CN104508125B - 用于产生睫状边缘带样结构的方法 - Google Patents

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Abstract

提供用于产生包含睫状边缘带样结构的细胞聚集体的方法等，所述方法的特征在于包括在含有Wnt信号传递途径激动剂的无血清培养基或血清培养基中，将包含视网膜组织的细胞聚集体仅培养一段时间直至出现表达RPE65基因的细胞，并随后在不含有Wnt信号传递途径激动剂的无血清培养基或血清培养基中培养“其中不出现表达RPE65基因的细胞的细胞聚集体”的步骤，在所述视网膜组织中Chx10阳性细胞以20%或更高的比例存在。根据本发明，可以高效产生睫状边缘带样结构。

Description

用于产生睫状边缘带样结构的方法
技术领域
本发明涉及用于产生睫状边缘带样结构的方法等。
背景技术
已知体内视网膜的睫状边缘带为结构形成和视网膜组织维持执行重要功能（参见例如，非专利文件1），并且例如，已知Rdh10基因（非专利文件2）和Otx1基因（非专利文件1）是睫状边缘带的基因标志物。然而，没有已知的用于从多能干细胞高效产生该睫状边缘带样结构的方法。
[文件列表]
[非专利文件]
专利文件1：W. Zac Stephens, Megan Senecal, Minhtu Nguyen,和TatjanaPiotrowski (2010) Loss of adenomatous polyposis coli (apc) Results in anExpanded Ciliary Marginal Zone in the Zebrafish Eye. DEVELOPMENTAL DYNAMICS卷:239, 页:2066-2077
专利文件2：Fumi Kubo和Shinichi Nakagawa (2009) Hairy1 acts as a nodedownstream of Wnt signaling to maintain retinal stem cell-like progenitorcells in the chick ciliary marginal zone. Development 卷:136, 页:1823-1833。
发明概述
本发明待解决的问题
已存在开发用于高效产生睫状边缘带样结构的方法的期望。
解决问题的方法
考虑到该情形，本发明人已经进行了深入研究并实现本发明。
尤其是，本发明提供：
1. 用于产生包含睫状边缘带样结构的细胞聚集体的方法，其包括在各自含有作用于Wnt信号途径的物质的无血清培养基或含血清培养基中，将包含视网膜组织的细胞聚集体仅在出现表达RPE65基因的细胞之前培养一段时间，随后在各自不含有作用于Wnt信号途径的物质的无血清培养基或含血清培养基中培养因此获得的“其中不出现表达RPE65基因的细胞的细胞聚集体”的步骤，在所述视网膜组织中Chx10阳性细胞以所述组织的20%或更高的比例存在（在下文中，有时候称为本发明的产生方法）；
2. 上述项目1的产生方法，其中出现表达RPE65基因的细胞之前的一段时间是这样的一段时间，在所述时间内Chx10阳性细胞以组织的50%-1%的比例存在于视网膜组织中，并且其中不出现表达RPE65基因的细胞的细胞聚集体是其中Chx10阳性细胞以组织的50%-1%的比例存在于视网膜组织中的细胞聚集体；
3. 上述项目2的产生方法，其中在各自不含有作用于Wnt信号途径的物质的无血清培养基或含血清培养基中培养因此获得的“其中不出现表达RPE65基因的细胞的细胞聚集体”，直至视网膜组织中存在的Chx10阳性细胞的比例达到所述组织的50%或更高；
4. 上述项目1-3中任一项的产生方法，其中所述视网膜组织来源于人多能干细胞；
5. 通过上述项目1-4中任一项的产生方法产生的包含睫状边缘带样结构的细胞聚集体作为用于评估毒性或药物效力的试剂的用途；
6. 通过上述项目1-4中任一项的产生方法产生的包含睫状边缘带样结构的细胞聚集体作为用于移植的生物材料的用途；
等。
发明效果
根据本发明的产生方法，可以高效产生睫状边缘带样结构。在通过本发明的产生方法产生的包含睫状边缘带样结构的细胞聚集体中，所述睫状边缘带样结构充当前进区起功能，并且可以高效形成在睫状边缘带样结构附近具有层结构的连续神经视网膜。
附图简述
图1是这样的图，其显示了在含有作用于Wnt信号途径的物质的无血清培养基中悬浮培养之前细胞聚集体的冷冻切片中表达Rax基因的细胞的GFP荧光图像。
图2是这样的图，其显示了在含有作用于Wnt信号途径的物质的无血清培养基中悬浮培养之前细胞聚集体的冷冻切片使用抗Chx10抗体的荧光免疫染色图像。图1（显示全部视网膜组织的存在）和图2（显示Chx10阳性细胞的存在）的比较证实了加入作用于Wnt信号途径的物质之前在全部的约40%中Chx10阳性细胞的存在。
图3是这样的图，其显示了在含有作用于Wnt信号途径的物质的无血清培养基中悬浮培养后的第3天细胞聚集体的冷冻切片中表达Rax基因的细胞的GFP荧光图像。
图4是这样的图，其显示了在含有作用于Wnt信号途径的物质的无血清培养基中悬浮培养后的第3天细胞聚集体的冷冻切片使用抗Chx10抗体的荧光免疫染色图像。图3（显示全部视网膜组织的存在）和图4（显示Chx10阳性细胞的存在）的比较揭示了向培养基中加入作用于Wnt信号途径的物质后的3天中仅在全部的约3%中的Chx10阳性细胞的存在，由此可以证实清楚的降低。
图5是这样的图，其显示了在含有作用于Wnt信号途径的物质的无血清培养基中悬浮培养3天，随后在不含有作用于Wnt信号途径的物质的含血清培养基中悬浮培养39天后细胞聚集体的冷冻切片中表达Rax基因的细胞的GFP荧光图像。
图6是这样的图，其显示了在含有作用于Wnt信号途径的物质的无血清培养基中悬浮培养3天，随后在不含有作用于Wnt信号途径的物质的含血清培养基中悬浮培养39天后细胞聚集体的冷冻切片使用抗Rdh10抗体的荧光免疫染色图像。图5（显示全部视网膜组织的存在）和图6（显示Rdh10阳性细胞的存在）的比较证实了通过加入作用于Wnt信号途径的物质培养3天，随后在不含有作用于Wnt信号途径的物质的含血清培养基中培养得到的Rdh10阳性细胞的存在。
图7是这样的图，其显示了在含有作用于Wnt信号途径的物质的无血清培养基中悬浮培养3天，随后在不含有作用于Wnt信号途径的物质的含血清培养基中悬浮培养50天后细胞聚集体的冷冻切片中表达Rax基因的细胞的GFP荧光图像。
图8是这样的图，其显示了在含有作用于Wnt信号途径的物质的无血清培养基中悬浮培养3天，随后在不含有作用于Wnt信号途径的物质的含血清培养基中悬浮培养50天后细胞聚集体的冷冻切片使用抗Rdh10抗体的荧光免疫染色图像。
图9是这样的图，其显示了在含有作用于Wnt信号途径的物质的无血清培养基中悬浮培养3天，随后在不含有作用于Wnt信号途径的物质的含血清培养基中悬浮培养50天后细胞聚集体的冷冻切片使用抗Otx1抗体的荧光免疫染色图像。图7（显示全部视网膜组织的存在）、图8（显示Rdh10阳性细胞的存在）和图9（显示Otx1阳性细胞的存在）的比较证实了通过加入作用于Wnt信号途径的物质培养3天，随后在不含有作用于Wnt信号途径的物质的含血清培养基中培养得到的Rdh10阳性细胞和Otx1阳性细胞的存在。
图10显示了含有在如下所示制备的细胞聚集体中含有的睫状边缘带样结构的区域的冷冻切片的染色图像。将在悬浮培养开始后第18天的细胞聚集体在含有作用于Wnt信号途径的物质的无血清培养基中悬浮培养3天，并且在不含有作用于Wnt信号途径的物质的含血清培养基中悬浮培养46天，然后在存在BrdU的情况下培养1天，然后在不存在BrdU的情况下培养13天，并在存在EdU (Invitrogen)的情况下培养1天。制备所获得的细胞聚集体的冷冻切片并使其进行使用抗Ki67抗体（左图）或抗BrdU抗体（右图）的荧光免疫染色或利用EdU的显色反应（中间的图）。
图11显示了含有在如下所示制备的细胞聚集体中含有的睫状边缘带样结构的区域的冷冻切片的染色图像。将在悬浮培养开始后第18天的细胞聚集体在含有作用于Wnt信号途径的物质的无血清培养基中悬浮培养3天，并且在不含有作用于Wnt信号途径的物质的含血清培养基中悬浮培养46天，然后在存在BrdU的情况下培养1天，然后在不存在BrdU的情况下培养13天，并在存在EdU (Invitrogen)的情况下培养1天，在不存在EdU的情况下进一步培养13天。制备所获得的细胞聚集体的冷冻切片并使其进行使用抗Ki67抗体（左图）或抗BrdU抗体（右图）或抗Rdh10抗体（下图）的荧光免疫染色，或利用EdU的显色反应（中间的图）。
图12是这样的图，其显示了通过使在悬浮培养开始后第18天的细胞聚集体在含有作用于Wnt信号途径的物质的无血清培养基中悬浮培养3天，并在不含有作用于Wnt信号途径的物质的含血清培养基中悬浮培养75天获得的细胞聚集体的分析。
图12A是所述条件下细胞聚集体的实例，并显示了没有睫状边缘带样结构(CMZ)的细胞聚集体的相差图像（A，左列，上图）、没有睫状边缘带样结构的细胞聚集体中表达Crx基因的细胞的GFP荧光图像（A，左列，下图）、含有睫状边缘带样结构的细胞聚集体的相差图像（A，右列，上图）、和含有睫状边缘带样结构的细胞聚集体中表达Crx基因的细胞的GFP荧光图像（A，右列，下图）。
图12B是与没有睫状边缘带样结构(CMZ-)的细胞聚集体和具有睫状边缘带样结构(CMZ+)的细胞聚集体相关的图像，其显示了通过使用表达Crx基因的细胞的形成作为指标，在不少于10%的细胞聚集体周围中含有连续的分层神经视网膜的细胞聚集体比例的测定结果。
进行本发明的方式
下文详细解释了用于进行本发明的方式。
在本发明中，“干细胞”的实例包括即使在细胞分裂后仍然维持相同分化能力并且当组织损伤时可以再生组织的细胞。在本文中，“干细胞”可以是胚胎干细胞（ES细胞）或组织干细胞（也称为组织干细胞、组织特异性干细胞或成体干细胞），或人工多能干细胞（iPS细胞：诱导型多能干细胞），但不限于这些。如从干细胞来源的组织细胞可以再生组织的事实中所理解的，已知干细胞可以分化成与活体中的正常细胞接近的正常细胞。
本发明中“多能干细胞”的实例包括可以在体外培养并且具有分化成构成除胎盘以外的活体的任何细胞（三胚层（外胚层、中胚层、内胚层）来源的组织）的能力（多能性）的干细胞，包括胚胎干细胞（ES细胞）。从受精卵、克隆胚胎、生殖干细胞和组织中的干细胞获得“多能干细胞”。其还包括在将若干种基因引入体细胞后具有与胚胎干细胞类似的人工多能性的细胞（也称为人工多能干细胞）。可以通过本身已知的方法产生多能干细胞。产生方法的实例包括在Cell 131(5) 第861-872页(2007)、Cell 126(4) 第663-676页(2006)等中描述的方法。
本发明中“胚胎干细胞（ES细胞）”的实例包括具有自我复制能力和多能性(multipotency)（即，“多能性(pluripotency)”）的干细胞，其是来源于早期胚胎的多能干细胞。胚胎干细胞首先在1981年建立并且自从1989年以来还已经应用于产生敲除小鼠。在1998年，建立了人胚胎干细胞，其也用于再生医学。
本发明中“人工多能干细胞”的实例包括通过表达若干种基因，如Oct3/4、Sox2、Klf4和Myc直接重编程已分化的细胞如成纤维细胞等诱导具有多能性的细胞，其由Yamanaka等在2006年在小鼠细胞中建立 (Takahashi K, Yamanaka S. Cell.2006, 126(4), 第663-676页)。在2007年，还在人成纤维细胞中建立了人工多能干细胞，并且其具有与胚胎干细胞相似的多能性(Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, Narita M, IchisakaT, Tomoda K, Yamanaka S. Cell.2007, 131(5), 第861-872页; Yu J, Vodyanik MA,Smuga-Otto K, Antosiewicz-Bourget J, Frane JL, Tian S, Nie J, Jonsdottir GA,Ruotti V, Stewart R, Slukvin II, Thomson JA., Science.2007, 318(5858), 第1917-1920页; Nakagawa M, Koyanagi M, Tanabe K, Takahashi K, Ichisaka T, AoiT, Okita K, Mochiduki Y, Takizawa N, Yamanaka S. Nat Biotechnol., 2008, 26(1), 第101-106页)。
可以从指定机构获得多能干细胞，或者可以购买市售产品。例如，从KyotoUniversity的Institute for Frontier Medical Sciences获得人胚胎干细胞，KhES-1、KhES-2和KhES-3。可分别从RIKEN获得EB5细胞（其为小鼠胚胎干细胞），和从ATCC获得D3细胞系。
可以通过根据本身已知的方法培养来维持多能干细胞。例如，可以使用KnockoutSerum Replacement (KSR)通过培养来维持人干细胞。例如，可以通过加入胎牛血清(FCS)和LIF，且没有饲养细胞的培养来维持小鼠干细胞。
本发明中“组织”的实例包括细胞群的结构，其具有这样的构象，其中多于一种类型的形状和性质不同的细胞以指定模式进行立体成形。
在发明中，“视网膜组织”的实例包括视网膜组织等，其中在体内视网膜中构成各视网膜层的至少两种或多种类型的细胞，如光受体、水平细胞、双极细胞、无长突细胞、视网膜神经节细胞、其前体细胞、其视网膜祖细胞等在层中立体排列。对于各细胞，可以通过已知方法，例如存在或不存在细胞标志物的表达或其水平等证实哪种细胞构成哪一视网膜层。
视网膜细胞标志物的实例包括Rax (视网膜的祖细胞)、PAX6 (祖细胞)、Chx10(神经视网膜祖细胞)、神经上皮干细胞蛋白(在下丘脑神经元的祖细胞中表达，但不在视网膜祖细胞中表达)、Sox1(在下丘脑神经上皮中表达，但不在视网膜中表达)、Crx (光受体的前体细胞)等。上述视网膜层特异神经元的标志物的实例包括Chx10(神经视网膜前体细胞或双极细胞)、L7(双极细胞)、Tuj1(神经节细胞)、Brn3(神经节细胞)、钙视网膜蛋白(无长突细胞)、钙结合蛋白(水平细胞)、视紫红质(光受体)、恢复蛋白(光受体)、RPE65(色素上皮)、Mitf(色素上皮)、Nrl(视杆细胞)、Rxr-γ(视锥细胞)等。
本发明中的“视网膜层”表示构成视网膜的各层。其具体实例包括视网膜色素上皮层、光受体层、外界膜、外核层、外网层、内核层、内网层、神经节细胞层、神经纤维层和内界膜。
本发明中“睫状边缘带(CMZ)”的实例包括体内视网膜中的视网膜组织（尤其是，神经视网膜）和视网膜色素上皮的边缘区中存在的组织，其是包括视网膜的组织干细胞（视网膜干细胞）的区域。睫状边缘带的标志物基因的实例包括Rdh10基因(阳性)、Otx1基因(阳性)等。已知睫状边缘带在向视网膜组织供应视网膜祖细胞和分化的细胞，维持视网膜组织结构等中起重要作用。
本发明中“前进区”的实例包括定位在一部分组织中的未分化的细胞群，并且其实例包括具有在发育和再生过程中持续生长以促进组织生长为整体的性质和/或通过分泌生长因子等促进周围组织生长的性质的细胞群。前进区的具体实例包括在肢芽尖端的未分化的细胞群。
本发明中“聚集体”的实例包括在培养基中分散但聚集以形成聚集体的大量细胞。本发明中的“聚集体”包括由在悬浮培养开始时分散的细胞形成的聚集体和在悬浮培养开始时早已经形成的聚集体。
当细胞聚集形成细胞聚集体并且聚集体进行悬浮培养时，“形成聚集体”表示“快速聚集指定数量的分散的干细胞”以形成性质上均匀的细胞聚集体。
实验操作以形成聚集体的实例包括涉及通过使用具有小孔的平板（96孔板）、微孔等将细胞保持在小空间中的方法、涉及通过使用小的离心管短时间离心聚集细胞的方法等。
可以从作为基础培养基用于培养动物细胞的培养基中制备待用于本发明中的“培养基”。基础培养基的实例包括可以用于培养动物细胞的培养基，如BME培养基、BGJb培养基、CMRL1066培养基、Glasgow MEM培养基、改良的MEM Zinc Option培养基、IMDM培养基、Medium199培养基、Eagle MEM培养基、αMEM培养基、DMEM培养基、ham培养基、RPMI1640培养基、Fischer’s培养基及其混合培养基等。
本发明中“无血清培养基”的实例包括没有未调整的或未纯化的血清的培养基。在本发明中，除非其中含有未调整的或未纯化的血清，无血清培养基中还包括含有纯化的血液来源组分和动物组织来源组分（例如，生长因子）的培养基。
为了避免复杂的制剂，加入适当量（例如，1-20%）的市售KSR的无血清培养基（GMEM或DMEM，0.1 mM 2-巯基乙醇，0.1 mM非必需氨基酸混合物，1 mM丙酮酸钠）可以作为无血清培养基被优选提及。
此外，无血清培养基可以含有血清替代物。血清替代物的实例包括白蛋白、转铁蛋白、脂肪酸、胶原前体、微量元素、2-巯基乙醇或3’巯基甘油(thiolglycerol)、适当含有这些的等同物等的一种替代物等。可以通过例如WO98/30679等中描述的方法制备此类血清替代物。此外，血清替代物可以是市售产品。此类市售血清替代物的实例包括浓缩的化学定义的脂质（由Gibco制造）、Glutamax（由Gibco制造）等。
待用于悬浮培养的“无血清培养基”可以含有脂肪酸、脂质、氨基酸（例如，非必需氨基酸）、维生素、生长因子、细胞因子、抗氧化剂、2-巯基乙醇、丙酮酸、缓冲剂、无机盐等。
本发明中“含血清培养基”的实例包括含有未调整的或未纯化的血清的培养基。培养基可以含有脂肪酸、脂质、氨基酸（例如，非必需氨基酸）、维生素、生长因子、细胞因子、抗氧化剂、2-巯基乙醇、丙酮酸、缓冲剂、无机盐等。
本发明中“悬浮培养”的实例包括在对细胞培养容器非粘附的条件下在培养基中培养细胞聚集体等。
待用于悬浮培养的细胞培养容器没有特别限定，只要它使得细胞能够悬浮培养。此类细胞培养容器的实例包括烧瓶、组织培养瓶、皿、培养皿、组织培养皿、复合皿(multidish)、微量培养板、微孔板、微孔、复合板(multiplate)、多孔板、腔室玻片、培养皿(schale)、管、托盘、培养袋、滚瓶等。优选的容器是细胞非粘附容器。
作为细胞非粘附容器，可以使用其表面未被人工处理以提高细胞粘附性（例如，利用细胞外基质的包被处理等）的一种容器等。
在本发明中待加入培养基中的“血清”的实例包括哺乳动物血清，如牛血清、小牛血清、胎牛血清、马血清、小马血清、胎马血清、兔血清、小兔血清、胎兔血清和人血清等。
本发明的产生方法特征性地包括在各自含有作用于Wnt信号途径的物质的无血清培养基或含血清培养基中，将包含视网膜组织的细胞聚集体仅在出现表达RPE65基因的细胞之前培养一段时间，随后在各自不含有作用于Wnt信号途径的物质的无血清培养基或含血清培养基中培养因此获得的“其中不出现表达RPE65基因的细胞的细胞聚集体”的步骤，在所述视网膜组织中Chx10阳性细胞以所述组织的20%或更高的比例存在。通过本发明的产生方法产生的“包含睫状边缘带样结构的细胞聚集体”可用作用于评估化学物质等的毒性或药物效力的试剂，或用作用于旨在细胞治疗等的测试或治疗的材料。
待在本发明的产生方法中用作起始材料的“包含视网膜组织的细胞聚集体”是这样的细胞聚集体，其中Chx10阳性细胞以组织的20%或更高的比例存在于视网膜组织中。上述“Chx10阳性细胞的比例”是例如优选不低于40%，更优选不低于60%，特别优选不低于80%。
例如，可以从多能干细胞（优选人多能干细胞）制备待在本发明的产生方法中用作起始材料的“包含视网膜组织的细胞聚集体”。尤其是，例如，其可以通过包括以下步骤（1）-（3）的方法制备。
（1）第一步，使多能干细胞在含有抑制Wnt信号途径的物质的无血清培养基中进行悬浮培养，以形成多能干细胞的聚集体，
（2）第二步，使在第一步中形成的聚集体在含有基膜制剂的无血清培养基中进行悬浮培养，和
（3）第三步，使在第二步中培养的聚集体在含血清培养基中进行悬浮培养。
待用于第一步中的抑制Wnt信号途径的物质没有特别限定，只要其可以抑制Wnt介导的信号转导。抑制Wnt信号途径的物质的实例包括Dkk1、Cerberus蛋白、Wnt 受体抑制剂、可溶型Wnt受体、Wnt抗体、酪蛋白激酶抑制剂、显性负相Wnt蛋白、CKI-7 (N-(2-氨乙基)-5-氯-异喹啉-8-氨磺酰)、D4476 (4-{4-(2,3-二氢苯并[1,4]二噁英-6-基)-5-吡啶-2-基-1H-咪唑-2-基}苯甲酰胺)、IWR-1-endo(IWR1e)、IWP-2等。抑制Wnt信号途径的物质的浓度仅需要是在该浓度下形成多能干细胞聚集体的浓度。例如，以约0.1 μM-100 μM，优选约1 μM -10 μM，更优选约3 μM的浓度加入抑制Wnt信号途径的常见物质，如IWR1e。
可以在悬浮培养开始之前向无血清培养基中加入，或在悬浮培养开始的几天内（例如5天内）向无血清培养基中加入抑制Wnt信号途径的物质。优选地，在悬浮培养开始的5天内，更优选3天内，最优选悬浮培养开始的同时向无血清培养基中加入抑制Wnt信号途径的物质。此外，从加入抑制Wnt信号途径的物质悬浮培养开始的高达第18天，更优选第12天进行悬浮培养。
可以适当地确定第一步中的培养条件，如培养温度和CO2浓度。尽管培养温度没有特别限定，其是例如约30-40℃，优选约37℃。CO2浓度是例如约1-10%，优选大约5%。
本领域普通技术人员可以适当地确定第一步中多能干细胞的浓度，以更均匀和有效地形成多能干细胞的聚集体。当形成聚集体时，多能干细胞的浓度没有特别限定，只要其允许形成均匀的干细胞聚集体。例如，当使用96孔微孔板使人ES细胞进行悬浮培养时，每孔加入制备成约1×103-约5×104个细胞，优选约3×103-约3×104个细胞，更优选约5×103-约2×104个细胞，最优选大约9×103个细胞的液体，并使平板静置以形成聚集体。
可以根据待使用的多能干细胞适当地确定用于形成聚集体所必需的悬浮培养的时间，只要细胞可以快速聚集。为了形成均匀的聚集体，希望尽可能地短。例如，在人ES细胞的情况下，期望优选在24小时，更优选在12小时内形成聚集体。本领域普通技术人员可以通过控制用于聚集细胞的工具、离心条件等适当地调整用于聚集体形成的时间。
本领域普通技术人员可以基于聚集体的大小和细胞数量、肉眼可见的形态、通过组织染色分析的显微形态及其均匀度、分化和未分化标志物的表达及其均匀度、分化标志物的表达控制及其同步性、聚集体之间分化效率的重复性等确定是否已经形成多能干细胞的聚集体。
待用于第二步中的基膜制剂指含有基膜组成成分的一种制剂，所述基膜组成成分具有控制细胞形态、分化、生长、运动性、功能表达等功能，其与上皮细胞的那些功能类似，当将能够形成基膜的预期细胞在其上涂布并培养时。在本文中，“基膜组成成分”指以在动物组织中上皮细胞层和间质细胞层等之间存在的薄膜形态的细胞外基质分子。例如，可以利用能够溶解细胞的脂质的溶液、碱溶液等去除能够形成基膜的细胞（其通过基膜附着到支持物上）来产生基膜制剂。优选的基膜制剂的实例包括可以作为基膜组分可商购的产品（例如Matrigel（下文中有时候称为Matrigel）），和称为基膜组分的细胞外基质分子（例如，层粘连蛋白、IV型胶原、硫酸乙酰肝素蛋白多糖、内功素等）。
Matrigel是从来源于Engelbreth Holm Swarn (EHS)小鼠肉瘤的基膜制备的产品。Matrigel的主要组分是IV型胶原、层粘连蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白多糖和内功素。除了这些，还含有TGF-β、成纤维细胞生长因子(FGF)、纤溶酶原激活物和EHS肿瘤天然产生的生长因子。 Matrigel的“生长因子减少(GFR)产品”具有比常规Matrigel低的生长因子浓度。在本发明中，优选使用GFR产品。
尽管待加入无血清培养基中用于在第二步中悬浮培养的基膜制剂的浓度没有特别限定，只要稳定维持神经组织（例如，视网膜组织）的上皮结构，但是例如，当使用Martigel时，其优选为培养基的1/20-1/200体积，更优选为大约1/100体积。尽管当干细胞培养开始时可以已经向培养基中加入了基膜制剂，但是优选在悬浮培养开始的5天内，更优选2天内向无血清培养基中加入。
因为在第二步中将使用无血清培养基，所以可以直接使用用于第一步中的无血清培养基，或者可以用新鲜的无血清培养基替换。
当用于第一步的无血清培养基直接用于该步骤时，可以向培养基中加入“基膜制剂”。
可以适当地确定第二步中的培养条件，如培养温度和CO2浓度。尽管培养温度没有特别限定，但其是例如约30-40℃，优选大约37℃。CO2浓度是例如约1-10%，优选大约5%。
因为在第三步中将使用含血清培养基，可以使用在第二步培养中使用的无血清培养基，向其中直接加入血清，或用新鲜的含血清培养基替换。
在悬浮培养开始的第7天或第7天后，更优选开始的第9天或第9天后，最优选开始的第12天或第12天后加入血清。待加入的血清浓度是约1-30%，优选约3-20%，更优选大约10%。
在第三步中，除血清外，可以通过加入作用于Shh信号途径的物质来增加视网膜组织的产生效率。
作用于Shh信号途径的物质没有特别限定，只要其可以增强由Shh介导的信号转导。作用于Shh信号途径的物质的实例包括属于Hedgehog家族的蛋白质（例如，Shh）、Shh受体、Shh受体激动剂、Purmorphamine、SAG等。
用于该步骤中的作用于Shh信号途径的物质的浓度例如，在作用于Shh信号途径上的常见物质，如SAG的情况下，是约0.1 nM-10 μM，优选约10 nM-1 μM，更优选大约100 nM。
呈递因此产生的视网膜组织以覆盖聚集体的表面。可以通过免疫染色方法等证实视网膜组织是否产生。
例如，使第三步中培养的聚集体在含血清培养基中进行悬浮培养。待用于悬浮培养的细胞培养容器的实例包括上文提及的那些。可以适当地确定悬浮培养的培养条件，如培养温度、CO2浓度和O2浓度。尽管培养温度没有特别限定，但其是例如约30-40℃，优选约37℃。CO2浓度是例如约1-10%，优选约5%。O2浓度是例如20-70%，优选20-60%，更优选30-50%。尽管培养期限没有特别限定，但其一般不少于48小时，优选不少于7天。
悬浮培养结束后，利用固定剂，如低聚甲醛(para-formaldehyde)溶液等固定聚集体，并制备冷冻切片。免疫染色所获得的冷冻切片，并证实视网膜组织的层结构的形成。因为视网膜组织的各层由不同的视网膜祖细胞（光受体、水平细胞、双极细胞、无长突细胞、视网膜神经节细胞）构成，可以使用针对在这些细胞中表达的上述标志物的抗体通过免疫染色证实层结构的形成。
可以通过例如以下方法检查如上述产生的细胞聚集体中含有的视网膜组织中的“Chx10阳性细胞的比例”。
(1)首先，制备“包含视网膜组织的细胞聚集体”的冷冻切片。
(2)然后，使用荧光显微镜等观察Rax蛋白质的免疫染色，或当使用通过改变表达Rax基因的细胞以表达荧光蛋白质，如GFP获得的基因重组细胞时，观察上述荧光蛋白质的表达，由此明确表达Rax基因的视网膜组织区域。
(3)使用与其中已经明确了表达Rax基因的视网膜组织区域的冷冻切片相同的部分或邻近部分作为样品，利用核染剂如Dapi对核进行染色。然后，计数上文明确的表达Rax基因的视网膜组织区域中染色核的数量，由此测定视网膜组织区域中细胞的数量。
(4)使用与其中已经明确了表达Rax基因的视网膜组织区域的冷冻切片相同的部分或邻近部分作为样品，免疫染色Chx10蛋白质。计数上文明确的视网膜组织区域中的Chx10阳性细胞的数量。
(5)基于上述(3)和(4)中测量的核的各自数量，将Chx10阳性细胞中核的数量除以上文明确的视网膜组织区域中Chx10阳性细胞中核的数量，由此计算“Chx10阳性细胞的比例”。
在本发明的产生方法中，首先，在各自含有作用于Wnt信号途径的物质的无血清培养基或含血清培养基中，将包含视网膜组织的细胞聚集体仅在出现表达RPE65基因的细胞之前培养一段时间，在所述视网膜组织中Chx10阳性细胞以所述组织的20%或更高的比例存在。
作为本文优选的培养，可以提及悬浮培养。作为本文优选的培养基，可以提及无血清培养基。
可以适当地设定培养条件，如培养温度、CO2浓度。培养温度是例如在约30℃-约40℃范围内，优选例如是大约37℃。CO2浓度是例如在约1%-约10%的范围内，优选例如是大约5%。
当在培养基中培养上述“包含视网膜组织的细胞聚集体”时，待包含于无血清培养基或含血清培养基中的作用于Wnt信号途径的物质没有特别限定，只要其可以增强由Wnt介导的信号转导。作用于Wnt信号途径的物质的具体实例包括属于Wnt家族的蛋白质、Wnt受体、Wnt受体激动剂、GSK3β抑制剂(例如，6-溴靛玉红-3'-肟(BIO)、CHIR99021、Kenpaullone)等。
待包含于无血清培养基或含血清培养基中的作用于Wnt信号途径的物质的浓度在作用于Wnt信号途径的常见物质如CHIR99021的情况下是例如在约0.1 μM-100 μM范围内，优选例如在约1 μM-30 μM范围内，更优选例如是大约3 μM。
在本发明的产生方法中“仅在出现表达RPE65基因的细胞之前培养一段时间”表示在出现表达RPE65基因的细胞之前的整个或部分时期中培养。即，满足在整个或部分时期（任何时期）中培养，在所述时期过程中培养系统中的“包含视网膜组织的细胞聚集体”由基本上不表达RPE65基因的细胞构成。通过使用此类培养，可以获得其中不出现表达RPE65基因的细胞的细胞聚集体。
为了确定该特定时期，“包含视网膜组织的细胞聚集体”用作样品，并且样品中含有的RPE65基因表达的存在或不存在仅需要通过一般的遗传改造方法来测定。尤其是，例如，如下文所述实施例中所述，可以使用针对RPE65蛋白质的抗体，通过使上述“包含视网膜组织的细胞聚集体”的冷冻切片进行免疫染色方法来检查RPE65基因表达的存在或不存在或其水平。
优选的“在出现表达RPE65基因的细胞之前的一段时间”是例如这样的一段时间，在所述时间内Chx10阳性细胞以组织的50%-1%的比例存在于视网膜组织中。在这种情况下，所获得的“其中不出现表达RPE65基因的细胞的细胞聚集体”是这样的细胞聚集体，其中Chx10阳性细胞以组织的50%-1%的比例存在于视网膜组织中。
尽管“在出现表达RPE65基因的细胞之前的一段时间”的天数根据作用于Wnt信号途径的物质的种类、无血清培养基或含血清培养基的种类、其他培养条件等而变化，但其例如是在5天内。上述时期优选为例如，在4天内，更优选例如2天至3天。
然后，在不含有作用于Wnt信号途径的物质的无血清培养基或含血清培养基中培养通过如上述培养获得的“其中不出现表达RPE65基因的细胞的细胞聚集体”。
本文的优选培养是例如悬浮培养。
优选的培养时间的实例包括用于培养直至视网膜组织中存在的Chx10阳性细胞的比例达到组织的50%或更高的时间。
可以适当地设定培养条件，如培养温度、CO2浓度。培养温度是例如在约30℃-约40℃范围内，优选例如是大约37℃。此外，CO2浓度是例如在约1%-约10%的范围内，优选例如是大约5%。
尽管直至获得“包含睫状边缘带样结构的细胞聚集体”的上述培养天数根据无血清培养基或含血清培养基的种类、其他培养条件等而变化，但其例如是在100天内。上述培养天数优选为例如，20天-70天，更优选例如30天-60天。
在因此产生的“包含睫状边缘带样结构的细胞聚集体”中，视网膜色素上皮和视网膜组织（尤其是，神经视网膜）存在于同一细胞聚集体中的睫状边缘带样结构附近。可以通过显微镜观察等容易地证实结构。
可以利用镊子等从上述“包含睫状边缘带样结构的细胞聚集体”中物理切掉视网膜组织（尤其是，神经视网膜）来制备高度纯的视网膜组织（尤其是，神经视网膜）。高度纯的视网膜组织（尤其是，神经视网膜）可以进一步持续培养（尤其是，长期培养例如60天或更长），同时维持其具有的良好组织结构。培养条件如培养温度、CO2浓度、O2浓度可以是一般用于组织培养的那些。在这种情况下，可以在存在血清、已知生长因子、添加剂和促进生长的化学物质等的情况下进行培养。已知生长因子的实例包括EGF、FGF等。促进生长的添加剂的实例包括N2添加物(Invitrogen)、B27添加物(Invitrogen)等。
本发明还包括通过本发明的产生方法产生的包含睫状边缘带样结构的细胞聚集体作为用于评估毒性或药物效力的试剂的用途，通过本发明的产生方法产生的包含睫状边缘带样结构的细胞聚集体作为用于移植等的生物材料的用途。
<包含睫状边缘带样结构的细胞聚集体作为用于评估毒性或药物效力的试剂的用途>
通过本发明的产生方法产生的包含睫状边缘带样结构的细胞聚集体可以用于筛选用于由视网膜细胞病症引起的疾病的治疗药物、用于研究疾病的材料或药物开发材料。其还可用于评估化学物质等的毒性或药物效力，以及研究毒性（如光毒性、神经毒性等）、毒性测试等。
<包含睫状边缘带样结构的细胞聚集体作为用于移植的生物材料的用途>
通过本发明的产生方法产生的包含睫状边缘带样结构的细胞聚集体可以用作用于移植（其用于补充本身处于细胞损伤状态中的患病组织）的生物材料（例如，用于移植操作）等。
实施例
在下文中通过参考实施例（其不解释为限制性的）更详细地解释本发明。
实施例1（使用人ES细胞的含有视网膜组织的细胞聚集体的产生实施例-1）
根据在“Ueno, M.等 PNAS 2006, 103(25), 9554-9559”和“Watanabe, K.等 NatBiotech 2007, 25, 681-686”中描述的方法培养RAX::GFP敲入人ES细胞(来源于KhES-1;Nakano, T.等 Cell Stem Cell 2012, 10(6), 771-785)。作为培养基，使用加入了20%KSR (Knockout Serum Replacement; Invitrogen)、0.1 mM 2-巯基乙醇、1 mM丙酮酸和5-10 ng/ml bFGF的DMEM/F12培养基(Invitrogen)。将上述培养的ES细胞单个分散在0.25%胰蛋白酶-EDTA (Invitrogen)中，并且使单个分散的ES细胞漂浮在100 μl无血清培养基中，达到在非细胞粘附96孔培养板(SUMILON球形板, SUMITOMO BAKELITE CO., LTD.)中每孔9×103个细胞，并在37℃、5% CO2下悬浮培养。然后使用的无血清培养基是通过向G-MEM培养基中加入20% KSR、0.1 mM 2-巯基乙醇、1 mM丙酮酸、20 μM Y27632和Wnt信号途径抑制物质(3 μM IWR1e)获得的无血清培养基。在悬浮培养的过程中，从悬浮培养开始的第2天以每体积1/100的量加入GFR Matrigel (Invitrogen)。在悬浮培养开始的第12天加入每体积1/10的量的胎牛血清和作用于Shh信号途径的物质(100 nM SAG)，并进行悬浮培养共18天。
利用4%的低聚甲醛固定因此产生的细胞聚集体，以产生冷冻切片。使所制备的冷冻切片进行荧光显微镜观察GFP荧光图像（图1）并利用Chx10（其是神经视网膜祖细胞标志物之一）进行免疫染色（图2）。在如上述产生的细胞聚集体中含有的视网膜组织中，在大约40%的组织中发现了Chx10阳性细胞（参见图2）。
实施例2（使用人ES细胞的含有视网膜组织的细胞聚集体的产生实施例-2）
通过与实施例1中的类似的方法，将悬浮培养进行更长的时间。结果，在悬浮培养开始的第25天，也获得了含有视网膜组织（其中在约80%或约90%的组织中发现了Chx10阳性细胞）的细胞聚集体。
实施例3（在含有作用于Wnt信号途径的物质的无血清培养基中培养含有视网膜组织的细胞聚集体）
将在悬浮培养开始的第18天的含有视网膜组织的细胞聚集体（其通过实施例1中所述的方法产生）在含有作用于Wnt信号途径的物质(3 μM CHIR99021)的无血清培养基中悬浮培养3天。
利用4%的低聚甲醛固定所获得的细胞聚集体，以制备冷冻切片。使所制备的冷冻切片进行荧光显微镜观察GFP荧光图像（图3）并利用Chx10（其是神经视网膜祖细胞标志物之一）进行免疫染色（图4）。在上述细胞聚集体（其已经在含有作用于Wnt信号途径的物质的无血清培养基中悬浮培养了3天）中含有的视网膜组织中，仅在约3%的组织中发现了Chx10阳性细胞并且观察到Chx10阳性细胞的比例明显下降（参见图4）。在那时，表达RPE65基因的细胞在上述细胞聚集体中没有出现。
实施例4（在不含有作用于Wnt信号途径的物质的含血清培养基中悬浮培养“其中不出现表达RPE65基因的细胞的细胞聚集体”-1）
将通过实施例1和实施例3中所述方法产生的在悬浮培养开始的第21天（上述“第18天”和“第3天”的总天数）的细胞聚集体（Chx10阳性细胞的比例：约3%）在不含有作用于Wnt信号途径的物质的含血清培养基（含有DMEM/F12、10%胎牛血清、N2添加物、0.5 μM视黄酸等）中在40% O2条件下进一步悬浮培养39天。
利用4%的低聚甲醛固定所获得的细胞聚集体，以制备冷冻切片。使所制备的冷冻切片进行荧光显微镜观察GFP荧光图像（图5）并利用Rdh10（其是睫状边缘带标志物之一）进行免疫染色（图6）。以上文提及的方式，可以证实在不含有作用于Wnt信号途径的物质的含血清培养基中悬浮培养39天后的细胞聚集体中，Rdh10阳性细胞（即，表达作为睫状边缘带样结构的标志物基因的Rdh10基因的细胞）在视网膜组织（尤其是，神经视网膜）和视网膜色素上皮的边缘区中存在的组织中以接近均匀的组区(group region)存在，并且高效产生含有睫状边缘带样结构的细胞聚集体（参见图6）。
实施例5（在不含有作用于Wnt信号途径的物质的含血清培养基中悬浮培养“其中不出现表达RPE65基因的细胞的细胞聚集体”-2）
将通过实施例1和实施例3中所述方法产生的在悬浮培养开始的第21天（上述“第18天”和“第3天”的总天数）的细胞聚集体（Chx10阳性细胞的存在比例：约3%）在不含有作用于Wnt信号途径的物质的含血清培养基（含有DMEM/F12、10%胎牛血清、N2添加物、0.5 μM视黄酸等）中在40% O2条件下，以与实施例4中相同的方式进一步悬浮培养50天。
利用4%的低聚甲醛固定所获得的细胞聚集体，以制备冷冻切片。使所制备的冷冻切片进行荧光显微镜观察GFP荧光图像（图7）并利用Rdh10（图8）或Otx1（图9）（其是睫状边缘带标志物之一）进行免疫染色。以上文提及的方式，在不含有作用于Wnt信号途径的物质的含血清培养基中悬浮培养50天后的细胞聚集体中，Rdh10阳性细胞（即，表达作为睫状边缘带样结构的标志物基因的Rdh10基因的细胞）在视网膜组织（尤其是，神经视网膜）和视网膜色素上皮的边缘区中存在的组织中以接近均匀的组区存在（参见图8），并且Otx1阳性细胞（即，表达作为睫状边缘带样结构的标志物基因的Otx1基因的细胞）也类似地存在（参见图9）。从这些结果可以证实，通过产生方法高效产生含有睫状边缘带样结构的细胞聚集体。
实施例6（含有睫状边缘带样结构的细胞聚集体的增殖能力的分析-1）
将通过实施例1所述方法产生的在悬浮培养开始的第18天的细胞聚集体在含有作用于Wnt信号途径的物质的无血清培养基中悬浮培养3天，然后在不含有作用于Wnt信号途径的物质的含血清培养基中，以与实施例4和实施例5中相同的方式悬浮培养46天。然后，将细胞聚集体在存在BrdU的情况下培养1天，以标记生长的细胞，然后在不存在BrdU的情况下培养13天，并且在存在EdU (Invitrogen)的情况下培养1天。利用4%的低聚甲醛固定所获得的细胞聚集体，以制备冷冻切片。使所制备的冷冻切片进行使用抗Ki67抗体的免疫荧光染色（图10，左图）或使用抗BrdU抗体的免疫荧光染色（图10，右图），或EdU显色反应（图10，中间的图）。
结果，发现以上述方式在不含有作用于Wnt信号途径的物质的含血清培养基中悬浮培养46天后的细胞聚集体中，睫状边缘带样结构是Ki67阳性生长细胞（图10，左图，通过箭显示）。发现90%或更多的生长细胞可以通过EdU吸收1天而被标记，因为90%或更多的Ki67阳性细胞是EdU阳性的（图10，中间的图，箭）。另一方面，因为在睫状边缘带样结构中的Ki67阳性细胞显示弱的BrdU信号（图10，右图，箭），假设上述Ki67阳性细胞在BrdU标记后继续生长14天并稀释被吸收到DNA中的BrdU。从这些结果发现，如上述培养的细胞聚集体中的睫状边缘带样结构是前进区。
实施例7（含有睫状边缘带样结构的细胞聚集体的增殖能力的分析-2）
将通过实施例1中所述方法产生的在悬浮培养开始的第18天的细胞聚集体在含有作用于Wnt信号途径的物质的无血清培养基中悬浮培养3天，然后在不含有作用于Wnt信号途径的物质的含血清培养基中，以与实施例4、实施例5和实施例6中相同的方式悬浮培养46天。然后，将细胞聚集体在存在BrdU的情况下培养1天，以标记生长的细胞，然后在不存在BrdU的情况下培养13天，在存在EdU (Invitrogen)的情况下培养1天，并在不存在EdU的情况下进一步培养13天。产生所获得的细胞聚集体的冷冻切片，并使其进行使用抗Ki67抗体（图11，左图）、抗BrdU抗体（图11，右图）或抗Rdh10抗体（图11，下图）的免疫荧光染色，或EdU显色反应（图11，中间的图）。
结果，发现以上述方式在不含有作用于Wnt信号途径的物质的含血清培养基中悬浮培养46天后的细胞聚集体中，Rdh10阳性的睫状边缘带样结构（图11，下图，通过箭显示）是Ki67阳性的（图11，左图）。发现睫状边缘带样结构中的上述Ki67阳性细胞显示弱的EdU（图11，中间的图）和BrdU（图11，右图）信号。因而，假设上述睫状边缘带样结构中的上述Ki67阳性细胞继续生长27天并且稀释被吸收到DNA中的EdU和BrdU。从这些结果发现，如上述培养的细胞聚集体中的睫状边缘带样结构是前进区。
实施例8（含有睫状边缘带样结构的细胞聚集体中的神经视网膜的形态分析）
将通过实施例1中所述方法产生的在悬浮培养开始的第18天的细胞聚集体在含有作用于Wnt信号途径的物质的无血清培养基中悬浮培养3天，并在不含有作用于Wnt信号途径的物质的含血清培养基中，以与实施例4、实施例5、实施例6和实施例7中相同的方式悬浮培养75天，并分析所获得的细胞聚集体。作为细胞聚集体的一个实施方案，显示了没有睫状边缘带样结构(CMZ)的细胞聚集体的相差图像（A，左列，上图）、没有睫状边缘带样结构的细胞聚集体的表达Crx基因的细胞的GFP荧光图像（A，左列，下图）、含有睫状边缘带样结构的细胞聚集体的相差图像（A，右列，上图），和含有睫状边缘带样结构的细胞聚集体的表达Crx基因的细胞的GFP荧光图像（A，右列，下图）。在含有睫状边缘带样结构的细胞聚集体中表达Crx基因的细胞的GFP荧光图像（A，右列，下图）中，在右下部分发现具有层结构的连续神经视网膜存在于睫状边缘带样结构附近（通过箭显示）。
在没有睫状边缘带样结构(CMZ-)的细胞聚集体中和具有睫状边缘带样结构(CMZ+)的细胞聚集体中，通过使用表达Crx基因的细胞的形态作为指标测量在不少于10%的细胞聚集体周围含有具有层结构的连续神经视网膜的细胞聚集体的比例（图12B）。结果，发现与没有睫状边缘带样结构(CMZ-)的细胞聚集体相比，具有睫状边缘带样结构(CMZ+)的细胞聚集体具有更高比例的含有具有层结构的连续神经视网膜的细胞聚集体。
工业实用性
根据本发明的产生方法，可以高效产生睫状边缘带样结构。在通过本发明的产生方法产生的包含睫状边缘带样结构的细胞聚集体中，睫状边缘带样结构充当前进区起功能，并且具有层结构的连续神经视网膜可以在睫状边缘带样结构附近高频率地形成。
该申请基于在日本提交的专利申请号2012-130521（提交日期：2012年6月8日），其内容完整并入本文。说明书中引用的所有出版物、专利和专利出版物由此通过引用并入。

Claims (4)

1.用于产生包含睫状边缘带样结构的细胞聚集体的方法，其包括在含有增强Wnt信号途径的物质的无血清培养基中，将从多能干细胞制备的且形成这样的视网膜组织的细胞聚集体仅在出现表达RPE65基因的细胞之前培养一段时间，在所述视网膜组织中Chx10阳性细胞以所述组织的20%或更高的比例存在，随后在各自不含有增强Wnt信号途径的物质的含血清替代物的无血清培养基或含血清培养基中培养因此获得的其中不出现表达RPE65基因的细胞且CHx10阳性细胞以降低的比例存在于视网膜组织中的细胞聚集体的步骤，
其中所述形成其中Chx10阳性细胞以所述组织的20%或更高的比例存在的视网膜组织的细胞聚集体是可以通过包括以下步骤（1）至（3）的方法制备的细胞聚集体：
（1）第一步，使多能干细胞在含有抑制Wnt信号途径的物质的无血清培养基中进行悬浮培养，以形成多能干细胞的聚集体，
（2）第二步，使在第一步中形成的聚集体在含有基膜制剂的无血清培养基中进行悬浮培养，和
（3）第三步，使在第二步中培养的聚集体在含血清培养基中进行悬浮培养。
2.权利要求1的产生方法，其中出现表达RPE65基因的细胞之前的一段时间是这样的一段时间，在所述时间内Chx10阳性细胞以组织的50%-1%的比例存在，并且其中不出现表达RPE65基因的细胞且CHx10阳性细胞以降低的比例存在于视网膜组织中的细胞聚集体是其中Chx10阳性细胞以组织的50%-1%的比例存在于视网膜组织中的细胞聚集体。
3.权利要求2的产生方法，其中在各自不含有作用于Wnt信号途径的物质的无血清培养基或含血清培养基中培养因此获得的其中不出现表达RPE65基因的细胞且CHx10阳性细胞以降低的比例存在于视网膜组织中的细胞聚集体，直至视网膜组织中存在的Chx10阳性细胞的比例达到所述组织的50%或更高。
4.权利要求1-3中任一项的产生方法，其中所述视网膜组织来源于人多能干细胞。
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