001-100μΜ。
利用本发明方法，成功获得了具有生物学活性及功能的心室肌细 胞， 不仅揭示了心肌前体细胞向心室肌细胞分化过程中的调节机制， 而且分化得到的人心室肌细胞对细胞移植治疗心肌梗死和心脏毒理 分析及心脏相关药物的研发有广泛的应用。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详 尽的描述， 但在本发明基础上， 可以对之作一些修改或改进， 这对本 领域技术人员而言是显而易见的。 因此， 在不偏离本发明精神的基础 上所做的这些修改或改进， 均属于本发明要求保护的范围。 工业实用性 釆用本发明提供的体外诱导多能干细胞分化为心室肌细胞的方 法， 成功获得了具有生物学活性及功能的心室肌细胞， 不仅揭示了心 肌前体细胞向心室肌细胞分化过程中的调节机制，而且分化得到的人 心室肌细胞对细胞移植治疗心肌梗死和心脏毒理分析及心脏相关药 物的研发有广泛的应用。
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Claims (59)

  1. 权 利 要 求 书
    1. 体外诱导多能干细胞分化为心室肌细胞的方法， 其是通过在 体外维持、 扩增、 培养多能干细胞， 使其定向分化为心室肌细胞， 其 特征在于，在多能干细胞分化的中期即由中胚层细胞或心肌前体细胞 向心肌细胞分化的时期， 向培养基中加入可直接或间接激活 Smadl/5/8信号通路的物质。
  2. 2. 根据权利要求 1所述的方法， 其特征在于， 所述多能干细胞为 来自于人类或哺乳动物的胚胎干细胞或诱导的多能干细胞。
  3. 3. 根据权利要求 1所述的方法， 其特征在于， 所述可直接或间接 激活 Smadl/5/8信号通路的物质为骨形态发生蛋白 2 ( BMP2 )和 /或骨 形态发生蛋白 4 ( BMP4 ), 其终浓度为 0.01-1200ng/mL。
  4. 4. 根据权利要求 1-3任一所述的方法， 其特征在于， 在多能干细 胞分化的初期，向培养基中加入具有促进心肌细胞分化的物质；其中， 多能干细胞分化的初期是指从干细胞分化成中胚层细胞的时期。
  5. 5. 根据权利要求 4所述的方法， 其特征在于， 所述具有促进心肌 细胞分化的物质为 BMP4、 碱性成纤维细胞生长因子 （bFGF )、 激活
    ^ A ( Activin A )、 Noggin、 Dorsomorphin、 6-溴靛玉红 -3'-月亏 ( 6-bromoindirubin-3 '-oxime , BIO ) 中的至少一种；
    其中， 添加的生长因子的终浓度为 0.01-1200ng/mL, 其它物质的 终浓度为 0.001-100μΜ。
  6. 6. 根据权利要求 1-3任一所述的方法， 其特征在于， 在多能干细 胞分化的中期， 还向培养基中添加具有抑制 Wnt信号通路的物质。
  7. 7. 根据权利要求 6所述的方法， 其特征在于， 所述具有抑制 Wnt 信号通路的物质为 dickkopf同源物 1 ( dickkopf homolog 1 , DKK1 )、 IWP、 Wntresponse的抑制剂 （IWR ) 中的至少一种； 其中， 添加的 DKK1 的终浓度为 0.01-1200ng/mL , 其它物质的终浓度为 0.001-100μΜ。
  8. 8. 根据权利要求 6所述的方法， 其特征在于， 在多能干细胞分化 的中期， 还包括 i)当培养基中不含有维甲酸或其合成所需的底物时， 向其中加入维甲酸受体 γ ( RARy ) 的激活剂； 或 ii)当培养基中含有维 甲酸或其合成所需的底物时， 向其中加入维甲酸受体 a ( RARa ) 和 / 或维甲酸受体 β ( RAR ) 的拮抗剂；
    其中， i)中所述激活剂和 ii)中所述拮抗剂的终浓度范围为 0.001-100μΜ。
  9. 9. 根据权利要求 1-8任一项所述方法制备的心室肌细胞在筛选治 疗心脏病药物中的应用。
  10. 10. 根据权利要求 1-8任一项所述的方法制备的心室肌细胞在药 物的心脏毒理检测中的应用。
  11. 11. 根据权利要求 1-8任一项所述的方法制备的心室肌细胞在受 损心脏的干细胞治疗中的应用。
  12. 12. 促进干细胞分化为心室肌细胞的方法， 该方法包括激活中胚 层细胞中的 Smadl/5/8信号通路； 其中， 所述中胚层细胞由干细胞分 化而来。
  13. 13. 根据权利要求 12所述的方法， 其特征在于， 所述干细胞为全 能干细胞 ( Totipotent stem cell ), 多能干细胞 ( Pluripotent stem cell ), 专能干细胞（ Multipotent stem cell )、寡能干细胞（ Oligopotent stem cell ) 或单能干细胞 （ Unipotent stem cell )。
  14. 14. 根据权利要求 12所述的方法， 其特征在于， 所述干细胞为胚 胎干细胞、 诱导的多能干细胞、 胎儿干细胞或成体干细胞。
  15. 15. 根据权利要求 12所述的方法， 其特征在于， 所述干细胞为哺 乳动物干细胞。
  16. 16. 根据权利要求 15所述的方法， 其特征在于， 所述哺乳动物干 细胞为人类干细胞。
  17. 17. 根据权利要求 12所述的方法， 其特征在于， 所述干细胞为人 胚胎干细胞或诱导的人多能干细胞。
  18. 18. 根据权利要求 12-17任一项所述的方法， 其特征在于， 由干 细胞分化成中胚层细胞是通过使未分化的干细胞与以下物质中的至 少一种发生接触； 所述物质为 bFGF、 BMP2、 BMP4、 ActivinA、 BMP 拮抗剂、 BMP信号通路抑制剂、 Wnt3a信号通路激活剂。
  19. 19. 根据权利要求 18所述的方法， 其特征在于， 所述 BMP拮抗剂 为 BMP4拮抗剂。
  20. 20. 根据权利要求 19所述的方法， 其特征在于， 所述 BMP拮抗剂 为 Noggin。
  21. 21. 根据权利要求 18所述的方法， 其特征在于， 所述 BMP信号通 路抑制剂为小分子 BMP信号通路抑制剂。
  22. 22. 根据权利要求 21所述的方法， 其特征在于， 所述小分子 BMP 信号通路抑制刻为 Dorsomorphin。
  23. 23. 根据权利要求 18所述的方法， 其特征在于， 所述 Wnt3a信号 通路激活剂为小分子 Wnt3a信号通路激活剂。
  24. 24.根据权利要求 23所述的方法，其特征在于，所述小分子 Wnt3a 信号通路激活剂为 GSK-3a/p的 ATP-竟争性抑制剂。
  25. 25. 根据权利要求 24所述的方法， 其特征在于， 所述 GSK-3a/p 的 ATP-竟争性抑制剂为细胞渗透双吲哚并 （靛玉红） 化合物。
  26. 26. 根据权利要求 25所述的方法， 其特征在于， 所述细胞渗透双 吲哚并 (靛玉红) 化合物为 BIO。
  27. 27. 根据权利要求 18-26任一项所述的方法， 其特征在于， 添加 的生长因子的终浓度为 0.01-1200ng/mL , 其它物质的终浓度为 0.001-100μΜ。
  28. 28. 根据权利要求 12-27任一项所述的方法， 其特征在于， 使干 细胞与 ΒΜΡ2和 /或 ΒΜΡ4接触从而激活 Smadl/5/8信号通路。
  29. 29.根据权利要求 28所述的方法，其特征在于， BMP2和 /或 BMP4 使用的终浓度为 0.01-1200ng/mL。
  30. 30. 根据权利要求 12-27任一项所述的方法， 其特征在于， 通过 在不含有维甲酸或其前体的培养基中培养干细胞， 并使干细胞与 RARy激活剂发生接触， 从而激活 Smadl/5/8信号通路。
  31. 31. 根据权利要求 30所述的方法， 其特征在于， 所述维甲酸前体 为维生素八。
  32. 32. 根据权利要求 30或 31所述的方法， 其特征在于， 所述 RARy 激活剂为 BMS961、 Palovarotene或购自 SIGMA-ALDRICH的 CD437。
  33. 33. 根据权利要求 30-32任一项所述的方法， 其特征在于， RARy 激活剂使用的终浓度为 0.001-100μΜ。
  34. 34. 根据权利要求 12-27任一项所述的方法， 其特征在于， 使干 细胞与 RARa和 /或 RARJ拮抗剂发生接触， 从而激活 Smadl/5/8信号通
  35. 35. 根据权利要求 34所述的方法， 其特征在于， 所述 RARa拮抗 剂为 Ro41-5253、 BMS195614或 ER50891 ,所述 RARJ拮抗剂为 LE135。
  36. 36. 根据权利要求 33-35任一项所述的方法， 其特征在于， RARa 和 /或 RARJ拮抗剂使用的终浓度为 0.001-100μΜ。
  37. 37. 根据权利要求 12-36任一项所述的方法， 其特征在于， 进一 步包括使所述干细胞与 Wnt抑制剂发生接触， 从而使干细胞分化成心 室肌细胞。
  38. 38. 根据权利要求 37所述的方法， 其特征在于， 所述 Wnt抑制剂 为 DKK1、 IWP、 Wntresponse抑制剂中的至少一种。
  39. 39. 根据权利要求 37或 38所述的方法， 其特征在于， Wnt抑制剂 DKK1使用的终浓度为 0.01-1200ng/mL , 其它物质的终浓度为 0.001-100μΜ。
  40. 40. 按照权利要求 12-39任一项所述方法制备得到的心室肌细胞。
  41. 41. 根据权利要求 40所述的心室肌细胞， 其特征在于， 心室特异 表达基因、心室肌动作电位和 /或心室肌细胞的代表性特征 Ca<sup>2+</sup>火花的 表达水平或所占心肌细胞的比率升高。
  42. 42. 根据权利要求 41所述的心室肌细胞， 其特征在于， 所述心室 特异表达基因为 IRX-4和 /或 MLC-2v。
  43. 43. —种组合物， 其包括已分化成中胚层细胞的， 且用能够激活 干细胞中 Smadl/5/8信号通路的外源性物质处理的干细胞。
  44. 44. 根据权利要求 43所述的组合物， 其特征在于， 所述能够激活 干细胞中 Smadl/5/8信号通路的外源性物质为 BMP2和 /或 BMP4。
  45. 45. 根据权利要求 43所述的组合物， 其特征在于， 所述能够激活 干细胞中 Smadl/5/8信号通路的外源性物质为 RARy激活剂。
  46. 46. 根据权利要求 43所述的组合物， 其特征在于， 所述能够激活干 细胞中 Smadl/5/8信号通路的外源性物质为 RARa和 /或 RARP拮抗剂。
  47. 47. 由干细胞生成心室肌细胞的方法， 该方法包括：
    1 )使干细胞与 bFGF和 BMP4接触， 从而引发细胞分化；
    2 ) 经 bFGF和 BMP4处理后的干细胞与 Activin A接触， 从而形成 中胚层细胞；
    3 )将已分化成中胚层细胞的干细胞与 Noggin接触， 从而提高干 细胞向心肌细胞分化的效率；
    4 )激活经 Noggin处理后的干细胞中的 Smadl/5/8信号通路， 从而 促进心室肌细胞的形成；
    5 )将经 Noggin处理后的干细胞与以下物质中的至少一种接触， 使干细胞分化成心室肌细胞； 所述物质为 DKK1、 IWP、 IWR中的至
  48. 48. 根据权利要求 47所述的方法， 其特征在于， 通过使所述干细 胞与 BMP2和 /或 BMP4接触， 从而激活 Smadl/5/8信号通路。
  49. 49. 根据权利要求 47所述的方法， 其特征在于， 通过在不含有维 甲酸或其前体的培养基中培养干细胞， 并使干细胞与 RARy激活剂发 生接触， 从而激活 Smadl/5/8信号通路。
  50. 50. 根据权利要求 47所述的方法， 其特征在于， 通过使所述干细 胞与 RARa和 /或 RARP拮抗剂接触， 从而激活 Smadl/5/8信号通路。
  51. 51. 按照权利要求 47-50任一项所述方法制备得到的心室肌细胞。
  52. 52. 用于治疗心脏受损或心脏病的药物组合物， 其包括有效量的 权利要求 40或 51所述的心室肌细胞以及药用载体或赋形剂。
  53. 53. 一种治疗心脏受损或心脏病的方法， 该方法包括对需要进行 此类治疗的个体施以有效量的权利要求 52所述的药物组合物。
  54. 54. 根据权利要求 53所述的方法，其特征在于，所述个体为人类。
  55. 55. 根据权利要求 53或 54所述的方法， 其特征在于， 该方法用于 心脏受损的干细胞治疗。
  56. 56. 权利要求 40或 51所述的心室肌细胞在制备用于治疗和 /或预 防心脏受损或心脏病的药物中的应用。
  57. 57. 权利要求 40或 51所述的心室肌细胞在筛选和 /或开发用于治 疗和 /或预防心脏受损或心脏病的药物中的应用。
  58. 58.权利要求 40或 51所述的心室肌细胞在药物的心脏毒理检测中 的应用。
  59. 59. 鉴定心室肌细胞调节因子的方法， 该方法包括：
    1 )使权利要求 40或 51所述的心室肌细胞与候选的调节因子接触， 并测定该候选调节因子对心室肌细胞功能的影响；
    2 ) 测定未与该候选调节因子接触的心室肌细胞的功能； 如果与该候选调节因子接触的心室肌细胞的功能较未与该候选 调节因子接触的心室肌细胞的功能不同，则确定该候选调节因子为所 述心室肌细胞的功能调节因子。
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