CN115885035A - 心肌细胞的精制方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种制造包含心肌细胞的细胞群的方法，其包括：(1)使包含心肌细胞或心肌祖细胞与其它细胞的细胞群与受体酪氨酸激酶抑制剂(其中，不包括EGF受体抑制剂。)接触的步骤，该细胞群是将多能干细胞在心肌细胞分化用培养基中培养得到的；和(2)培养该细胞群的步骤。

Description

心肌细胞的精制方法
技术领域
本发明涉及一种心肌细胞的制造方法及精制方法，更详细而言，涉及一种使用受体酪氨酸激酶抑制剂制造心肌细胞的方法及精制方法。
背景技术
近年来，心肌梗塞的发病率虽然逐渐减少，但包括心肌梗塞在内的心脏疾病仍然是世界范围内主要的死亡原因。心脏移植是目前严重心力衰竭患者唯一的治疗方法，但心脏移植存在供体不足的问题。因而，使用心肌细胞的细胞疗法作为改善心脏疾病的治疗方法备受注目。另外，使用心肌细胞的体外药效评价试验或者药剂安全性试验的建立也受到关注。因此，要求稳定供应能够用于细胞疗法及体外试验的均匀的心肌细胞。
作为稳定提供均匀的心肌细胞的方法之一，可列举从干细胞或心肌祖细胞分化诱导心肌细胞的方法，为了建立有效的心肌细胞分化诱导法，进行了各种努力。作为该分化诱导法，报道了通过在包含EGFR抑制剂的培养基中培养多能干细胞来促进多能干细胞向心肌细胞的分化诱导的方法(专利文献1)；将人工多能干细胞向心肌细胞分化诱导之后，使该心肌细胞和Neuregulin1的拮抗剂或ErbB的拮抗剂接触，从而使心肌细胞成熟的方法(专利文献2)；通过使成肌细胞等未分化祖细胞和去乙酰化酶抑制剂接触，促进该未分化祖细胞的分化诱导的方法(专利文献3)；通过使心肌祖细胞等成体的祖细胞和组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂接触，促进该祖细胞的分化诱导的方法(专利文献4)等。另外，还报道了不经过从干细胞的分化诱导过程的方法，例如，专利文献5中公开了通过直接重编程由成纤维细胞等体细胞制造心肌祖细胞或心肌细胞的方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2014/136519号
专利文献2：美国公开第2010/0183565号
专利文献3：国际公开第2003/033678号
专利文献4：国际公开第2009/073618号
专利文献5：国际公开第2015/038704号
发明内容
发明要解决的问题
本发明的课题在于提供一种通过与上述现有的方法不同的方式制造包含高纯度心肌细胞的细胞群的方法。另外，其课题还在于提供一种由包含心肌细胞的细胞群高纯度精制心肌细胞的方法。
用于解决课题的手段
本发明的发明人为了解决上述课题进行了潜心研究，结果得出了如下构思：不是促进由未分化细胞成为心肌细胞的分化诱导，而是通过靶向已包含心肌细胞的细胞群中的心肌细胞以外的细胞中高表达的蛋白质的抑制剂，抑制该心肌细胞以外的细胞的增殖或者减少心肌细胞以外的细胞的数量，从而增加该细胞群中的心肌细胞的比例，即精制心肌细胞。因而，首先，使用包含由iPS细胞分化诱导的心肌细胞的细胞群，进行单细胞RNA序列分析，将该细胞群中的细胞聚类。聚类结果发现，心肌细胞和此外的其它细胞中受体酪氨酸激酶的表达存在差异。因而，使用针对受体酪氨酸激酶的抑制剂验证心肌细胞在细胞群中所占的比例的变化，结果发现，通过受体酪氨酸激酶抑制剂能够成功地纯化心肌细胞。本发明的发明人基于该见解进一步反复研究，最终完成了本发明。
解决问题的方法
即，本发明提供以下内容。
[1]一种制造包含心肌细胞的细胞群的方法，其包括下述步骤：
(1)使包含心肌细胞或心肌祖细胞与其它细胞的细胞群与受体酪氨酸激酶抑制剂(其中，不包括EGF受体抑制剂。)接触的步骤，该细胞群是将多能干细胞在心肌细胞分化用培养基中培养得到的；及
(2)培养该细胞群的步骤。
[2]根据[1]所述的方法，其中，上述步骤(1)中细胞群与受体酪氨酸激酶抑制剂的接触在多能干细胞分化诱导开始后第4天之后进行。
[3]根据[1]或[2]所述的方法，其中，上述步骤(1)中细胞群与受体酪氨酸激酶抑制剂的接触进行1天以上。
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的方法，其中，上述抑制剂是针对选自VEGF受体、PDGF受体、HGF受体及FGF受体中的至少一种受体酪氨酸激酶的抑制剂。
[5]根据[1]～[4]中任一项所述的方法，其中，上述抑制剂为选自N-[5-({2-[(环丙烷羰基)氨基]咪唑并[1,2-b]哒嗪-6-基}氧基)-2-甲基苯基]-1,3-二甲基-1H-吡唑-5-甲酰胺、N-{4-[(6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基]-3-氟苯基}-N’-(4-氟苯基)环丙烷-1,1-二甲酰胺、AMG337、ASP5878、BGJ398、福瑞替尼(Foretinib)、ZM323881、CP-673451、克莱拉尼(Crenolanib)及克唑替尼(Crizotinib)中的至少一种。
[6]根据[1]～[5]中任一项所述的方法，其中，上述多能干细胞为人工多能干细胞。
[7]一种细胞群，其包含通过[1]～[6]中任一项所述的方法得到的心肌细胞。
[8]一种细胞移植治疗剂，其含有[7]所述的细胞群而成。
[9]一种精制心肌细胞的方法，其包括下述步骤：
(1)使包含心肌细胞或心肌祖细胞与其它细胞的细胞群与受体酪氨酸激酶抑制剂接触的工序，该细胞群是将多能干细胞在心肌细胞分化用培养基中培养得到的；及
(2)培养该细胞群的步骤。
发明的效果
根据本发明，提供一种高纯度包含心肌细胞的细胞群。该细胞群能够适用于针对心脏疾病的细胞移植疗法。另外，还提供一种从包含心肌细胞及心肌祖细胞的细胞群中高纯度精制心肌细胞的方法。
附图说明
图1示出从由iPS细胞分化诱导来的心肌细胞的单细胞RNA测序数据获得的聚类的t-SNE图、及各集群(cluster)的肌节-α-辅肌动蛋白(sarcomeric-α-辅肌动蛋白)和cTnT(心肌肌钙蛋白T，Cardiac Troponin T)的表达量。上方的图中由圆圈围成的部分表示非心肌细胞群。中央和下方的图的纵轴表示基因表达量，横轴的一致性(identity)的标签表示图1的集群的编号。各点表示各个细胞，方框围成的部分表示非心肌细胞集群。
图2-1示出从单细胞RNA测序数据获得的来自iPS细胞的心肌细胞的聚类结果的t-SNE图和各细胞的VEGFR1、VEGFR2基因的表达。表示基因表达的图的深灰色点表示显示高表达量的细胞，浅灰色表示显示低表达量的细胞。高表达细胞群由圆圈围起，图中示出群名称(CM：心肌细胞(下面称为CM)，SMC：平滑肌样细胞(下面称为SMC)，END：内胚层谱系细胞(下面称为END)，EC：内皮样细胞)。
图2-2示出从单细胞RNA测序数据获得的来自iPS细胞的心肌细胞的聚类结果的t-SNE图和各细胞的VEGFR3、PDGFRA、PDGFRB基因的表达。表示基因表达的图的深灰色点表示显示高表达量的细胞，浅灰色表示显示低表达量的细胞。高表达细胞群由圆圈围起，图中示出群名称(SMC：平滑肌样细胞(下面称为SMC)，EC：内皮样细胞)。
图2-3示出由单细胞RNA测序数据获得的来自iPS细胞的心肌细胞的聚类结果的t-SNE图和各细胞的FGFR4、HGFR(c-Met)、EGFR1基因的表达。表示基因表达的图的深灰色点表示显示高表达量的细胞，浅灰色表示显示低表达量的细胞。高表达细胞群由圆圈围起，图中示出群名称(END：内胚层谱系细胞(以下称为END))。
图2-4示出由单细胞RNA测序数据获得的来自iPS细胞的心肌细胞的聚类结果的t-SNE图和各细胞的EGFR3基因的表达。表示基因表达的图的深灰色点表示显示高表达量的细胞，浅灰色表示显示低表达量的细胞。高表达细胞群由圆圈围起，图中示出群名称(END：内胚层谱系细胞(以下称为END))。
图3示出根据来自iPS细胞的心肌细胞的CD326、CD31、CD49a表达获得的细胞群的分离结果。通过流式细胞技术，将心肌细胞率(TNNI1阳性率)为89.6％(左端的图)的TNNI1报告的来自iPS细胞的心肌细胞分离为CD326阳性细胞(END，中央左侧的图中由方框围起的细胞)、CD326阴性CD31阳性细胞(EC，中央右侧的图中由方框围起的细胞)、CD326阴性CD31阴性CD49a阳性细胞(SMC，中央右侧的图中由方框围起的细胞)、CD326阴性CD31阴性CD49a阴性细胞(三阴(Triple Negative)：TN，中央右侧的图中位于左下方的细胞)。TN的99％以上为心肌标志物TNNI1阳性细胞(心肌细胞)(右端的图)。EC和SMC的百分比显示并非表示图内的细胞，而是表示也包括CD326阴性细胞在内的数值。
图4示出化合物处理后的心肌细胞率。＊：因细胞数较少而不能实施测定。纵轴表示实验编号，横轴表示辅肌动蛋白阳性细胞率(心肌细胞率)。
图5示出化合物处理后的非心肌细胞率(END：内胚层谱系细胞，SMC：平滑肌样细胞，EC：内皮样细胞)。纵轴表示实验编号，横轴表示非心肌细胞率。
图6示出化合物处理后的心肌细胞率的平均值(标准偏差)(n＝4)。纵轴表示实验编号，横轴表示心肌细胞率。
图7示出化合物处理后的非心肌细胞率(END：内胚层谱系细胞，SMC：平滑肌样细胞，EC：内皮样细胞)。纵轴表示实验编号，横轴表示非心肌细胞率。
图8示出化合物处理后的心肌细胞率的平均值(标准偏差)(n＝3)。纵轴表示实验编号，横轴表示心肌细胞率。
图9示出将化合物未处理时的回收细胞数设为1时，化合物处理后的回收细胞数的相对比的平均值(标准偏差)(n＝3)。纵轴表示实验编号，横轴表示回收细胞数的相对比。
图10示出化合物处理后的心肌细胞率的平均值(标准偏差)(n＝4)。纵轴表示实验编号，横轴表示心肌细胞数率。
图11示出将化合物未处理时回收细胞数设为1时，化合物处理后的回收细胞数的相对比的平均值(标准偏差)(n＝4)。纵轴表示实验编号，横轴表示回收细胞数的相对比。
图12示出化合物处理后的心肌细胞率的平均值(标准偏差)(n＝4)。纵轴表示实验编号，横轴表示心肌细胞率。
图13示出化合物处理后的非心肌细胞率的平均值(标准偏差)(n＝4)(END：内胚层谱系细胞，SMC：平滑肌样细胞，EC：内皮样细胞)。纵轴表示实验编号，横轴表示非心肌细胞率。
图14示出将化合物未处理时的回收细胞数设为1时，化合物处理后的回收细胞数的相对比的平均值(标准偏差)(n＝4)。纵轴表示实验编号，横轴表示回收细胞数的相对比。
图15示出化合物处理后的心肌细胞率(实验编号1为n＝2的平均值，其他为n＝1)。纵轴表示实验编号，横轴表示心肌细胞率。
图16示出化合物处理后的非心肌细胞率(END：内胚层谱系细胞，SMC：平滑肌样细胞，EC：内皮样细胞)。纵轴表示实验编号，横轴表示非心肌细胞率。＊：因细胞数较少而无法实施测定。
图17示出化合物处理后的心肌细胞率(实验编号1为n＝4，实验编号2、3为n＝3的平均值(标准偏差)，实验编号4、5为n＝1)。纵轴表示实验编号，横轴表示心肌细胞数率。
图18示出化合物处理后的非心肌细胞率(实验编号1为n＝4，实验编号2为n＝3的平均值(标准偏差)，实验编号3为n＝2的平均值，实验编号4、5为n＝1)(END：内胚层谱系细胞，SMC：平滑肌样细胞，EC：内皮样细胞)。纵轴表示实验编号，横轴表示非心肌细胞率。
图19示出化合物处理后的心肌细胞率的平均值(标准偏差)(n＝4，实验编号2为n＝3)。纵轴表示实验编号，横轴表示心肌细胞率。
图20示出化合物处理后的非心肌细胞率的平均值(标准偏差)(n＝4)(END：内胚层谱系细胞，SMC：平滑肌样细胞，EC：内皮样细胞)。纵轴表示实验编号，横轴表示非心肌细胞率。
图21示出将化合物未处理时的回收细胞数设为1时，化合物处理后的回收细胞数的相对比的平均值(标准偏差)(n＝4)。纵轴表示实验编号，横轴表示回收细胞数的相对比。
发明的具体实施方式
1.包含心肌细胞的细胞群的制造方法
本发明提供一种制造包含心肌细胞的细胞群的方法(下面，也称为“本发明的制法”)。本发明的制法包括下述步骤：(1)使包含心肌细胞或心肌祖细胞与其它细胞的细胞群与受体酪氨酸激酶抑制剂接触的步骤；及(2)培养该细胞群的步骤。在本发明的制法中，上述(1)中的“受体酪氨酸激酶抑制剂”不包括EGF受体抑制剂。
在本说明书中，“心肌细胞”表示肌节α-辅肌动蛋白(Sarcomericα-actinin)、心肌肌钙蛋白T(cTnT)、1型肌钙蛋白I(TNNI1)中的至少一个为阳性的细胞，优选为肌节α-辅肌动蛋白阳性细胞。另外，典型为具有自搏能力的心肌的细胞。另外，“心肌祖细胞”表示上述心肌细胞的祖细胞，且是Nkx2.5、GATA4、MEF2C及MESP1中的至少一个为阳性的细胞。上述“其它细胞”表示不符合心肌细胞及心肌祖细胞中的任意一种的细胞(下面，也称为“非心肌细胞”。)，作为具体的细胞，可列举例如：平滑肌细胞、内皮细胞、干细胞(例如，多能干细胞)等。
在本说明书中，“阳性”表示蛋白质或基因以本领域中任意公知的方式可以检测到的量表达。蛋白质能够利用使用抗体的免疫学测定、例如ELISA、免疫染色、流式细胞技术来检测。另外，在细胞内表达但细胞表面未出现的蛋白质(例如转录因子或其亚基等)能够通过使报告蛋白质与该蛋白质一同表达，并检测该报告蛋白质来检测目标蛋白质。基因的检测能够利用例如RT-PCR、生物芯片(例如，微阵列)、RNAseq等核酸扩增方法和/或核酸检测方法来进行。蛋白质或基因的表达能够利用通常方法进行判断，例如在利用流式细胞技术的情况下，将蛋白质的表达与阴性对照组中的表达量进行比较，若表达量相对较高，则判断蛋白质以能够检测到的水平表达。
在本说明书中，“阴性”表示蛋白质或基因的表达量低于通过如上所述的公知方法中的全部或者任意一种的检测下限值。蛋白质或基因的表达的检测下限值可能根据方法的不同而不同，但能够通过常用方法进行判断。
在本说明书中，“细胞群”表示由相同种类或不同种类的两个以上细胞构成的群。“细胞群”也表示相同种类或不同种类的细胞团(mass)。上述步骤(1)中使用的包含心肌细胞或心肌祖细胞与非心肌细胞的细胞群能够通过将多能干细胞在心肌细胞分化用培养基中培养来制造。因此，本发明的制法在上述步骤(1)之前还可以包括步骤(0)，即从多能干细胞分化诱导心肌细胞或心肌祖细胞的步骤。
作为用于本发明的多能干细胞，可列举例如：人工多能干细胞(inducedpluripotent stem cell：iPS细胞)、胚胎干细胞(embryonic stem cell：ES细胞)、来自通过核移植得到的克隆胚胎的胚胎干细胞(nuclear transfer Embryonic stem cell：ntES细胞)、多能生殖干细胞(multipotent germline stem cell：mGS细胞)、胚胎生殖干细胞(EG细胞)、Muse细胞(multi-lineage differentiating stress enduring cell)，优选为iPS细胞(更优选为人iPS细胞)。在上述多能干细胞为ES细胞或来自人胚胎的任意的细胞的情况下，该细胞可以为破坏胚胎所制作的细胞，也可以为不破坏胚胎所制作的细胞，优选为不破坏胚胎所制作的细胞。上述多能干细胞优选来自哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、狗、猴子、红毛猩猩、黑猩猩、人)，更优选来自人。因此，作为本发明中使用的多能干细胞，最优选人iPS细胞。
“人工多能干细胞(iPS细胞)”是指通过向哺乳动物体细胞或未分化干细胞中导入特定的因子(核重编程因子)并重新编程而得到的细胞。目前，“人工多能干细胞(iPS细胞)”具有各种细胞，除山中等人通过向小鼠成纤维细胞导入Oct3/4·Sox2·Klf4·c-Myc这四种因子所建立的iPS细胞(Takahashi K，Yamanaka S.，Cell，(2006)126：663-676)之外，也可以使用：将同样的四种因子导入人成纤维细胞所建立的来自人细胞的iPS细胞(Takahashi K，Yamanaka S.，et al.Cell，(2007)131：861-872.)、导入上述四种因子之后，以Nanog的表达作为指标进行筛选后建立的Nanog-iPS细胞(Okita，K.，Ichisaka，T.，andYamanaka，S.(2007).Nature 448，313-317.)、通过不包含c-Myc的方法制作的iPS细胞(Nakagawa M，Yamanaka S.，et al.Nature Biotechnology，(2008)26，101-106)、通过无病毒法导入六种因子所建立的iPS细胞(Okita K et al.Nat.Methods 2011May；8(5)：409-12，Okita K et al.Stem Cells.31(3)：458-66.)。另外，还可以使用：Thomson等人制作的导入OCT3/4·SOX2·NANOG·LIN28这四种因子后建立的人工多能干细胞(Yu J.，ThomsonJA.et al.，Science(2007)318：1917-1920.)、由Daley等人制作的人工多能干细胞(ParkIH，Daley GQ.et al.，Nature(2007)451：141-146)、由樱田等人制作的人工多能干细胞(日本特开2008-307007号)等。
此外，还可以使用所公开的全部论文(例如，Shi Y.,DingS.,et al.,Cell StemCell,(2008)Vol3,Issue 5,568-574；,Kim JB.,Scholer HR.,et al.,Nature,(2008)454,646-650；Huangfu D.,Melton,DA.,et al.,Nature Biotechnology,(2008)26,No 7,795-797)、或者专利(例如，日本特开2008-307007号、日本特开2008-283972号、US2008-2336610、US2009-047263、WO2007-069666、WO2008-118220、WO2008-124133、WO2008-151058、WO2009-006930、WO2009-006997、WO2009-007852)中记载的本领域中公知的任意人工多能干细胞。作为人工多能干细胞系，可以利用NIH、理研、京都大学等建立的各种iPS细胞系。例如，作为人iPS细胞系，可列举：理研的HiPS-RIKEN-1A系、HiPS-RIKEN-2A系、HiPS-RIKEN-12A系、Nips-B2系、京都大学的253G1系、201B7系、409B2系、454E2系、606A1系、610B1系、648A1系、再生医学用iPS细胞原液等。
在本说明书中，“体细胞”表示除卵子、卵母细胞、ES细胞等生殖系细胞或分化全能性细胞之外的全部动物细胞(优选包含人在内的哺乳动物的细胞)。体细胞不受特别限定，可以包括胎儿(胎仔)的体细胞、新生儿(新生仔)的体细胞及成熟的健康或者疾病性体细胞中的任意细胞，也可以包括初代培养细胞、传代细胞及株化细胞中的全部细胞。具体而言，体细胞示例例如：(1)神经干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、牙髓干细胞等组织干细胞(体性干细胞)；(2)组织祖细胞；(3)淋巴细胞、上皮细胞、内皮细胞、肌肉细胞、成纤维细胞(皮肤细胞等)、毛细胞、肝细胞、胃粘膜细胞、肠细胞、脾细胞、胰腺细胞(胰腺外分泌细胞等)、脑细胞、肺细胞、肾细胞及脂肪细胞等分化后的细胞等。
ES细胞是由人或小鼠等哺乳动物的初期胚胎(例如囊胚)的内部细胞团建立的具有多能性和通过自我复制的增殖能力的干细胞。ES细胞于1981年在小鼠中发现(M.J.Evansand M.H.Kaufman(1981)，Nature 292：154-156)，之后，在人、猴等灵长类动物中也建立了ES细胞系(J.A.Thomson et al.(1998)，Science 282：1145-1147；J.A.Thomson et al.(1995)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92：7844-7848；J.A.Thomson et al.(1996)，Biol.Reprod.，55：254-259；J.A.Thomson and V.S.Marshall(1998)，Curr.Top.Dev.Biol.，38：133-165)。ES细胞能够通过从目标动物的受精卵的囊胚中取出内部细胞团，将内部细胞团在成纤维细胞的饲养物上培养来建立。例如USP5,843,780；Thomson JA，et al.(1995)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.92：7844-7848；Thomson JA，et al.(1998)，Science.282：1145-1147；Suemori H.et al.(2006)，Biochem.Biophys.Res.Commun.，345：926-932；Ueno M.et al.(2006)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，103：9554-9559；Suemori H.et al.(2001)，Dev.Dyn.，222：273-279；Kawasaki H.et al.(2002)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，99：1580-1585；KlimanskayaI.et al.(2006)，Nature.444：481-485等中记载了人及猴子的ES细胞的建立及维持方法。或者，ES细胞可以仅使用囊胚期以前的卵裂期的胚胎的单卵裂球来建立(Chung Y.et al.(2008)，Cell Stem Cell 2：113-117)，也可以使用发育停止后的胚胎来建立(Zhang X.etal.(2006)，Stem Cells 24：2669-2676.)。作为“ES细胞”，小鼠ES细胞可以利用inGenioustargeting laboratory公司、理研(理化学研究所)等建立的各种小鼠ES细胞系，人ES细胞可以利用美国威斯康辛大学、NIH、理研、京都大学、国立成育医疗研究中心及Cellartis公司等建立的各种人ES细胞系。例如，作为人ES细胞系，能够利用ESI Bio公司出售的CHB-1～CHB-12系、RUES1系、RUES2系、HUES1～HUES28系等、WiCell Research出售的H1系、H9系等、理研出售的KhES-1系、KhES-2系、KhES-3系、KhES-4系、KhES-5系、SSES1系、SSES2系、SSES3系等。
nt ES细胞(核移植ES细胞，nuclear transfer ES细胞)是来自通过核移植技术制作的克隆胚胎的ES细胞，具有与来自受精卵的ES细胞大致相同的特性(Wakayama T.et al.(2001)，Science，292：740-743；S.Wakayama et al.(2005)，Biol.Reprod.，72：932-936；Byrne J.et al.(2007)，Nature，450：497-502)。即，由来自通过将未受精卵的核替换为体细胞的核得到的克隆胚胎的囊胚的内部细胞团建立的ES细胞是nt ES(nuclear transferES)细胞。为了制作nt ES细胞，使用了核移植技术(Cibelli J.B.et al.(1998)，NatureBiotechnol.，16：642-646)与ES细胞制作技术(上述)的组合(若山清香等(2008)，实验医学，26卷，5号(增刊)，47～52页)。在核移植时，向哺乳动物的除去核后的未受精卵中注入体细胞的核，并培养数小时，由此能够实现初始化。
mGS细胞是来自睾丸的多能干细胞，该细胞是用于形成精子的源头。与ES细胞相同，该细胞也可以分化诱导为各种系列的细胞，具有例如移植于小鼠囊胚后能够制作嵌合小鼠等性质(Kanatsu-Shinohara M.et al.(2003)Biol.Reprod.，69：612-616；ShinoharaK.et al.(2004)，Cell，119：1001-1012)。可以在包含胶质细胞源性神经营养因子(glialcell line-derived neurotrophic factor(GDNF))的培养液中自我复制，也可以通过在与ES细胞相同的培养条件下反复传代获得生殖干细胞(竹林正则等(2008)，实验医学，26卷，5号(增刊)，41～46页，羊土公司(日本东京))。
EG细胞是由胎儿期的原始生殖细胞建立的具有与ES细胞相同的多能性的细胞。能够通过在LIF、bFGF、干细胞因子(stem cell factor)等物质的存在下培养原始生殖细胞来建立(Matsui Y.et al.(1992)，Cell，70：841-847；J.L.Resnick et al.(1992)，Nature，359：550-551)。
Muse细胞是生物体内的非肿瘤性多能干细胞，能够通过例如WO 2011/007900中记载的方法来制造。详细而言，将成纤维细胞或骨髓基质细胞进行长时间胰蛋白酶处理、优选8小时或16小时胰蛋白酶处理之后，进行悬浮培养，由此得到的具有多能性的细胞即为Muse细胞，SSEA-3及CD105为阳性。
上述步骤(0)只要能够诱导多能干细胞向心肌细胞或心肌祖细胞分化，则不受特别限制，例如，能够通过将多能干细胞在心肌细胞分化用培养基中培养来诱导向心肌细胞或心肌祖细胞分化。在本发明的一个方式中，上述步骤(0)可以包括(0-1)将多能干细胞向中胚层细胞诱导分化的步骤；及(0-2)将该中胚层细胞向心肌细胞或心肌祖细胞分化诱导的步骤。在本说明书中，“心肌细胞分化用培养基”表示包含细胞因子等促进向心肌细胞的分化诱导的因子(下面，有时称为“心肌细胞分化诱导因子”。)及基础培养基的培养基。上述心肌细胞分化诱导促进因子也包括从多能干细胞分化诱导成心肌细胞或心肌祖细胞的过程中，分化诱导成中间细胞(例如，中胚层细胞等)所需的因子。
本发明中使用的基础培养基包括例如StemFit(例如，StemFit AK03N、StemFitAK02N)(味之素公司)、StemPro-34(Thermo Fisher Scientific公司)、PECM(Primate ESCell Medium)、GMEM(格拉斯哥极限必需培养基：Glasgow Minimum Essential Medium)、IMDM(Iscove改良杜氏培养基：Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium)、199培养基、伊格尔极限必需培养基(Eagle’s Minimum Essential Medium)(EMEM)、αMEM、杜氏改良Eagle培养基(Dulbecco’s modified Eagle’s Medium)(DMEM)、Ham’s F12培养基、RPMI 1640培养基、费氏培养基(Fischer’s medium)、及它们的混合培养基等。
基础培养基中能够适当添加ROCK抑制剂(例如，Y-27632、Fasudil/HA1077、SR3677、GSK269962、H-1152、Wf-536等)、血清(例如，胎牛血清(FBS)、人血清、马血清等)或者血清替代物、胰岛素、各种维生素(例如，维生素C类(例如，抗坏血酸))、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸等各种氨基酸、2-巯基乙醇、硫代甘油(例如，α-单硫代甘油(MTG))、各种细胞因子、干细胞因子(SCF(Stem cell factor))、激活素等)、各种激素、各种增殖因子(白血病抑制因子(LIF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、TGF-β等)、各种细胞外基质、各种细胞粘附分子、青霉素/链霉素、嘌呤霉素等抗生素、酚红等pH指示剂等。血清替代物包括白蛋白、转铁蛋白、脂肪酸、胰岛素、胶原前体、微量元素、Knockout Serum Replacement(敲除血清替代物，KSR)、ITS-补充剂及它们的混合物等。
在本发明中，维生素C类表示L-抗坏血酸及其衍生物，L-抗坏血酸衍生物表示在体内通过酶促反应变为维生素C的物质。作为本发明中使用的抗坏血酸的衍生物，可示例：维生素C磷酸盐(例如，抗坏血酸-2-磷酸盐)、抗坏血酸葡糖苷、抗坏血酸乙酯、维生素C酯、抗坏血酸四己基癸酸酯、抗坏血酸硬脂酸酯及抗坏血酸-2-磷酸-6-棕榈酸酯。优选为维生素C磷酸盐(例如，抗坏血酸-2-磷酸盐)，可列举例如：磷酸-L-抗坏血酸Na或磷酸-L-抗坏血酸Mg等磷酸-L-抗坏血酸盐。
人工多能干细胞或类胚体的培养可以为粘附培养或悬浮培养。粘附培养可以使用经细胞外基质成分涂布的培养容器来进行，也可以与饲养细胞共培养。饲养细胞不受特别限定，可列举例如：成纤维细胞(小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)、小鼠成纤维细胞(STO)等)。饲养细胞自身优选通过例如射线(伽马射线等)照射及抗癌剂(丝裂霉素C等)处理等公知的方法灭活。作为细胞外基质成分，可列举：基质胶(Niwa A，et al.PLoS One.6(7)：e22261，2011)、明胶、胶原、弹性蛋白等纤维蛋白、透明质酸、硫酸软骨素等葡糖胺聚糖及蛋白聚糖、纤连蛋白、玻连蛋白、层粘连蛋白等细胞粘附蛋白等。
培养温度的条件不受特别限制，例如为37℃～42℃左右，优选37℃～39℃左右。另外，还可以在低氧条件下培养，在本发明中，低氧条件可示例15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％或其以下的氧浓度。
悬浮培养是指在未粘附于培养容器的状态下培养细胞，没有特别限定，能够使用未进行人工处理(例如，利用细胞外基质等的涂布处理)以提高与细胞的粘附性的培养容器、或者经过人工抑制粘附的处理(例如，利用聚甲基丙烯酸羟乙酯(poly-HEMA)或非离子型表面活性多元醇(Pluronic F-127等)的涂布处理)的培养容器来进行。另外，也可以使用例如一次性生物反应器(株式会社biott)、一次性生物反应器(Thermo Fisher)、一次性生物反应器(赛多利斯公司)、一次性生物反应器(GE医疗生命科学公司)等具备搅拌桨的培养器来进行悬浮培养。所使用的培养器的种类及搅拌速度能够由本领域技术人员根据培养的细胞的种类适当选择。作为搅拌速度的示例，可列举例如：0～100rpm、20～80rpm或45～65rpm，但不限定于此。
另外，悬浮培养时，优选形成类胚体(EB)后培养。因此，上述步骤(0)中还可以包括由多能干细胞形成类胚体的步骤。在该步骤中，优选解离形成集落后的多能干细胞，制成单细胞，然后使其形成类胚体。在解离多能干细胞的步骤中，将彼此粘附形成了群的细胞解离(分离)为单个的细胞。作为解离多能干细胞的方法，可列举例如：机械解离方法、使用具有蛋白酶活性和胶原酶活性的解离溶液(例如，AccutaseTM及AccumaxTM等)或仅具有胶原酶活性的解离溶液的解离方法。优选使用具有蛋白酶活性和胶原酶活性的解离溶液(特别优选AccumaxTM)来解离多能干细胞的方法。上述步骤中使用的培养基优选包含硫代甘油、L-谷氨酰胺及/或抗坏血酸。
作为上述步骤(0-1)中使用的心肌细胞分化诱导因子，可列举：Wnt信号激活物质、激活素A、BMP4、bFGF，这些可以单独使用，也可以组合使用多种。在本发明的一个方式中，使用激活素A、BMP4及bFGF的组合。另外，上述步骤(0-1)中使用的培养基优选包含硫代甘油、L-谷氨酰胺及/或抗坏血酸。
在本说明书中，“Wnt信号激活剂”表示激活Wnt信号通路的物质。作为Wnt信号激活剂，可列举例如：Wnt蛋白质，GSK3β抑制剂(例如，BIO、CHIR99021等)等。这些可以单独使用，也可以组合多种使用。在使用Wnt信号激活剂的情况下，其在培养基中的浓度不受特别限定。在使用BIO或CHIR99021作为Wnt信号激活剂的情况下，优选使其在培养基中的最终浓度为100nM～100μM、优选为1μM～10μM下使用。
在使用激活素A的情况下，其在培养基中的浓度优选1ng/ml～100ng/ml，例如，1ng/ml、2ng/ml、3ng/ml、4ng/ml、5ng/ml、6ng/ml、7ng/ml、8ng/ml、9ng/ml、10ng/ml、11ng/ml、12ng/ml、13ng/ml、14ng/ml、15ng/ml、16ng/ml、17ng/ml、18ng/ml、19ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml及100ng/ml。
在使用BMP4的情况下，其在培养基中的浓度优选1ng/ml～1μg/ml，例如，1ng/ml、2ng/ml、3ng/ml、4ng/ml、5ng/ml、6ng/ml、7ng/ml、8ng/ml、9ng/ml、10ng/ml、11ng/ml、12ng/ml、13ng/ml、14ng/ml、15ng/ml、16ng/ml、17ng/ml、18ng/ml、19ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml、600ng/ml、700ng/ml、800ng/ml、900ng/ml及1μg/ml。
在使用bFGF的情况下，其在培养基中的浓度优选1ng/ml～100ng/ml，例如，1ng/ml、2ng/ml、3ng/ml、4ng/ml、5ng/ml、6ng/ml、7ng/ml、8ng/ml、9ng/ml、10ng/ml、11ng/ml、12ng/ml、13ng/ml、14ng/ml、15ng/ml、16ng/ml、17ng/ml、18ng/ml、19ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml及100ng/ml。
作为上述步骤(0-1)的时长，只要能够得到中胚层细胞，则不受特别限定，优选12小时以上(例如，1天、2天或2天以上)、6天以下(例如，5天、4天、3天或3天以下)。另外，还可以监测是否得到了中胚层细胞，此时，能够通过中胚层标记基因的表达来确定。作为中胚层标记基因，可列举例如：T、MIXL1、NODAL等。
作为上述步骤(0-2)中使用的心肌细胞分化诱导因子，可列举例如：Wnt抑制剂、VEGF，这些可以单独使用，也可以组合多种使用。另外，上述步骤(0-2)中使用的培养基优选包含硫代甘油、L-谷氨酰胺及/或抗坏血酸。
在本说明书中，“Wnt抑制剂”表示抑制从Wnt与受体结合至β连环蛋白的积累期间连续的信号传递的物质，可以为抑制向作为受体的Frizzled家族结合的物质，也可以为促进β连环蛋白分解的物质。作为Wnt抑制剂，可列举例如：DKK1蛋白质(例如，当为人时，NCBI的登录编号为NM＿012242)、硬骨素(例如，当为人时，NCBI的登录编号时NM＿025237)、IWR-1(Merck Millipore，默克密理博)、IWP-2(Sigma-Aldrich，西格玛奥瑞奇)、IWP-3(西格玛奥瑞奇)、IWP-4(西格玛奥瑞奇)、PNU-74654(西格玛奥瑞奇)、XAV939(西格玛奥瑞奇)及它们的衍生物等。其中，优选IWP-3或IWP-4。Wnt抑制剂可以仅使用一种，也可以组合使用多种。
在使用Wnt抑制剂的情况下，其在培养基中的浓度优选1nM～50μM，例如，1nM、10nM、50nM、100nM、500nM、750nM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、40μM、50μM，但不限定于此。更优选为1μM。
在使用VEGF的情况下，其在培养基中的浓度优选1～100ng/ml，可以例示例如，1ng/ml、2ng/ml、3ng/ml、4ng/ml、5ng/ml、6ng/ml、7ng/ml、8ng/ml、9ng/ml、10ng/ml、11ng/ml、12ng/ml、13ng/ml、14ng/ml、15ng/ml、16ng/ml、17ng/ml、18ng/ml、19ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml及100ng/ml。
在上述步骤(0-2)中，可以向基础培养基进一步添加作为心肌细胞分化诱导因子的BMP抑制剂及/或TGFβ抑制剂。在本说明书中，作为“BMP抑制剂”，可列举：腱蛋白(Chordin)、头蛋白(Noggin)、卵泡抑制素(Follistatin)等蛋白质性抑制剂、多索吗啡(Dorsomorphin)(6-[4-(2-哌啶-1-基-乙氧基)苯基]-3-吡啶-4-基-吡唑并[1，5-a]嘧啶)及其衍生物(P.B.Yu et al.(2007)、Circulation(116：II＿60；P.B.Yu et al.(2008)，Nat.Chem.Biol.，4：33-41；J.Hao et al.(2008)，PLoS ONE，3(8)：e2904)、LDN-193189(4-(6-(4-(哌嗪-1-基)苯基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-基)喹啉)等。其中，优选多索吗啡。BMP抑制剂及TGFβ抑制剂可以仅使用一种，也可以组合使用多种。
在使用BMP抑制剂的情况下，其在培养基中的浓度优选1nM～50μM，例如，1nM、10nM、50nM、100nM、500nM、600nM、700nM、800nM、900nM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、40μM、50μM，但不限定于此。
在本说明书中，TGFβ抑制剂表示抑制从TGFβ与受体结合至SMAD期间连续的信号传递的物质，可以为抑制与作为受体的ALK家族的结合的物质，也可以为抑制ALK家族引起SMAD磷酸化的物质。作为TGFβ抑制剂，可列举例如：Lefty-1(作为NCBI Accession No.，可示例：小鼠：NM＿010094，人：NM＿020997)、SB431542、SB202190(以上来自R.K.Lindemannet al.，Mol.Cancer，2003，2：20)、SB505124(GlaxoSmithKline)、NPC30345、SD093、SD908、SD208(Scios)、LY2109761、LY364947、LY580276(Lilly Research Laboratories)、A-83-01(WO 2009146408)及它们的衍生物等。其中，优选SB431542。
在使用TGFβ抑制剂的情况下，其在培养基中的浓度优选1nM～50μM，例如，1nM、10nM、50nM、100nM、500nM、750nM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、5.2μM、5.4μM、5.6μM、5.8μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、40μM、50μM，但不限定于此。
作为上述步骤(0-2)的时长，只要能够得到心肌细胞或心肌祖细胞，则不受特别限定，可列举1天以上(例如，1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或7天以上)。另外，由于长时间培养不会对心肌细胞或心肌祖细胞的建立产生影响，因此未特别设置上限，典型为40天以下。另外，还可以监测是否得到心肌细胞或心肌祖细胞，在该情况下，能够通过搏动心肌细胞数量、心肌细胞或心肌祖细胞的标志物的表达、离子通道的表达、对于电生理刺激的反应等来确认。
另外，上述步骤(0)可以进一步包括步骤(0-3)，即，在VEGF及/或bFGF存在下或不存在下对步骤(0-2)中得到的心肌细胞或心肌祖细胞进行培养。本步骤中使用的培养基优选包含硫代甘油、L-谷氨酰胺及/或抗坏血酸。另外，本步骤中使用的培养基还可以包含心肌成熟化化合物(例如，N-(1,1-二氧代-2,3-二氢-1H-1-苯并噻吩-5-基)-2-(4-{5-[1-氧代-5-(哌啶-1-基)-1,3-二氢-2H-异吲哚-2-基]-1H-苯并咪唑-2-基}苯氧基)乙酰胺)及/或多激酶抑制剂(例如，2-(4-{3-[3-(2-氨基-2-苯基乙氧基)-4-氰基苯基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-6-基}-1H-吡唑-1-基)-N-(2-甲氧基乙基)乙酰胺)。
在步骤(0-3)中使用VEGF的情况下，其在培养基中的浓度优选1～100ng/ml，可以例示，1ng/ml、2ng/ml、3ng/ml、4ng/ml、5ng/ml、6ng/ml、7ng/ml、8ng/ml、9ng/ml、10ng/ml、11ng/ml、12ng/ml、13ng/ml、14ng/ml、15ng/ml、16ng/ml、17ng/ml、18ng/ml、19ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml及100ng/ml。
在步骤(0-3)中使用bFGF的情况下，其在培养基中的浓度优选1～100ng/ml，可以例示，1ng/ml、2ng/ml、3ng/ml、4ng/ml、5ng/ml、6ng/ml、7ng/ml、8ng/ml、9ng/ml、10ng/ml、11ng/ml、12ng/ml、13ng/ml、14ng/ml、15ng/ml、16ng/ml、17ng/ml、18ng/ml、19ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml及100ng/ml。更优选为5ng/ml。
上述步骤(0-3)的时长不受特别限制，可列举1天以上(例如，1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天或28天以上)。另外，由于长时间培养不会对心肌细胞或心肌祖细胞的建立产生影响，因此不特别设置上限，典型为60天以下。通过进行上述步骤(0-3)，能够提高分化成心肌细胞或心肌祖细胞的分化效率。
另外，在进行上述步骤(0-2)或步骤(0-3)之前，可以通过与上述相同的方法解离类胚体。
上述具体说明的方法仅为示例，并不限定于上述方法。可列举例如：将来自小鼠的作为支持细胞的END2细胞与多能干细胞共培养的方法(Mummery，C.，et al.，Differentiation of human embryonic stem cells to cardiomyocytes：role ofcoculture with visceral endoderm-like cells.Circulation.107(21)，2733-40(2003))；通过将类胚体用BMP4、FGF2、胰岛素及血清培养来诱导心肌细胞的方法(Paul，WB.，et al.，A Universal System for Highly Efficient Cardiac Differentiation ofHuman Induced Pluripotent Stem Cells That Eliminates InterlineVariability.PLoSone.6(4)，e18293(2011).)等。另外，也可以使用通过粘附培养且不使用细胞因子来分化诱导心肌细胞的方法(Lian X，et al.，Robust cardiomyocytedifferentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation ofcanonical Wnt signaling.，Proc Natl Acad Sci USA.，2012July 3；109(27)：E1848-57)；将粘附培养与悬浮培养联用，不使用细胞因子来分化诱导心肌细胞的方法(Minami I，et al.，A small molecule that promotes cardiac differentiation of humanpluripotent stem cells under defined，cytokine-and xeno-free conditions.，CellRep.，2012Nov 29；2(5)：1448-60)等。
使如上得到的包含心肌细胞或心肌祖细胞的细胞群与受体酪氨酸激酶抑制剂接触，接着培养该细胞群，由此能够制造心肌细胞的纯度高于接触受体酪氨酸激酶抑制剂前的细胞群的细胞群。即，能够使用受体酪氨酸激酶抑制剂来精制心肌细胞。因此，在本发明的其它方式中，提供一种精制心肌细胞的方法(下面，也称为“本发明的精制方法”。)，其包括下述步骤：(1’)使包含心肌细胞或心肌祖细胞与非心肌细胞的细胞群与受体酪氨酸激酶抑制剂接触的步骤，该细胞群是将多能干细胞在心肌细胞分化用培养基中培养得到的，；及(2’)培养该细胞群的步骤。
在本说明书中，精制心肌细胞表示通过受体酪氨酸激酶抑制剂使非心肌细胞的细胞数(“细胞数”表示活细胞数。下同。)的减少比例超过心肌细胞的减少比例或者通过抑制非心肌细胞的增殖使心肌细胞的增殖比例更高来增加细胞群中的心肌细胞的比例(细胞群中的心肌细胞数/细胞群中的总细胞数)。因此，这与通过促进心肌祖细胞向心肌细胞的分化诱导或抑制心肌祖细胞向心肌细胞以外的细胞的分化诱导来增加心肌细胞的比例不同。推测受体酪氨酸激酶抑制剂使细胞数减少是受体酪氨酸激酶抑制剂诱导了细胞的细胞凋亡后的结果，但不受任何理论约束。
在上述步骤(1)及(1’)中，包含心肌细胞或心肌祖细胞的细胞群与受体酪氨酸激酶抑制剂接触的时长不受特别限定，优选为例如1小时以上(例如，2小时、3小时、5小时、12小时、1天、2天、3天或3天以上)。另外，由于长时间培养不会对心肌细胞或心肌祖细胞的建立产生影响，因此未特别设置上限，典型优选为60天以下(例如，50天、40天、30天、20天、14天、13天、12天、11天或11天以下)。包含心肌细胞或心肌祖细胞的细胞群与受体酪氨酸激酶抑制剂的接触可以通过向包含该细胞群的培养基中添加受体酪氨酸激酶抑制剂来进行，另外，也可以通过向预先添加有受体酪氨酸激酶抑制剂的培养基中接种该细胞群来进行。与受体酪氨酸激酶抑制剂接触的时间点只要为细胞群中包含心肌细胞或心肌祖细胞的时间点，则不受特别限定，例如优选在上述步骤(0-2)或(0-3)中接触，以多能干细胞的分化诱导开始日为标准，优选在分化诱导开始起第4天之后(例如，第5天、第6天、第7天或第7天以后)进行接触。
作为被本发明中使用的受体酪氨酸激酶抑制剂所抑制的受体酪氨酸激酶，可列举：EGF受体(也称为ErbB或HER)(例如，ErbB1(EGFR)、ErbB2(HER2)、ErbB3(HER3)、ErbB4(HER4))、胰岛素受体(例如，IR-A、IR-B)、胰岛素样生长因子1受体、VEGF受体(例如，VEGFR-1(Flt-1)、VEGFR-2(KDR/Flk-1)、VEGFR-3(Flt-4))、PDGF受体(例如，PDGFRα、PDGFRβ)、HGF受体(也称为c-Met)、FGF受体(例如，FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4)、CCK、NGF受体(也称为Trk受体)(例如，TrkA、TrkB、TrkC)、Eph(Ephrin)受体(例如，EPHA1、EPHA2、EPHA3、EPHA4、EPHA5、EPHA6、EPHA7、EPHA8、EPHA9、EPHA10、EPHB1、EPHB2、EPHB3、EPHB4、EPHB5、EPHB6)、AXL(也称为TAM受体)、TIE(例如，TIE-1、TIE-2)、RYK、DDR(例如，DDR1)、RET、ROS、LTK、ROR(例如，ROR1、ROR2)、MuSK、LMR。其中，受体酪氨酸激酶抑制剂的标靶优选VEGF受体、PDGF受体、HGF受体及FGF受体。另外，虽然上述步骤(1)中使用的受体酪氨酸激酶抑制剂中排除了EGF受体抑制剂，但上述步骤(1’)中使用的受体酪氨酸激酶抑制剂能够使用EGF受体抑制剂。
在本说明书中，受体酪氨酸激酶抑制剂只要至少具有针对上述任意一种受体酪氨酸激酶的抑制活性即可，还可以具有例如针对其它受体酪氨酸激酶的抑制活性等其它活性，也可以具有特异性针对一种受体酪氨酸激酶的抑制活性。另外，除EGF受体抑制剂之外的受体酪氨酸激酶抑制剂不排除具有针对除EGF受体以外的受体酪氨酸激酶的抑制活性，且具有针对EGF受体的抑制活性的物质，在本说明书中，“EGF受体抑制剂”是EGF受体抑制活性相比其它活性占优势的物质，具体是指至少抑制90％以上EGF受体的物质或EGF受体的50％抑制浓度为10μM以下的物质。
作为本发明中使用的针对EGF受体的抑制剂，可列举例如：西妥昔单抗(Cetuximab)、厄洛替尼(Erlotinib)HCl(OSI-744)、吉非替尼(Gefitinib)(ZD1839)、拉帕替尼(Lapatinib)(GW-572016)二甲苯磺酸盐、阿法替尼(Afatinib)(BIBW2992)、卡纳替尼(Canertinib)(CI-1033)、TAS6417、PD153035、MTX-211、HS-10296、西利替尼(Theliatinib)(HMPL-309)、拉帕替尼(Lapatinib)、AG-490(Tyrphostin，酪氨酸磷酸化抑制剂B42)、CP-724714、达克替尼(Dacomitinib)(PF-00299804)、WZ4002、沙普替尼(Sapitinib)(AZD8931)、CUDC-101、AG-1478(酪氨酸磷酸化抑制剂AG-1478)、PD153035HCl、培利替尼(Pelitinib)(EKB-569)、AC480(BMS-599626)、AEE788(NVP-AEE788)、AP26113-类似物(ALK-IN-1)、OSI-420、WZ3146、HER2抑制剂1、WZ8040、AST-1306、罗乐替尼(Rociletinib)(CO-1686)、染料木黄酮(Genistein)、瓦利替尼(Varlitinib)、埃克替尼(Icotinib)、TAK-285、WHI-P154、瑞香素(Daphnetin)、PD168393、酪氨酸磷酸化抑制剂9、CNX-2006、AG-18、AZ5104、拉泽替尼(Lazertinib)、AZD9291、CL-387785(EKI-785)、奥莫替尼(Olmutinib)(BI1482694)、(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯、厄洛替尼(Erlotinib)、盐酸吉非替尼、双马来酸阿法替尼(BIBW2992)、AZD3759、波奇替尼(Poziotinib)
(HM781-36B)、布加替尼(Brigatinib)(AP26113)、奥希替尼甲磺酸盐(Osimertinib mesylate)、那考替尼(Naquotinib)(ASP8273)、大黄酸、纳扎替尼(Nazartinib)(EGF816)、去甲斑蝥素、利菲拉非尼(Lifirafenib)(BGB-283)、盐酸利多卡因、紫铆花素、EAI045、川膝蜕皮酮、艾维替尼(Avitinib)(AC0010)等。
作为针对胰岛素受体或胰岛素样生长因子1受体的抑制剂，可列举例如：HNMPA、GSK1904529A、多韦替尼(Dovitinib)(TKI-258)双乳酸、乳酸多韦替尼(TKI258)、NVP-AEW541、多韦替尼(TKI-258)、NVP-ADW742、林西替尼(Linsitinib)(OSI-906)、GSK1904529A、BMS-754807、TAE226(NVP-TAE226)、色瑞替尼(Ceritinib)(LDK378)等。
作为针对PDGFRα的抑制剂，可列举：N-[5-({2-[(环丙烷羰基)氨基]咪唑并[1,2-b]哒嗪-6-基}氧基)-2-甲基苯基]-1,3-二甲基-1H-吡唑-5-甲酰胺(式(I)的化合物)
Figure BDA0003852339160000201
、普纳替尼(Ponatinib)(AP24534)、替拉替尼(Telatinib)、安姆伐替尼(Amuvatinib)(MP-470)、Ki8751、KRN 633、克莱拉尼(CP-868596)、阿西替尼(Axitinib)、CP-673451、替沃扎尼(Tivozanib)(AV-951)、尼达尼布(Nintedanib)(BIBF 1120)、多韦替尼(TKI-258、CHIR-258)、乳酸多韦替尼(TKI258)、双乳酸多韦替尼(TKI-258)、马赛替尼(Masitinib)(AB1010)等。作为针对PDGFRβ的抑制剂，可列举：N-[5-({2-[(环丙烷羰基)氨基]咪唑并[1,2-b]哒嗪-6-基}氧基)-2-甲基苯基]-1,3-二甲基-1H-吡唑-5-甲酰胺、CP-673451、苹果酸舒尼替尼(Sunitinib Malate)、舒尼替尼(Sunitinib)、TSU-68(SU6668、奥安替尼(Orantinib))、MK-2461、甲苯磺酸索拉替尼(Sorafenib Tosylate)、利尼伐尼(Linifanib)(ABT-869)、阿西替尼、克莱拉尼(CP-868596)、双乳酸多韦替尼(TKI-258)、多韦替尼(TKI-258、CHIR-258)、乳酸多韦替尼(TKI258)、替沃扎尼(AV-951)、尼达尼布(BIBF1120)、马赛替尼(AB1010)、KRN 633等。
作为针对VEGFR-1的抑制剂，可列举：N-[5-({2-[(环丙烷羰基)氨基]咪唑并[1,2-b]哒嗪-6-基}氧基)-2-甲基苯基]-1,3-二甲基-1H-吡唑-5-甲酰胺、ZM 306416、阿西替尼、二磷酸莫替沙尼(motesanib diphosphate)(AMG-706)、利尼伐尼(ABT-869)、MGCD-265、西地尼布(Cediranib)(AZD2171)、福瑞替尼(GSK1363089)、OSI-930、多韦替尼(TKI-258、CHIR-258)、帕唑帕尼(Pazopanib)HCl(GW786034HCl)、帕唑帕尼、双乳酸多韦替尼(TKI-258)、乳酸多韦替尼(TKI258)、卡博替尼(Cabozantinib)(XL184、BMS-907351)、苹果酸卡博替尼(Cabozantinib malate)(XL184)、瑞格非尼(Regorafenib)(BAY 73-4506)、乐伐替尼(Lenvatinib)(E7080)、替沃扎尼(AV-951)、尼达尼布(BIBF 1120)、AEE788(NVP-AEE788)、瓦他拉尼(Vatalanib)(PTK787)2HCl、KRN 633、布立尼布(Brivanib)(BMS-540215)、丙氨酸布立尼布(Brivanib Alaninate)(BMS-582664)等。作为针对VEGFR-2的抑制剂，可列举：N-[5-({2-[(环丙烷羰基)氨基]咪唑并[1,2-b]哒嗪-6-基}氧基)-2-甲基苯基]-1,3-二甲基-1H-吡唑-5-甲酰胺、N-{4-[(6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基]-3-氟苯基}-N’-(4-氟苯基)环丙烷-1,1-二甲酰胺(式(II)的化合物)
Figure BDA0003852339160000211
、卡博替尼(XL184、BMS-907351)、苹果酸卡博替尼(XL184)、Ki8751、阿帕替尼(Apatinib)、普纳替尼(AP24534)、ZM323881、LY2874455、甲苯磺酸索拉替尼、BMS-794833、戈伐替尼(Golvatinib)(E7050)、RAF265(CHIR-265)、SKLB1002、凡德他尼(Vandetanib)(ZD6474)、CYC116、苹果酸舒尼替尼、舒尼替尼、PD173074、塞马西尼(Semaxanib)(SU5416)、TSU-68(SU6668、奥安替尼)、阿西替尼、西地尼布(AZD2171)、福瑞替尼(GSK1363089)、MGCD-265、二磷酸莫替沙尼(AMG-706)、利尼伐尼(ABT-869)、乐伐替尼(E7080)、瑞格非尼(BAY73-4506)、替拉替尼、替沃扎尼(AV-951)、OSI-930、双乳酸多韦替尼(TKI-258)、尼达尼布(BIBF 1120)、乳酸多韦替尼(TKI258)、多韦替尼(TKI-258、CHIR-258)、丙氨酸布立尼布(BMS-582664)、布立尼布(BMS-540215)、帕唑帕尼、帕唑帕尼HCl(GW786034HCl)、瓦他拉尼(PTK787)2HCl、ENMD-2076L-(+)-酒石酸、ENMD-2076L-(+)-酒石酸、AEE788(NVP-AEE788)、KRN 633等。作为针对VEGFR-3的抑制剂，可列举：N-[5-({2-[(环丙烷羰基)氨基]咪唑并[1,2-b]哒嗪-6-基}氧基)-2-甲基苯基]-1,3-二甲基-1H-吡唑-5-甲酰胺、SAR131675、阿西替尼、福瑞替尼(GSK1363089)、西地尼布(AZD2171)、替拉替尼、MGCD-265、乐伐替尼(E7080)、卡博替尼(XL184、BMS-907351)、苹果酸卡博替尼(XL184)、二磷酸莫替沙尼(AMG-706)、多韦替尼(TKI-258、CHIR-258)、双乳酸多韦替尼(TKI-258)、乳酸多韦替尼(TKI258)、尼达尼布(BIBF 1120)、替沃扎尼(AV-951)、ENMD-2076L-(+)-酒石酸、ENMD-2076、瑞格非尼(BAY 73-4506)、帕唑帕尼HCl(GW786034HCl)、帕唑帕尼、KRN 633、利尼伐尼(ABT-869)、AEE788(NVP-AEE788)、瓦他拉尼(PTK787)2HCl等。
作为针对HGF受体的抑制剂，可列举例如：N-{4-[(6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基]-3-氟苯基}-N’-(4-氟苯基)环丙烷-1,1-二甲酰胺、克唑替尼(PF-02341066)、卡博替尼(BMS-907351)、福瑞替尼(GSK1363089)、PHA-665752、SU11274、JNJ-38877618(OMO-1)、谷美替尼(Glumetinib)(SCC244)、奥曲替尼(Altiratinib)、SAR125844、SGX-523、BMS-777607、替万替尼(Tivantinib)(ARQ 197)、JNJ-38877605、PF-04217903、MGCD-265类似物、卡马替尼(Capmatinib)(INCB28060)、BMS-754807、BMS-794833、AMG-208、MK-2461、戈伐替尼(E7050)、AMG-458、NVP-BVU972、AMG 337、美乐替尼(Merestinib)(LY2801653)、S49076、白头翁皂苷D、去甲斑蝥素、NPS-1034、赛沃替尼(Savolitinib)(AZD6094)等。
作为针对FGFR1的抑制剂，可列举例如：ASP5878、普纳替尼(AP24534)、PD173074、达鲁舍替(Danusertib)(PHA-739358)、丙氨酸布立尼布(BMS-582664)、布立尼布(BMS-540215)、TSU-68(SU6668、奥安替尼)、SSR128129E、AZD4547、BGJ398(NVP-BGJ398)、LY2874455、多韦替尼(TKI-258、CHIR-258)、乳酸多韦替尼(TKI258)、双乳酸多韦替尼(TKI-258)、CH5183284(Debio-1347)、MK-2461、尼达尼布(BIBF 1120)等。作为针对FGFR2的抑制剂，可列举例如：ASP5878、BGJ398(NVP-BGJ398)、AZD4547、LY2874455、CH5183284(Debio-1347)、尼达尼布(BIBF 1120)、MK-2461等。作为针对FGFR3的抑制剂，可列举例如：ASP5878、BGJ398(NVP-BGJ398)、AZD4547、LY2874455、双乳酸多韦替尼(TKI-258)、乳酸多韦替尼(TKI258)、多韦替尼(TKI-258、CHIR-258)、CH5183284(Debio-1347)、MK-2461、尼达尼布(BIBF 1120)等。作为针对FGFR4的抑制剂，可列举例如：ASP5878、LY2874455、AZD4547、CH5183284(Debio-1347)、尼达尼布(BIBF 1120)等。
作为针对NGF受体的抑制剂，可列举例如：BMS-754807、GW441756、DS-6051b、GNF-5837、CH7057288、奥曲替尼、赛利替尼(Selitrectinib)(LOXO-195)、BMS-935177、恩曲替尼(Entrectinib)(RXDX-101)、西曲替尼(Sitravatinib)(MGCD516)、PF-06273340、贝扎替尼(Belizatinib)(TSR-011)、硫酸拉罗替尼(Larotrectinib(LOXO-101)sulfate)等。
作为针对Eph受体的抑制剂，可列举例如：NVP-BHG712、西曲替尼(MGCD516)等。
作为针对AXL的抑制剂，可列举例如：BMS-777607、倍美替尼(Bemcentinib)(R428)、苹果酸卡博替尼(XL184)、UNC2250、度博替尼(Dubermatinib)(TP-0903)、UNC-2025、LDC1267、UNC2881、RXDX-106(CEP-40783)、S49076、西曲替尼(MGCD516)、2-D08、吉瑞替尼(Gilteritinib)(ASP2215)、NPS-1034等。
作为针对TIE的抑制剂，可列举例如：MGCD-265类似物、Tie2激酶抑制剂、奥曲替尼、培美替尼(ARRY-614)等。
另外，也可以适当选择其它受体酪氨酸激酶抑制剂。受体酪氨酸激酶抑制剂优选N-[5-({2-[(环丙烷羰基)氨基]咪唑并[1,2-b]哒嗪-6-基}氧基)-2-甲基苯基]-1,3-二甲基-1H-吡唑-5-甲酰胺、N-{4-[(6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基]-3-氟苯基}-N’-(4-氟苯基)环丙烷-1,1-二甲酰胺、AMG337、ASP5878、BGJ398、福瑞替尼、ZM323881、CP-673451、克莱拉尼或克唑替尼。受体酪氨酸激酶抑制剂可以仅使用一种，也可以组合使用多种。另外，为了获得更高纯度的心肌细胞，还可以与受体酪氨酸激酶抑制剂同时或在其前后步骤中使用其它药剂(组蛋白去乙酰化酶抑制剂等)。
上述抑制剂可以含有一种或两种以上上述化合物或其盐。
上述化合物或其盐能够分别按照自身公知的方法来制造。
在上述化合物为盐的情况下，优选药理学上可接受的盐，作为这样的盐，可列举例如：与无机碱的盐、与有机碱的盐、与无机酸的盐、与有机酸的盐、与碱性或酸性氨基酸的盐等。
作为与无机碱的盐的优选示例，可列举：钠盐、钾盐等碱金属盐；钙盐、镁盐等碱土金属盐；铝盐；铵盐等。
作为与有机碱的盐的优选示例，可列举：与三甲基胺、三乙基胺、吡啶、甲基吡啶、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨基丁三醇[三(羟基甲基)甲基胺]、叔丁基胺、环己基胺、苄基胺、二环己基胺、N,N-二苄基乙二胺等的盐。
作为与无机酸的盐的优选示例，可列举：与盐酸、氢溴酸、硝酸、硫酸、磷酸等的盐。
作为与有机酸的盐的优选示例，可列举：与甲酸、乙酸、三氟乙酸、邻苯二甲酸、富马酸、草酸、酒石酸、马来酸、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸、甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸等的盐。
作为与碱性氨基酸的盐的优选示例，可列举：与精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸等的盐。
作为与酸性氨基酸的盐的优选示例，可列举：与天冬氨酸、谷氨酸等的盐。
上述化合物可以为水合物、非水合物、溶剂化物、无溶剂化物中的任意一种。
另外，上述化合物还可以为经同位素(例，2H、3H、11C、14C、18F、35S、125I等)等标记或取代的化合物。
将1H转换为2H(D)而成的氘代转换体也包含在上述化合物中。
互变异构体也包含在上述化合物中。
上述化合物还可以为药学上可接受的共晶或共晶盐。其中，共晶或共晶盐表示分别具有不同的物理特性(例如，结构、熔点、熔化热、吸湿性、溶解性及稳定性等)的室温下由两种或两种以上独特的固体构成的结晶物质。共晶或共晶盐能够按照自身公知的共晶法来制造。
受体酪氨酸激酶抑制剂在培养基中的浓度可以由本领域技术人员适当选择，例如，优选1nM～10μM，特别是更优选10nM～3μM，具体而言，可列举：1nM、2nM、3nM、5nM、10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM、1.0μM、1.5μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM。另外，还可以根据化合物的种类来适当变更浓度，例如，在使用N-[5-({2-[(环丙烷羰基)氨基]咪唑并[1,2-b]哒嗪-6-基}氧基)-2-甲基苯基]-1,3-二甲基-1H-吡唑-5-甲酰胺的情况下，优选20nM～10μM；在使用N-{4-[(6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基]-3-氟苯基}-N’-(4-氟苯基)环丙烷-1,1-二甲酰胺的情况下，优选0.2μM～10μM；在使用AMG337的情况下，优选0.2μM～10μM；在使用ASP5878的情况下，优选1nM～1μM；在使用BGJ398的情况下，优选5nM～5μM；在使用福瑞替尼的情况下，优选5nM～5μM；在使用ZM323881的情况下，优选0.1μM～10μM；在使用CP-673451的情况下，优选0.1μM～10μM；在使用克莱拉尼的情况下，优选0.1μM～10μM；在使用克唑替尼的情况下，优选0.1μM～10μM；但并不限定于上述浓度。
上述步骤(2)及(2’)中细胞群的培养方法与上述(0-2)或(0-3)相同。培养时长也相同，只要至少在细胞群与受体酪氨酸激酶抑制剂接触期间持续培养即可。
2.包含心肌细胞的细胞群
本发明还提供一种通过本发明的制法或精制方法得到的包含心肌细胞的细胞群(下面，也称为“本发明的细胞群”)。如上所述，本发明的细胞群以高纯度包含心肌细胞。高纯度表示以细胞群中的心肌细胞的比例(细胞群中的心肌细胞数/细胞群中的总细胞数)具体为80％以上(例如，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或99％以上)的高纯度包含。当然，在混合使用上述细胞群和间充质干细胞等其它细胞或细胞群的情况下，上述心肌细胞的比例则是指与其它细胞或细胞群混合前的比例。在优选的方案中，本发明的细胞群以比由多能干细胞诱导心肌细胞的现有方法得到的细胞群更高的比例包含心肌细胞。该细胞群可以通过细胞分选等进一步精制，如此精制而成的细胞群也包括在“本发明的细胞群”中。
3.细胞移植治疗剂
本发明还提供一种含有本发明的细胞群而成的细胞移植治疗剂(下面，也称为“本发明的细胞移植治疗剂”)。本发明的细胞移植治疗剂可以用于自体移植，也可以用于异体移植。另外，还可以与例如免疫抑制剂等其它药剂联用。如上所述，由于本发明的细胞群以高纯度包含心肌细胞，因此，本发明的细胞群适合用作细胞移植治疗剂的原料，本发明的细胞群或本发明的细胞移植治疗剂可以用于治疗或预防心脏疾病。因此，本发明还包括心脏疾病的治疗或预防方法，其中，将有效量的本发明的细胞群或细胞移植治疗剂给药或移植于需要治疗或预防的哺乳动物(例如，人、小鼠、大鼠、猴子、牛、马、猪、犬等)。作为需要治疗或预防的心脏疾病，可列举：心力衰竭、缺血性心脏病、心肌梗塞、心肌病、心肌炎、肥厚型心肌病、舒张期肥厚型心肌病、扩张型心肌病等疾病或病症导致的缺损等，但不限定于此。
在将本发明的细胞群用于细胞移植治疗剂的情况下，从不会产生排斥反应的观点出发，优选使用包含来自iPS细胞的细胞的细胞群，其中，该iPS细胞由移植目标的个体的HLA基因型相同或者基本相同的体细胞建立。其中，“基本相同”是指HLA基因型的一致程度能够使得可以通过免疫抑制剂抑制所移植细胞的免疫反应，例如，具有HLA-A、HLA-B及HLA-DR这三个基因座或者外加HLA-C的四个基因座一致的HLA型的体细胞。另外，也可以在包埋于聚乙二醇及硅等胶囊、多孔容器等中以避免排斥反应的状态下进行移植。
本发明的细胞群按照常规手段与药学上可接受的载体进行混合等，以制成注射剂、悬浮剂、点滴剂等非口服制剂。作为该非口服制剂中可包含的药学上可接受的载体，可列举例如：生理盐水、葡萄糖及其它包含佐剂的等渗溶液(例如，D-山梨糖醇、D-甘露醇、氯化钠等)等用于注射的水性液。本发明的细胞移植治疗剂还可以与例如缓冲剂(例如，磷酸盐缓冲液、乙酸钠缓冲液)、止痛剂(例如，苯扎氯铵、盐酸普鲁卡因等)、稳定剂(例如，人血清白蛋白、聚乙二醇等)、防腐剂、抗氧化剂等配合。在将本发明的移植治疗剂制成水性悬浮液剂的情况下，只要以达到约1×106～约1×108细胞/mL的方式使包含心肌细胞的细胞群悬浮于上述水性液中即可。另外，可以与用于促进存活的骨架材料共同给药。其中，骨架材料示例了胶原等来自生物体的成分及代替其的聚乳酸等合成聚合物，但不限定于此。
或者，心脏疾病也可以将得到的心肌细胞制成片后粘贴于患者的心脏来进行治疗。在施用心肌片的情况下，能够通过以覆盖所需部分的方式配置来进行治疗。其中，能够使用该领域中熟知的技术来实现以覆盖所需部分的方式配置。在进行配置时，在所需部分较大的情况下，以包围组织的方式配置。另外，给药时，为了获得所需的效果，也可以向相同部分配置数次。在配置数次的情况下，为了使所需的细胞在组织中存活并生成血管，优选间隔足够时间后进行。这种心脏疾病的治疗机理可以是通过心肌片存活产生的效果，或者也可以是不依赖于细胞存活的间接作用(例如，通过分泌引诱物质将来自受体的细胞向损伤部位募集而产生的效果)。在心脏疾病治疗中使用心肌片的情况下，除心肌细胞之外，还可以包含胶原、纤连蛋白、层粘连蛋白等细胞骨架材料(骨架)。或者，除心肌细胞之外，还可以包含任意的细胞种类(也可以为多种)。用于治疗心脏疾病的心肌细胞的细胞数只要为使施用的心肌片在心脏疾病治疗中发挥效果的量即可，不受特别限定，能够根据患处的大小及体型大小适当增加调节。
在另一个实施方式中，本发明的细胞群还可以用于筛选治疗心脏疾病的药剂及药剂的心脏毒性评价。例如，能够向本发明的细胞群投予试验药剂，考察心肌细胞的响应，从而评价试验药剂的效果及毒性。
通过下面的实施例对本发明进行更说明，但本发明的范围并不限定于这些实施例。
实施例
实施例1.由iPS细胞分化诱导为心肌细胞的细胞的单细胞RNA测序分析
使用国立大学法人京都大学iPS细胞研究所(CiRA)制作的临床用iPS细胞系的评价用株。iPS细胞系的维持培养按照现有方法进行(Okita K，et al.Stem Cells.2012Nov29.doi：10.1002/stem.1293)。向心肌细胞的分化诱导按照论文(Miki et al，Cell StemCell.2015Jun 4；16.doi：10.1016/j.stem.2015.04.005.)所述的方法进行。使用10XGenomics公司的Chromium对分化诱导开始后第22天的心肌细胞进行单细胞RNA测序分析。通过软件(Cellranger，Seurat，Loupe Cell Browser)进行细胞的聚类及各集群的分析。发现由iPS细胞分化诱导为心肌细胞的细胞群中，除表达肌节-α-辅肌动蛋白和心肌肌钙蛋白T的心肌细胞群之外，还存在不表达肌节-α-辅肌动蛋白和心肌肌钙蛋白T的三个非心肌细胞群(根据基因表达，考虑其为平滑肌样细胞(SMC)、内皮样细胞(EC)、内胚层谱系的细胞(END))(图1)。
实施例2.由iPS细胞分化诱导为心肌的细胞群中存在的非心肌细胞的分析
利用Loupe Cell Browser对单细胞RNA测序数据进行分析，由此分析受体酪氨酸激酶的基因表达。结果发现，PDGFRA、PDGFRB、VEGFR1、VEGFR2、c-Met(HGFR)、FGFR4等受体酪氨酸激酶的基因表达在非心肌细胞群中很高，而在心肌细胞群中则不高(图2)。
实施例3.通过细胞表面标志物进行的非心肌细胞染色
制作双重敲入的人iPS细胞系，其中，TNNI1的基因座上插入有EmGFP(序列号1)，TNNI3的基因座上插入有mCherry(序列号2)的报告蛋白质的序列。人iPS细胞系使用由CTL公司购入的PBMC(LP＿167，Sample ID：20130318)通过游离型载体(episomal vector)(搭载基因；OCT3/4，KLF4，SOX2，L-MYC，LIN28，mouse p53DD)来制作(参考文献；Okita K，etal.Stem Cells.2012Nov 29.doi：10.1002/stem.1293)。
iPS细胞系的维持培养按照现有方法进行(Okita K，et al.Stem Cells.2012Nov29.doi：10.1002/stem.1293)。
向心肌细胞的分化诱导按照论文(Miki et al，Cell Stem Cell.2015Jun 4；16.doi：10.1016/j.stem.2015.04.005.)所述的方法在6孔板中进行。为了简化说明，在向心肌细胞的分化诱导中，将报告iPS细胞系用通过0.5mM EDTA/PBS稀释至1/2的TrypLEselect(生命技术公司)处理4～5分钟后，利用细胞刮板(IWAKI)剥离细胞，通过吹打解离为单细胞。通过在1,000rpm下离心分离5min除去培养基，将得到的细胞按照每孔2×106cells接种于6孔板，通过向StemPro34培养基中添加1％L-谷氨酰胺、转铁蛋白150μg/mL、抗坏血酸50μg/mL(sigma)、单硫代甘油4×10-4M、10μM Y-27632、2ng/mL BMP4(R&D)及0.5％生长因子减少基质胶而成的培养基1.5mL/孔，在37℃、5％氧的条件下进行培养，从而形成类胚体(第0天)。
次日(第1天)，向每个孔中添加1.5mL培养基，该培养基是向StemPro34培养基中加入1％L-谷氨酰胺、转铁蛋白150μg/mL、抗坏血酸50μg/mL(sigma)、单硫代甘油4×10-4M、2ng/mL BMP4(R&D)激活素A 12ng/mL、bFGF 5ng/mL、BMP4 18ng/mL而成的，在37℃、5％氧的条件下再培养2天。
接着(第3天)，将6孔板倾斜静置，以沉降类胚体，除去80～90％培养基之后，向每个孔中添加1.5mL IMDM。再将孔板倾斜静置，以使类胚体沉降，除去80～90％的培养基之后，在向StemPro34培养基中添加有1％L-谷氨酰胺、转铁蛋白150μg/mL、抗坏血酸50μg/mL(sigma)、单硫代甘油4×10-4M、10ng/mL VEGF、1μM IWP-3、0.6μM Dorsomorphin及5.4μMSB431542而成的培养基中，在37℃、5％氧的条件下培养3天。
接着(第6天)，将6孔板倾斜静置，以沉降类胚体，除去80～90％培养基之后，加入添加有1％L-谷氨酰胺、转铁蛋白150μg/mL、抗坏血酸50μg/mL(sigma)、单硫代甘油4×10-4M及5ng/mL VEGF的StemPro34培养基。在37℃、5％氧的条件下培养8天。在此期间，每2～3天更换一次相同的培养基。
分化诱导第15天时，将200g包含类胚体的细胞培养液离心1分钟后，用抽吸器吸除上清。加入PBS，在200xg下离心1分钟后，用抽吸器吸除上清。向每个管中添加3mL溶液，该溶液是向IMDM(Iscove’s Modified Dulbecco’s Media)中添加DNase 10μg/mL、Liberase100μg/mL而成的，在37℃、通常氧条件下静置1小时。1小时后，将管中的400g离心5分钟，以不会吸取类胚体的方式除去上清。向每个管中添加2mL溶液，该溶液是向Accutase(Thermo)中添加DNase 10μg/mL而成的，在37℃、通常氧条件下静置10分钟。静置后，通过吹打制成单一的细胞(single cell)，向每个管中加入2mL培养基，该培养基是向IMDM中添加DNase 10μg/mL而成的，然后颠倒混合，从而制得单细胞悬浮液。
将上述单细胞悬浮液在200xg下离心5分钟后，除去上清，并在-80℃下冷冻保存。
在冷冻保存后的细胞在37℃的温浴中融化，在400xg下离心5分钟后，除去上清。
轻敲细胞团块(pellet)后，加入1mL包含1％BSA的PBS，在300xg下离心3分钟，除去上清。在包含1％BSA的PBS中，使用APCFire750标记抗CD326抗体、PE标记抗CD49a抗体、BV605标记抗CD31抗体、DAPI进行染色。除去DAPI阳性的死亡细胞之后，测定核细胞的各荧光色素的信号量，由此测定细胞群的分离和各细胞群的比例。
由上述报告iPS细胞分化诱导为心肌的心肌细胞根据以上三个表面标志物的表达的不同分离为CD326阳性细胞、CD326阴性CD31阳性细胞、CD326阴性CD31阴性CD49a阳性细胞、CD326阴性CD31阴性CD49a阴性细胞这四个主要细胞群。四个细胞群为表达以上三个表面标志物中的任意一个或多个的三个以非心肌细胞为主的群(包含大量不表达心肌报告基因的细胞的群)和三个标志物均为阴性的心肌细胞群(表达心肌报告基因的细胞群)。在三个标志物均为阴性的细胞群中，99％以上为心肌细胞(表达心肌报告基因的细胞)(图3)。
接着，着眼于由实施例2发现的受体酪氨酸激酶，在各种条件下验证受体酪氨酸激酶抑制剂是否能够纯化受体酪氨酸激酶的表达相对较低的心肌细胞(试验例1～9)。
在下面的试验例1～9中，化合物A为N-[5-({2-[(环丙烷羰基)氨基]咪唑并[1,2-b]哒嗪-6-基}氧基)-2-甲基苯基]-1,3-二甲基-1H-吡唑-5-甲酰胺，化合物B表示N-{4-[(6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基]-3-氟苯基}-N’-(4-氟苯基)环丙烷-1,1-二甲酰胺。
试验例1.受体酪氨酸激酶抑制剂对于心肌细胞的纯化作用的验证
<向心肌细胞的分化诱导>
人iPS细胞系使用由CTL公司购入的PBMC(LP＿167，Sample ID：20130318)通过游离型载体(搭载基因；OCT3/4，KLF4，SOX2，L-MYC，LIN28，mouse p53DD)制作(参考文献；Okita K，et al.Stem Cells.2012Nov29.doi：10.1002/stem.1293)的细胞系(通过细胞表面标志物对非心肌细胞进行染色时所使用的报告细胞的母株)。
iPS细胞系的维持培养按照现有方法进行(Okita K，et al.Stem Cells.2012Nov29.doi：10.1002/stem.1293)。向心肌细胞的分化诱导按照论文(Miki et al，Cell StemCell.2015Jun 4；16.doi：10.1016/j.stem.2015.04.005.)所述的方法在6孔板中进行。针对VEGF，以在第8天以后不添加的方式实施。
分化诱导第8天时，将类胚体收集在一个离心管中，室温下静置数分钟，使类胚体沉降，用抽吸器吸除上清，添加培养基，由此更换培养基。将类胚体悬浮液转移至6孔板，向每个孔中添加百分之一量的最终浓度的100倍浓度的评价化合物(下面的表1中所示的实验编号2～8的化合物和浓度)，然后对板进行搅拌，进行细胞培养。
[表1]
实验编号 化合物 最终浓度(μM)
1 未处理 -
2 化合物A 0.5
3 AMG337 2
4 ASP5878 0.02
5 ASP5878 0.05
6 ASP5878 0.12
7 BGJ398 0.2
8 BGJ398 1
分化诱导第10天时，将6孔板倾斜静置数分钟，以使类胚体沉降，用抽吸器吸除上清，添加培养基，由此更换每个孔的培养基，与第8天相同地，添加百分之一量的最终浓度的100倍浓度的评价化合物，由此添加化合物。分化诱导第13天时，倾斜6孔板，以使类胚体沉降，利用安装有宽径的1mL移液器用吸头的移液器将类胚体转移至1.5mL管。按照利用细胞表面标志物进行的非心肌细胞的染色来将细胞制成单细胞，将单细胞悬浮液用于心肌细胞标志物阳性细胞率的测定及非心肌细胞标志物阳性细胞率的测定。
<心肌标志物阳性细胞率(心肌细胞率)的测定>
将上述的单细胞悬浮液分注到1.5mL管中之后，用400g离心3分钟，除去上清。将细胞团块重新悬浮于Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution(BD)后，室温下静置15分并固定。向每个管中添加1xPerm/Wash Buffer 1mL，用1500g离心3分钟后，除去上清，由此清洗细胞。将细胞团块分离后，添加1xPerm/Wash Buffer 1mL，并通过进行相同操作来清洗细胞。细胞团块分离后，在包含1％BSA的1xPerm/Wash Buffer中，使用抗肌节α-辅肌动蛋白抗体，通过荧光色素Alexa647染色后，再用DAPI(4’，6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐)进行DNA染色。利用流式细胞仪测定时，测定除去死亡细胞(DNA量为Sub-G1的细胞)后的细胞群的Alexa647的荧光信号量，由此分析肌节α-辅肌动蛋白阳性的细胞率。其结果，通过化合物A(N-[5-({2-[(环丙烷羰基)氨基]咪唑并[1,2-b]哒嗪-6-基}氧基)-2-甲基苯基]-1,3-二甲基-1H-吡唑-5-甲酰胺)、AMG337、ASP5878、BGJ398处理，使心肌细胞率(辅肌动蛋白阳性细胞率)相比化合物未处理时增加(图4)。
<非心肌细胞标志物阳性细胞率(非心肌细胞率)的测定>
使用未冷冻的单细胞悬浮液，按照通过细胞表面标志物进行的非心肌细胞的染色，实施染色、测定、分析。结果发现，通过化合物A、AMG337、ASP5878、BGJ398处理，与化合物未处理相比，非心肌细胞率(CD326、CD31、CD49a中的任意一个为阳性的细胞率)减少(图5)。
试验例2.受体酪氨酸激酶抑制剂对心肌细胞的纯化作用的验证
<向心肌细胞的分化诱导>
人iPS细胞使用与试验例1相同的细胞系，向心肌细胞的分化诱导也通过相同方法进行。分化诱导第8天、第10天、第13天时更换培养基，分化诱导第8天、第10天时通过与试验例1相同的方法更换，分化诱导第13天时通过与试验例1的第10天相同的方法进行。分化诱导第8天、第10天、第13天时，通过与试验例1相同的方法添加评价化合物(下面的表2中所示的实验编号2、3的化合物及浓度)。其中，实验编号3的ASP5878仅在分化诱导第8天和第10天添加。各个实验分别实施4个孔。
[表2]
实验编号 化合物 最终浓度(μM)
1 未处理 -
2 福瑞替尼 2
3 ASP5878 0.02
分化诱导第16天时，通过与试验例1相同的方法将细胞制成单细胞、固定、测定心肌细胞率(肌节α-辅肌动蛋白阳性细胞率)。其结果，通过福瑞替尼、ASP5878处理，使心肌细胞率相比化合物未处理时增加(图6)。
试验例3.受体酪氨酸激酶抑制剂对心肌细胞的纯化作用的验证
<向心肌细胞的分化诱导>
人iPS细胞系使用利用从CTL公司购入的PBMC(LP＿140，Sample ID：20120808)通过游离型载体(搭载基因；OCT3/4，KLF4，SOX2，L-MYC，LIN28，mouse p53DD)制作(参考文献；Okita K，et al.Stem Cells.2012 Nov 29.doi：10.1002/stem.1293)的细胞系。
iPS细胞系的维持培养按照现有方法进行(Okita K，et al.Stem Cells.2012 Nov29.doi：10.1002/stem.1293)。向心肌细胞的分化诱导通过与实施例1相同的方法进行。关于VEGF，以在第10天以后不添加的方式实施。
分化诱导第8天、第10天、第13天时更换培养基，分化诱导第8天、第10天时通过与试验例1相同的方法更换，分化诱导第13天时通过与试验例1的第10天相同的方法更换。分化诱导第8天、第10天、第13天时，通过与试验例1相同的方法添加评价化合物(下面的表3中所示的实验编号2～6的化合物及浓度)。
[表3]
实验编号 化合物 最终浓度(μM)
1 未处理 -
2 化合物A 0.5
3 福瑞替尼 2
4 ZM323881 2
5 克莱拉尼 1
6 克唑替尼 2
分化诱导第17天时，通过与试验例1相同的方法将细胞制成单细胞、测定非心肌细胞率(CD326、CD31、CD49a中的任意一个为阳性的细胞率)。其结果，通过化合物A、福瑞替尼、ZM323881、克莱拉尼、克唑替尼处理，使非心肌细胞率与化合物未处理相比减少(图7)。
试验例4.受体酪氨酸激酶抑制剂对心肌细胞的纯化作用的验证
<向心肌细胞的分化诱导>
人iPS细胞使用与试验例3相同的细胞系，向心肌细胞的分化诱导也通过相同的方法进行。
在分化诱导第8天、第10天、第13天时更换培养基，在分化诱导第8天、第10天时通过与试验例1相同的方法进行更换，在分化诱导第13天时通过与试验例1的第10天相同的方法进行更换。分化诱导第8天、第10天、第13天时，通过与试验例1相同的方添加评价化合物(下面的表4中所示的实验编号2、3的化合物和浓度)。各个实验分别各在4个孔实施。
[表4]
Figure BDA0003852339160000331
Figure BDA0003852339160000341
分化诱导第17天时，将细胞制成单细胞，测定细胞数及心肌细胞率。通过与试验例1相同的方法进行固定、及测定心肌细胞率(肌节α-辅肌动蛋白阳性细胞率)。其结果，通过化合物A、福瑞替尼处理，使心肌细胞率相比未处理时增加(图8)。
将上述单细胞悬浮液加入在1.5mL管中以稀释5倍的方式预先准备好的IMDM培养基中，并颠倒混合，通过细胞计数装置NC-200(Chemometec)测定细胞数。其结果，福瑞替尼处理时，与未处理相比，回收到70％左右的细胞数，化合物A处理时，回收到基本相同数量的细胞数(图9)。
试验例5.受体酪氨酸激酶抑制剂对于心肌细胞的纯化作用的验证
<向心肌细胞的分化诱导>
人iPS细胞使用与试验例3相同的细胞系，向心肌细胞的分化诱导也通过相同方法进行。
在分化诱导第8天、第10天、第13天时更换培养基，在分化诱导第8天、第10天时通过与试验例1相同的方法进行更换，在分化诱导第13天时通过与试验例1的第10天相同的方法进行更换。在分化诱导第8天、第10天、第13天时，通过与试验例1相同的方法添加评价化合物(下面的表5中所示的实验编号2～4的化合物和浓度)。其中，实验编号4的ASP5878仅在分化诱导第8天和第10天添加。各个实验分别各在4个孔实施。
[表5]
实验编号 化合物 最终浓度(μM)
1 未处理 -
2 克莱拉尼 1
3 化合物B 2
4 ASP5878 0.02
分化诱导第16天时，通过与试验例1相同的方法将细胞制成单细胞、固定、测定心肌细胞率(肌节α-辅肌动蛋白阳性细胞率)。其结果，通过克莱拉尼，化合物B(N-{4-[(6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基]-3-氟苯基}-N’-(4-氟苯基)环丙烷-1,1-二甲酰胺)、ASP5878处理，使心肌细胞率(肌节α-辅肌动蛋白阳性细胞率)相比化合物未处理时增加(图10)。
使用上述单细胞悬浮液，按照试验例4所述的方法实施细胞数测定方法。其结果，无论有无化合物处理，回收到的细胞数均未见显著变化(图11)。
试验例6.受体酪氨酸激酶抑制剂对于心肌细胞的纯化作用的验证
<向心肌细胞的分化诱导>
使用通过CiRA制作的临床用iPS细胞系。iPS细胞系的维持培养按照现有方法进行(Okita K，et al.Stem Cells.2012Nov 29.doi：10.1002/stem.1293)。向心肌细胞的分化诱导按照论文(Miki et al，Cell Stem Cell.2015Jun 4；16.doi：10.1016/j.stem.2015.04.005.)所述的方法进行。
在分化诱导第8天、第10天、第14天、第17天、第21天时更换培养基，在分化诱导第8天、第10天时通过与试验例1相同的方法进行更换，分化诱导第14天以后通过与试验例1的第10天相同的方法进行更换。
在分化诱导第14天、第17天、第21天时，通过与试验例1相同的方法添加作为评价化合物之一的化合物A。各个实验分别各在4个孔实施。
[表6]
实验编号 化合物 最终浓度(μM)
1 未处理 -
2 化合物A 0.2
通过与试验例1相同的方法将细胞制成单细胞、固定、及测定心肌细胞率，通过与试验例4相同的方法测定细胞数。其结果，通过化合物A处理，使心肌细胞率相比化合物未处理时增加(图12)，非心肌细胞率相比化合物未处理时减少(图13)。无论有无化合物处理，回收到的细胞数均未见显著变化(图14)。
试验例7.受体酪氨酸激酶抑制剂对于心肌细胞的纯化作用的验证
<向心肌细胞的分化诱导>
人iPS细胞使用通过CiRA制作的临床用iPS细胞系。使用与试验例6相同的细胞系，向心肌细胞的分化诱导也通过相同方法进行。
在分化诱导第8天、第10天、第13天时更换培养基，在分化诱导第8天、第10天时通过与试验例1相同的方法进行更换，在分化诱导第13天时通过与试验例1的第10天相同的方法进行更换。分化诱导第8天、第10天、第13天时，通过与试验例1相同的方法添加评价化合物(下面的表7中所示的实验编号2～9的化合物和浓度)(实验编号1实施2个孔，其它实施1个孔)。
[表7]
实验编号 化合物 最终浓度(μM)
1 未处理 -
2 化合物A 0.5
3 福瑞替尼 2
4 福瑞替尼 0.5
5 ZM323881 2
6 CP-673451 1
7 CP-673451 0.3
8 克唑替尼 2
9 克唑替尼 0.5
分化诱导第17天时，通过与试验例1相同的方法将细胞制成单细胞、固定、测定心肌细胞率(肌节α-辅肌动蛋白阳性细胞率)、测定非心肌细胞率。通过化合物A、福瑞替尼、ZM323881、CP-67351、克唑替尼处理，使心肌细胞率相比化合物未处理时增加(图15)，非心肌细胞率相比化合物未处理时减少(图16)。
试验例8.受体酪氨酸激酶抑制剂对于心肌细胞的纯化作用的验证
<向心肌细胞的分化诱导>
人iPS细胞使用与试验例6相同的细胞系，向心肌细胞的分化诱导也通过相同方法进行。
在分化诱导第8天、第10天、第13天、第17天、第20天时更换培养基，在分化诱导第8天时通过与试验例1的第8天相同的方法进行更换，分化诱导第10天以后通过与试验例1第10天相同的方法进行更换。分化诱导第8天、第10天、第13天、第17天、第20天时，按照表8所述的条件，通过与试验例1相同的方法添加评价化合物克莱拉尼。实验编号4在分化诱导第8天以后添加化合物，实验编号2、3在分化诱导第10天以后添加化合物，实验编号5在分化诱导第13天以后添加化合物。实验编号1实施4个孔，实验编号2、3实施3个孔，实验编号4、5实施1个孔。
[表8]
实验编号 化合物 最终浓度(μM) 添加开始日
1 未处理 - -
2 克莱拉尼 0.2 第10天
3 克莱拉尼 1 第10天
4 克莱拉尼 1 第8天
5 克莱拉尼 1 第13天
分化诱导第23天时，通过与试验例1相同的方法将细胞制成单细胞、固定、测定心肌细胞率(肌节α-辅肌动蛋白阳性细胞率)、测定非心肌细胞率。通过克莱拉尼处理，使心肌细胞率增加(图17)，非心肌细胞率减少(图18)。
试验例9.受体酪氨酸激酶抑制剂对于心肌细胞的纯化作用的验证
<向心肌细胞分化诱导>
人iPS细胞使用与试验例6相同的细胞系，向心肌细胞的分化诱导也通过相同方法进行。
分化诱导第8天时通过与试验例1的第8天相同的方法更换培养基，分化诱导第10天、第13天时通过与试验例1的第10天相同的方法更换培养基。分化诱导第8天、第10天、第13天时，通过与试验例1相同的方法添加评价化合物(下面的表9中所述的实验编号2、3的化合物和浓度)。每个实验编号实施4个孔。
[表9]
实验编号 化合物 最终浓度(μM)
1 未处理 -
2 福瑞替尼 0.5
3 克唑替尼 2
分化诱导第17天时，通过与试验例1相同的方法将细胞制成单细胞、固定、测定心肌细胞率(肌节α-辅肌动蛋白阳性细胞率)、测定非心肌细胞率，通过与试验例4相同的方法测定细胞数。通过福瑞替尼、克唑替尼处理，使心肌细胞率(图19)相比化合物未处理时增加，使非心肌细胞率相比化合物未处理时减少(图20)。与化合物未处理相比，克唑替尼中回收8成，福瑞替尼处理中回收大致相同数量的细胞数(图21)。
以上表明，通过将各种受体酪氨酸激酶抑制剂添加于培养基这一简单的处理，就能够在各种细胞系中纯化类胚体中的心肌细胞。
此外，将上述试验例1～9中使用的成为各化合物的标靶的受体酪氨酸激酶示于表10。
[表10]
Figure BDA0003852339160000381
工业适用性
本发明提供一种以高纯度包含心肌细胞的细胞群。该细胞群能够适用于针对心脏疾病的细胞移植疗法及心脏疾病的治疗剂的筛选，因此是有用的。
本申请以在日本申请的日本特愿2020-050268(申请日：2020年3月19日)为基础，其内容全部包含在本说明书中。
序列表
<110> 千纸鹤治疗公司
<120> 心肌细胞的精制方法
<130> PF02522A
<150> JP2020-050268
<151> 2020-03-19
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 720
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EmGFP-编码序列
<400> 1
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1 5 10 15
Ala Gly Gly Ala Gly Cys Thr Gly Thr Thr Cys Ala Cys Cys Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Thr Gly Gly Thr Gly Cys Cys Cys Ala Thr Cys Cys Thr Gly
35 40 45
Gly Thr Cys Gly Ala Gly Cys Thr Gly Gly Ala Cys Gly Gly Cys Gly
50 55 60
Ala Cys Gly Thr Ala Ala Ala Cys Gly Gly Cys Cys Ala Cys Ala Ala
65 70 75 80
Gly Thr Thr Cys Ala Gly Cys Gly Thr Gly Thr Cys Cys Gly Gly Cys
85 90 95
Gly Ala Gly Gly Gly Cys Gly Ala Gly Gly Gly Cys Gly Ala Thr Gly
100 105 110
Cys Cys Ala Cys Cys Thr Ala Cys Gly Gly Cys Ala Ala Gly Cys Thr
115 120 125
Gly Ala Cys Cys Cys Thr Gly Ala Ala Gly Thr Thr Cys Ala Thr Cys
130 135 140
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145 150 155 160
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210 215 220
Cys Cys Cys Cys Gly Ala Cys Cys Ala Cys Ala Thr Gly Ala Ala Gly
225 230 235 240
Cys Ala Gly Cys Ala Cys Gly Ala Cys Thr Thr Cys Thr Thr Cys Ala
245 250 255
Ala Gly Thr Cys Cys Gly Cys Cys Ala Thr Gly Cys Cys Cys Gly Ala
260 265 270
Ala Gly Gly Cys Thr Ala Cys Gly Thr Cys Cys Ala Gly Gly Ala Gly
275 280 285
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290 295 300
Ala Gly Gly Ala Cys Gly Ala Cys Gly Gly Cys Ala Ala Cys Thr Ala
305 310 315 320
Cys Ala Ala Gly Ala Cys Cys Cys Gly Cys Gly Cys Cys Gly Ala Gly
325 330 335
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Ala Cys Ala Cys Cys Cys Thr Gly Gly Thr Gly Ala Ala Cys Cys Gly
355 360 365
Cys Ala Thr Cys Gly Ala Gly Cys Thr Gly Ala Ala Gly Gly Gly Cys
370 375 380
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405 410 415
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420 425 430
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450 455 460
Cys Gly Ala Cys Ala Ala Gly Cys Ala Gly Ala Ala Gly Ala Ala Cys
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485 490 495
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515 520 525
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Ala Cys Thr Ala Cys Cys Ala Gly Cys Ala Gly Ala Ala Cys Ala Cys
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Cys Cys Cys Cys Ala Thr Cys Gly Gly Cys Gly Ala Cys Gly Gly Cys
565 570 575
Cys Cys Cys Gly Thr Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly Cys Cys Cys Gly
580 585 590
Ala Cys Ala Ala Cys Cys Ala Cys Thr Ala Cys Cys Thr Gly Ala Gly
595 600 605
Cys Ala Cys Cys Cys Ala Gly Thr Cys Cys Gly Cys Cys Cys Thr Gly
610 615 620
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Ala Gly Ala Ala Gly Cys Gly Cys Gly Ala Thr Cys Ala Cys Ala Thr
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<211> 711
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mCherry-编码序列
<400> 2
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1 5 10 15
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65 70 75 80
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Gly Cys Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Ala Ala Gly Gly Thr Gly Ala
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275 280 285
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Cys Ala Cys Ala Ala Cys Gly Ala Gly Gly Ala Cys Thr Ala Cys Ala
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Cys Gly Ala Ala Cys Gly Cys Gly Cys Cys Gly Ala Gly Gly Gly Cys
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690 695 700
Cys Ala Ala Gly Thr Ala Gly
705 710

Claims (9)

1.一种制造包含心肌细胞的细胞群的方法，其包括：
(1)使包含心肌细胞或心肌祖细胞与其它细胞的细胞群与受体酪氨酸激酶抑制剂接触的步骤，其中，所述受体酪氨酸激酶抑制剂不包括EGF受体抑制剂，该细胞群是将多能干细胞在心肌细胞分化用培养基中培养得到的；和
(2)培养该细胞群的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(1)中细胞群与受体酪氨酸激酶抑制剂的接触在多能干细胞分化诱导开始后第4天进行。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述步骤(1)中细胞群与受体酪氨酸激酶抑制剂的接触进行1天以上。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，所述抑制剂是针对选自VEGF受体、PDGF受体、HGF受体和FGF受体中的至少一种受体酪氨酸激酶的抑制剂。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，所述抑制剂为选自N-[5-({2-[(环丙烷羰基)氨基]咪唑并[1,2-b]哒嗪-6-基}氧基)-2-甲基苯基]-1,3-二甲基-1H-吡唑-5-甲酰胺、N-{4-[(6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基]-3-氟苯基}-N’-(4-氟苯基)环丙烷-1,1-二甲酰胺、AMG337、ASP5878、BGJ398、福瑞替尼、ZM323881、CP-673451、克莱拉尼和克唑替尼中的至少一种。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，所述多能干细胞为人工多能干细胞。
7.一种细胞群，其包含通过权利要求1～6中任一项所述的方法得到的心肌细胞。
8.一种细胞移植治疗剂，其含有权利要求7所述的细胞群。
9.一种精制心肌细胞的方法，其包括：
(1)使包含心肌细胞或心肌祖细胞与其它细胞的细胞群与受体酪氨酸激酶抑制剂接触的步骤，该细胞群是将多能干细胞在心肌细胞分化用培养基中培养得到的；和
(2)培养该细胞群的步骤。
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