KR20230154071A - 희소돌기아교세포 전구 세포의 생성 방법 및 이의 용도 - Google Patents
희소돌기아교세포 전구 세포의 생성 방법 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
인간 다능성 줄기 세포를 희소돌기아교세포 전구 세포(OPC)로 분화하는 방법이 제공된다. 또한, 그러한 방법에 의해 얻어진 세포 및 세포 조성물, 및 그러한 세포의 용도가 제공된다. 인간 다능성 줄기 세포를 OPC로 효율적으로 분화하기 위한 방법 및 프로토콜이 추가로 제공된다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2021년 3월 10일에 출원된 미국 가출원 번호 63/159,350의 이익을 주장하며, 이는 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된다.
기술 분야
본 개시내용은 인간 배아 줄기 세포와 같은 다능성 줄기 세포를 먼저 등쪽 척수 전구 표현형을 갖는 신경외배엽 전구 세포로, 이어서 더 나아가 신경교 전구 세포로, 그리고 더 나아가 희소돌기아교세포 전구 세포로 분화시키는 신규한 방법에 관한 것이다. 또한 그러한 방법에 의해 얻어진 세포 및 세포 조성물, 및 그러한 세포의 용도가 제공된다. 본 개시내용은 또한 하나 이상의 마커를 발현하는 본 발명에 따른 방법에 의해 생산된 세포에 관한 것이다.
희소돌기아교세포 전구 세포(OPC)는 뇌와 척수의 심실 영역에서 발생하고 희소돌기아교세포로 성숙하기 전에 발달 중인 CNS로 이동하는 중추신경계(CNS)의 신경교 세포의 아형이다. 성숙한 희소돌기아교세포는 신경 축삭을 절연하는 수초를 생성하고 수초가 손실된 CNS 병변을 재수초화한다. 희소돌기아교세포는 또한 신경 생존을 촉진하는 신경영양 인자의 생성을 포함한 다른 메커니즘을 통해 신경 보호에 기여한다(Wilkins et al., 2001 Glia 36(1):48-57; Dai et al., 2003 JNeurosci. 23(13):5846-53; Du and Dreyfus, 2002 JNeurosci Res. 68(6):647-54). 대부분의 전구 세포와 달리, OPC는 성인 CNS에 풍부하게 남아 있어 새로운 희소돌기아교세포를 생성하는 능력을 유지한다. 따라서, OPC와, OPC로부터 유래된 성숙한 희소돌기아교세포는 탈수초성 및 수초이상성 장애(예컨대 다발성 경화증, 부신백질이영양증 및 부신척수신경병증), 기타 신경퇴행성 장애(예컨대 알츠하이머병, 근위축성 측삭 경화증 및 헌팅턴병) 및 급성 신경학적 손상(예컨대 뇌졸중 및 척수 손상(SCI))에 대한 중요한 치료 표적이다.
배아 줄기 세포(ESC) 및 유도 다능성 줄기 세포(iPSC)와 같은 인간 다능성 줄기 세포를 세포 치료에 사용할 수 있는 OPC로 분화하기 위한 여러 프로토콜이 개발되었다. 이러한 방법은 연구 목적으로 인간 다능성 줄기 세포에서 OPC를 생성하는 데 성공했지만, 기존 프로토콜을 상업적 규모의 임상 생산 공정으로 전환하는 것과 관련된 품질, 확장성 및 제품 비용과 관련된 난제가 남아 있다.
다능성 줄기 세포를 OPC로 분화시키기 위한 개선된 방법이 필요하다. 이상적으로, 그러한 방법은 원하는 품질 속성을 갖는 표적 세포 OPC를 일관되고 재현 가능하게 생산하면서 세포 치료 응용 분야를 위한 충분한 양의 OPC를 생산하기 위해 쉽게 확장 가능해야 한다.
본원에 기재된 다양일 실시양태에서, 본 개시내용은 특히 인간 다능성 줄기 세포, 예컨대 ESC 및 iPSC를 희소돌기아교세포 전구 세포(OPC)로 분화시키기 위한 강력하고 신뢰할 수 있는 프로토콜을 제공한다.
본 개시내용은 부분적으로, 인간 다능성 줄기 세포가 SHH 신호전달에 의해 매개되는 신경외배엽-제한된 전구 세포의 복부화의 부재 하에서 척수 OPC로 용이하고 효율적으로 분화될 수 있다는 발견에 기초한다.
일 양상에서, 본원에 제공된 것은 미분화 다능성 줄기 세포로부터 희소돌기아교세포 전구 세포(OPC)의 집단을 얻는 방법으로서, 상기 방법은 다음을 포함한다: a) 미분화 다능성 인간 배아 줄기 세포(hESC)의 배양물을 얻는 단계; b) hESC의 신경외배엽 세포 및 신경 전구 세포로의 분화를 유도하기에 충분한 배양 조건 하에 제1 기간 동안 미분화 다능성 hESC를 배양하는 단계; 및 c) 신경 전구 세포를 OPC로 분화시키기에 충분한 배양 조건 하에 제2 기간 동안 단계 b)로부터의 신경 전구 세포를 배양하는 단계.
실시양태에서, 방법으로서, 단계 b)에서 다능성 세포는 부착 조직 배양 용기, 또는 현탁 복합체, 또는 둘 모두에서 라미닌에서 배양된다.
실시양태에서, 방법으로서, 다능성 줄기 세포는 인간 배아 줄기 세포(hESC)이다. 실시양태에서, 다능성 줄기 세포는 인간 유도 다능성 줄기 세포(hiPSC)이다.
실시양태에서, 방법으로서, 단계 b)의 미분화 hESC는 도르소모르핀, PD0325901 및 RA(레티노산)의 존재 하에 배양된다. 실시양태에서, AA(아스코르브산) 및 RA(레티노산)의 존재 하에 배양하는 단계를 추가로 포함한다.
실시양태에서, 방법으로서, 단계 b)로부터 신경외배엽 세포는 EGF 및 hsbFGF(열에 안정한 염기성 섬유아세포 성장인자)의 존재 하에 배양된다. 실시양태에서, EGF(표지 성장 인자) 및 PDGF-AA(혈소판 유래 성장 인자 AA)의 존재 하에서 배양하는 단계를 추가로 포함한다.
실시양태에서, 방법으로서, 단계 b)에서의 제1 기간은 약 3일 내지 약 60일이다. 실시양태에서, 제1 기간은 약 10일 내지 약 15일이다. 실시양태에서, 제1 기간은 약 14일이다.
실시양태에서, 방법으로서, 단계 c)로부터 제2 기간은 약 10일 내지 약 60일이다. 실시양태에서, 제2 기간은 약 20일 내지 약 40일이다. 실시양태에서, 제2 기간은 약 28일이다.
실시양태에서, 방법으로서, 단계 b)에서 분화 hESC는 약 14일차에 동결보존된다.
실시양태에서, 방법으로서, 동결보존된 세포는 해동하고, 후속적으로 해동된 세포를 방법의 임의의 나머지 단계에서 배양한다.
실시양태에서, 방법으로서, 제1 기간이 완료될 때 또는 완료될 무렵 단계 b)로부터의 신경 전구 세포를 동결보존하는 단계를 포함한다.
실시양태에서, 방법으로서, 동결보존되는 신경외배엽 세포를 해동하고 단계 c)에 따라 배양한다.
실시양태에서, 방법으로서, 단계 c)의 OPC는 동결보존된다.
실시양태에서, 방법으로서, 동결보존된 OPC는 해동된다.
실시양태에서, 방법으로서, OPC는 신경/신경교 항원 2(NG2), 혈소판 유래 성장 인자 수용체 A(PDGFRα), 및 혈소판 유래 성장 인자 수용체 B(PDGFRβ)로부터 선택된 하나 이상의 마커를 발현한다.
일 양상에서, 본원에 제공된 것은 해동 후 직접 투여하기 위한 희소돌기아교세포 전구 세포(OPC) 조성물을 제형화하는 방법으로서, 상기 방법은: (a) 상기 방법에 따라 OPC를 동결보존 배지에 현탁시켜 세포 현탁액을 형성하는 단계, (b) 세포 현탁액을 동결보존 온도에서 보관하는 단계, 및 (c) 동결보존된 현탁액을 해동하는 단계를 포함한다.
실시양태에서, 방법으로서, 동결보존 배지는 아데노신, 덱스트란-40, 락토비온산, HEPES(N-(2-하이드록시에틸) 피페라진-N'-(2-에탄설폰산)), 수산화나트륨, L-글루타티온, 염화칼륨, 중탄산칼륨, 인산칼륨, 덱스트로스, 수크로스, 만니톨, 염화칼슘, 염화마그네슘, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 디메틸 설폭사이드(DMSO), 및 물 중 하나 이상을 포함한다.
일 양상에서, 본원에 제공된 것은 대상체에게 투여하기 위한 약제학적 조성물로서, 상기 조성물은 상기 방법에 따른 OPC 및 동결보존 배지를 포함한다.
실시양태에서, 약제학적 조성물로서, 동결보존 배지는 아데노신, 덱스트란-40, 락토비온산, HEPES(N-(2-하이드록시에틸) 피페라진-N'-(2-에탄설폰산)), 수산화나트륨, L-글루타티온, 염화칼륨, 중탄산칼륨, 인산칼륨, 덱스트로스, 수크로스, 만니톨, 염화칼슘, 염화마그네슘, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 디메틸 설폭사이드(DMSO), 및 물 중 하나 이상을 포함한다.
일 양상에서, 본원에 제공된 것은 대상체의 척추 손상을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 치료학적 유효량의 상기 약제학적 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
실시양태에서, 대상체에서 척추 손상을 치료하는 방법으로서, 투여는 척수 손상 부위 내로 또는 그에 인접하여 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
실시양태에서, 대상체에서 척추 손상을 치료하는 방법으로서, 투여는 주사에 의한 것이다.
실시양태에서, 대상체에서 척추 손상을 치료하는 방법으로서, 투여는 이식(implantation)에 의한 것이다.
실시양태에서, 대상체에서 척추 손상을 치료하는 방법으로서, 투여는 이식(transplantation)에 의한 것이다.
실시양태에서, 약제학적 조성물로서, 세포의 농도는 약 1×106개의 세포/mL 내지 약 100 x 106개의 세포/mL이다.
실시양태에서, 약제학적 조성물로서, 약제학적 조성물은 약 100 마이크로리터 내지 약 1 밀리리터의 부피로 보관된다.
실시양태에서, 약제학적 조성물로서, 세포의 농도는 100 x 106개의 세포/mL이다.
실시양태에서, 약제학적 조성물로서, 약제학적 조성물은 250 마이크로리터의 부피로 보관된다.
실시양태에서, 약제학적 조성물로서, 약제학적 조성물은 300 마이크로리터의 부피로 보관된다.
실시양태에서, 약제학적 조성물로서, 동결보존 배지는 동결용액이다.
실시양태에서, 약제학적 조성물로서, 동결용액은 CryoStor10(CS10)이다.
실시양태에서, 약제학적 조성물로서, OPC는 신경/신경교 항원 2(NG2), 혈소판 유래 성장 인자 수용체 A(PDGFRα), 및 혈소판 유래 성장 인자 수용체 B(PDGFRβ)로부터 선택된 하나 이상의 마커를 발현한다.
도 1은 본 개시내용의 OPC 해동 및 주사(TAI) 수확 및 동결보존 공정의 개요를 도시하는 흐름도이다.
도 2는 본 개시내용의 개선된 OPC 제조 공정(상단)과 비교한 GPOR(Geron Process of Record) 공정(하단)을 도시한 것이다.
도 3은 본 개시내용의 OPC 분화 과정을 확립하기 위해 사용되는 다능성 줄기 세포로부터 희소돌기아교세포 전구 세포까지의 신호전달 순서 도식을 도시하는 흐름도이다.
도 4는 본 개시내용의 OPC 생산 공정의 흐름과 타임라인을 도시하는 흐름도이다.
도 5는 본 개시내용에 따른 OPC의 100 TAI 바이알을 제조하기 위한 GMP(good manufacturing process)를 도시하는 흐름도이다.
도 6은 10X 배율(좌측) 및 20X 배율(좌측)로 10일차(시간 = 0, 7일)에 신경교 전구 배지(GPM/E)에서 배양된 세포인 대조군 배양 조건의 OPC 모폴로지를 나타낸다.
도 7은 10X 배율(좌측) 및 20X 배율(우쪽)로 처리 후 3일차에 50% GPM/E 및 50% N2.1(IBMX 부재)에서 배양된 세포의 OPC 모폴로지를 나타낸다.
도 8은 10X 배율(좌측) 및 20X 배율(우측)로 12일차에 GPM/E에서 배양된 세포인 대조군 배양 조건의 OPC 모폴로지를 나타낸다.
도 9는 10X 배율(좌측) 및 20X 배율(우측)로 처리 후 5일차에 100% N2.1(2일 동안 IBMX와 함께)에서 배양된 세포의 OPC 모폴로지를 나타낸다.
도 10은 GPM/E에서 배양된 대조군 시스템(좌측)과 100% N2.1(우측)에서 배양된 세포에 대한 13일차(고정 세포)에 Hoechst(청색) 및 MBP(녹색)에 대한 공초점 면역염색을 나타낸다.
도 11은 대규모 배치 OPC 분화 프로토콜의 흐름도이다.
도 12는 35일차부터 그리고 42일차에 시작하는 세포의 모폴로지 사진을 나타낸다. 성공한 그룹과 실패한 그룹의 배양물은 다른 모폴로지에 따라 다르다. ER-ICBRD-02 배치의 세포는 조직화되고 치밀하며 조밀한 세포 모폴로지를 나타내며 방추형의 '실패한' 모폴로지를 획득하지 못했다.
도 13은 해동된 세포 OPC 분화 프로토콜의 흐름도이다.
도 14는 진행 중인 실행의 모폴로지 사진을 ICB 해동된 세포와 비교하여 나타내며, 21일차에는 원래 실행과 유래된 ICB 사이의 모폴로지 유사성을 종합한 것이다.
도 15는 35일 및 42일차에 ICB 해동된 세포와 비교하여 진행 중인 실행의 모폴로지의 사진을 나타낸다. 원래 실행과 유래된 ICB 사이의 모폴로지 유사성이 제시되고, 세포는 치밀하고 조밀한 세포로 조직화된다.
도 2는 본 개시내용의 개선된 OPC 제조 공정(상단)과 비교한 GPOR(Geron Process of Record) 공정(하단)을 도시한 것이다.
도 3은 본 개시내용의 OPC 분화 과정을 확립하기 위해 사용되는 다능성 줄기 세포로부터 희소돌기아교세포 전구 세포까지의 신호전달 순서 도식을 도시하는 흐름도이다.
도 4는 본 개시내용의 OPC 생산 공정의 흐름과 타임라인을 도시하는 흐름도이다.
도 5는 본 개시내용에 따른 OPC의 100 TAI 바이알을 제조하기 위한 GMP(good manufacturing process)를 도시하는 흐름도이다.
도 6은 10X 배율(좌측) 및 20X 배율(좌측)로 10일차(시간 = 0, 7일)에 신경교 전구 배지(GPM/E)에서 배양된 세포인 대조군 배양 조건의 OPC 모폴로지를 나타낸다.
도 7은 10X 배율(좌측) 및 20X 배율(우쪽)로 처리 후 3일차에 50% GPM/E 및 50% N2.1(IBMX 부재)에서 배양된 세포의 OPC 모폴로지를 나타낸다.
도 8은 10X 배율(좌측) 및 20X 배율(우측)로 12일차에 GPM/E에서 배양된 세포인 대조군 배양 조건의 OPC 모폴로지를 나타낸다.
도 9는 10X 배율(좌측) 및 20X 배율(우측)로 처리 후 5일차에 100% N2.1(2일 동안 IBMX와 함께)에서 배양된 세포의 OPC 모폴로지를 나타낸다.
도 10은 GPM/E에서 배양된 대조군 시스템(좌측)과 100% N2.1(우측)에서 배양된 세포에 대한 13일차(고정 세포)에 Hoechst(청색) 및 MBP(녹색)에 대한 공초점 면역염색을 나타낸다.
도 11은 대규모 배치 OPC 분화 프로토콜의 흐름도이다.
도 12는 35일차부터 그리고 42일차에 시작하는 세포의 모폴로지 사진을 나타낸다. 성공한 그룹과 실패한 그룹의 배양물은 다른 모폴로지에 따라 다르다. ER-ICBRD-02 배치의 세포는 조직화되고 치밀하며 조밀한 세포 모폴로지를 나타내며 방추형의 '실패한' 모폴로지를 획득하지 못했다.
도 13은 해동된 세포 OPC 분화 프로토콜의 흐름도이다.
도 14는 진행 중인 실행의 모폴로지 사진을 ICB 해동된 세포와 비교하여 나타내며, 21일차에는 원래 실행과 유래된 ICB 사이의 모폴로지 유사성을 종합한 것이다.
도 15는 35일 및 42일차에 ICB 해동된 세포와 비교하여 진행 중인 실행의 모폴로지의 사진을 나타낸다. 원래 실행과 유래된 ICB 사이의 모폴로지 유사성이 제시되고, 세포는 치밀하고 조밀한 세포로 조직화된다.
상세한 설명
이 설명은 본 개시내용이 구현될 수 있는 모든 상이한 방식, 또는 본 개시내용에 추가될 수 있는 모든 특징들에 대한 상세한 카탈로그가 되도록 의도되지 않는다. 예를 들어, 일 실시양태와 관련하여 설명된 특징은 다른 실시양태에 통합될 수 있고, 특정 실시양태와 관련하여 설명된 특징은 그 실시양태로부터 삭제될 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 본 개시내용의 일부 실시양태에서, 본원에 설명된 임의의 특징 또는 특징의 조합이 배제되거나 생략될 수 있음을 고려한다. 또한, 본원에 제안된 다양일 실시양태에 대한 수많은 변형 및 추가가 본 개시내용에 비추어 당업자에게 명백할 것이며, 이는 본 개시내용으로부터 벗어나지 않는다. 다른 경우에, 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않기 위해 잘 알려진 구조, 인터페이스, 및 공정을 상세히 설명하지 않았다. 본 명세서의 어떤 부분도 본 발명의 전체 범위의 임의의 부분의 부인에 영향을 미치는 것으로 해석되는 것은 아니다. 따라서, 다음의 설명은 본 개시내용의 일부 특정 양상을 설명하기 위한 것이며, 이들의 모든 순열, 조합 및 변형을 철저하게 명시하는 것은 아니다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 개시내용이 속하는 당업자가 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원의 개시내용의 설명에 사용된 용어는 단지 특정 실시양태를 설명하기 위한 목적이며, 본 개시내용을 제한하려는 의도가 아니다
본원에 인용된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참고문헌은 그 전체가 참조로 포함된다.
문맥에 달리 나타내지 않는 한, 본원에 기재된 개시내용의 다양한 특징이 임의의 조합으로 사용될 수 있다는 것이 구체적으로 의도된다. 더욱이, 본 개시내용은 또한 본 개시내용의 일부 실시양태에서, 본원에 설명된 임의의 특징 또는 특징의 조합이 배제되거나 생략될 수 있음을 고려한다.
본원에 개시된 방법은 기재된 방법을 달성하기 위한 하나 이상의 단계 또는 동작을 포함할 수 있다. 방법 단계 및/또는 동작은 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 서로 상호교환될 수 있다. 즉, 양상의 적절한 작동을 위해 특정 단계 또는 동작의 순서가 요구되지 않는 한, 특정 단계 및/또는 동작의 순서 및/또는 사용은 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 수정될 수 있다.
I. 정의
본 개시내용 및 첨부된 청구범위의 설명에서 사용된 바와 같이, 단수형 "a", "an" 및 "the"는 문맥상 명백하게 달리 나타내지 않는 한, 복수형도 포함하도록 의도된다.
본원에 사용된 바와 같이, "및/또는"은 연관된 나열된 항목들 중 하나 이상에 대한 임의의 및 모든 가능한 조합뿐만 아니라 대안("또는")으로 해석될 때 조합의 결여를 지칭하고 포괄한다.
백분율, 밀도, 부피 등과 같은 측정 가능한 값을 언급할 때 본원에 사용된 용어 "약" 및 "대략"은 명시된 양의 ± 10%, ± 5%, ± 1%, ± 0.5%, 또는 심지어 0.1%± 변동을 포괄하는 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "X와 Y 사이" 및 "약 X와 Y 사이"와 같은 문구는 X 및 Y를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 본원에 사용된 바와 같이, "약 X와 Y 사이"와 같은 문구는 "약 X와 약 Y 사이"를 의미하고, "약 X에서 Y까지"와 같은 문구는 "약 X에서 약 Y까지"를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "희소돌기아교세포 전구 세포"(OPC)는 신경외배엽/신경교 계통에 속하는 중추신경계에서 발견되는 세포를 지칭하며, 특징적인 마커인 신경/신경교 항원 2(NG2)를 발현하고 희소돌기아교세포로 분화할 수 있다.
용어 "신경교 계통 세포", "신경교 전구 세포" 및 "신경교 세포"는 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 신경외배엽/신경 전구 세포로부터 유래된 비뉴런 CNS 세포를 지칭한다. 신경교 전구 세포는 추가로 분화되어 OPC/희소돌기아교세포 또는 성상교세포를 형성할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 신경교 전구 세포는 칼슘 전압-개폐 채널 보조 서브유닛 감마 4(CACNG4), 지방산 결합 단백질 7(FABP7), 및 네트린-1 수용체(DCC)로부터 선택된 하나 이상의 마커를 발현한다.
용어 "신경외배엽", "신경외배엽 세포", "신경외배엽 전구체", "신경외배엽 전구 세포", "신경 전구 세포" 및 "신경 전구체"는 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 신경 전구체 경로를 따라 분화될 수 있고 CNS 뉴런, 희소돌기아교세포, 성상교세포 및 뇌실막 세포를 형성할 수 있는 세포를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 신경외배엽 세포는 쌍을 이루는 박스 6(PAX6), Hes 패밀리 BHLH 전사 인자 5(HESS) 및 아연 핑거 및 BTB 도메인 함유 16(ZBTB16)으로부터 선택된 하나 이상의 마커를 발현한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "등쪽" 및 "복부"는 발달 중인 척수에서 신경관의 등쪽-복부 축을 따라 공간적으로 분리된 도메인으로 배열된 전구 세포로부터 나오는 별개의 신경 세포 아형을 지칭한다. 등쪽-복부 패턴화로 알려진 이 과정은 신경 전구 세포를 분할하는 분비된 신호에 의해 제어된다. BMP 및 Wnt 신호전달은 등쪽 신경관으로부터 패터닝을 개시하는 반면(Lee and Jessell, 1999 Annu. Rev. Neurosci. 22: 261-294), SHH의 분비는 복부 뉴런 세포의 운명을 확립하는데 중요한 역할을 한다(Chiang et al., 1996 Nature 383: 407-413; Ericson et al., 1996 Cell 87: 661-683; Briscoe et al., 2001 Mol. Cell 7:1279-1291).
용어 "등쪽 신경외배엽 전구 세포", "등쪽 신경 전구 세포" 및 "dNPC"는 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 등쪽 척수 표현형을 갖고, 외인성 SHH 또는 SHH 신호전달 활성화제의 부재 하에 다능성 줄기 세포를 신경외배엽-제한된 전구체로 분화시킴으로써 얻어진 신경 전구 세포를 지칭한다. 특정 실시양태에서, dNPC는 쌍을 이루는 박스 3(PAX3), 쌍을 이루는 박스 7(PAX7) 및 활성화 단백질 2(AP2)로부터 선택된 하나 이상의 마커를 발현한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "배아체"(EB)는 3개의 배엽(germ layer) 모두로 자발적인 분화를 겪은 다능성 줄기 세포로부터 유래된 3차원 세포 응집체를 지칭한다. EB는 분화를 억제하는 배양 조건에서 다능성 줄기 세포를 제거할 때 형성된다. 예를 들어, 인간 배아 줄기 세포의 경우, 배양 배지로부터 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF) 및 형질전환 성장 인자 베타(TGE13)를 제거하면 3개의 배엽 모두로 자발적으로 분화되고 EB가 형성된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "BMP 신호전달 억제제"는 골 형태발생 단백질(BMP) 신호전달 경로를 따라 신호전달을 하향조절할 수 있는 소분자 또는 단백질 조절제를 지칭한다. 특정 실시양태에서, BMP 신호전달 억제제는 액티빈 수용체-유사 키나제 2(ALK2)로도 알려진 액티빈 A 수용체 유형 I(ACVR1)을 직접 표적으로 한다. 특정 실시양태에서, BMP 신호전달 억제제는 도르소모르핀, DMH-1, K02288, ML347, LDN193189 및 Noggin 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "MAPK/ERK 억제제"는 MAPK/ERK 키나제를 억제하는 소분자 또는 단백질 조절제를 의미한다. 특정 실시양태에서, MAPK/ERK 억제제는 PD0325901, AZD6244, GSK1120212, PD1 84352 및 코비메티닙으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
용어 "SHH 신호전달 활성화제", "SHH 신호전달 작용제", "SHH 활성화제" 및 "SHH 작용제"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 소닉 헤지호그(SHE: Sonic Hedgehog) 신호전달 경로를 활성화시킬 수 있는 소분자 또는 단백질 조절제를 지칭한다. SHE 신호전달 활성화제의 비제한적인 예는 푸르모르파민(PMA), 스무드닝된 작용제(Smoothened Agonist)(SAG, CAS 364590-63-6) 및 소닉 헤지호그(SHH) 단백질을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "FGF" 또는 "bFGF"는 FGF2 유전자에 의해 코딩되는 성장 인자 및 신호전달 단백질인 인간 염기성 섬유아세포 성장 인자 또는 FGF-2를 지칭한다. 용어는 또한 상업적으로 입수 가능한 "열 안정성" FGF(hs-FGF, hs-bFGF, hs-hbFGF, 및/또는 hsbFGF)를 포함하는 임의의 서열 변이체 또는 이의 접합체를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "바람직하지 않은 세포 유형"은 본원에 기재된 바와 같이 이식 시 이소성 조직의 형성을 초래할 수 있거나 낭종 검정에서 하나 이상의 낭종의 형성을 초래하는 신경외배엽 계통 외부의 세포를 지칭한다. 일 실시양태에서, "바람직하지 않은 세포 유형"은 신경 전구 세포와 상피 세포 둘 모두에 의해 발현되는 마커인 CD49f에 대해 양성인 세포, 또는 다능성 세포와 상피 세포 둘 모두에 의해 발현되는 2개의 마커인 CLDN6 또는 EpCAM에 대해 양성인 세포와 같은 상피 계통 세포를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "이식(implantation)" 또는 "이식(transplantation)"은 적합한 전달 기술을 사용하여 (예를 들어, 주사 장치를 사용하여) 표적 조직 내로 세포 집단을 투여하는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "대상체"는 동물 또는 인간을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "이를 필요로 하는 대상체"는 중추 신경계의 손상된 조직을 갖는 동물 또는 인간을 지칭한다. 일 실시양태에서, 동물 또는 인간은 운동 기능의 상실을 경험하고 있다.
용어 "중추 신경계" 및 "CNS"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 척추동물의 뇌 및 척수를 포함하지만 이에 제한되지 않는 신체의 하나 이상의 활동을 제어하는 신경 조직의 복합체를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 병태 또는 질환과 관련하여, "치료" 또는 "치료하는"은 병태 또는 질환이 환자에서 나타난 후에 바람직하게는 임상 결과를 포함하여 유익하거나 원하는 결과를 얻기 위한 접근법이다. 질환과 관련하여 유익하거나 원하는 결과는 다음 중 하나 이상을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 질환과 관련된 병태의 개선, 질환의 치료, 질환 중증도 완화, 질환의 진행 지연, 질환과 관련된 하나 이상의 증상 완화, 질환으로 고통받는 사람의 삶의 질 향상, 생존 연장 및 이들의 조합. 마찬가지로, 본 개시내용의 목적을 위해, 병태와 관련하여 유익하거나 원하는 결과는 다음 중 하나 이상을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 병태의 개선, 병태의 치료, 병태의 중증도 완화, 병태의 진행 지연, 병태와 관련된 하나 이상의 증상 완화, 병태로 고통받는 사람의 삶의 질 향상, 생존 연장, 및 이들의 임의의 조합.
I. OPC 조성물
본 개시내용의 방법은 세포 요법에 적합한 희소돌기아교세포 전구 세포(OPC)를 포함하는 조성물을 얻기 위해 사용될 수 있다. 본 개시내용에 따라 얻어진 OPC는 OPC의 특징인 프로테오글리칸 NG2, PDGFRa, 및/또는 PDGFRβ를 높은 수준으로 발현하고, 신경 전구 세포와 상피 세포 둘 모두에 의해 발현될 수 있고 시험관내 낭종 형성과 관련된 CD49f(Debnath J, Muthuswamy SK, Brugge JS. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. 2003 Methods. 3:256-68), 사이토케라틴 7(CK7), 또는 다능성 세포와 상피 세포 둘 모두에 의해 발현되는 두 마커인 CLDN6 및 EpCAM(Lin D, Guo Y, Li Y, Ruan Y, Zhang M, Jin X, Yang M, Lu Y, Song P, Zhao S, Dong B, Xie Y, Dang Q, Quan C. Bioinformatic analysis reveals potential properties of human Claudin-6 regulation and functions. Oncol Rep. 2017 Aug;38(2):875-885; Huang L, Yang Y, Yang F, Liu S, Zhu Z, Lei Z, Guo J. Functions of EpCAM in physiological processes and diseases (Review). Int JMol Med. 2018 Oct;42(4):1771-1785)과 같은 바람직하지 않은 세포 유형과 관련된 비-OPC 마커를 낮은 수준으로 발현한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용에 따라 생성된 OPC는 인간 다능성 줄기 세포의 시험관내 분화된 자손이다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용에 따라 얻어진 OPC는 인간 배아 줄기 세포의 시험관내 분화된 자손이다. 다른 실시양태에서, 본 개시내용에 따라 얻어진 OPC는 유도 다능성 줄기(iPS) 세포의 시험관내 분화된 자손이다.
얻어진 OPC 집단의 하나 이상의 특성은, 예를 들어, 세포 집단의 몇 퍼센트가 특정 마커 또는 마커 세트에 대해 양성인지 결정하거나 OPC 집단에 존재하는 바람직하지 않은 세포 유형을 확인하기 위해, 유세포 분석을 사용하여 다양한 세포 마커를 정량화함으로써 결정될 수 있다.
본 개시내용에 따라 얻어진 OPC 집단은 약 30% 내지 약 100% OPC, 예컨대 적어도 약 35%, 예컨대 적어도 약 40%, 예컨대 적어도 약 45%, 예컨대 적어도 약 50%, 예컨대 적어도 약 55%, 예컨대 적어도 약 60%, 예컨대 적어도 약 65%, 예컨대 적어도 약 70%, 예컨대 적어도 약 75%, 예컨대 적어도 약 80%, 예컨대 적어도 약 85%, 예컨대 적어도 약 90%, 예컨대 적어도 약 95%, 예컨대 적어도 약 98%, 예컨대 적어도 약 99%, 예컨대 적어도 약 99.5%, 예컨대 적어도 약 99.8%, 또는 예컨대 적어도 약 99.9% OPC를 포함할 수 있다. 백분율은 끝점을 포함하여 인용된 범위 내의 임의의 값 또는 하위 범위일 수 있다. 집단에서 OPC의 백분율은, 예를 들어, OPC의 양성 마커의 존재 및/또는 OPC의 음성 마커의 부재에 의해 결정될 수 있다. OPC 양성 마커의 예는 제한 없이, NG2, PDGFRa, 및/또는 PDGFRβ를 포함한다. OPC 마커의 추가의 예는 WO 2020/154533에서 찾을 수 있으며, 이는 예를 들어, OPC 및 다른 세포 유형의 마커, 세포를 분화시키는 방법, 분화된 세포를 사용하는 방법, 세포 유형, 시약, 및 모든 다른 방법, 조성물 및 개시를 포함하여, 그 안에 개시된 모든 것에 대해 본원에 참조로 포함된다.
본 개시내용에 따라 얻어진 OPC 집단은 약 30% 내지 약 100% NG2 양성 세포, 예컨대 적어도 약 35%, 예컨대 적어도 약 40%, 예컨대 적어도 약 45%, 예컨대 적어도 약 50%, 예컨대 적어도 약 55%, 예컨대 적어도 약 60%, 예컨대 적어도 약 65%, 예컨대 적어도 약 70%, 예컨대 적어도 약 75%, 예컨대 적어도 약 80%, 예컨대 적어도 약 85%, 예컨대 적어도 약 90%, 예컨대 적어도 약 95%, 예컨대 적어도 약 98%, 예컨대 적어도 약 99%, 예컨대 적어도 약 99.5%, 예컨대 적어도 약 99.8%, 또는 예컨대 적어도 약 99.9% NG2 양성 세포를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용에 따라 얻어진 OPC 집단은 약 45% 내지 약 75% NG2 양성 세포, 예컨대 약 45% 내지 약 50%, 예컨대 약 50% 내지 약 55%, 예컨대 약 55% 내지 약 60%, 예컨대 약 60% 내지 약 65%, 예컨대 약 65% 내지 약 70%, 예컨대 약 70% 내지 약 75%, 예컨대 약 50% 내지 약 70%, 예컨대 약 55% 내지 약 65%, 또는 예컨대 약 58% 내지 약 63% NG2 양성 세포를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 본 개시내용에 따라 얻어진 OPC 집단은 약 60% 내지 약 90% NG2 양성 세포, 예컨대 약 60% 내지 약 65%, 예컨대 약 65% 내지 약 70% 양성 세포를 포함할 수 있다. 백분율은 끝점을 포함하여 인용된 범위 내의 임의의 값 또는 하위 범위일 수 있다.
본 개시내용에 따라 얻어진 OPC 집단은 약 30% 내지 약 100% PDGFRa 양성 세포, 예컨대 적어도 약 35%, 예컨대 적어도 약 40%, 예컨대 적어도 약 45%, 예컨대 적어도 약 50%, 예컨대 적어도 약 55%, 예컨대 적어도 약 60%, 예컨대 적어도 약 65%, 예컨대 적어도 약 70%, 예컨대 적어도 약 75%, 예컨대 적어도 약 80%, 예컨대 적어도 약 85%, 예컨대 적어도 약 90%, 예컨대 적어도 약 95%, 예컨대 적어도 약 98%, 예컨대 적어도 약 99%, 예컨대 적어도 약 99.5%, 예컨대 적어도 약 99.8%, 또는 예컨대 적어도 약 99.9% PDGFRa 양성 세포를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용에 따라 얻어진 OPC 집단은 약 45% 내지 약 75% PDGFRa 양성 세포, 예컨대 약 45% 내지 약 50%, 예컨대 약 50% 내지 약 55%, 예컨대 약 55% 내지 약 60%, 예컨대 약 60% 내지 약 65%, 예컨대 약 65% 내지 약 70%, 예컨대 약 70% 내지 약 75%, 예컨대 약 50% 내지 약 70%, 예컨대 약 55% 내지 약 65%, 또는 예컨대 약 58% 내지 약 63% PDGFRa 양성 세포를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 본 개시내용에 따라 얻어진 OPC 집단은 약 60% 내지 약 90% PDGFRa 양성 세포, 예컨대 약 60% 내지 약 65%, 예컨대 약 65% 내지 약 70% 양성 세포를 포함할 수 있다. 백분율은 끝점을 포함하여 인용된 범위 내의 임의의 값 또는 하위 범위일 수 있다.
본 개시내용에 따라 얻어진 OPC 집단은 약 30% 내지 약 100% PDGFRβ 양성 세포, 예컨대 적어도 약 35%, 예컨대 적어도 약 40%, 예컨대 적어도 약 45%, 예컨대 적어도 약 50%, 예컨대 적어도 약 55%, 예컨대 적어도 약 60%, 예컨대 적어도 약 65%, 예컨대 적어도 약 70%, 예컨대 적어도 약 75%, 예컨대 적어도 약 80%, 예컨대 적어도 약 85%, 예컨대 적어도 약 90%, 예컨대 적어도 약 95%, 예컨대 적어도 약 98%, 예컨대 적어도 약 99%, 예컨대 적어도 약 99.5%, 예컨대 적어도 약 99.8%, 또는 예컨대 적어도 약 99.9% PDGFRβ 양성 세포를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용에 따라 얻어진 OPC 집단은 약 45% 내지 약 75% PDGFRβ 양성 세포, 예컨대 약 45% 내지 약 50%, 예컨대 약 50% 내지 약 55%, 예컨대 약 55% 내지 약 60%, 예컨대 약 60% 내지 약 65%, 예컨대 약 65% 내지 약 70%, 예컨대 약 70% 내지 약 75%, 예컨대 약 50% 내지 약 70%, 예컨대 약 55% 내지 약 65%, 또는 예컨대 약 58% 내지 약 63% PDGFRβ 양성 세포를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 본 개시내용에 따라 얻어진 OPC 집단은 약 60% 내지 약 90% PDGFRβ 양성 세포, 예컨대 약 60% 내지 약 65%, 예컨대 약 65% 내지 약 70% 양성 세포를 포함할 수 있다. 백분율은 끝점을 포함하여 인용된 범위 내의 임의의 값 또는 하위 범위일 수 있다.
일 실시양태에서, 본 개시내용에 따라 얻어진 OPC 집단은 본 개시내용의 실시예 8에 기재된 바와 같은 낭포 검정에서 세포 100,000개당 4개 이하의 상피 낭종을 형성할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용에 따라 얻어진 OPC 집단은 낭종 검정에서 세포 100,000개당 3개 이하의 상피 낭종을 형성할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용에 따라 얻어진 OPC 집단은 낭종 검정에서 세포 100,000개당 2개 이하의 상피 낭종을 형성할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용에 따라 수득된 OPC 집단은 본 개시내용의 실시예 8에 기재된 바와 같은 낭종 검정에서 세포 100,000개 당 1개 이하의 상피 낭종을 형성할 수 있다.
II. 약제학적 제형
본 개시내용에 따른 OPC 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 일 실시양태에서, 약제학적으로 허용되는 담체는 디메틸 설폭시드(DMSO)를 포함할 수 있다. 일 실시양태에서, 약제학적으로 허용되는 담체는 디메틸 설폭시드를 포함하지 않는다. 상기 언급된 바와 같이, 조성물은 -80℃ 내지 -195℃ 이하에서 동결보존을 위해 추가로 조정될 수 있다. 실시양태에서, 조성물은 해동되도록 제형화되어 투여 전에 추가의 조작 없이, 예를 들어 주사를 통해 대상체에게 직접 투여될 수 있다. 실시양태에서, 동결보존 배지로서 CryoStor®10(CS10)과 같은 동결용액을 포함하는 조성물이 제형화될 수 있다. 일 실시양태에서, 조성물은 동결보존 전에 60 um 필터 키트를 사용하여 여과될 수 있다.
본 개시내용에 따른 OPC 조성물은 대상체의 척수에 대한 직접 주사를 통해 투여하기 위해 제형화될 수 있다. 일 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 OPC 조성물은 대상체에게 뇌내, 뇌실내, 경막내, 비강내, 또는 수조내 투여를 위해 제형화될 수 있다. 일 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 OPC 조성물은 대상체의 뇌 내의 경색 공동에 직접적으로 또는 바로 인접한 주사를 통해 투여를 위해 제형화될 수 있다. 일 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 조성물은 이식을 통한 투여를 위해 제형화될 수 있다. 일 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 조성물은 용액으로서 제형화될 수 있다.
본 개시내용에 따른 OPC 조성물은 약 1×106 내지 약 200 x 106개의 세포/밀리리터, 예컨대 약 1×106개의 세포/밀리리터, 예컨대 약 2 x 106개의 세포/밀리리터, 예컨대 약 3 x 106개의 세포/밀리리터, 예컨대 약 4 x 106개의 세포/밀리리터, 예컨대 약 5 x 106개의 세포/밀리리터, 예컨대 약 6 x 106개의 세포/밀리리터, 예컨대 약 7 x 106개의 세포/밀리리터, 예컨대 약 8 x 106개의 세포/밀리리터, 예컨대 약 9 x 106개의 세포/밀리리터, 예컨대 약 10 x 106개의 세포/밀리리터, 예컨대 약 20 x 106개의 세포/밀리리터, 예컨대 약 30 x 106개의 세포/밀리리터, 예컨대 약 40 x 106개의 세포/밀리리터, 예컨대 약 50 x 106개의 세포/밀리리터, 예컨대 약 60 x 106개의 세포/밀리리터, 예컨대 약 70 x 106개의 세포/밀리리터, 예컨대 약 80 x 106개의 세포/밀리리터, 예컨대 약 90 x 106개의 세포/밀리리터, 예컨대 약 100 x 106개의 세포/밀리리터, 예컨대 약 101×106개의 세포/밀리리터, 예컨대 약 102 x 106개의 세포/밀리리터, 예컨대 약 103 x 106개의 세포/밀리리터, 예컨대 약 104 x 106개의 세포/밀리리터, 예컨대 약 105 x 106개의 세포/밀리리터, 예컨대 약 106 x 106개의 세포/밀리리터, 예컨대 약 107 x 106개의 세포/밀리리터, 예컨대 약 108 x 106개의 세포/밀리리터, 예컨대 약 109 x 106개의 세포/밀리리터, 예컨대 약 110 x 106개의 세포/밀리리터, 예컨대 약 120 x 106개의 세포/밀리리터, 예컨대 약 130 x 106개의 세포/밀리리터, 예컨대 약 140 x 106개의 세포/밀리리터, 예컨대 약 150 x 106개의 세포/밀리리터, 예컨대 약 160 x 106개의 세포/밀리리터, 예컨대 약 170 x 106개의 세포/밀리리터, 예컨대 약 180 x 106개의 세포/밀리리터, 예컨대 약 190 x 106개의 세포/밀리리터, 예컨대 약 200 x 106개의 세포/밀리리터를 포함할 수 있다. 세포의 수는 인용된 범위 내의 임의의 값 또는 하위 범위일 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 OPC 조성물은 약 250 마이크로리터 내지 약 1 밀리리터의 범위, 예컨대 약 300 마이크로리터, 예컨대 약 400 마이크로리터, 예컨대 약 500 마이크로리터, 예컨대 약 600 마이크로리터, 예컨대 약 700 마이크로리터, 예컨대 약 800 마이크로리터, 예컨대 약 900 마이크로리터, 또는 예컨대 약 1 밀리리터의 부피를 가질 수 있다. 일 실시양태에서, 본 발명에 따른 조성물은 약 250 마이크로리터 내지 약 1 밀리리터의 범위, 예컨대 약 250 마이크로리터 내지 약 900 마이크로리터, 예컨대 약 300 마이크로리터 내지 약 800 마이크로리터, 예컨대 약 400 마이크로리터 내지 약 700 마이크로리터, 또는 예컨대 약 500 마이크로리터 내지 약 600 마이크로리터의 부피를 가질 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 조성물은 약 100 마이크로리터 내지 약 1 밀리리터의 범위, 예컨대 약 200 마이크로리터 내지 약 900 마이크로리터, 예컨대 약 300 마이크로리터 내지 약 800 마이크로리터, 예컨대 약 400 마이크로리터 내지 약 700 마이크로리터, 또는 예컨대 약 500 마이크로리터 내지 약 600 마이크로리터의 부피를 가질 수 있다. 부피는 인용된 범위 내의 임의의 값 또는 하위 범위일 수 있다. 일 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 OPC 조성물은 동결보존을 위해 또는 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하기 위해 구성된 용기 내에 있을 수 있다. 일 실시양태에서, 용기는 사전충전된 주사기일 수 있다
일 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 OPC 조성물은 약 50 마이크로리터 내지 약 100 마이크로리터의 범위, 예컨대 약 55 마이크로리터, 예컨대 약 60 마이크로리터, 예컨대 약 65 마이크로리터, 예컨대 약 70 마이크로리터, 예컨대 약 75 마이크로리터, 예컨대 약 80 마이크로리터, 예컨대 약 85 마이크로리터, 예컨대 약 90 마이크로리터, 예컨대 약 95 마이크로리터, 또는 예컨대 약 100 마이크로리터의 부피로 투여될 수 있다. 일 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 OPC 조성물은 약 50 마이크로리터 내지 약 100 마이크로리터의 범위, 예컨대 약 55 마이크로리터 내지 약 95 마이크로리터, 예컨대 약 60 마이크로리터 내지 약 90 마이크로리터, 예컨대 약 65 마이크로리터 내지 약 85 마이크로리터, 또는 예컨대 약 70 마이크로리터 내지 약 80 마이크로리터의 부피로 투여될 수 있다. 부피는 인용된 범위 내의 임의의 값 또는 하위 범위일 수 있다.
일 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 OPC 조성물은 약 5.0 x 106개 세포 내지 약 10.0 x 106개 세포의 범위, 예컨대 약 5.5 x 106개 세포, 예컨대 약 6.0 x 106개 세포, 예컨대 약 6.5 x 106개 세포, 예컨대 약 7.0 x 106개 세포, 예컨대 약 7.5 x 106개 세포, 예컨대 약 8.0 x 106개 세포, 예컨대 약 8.5 x 106개 세포, 예컨대 약 9.0 x 106개 세포, 예컨대 약 9.5 x 106개 세포, 또는 예컨대 약 10.0 x 106개 세포의 부피로 투여될 수 있다. 일 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 OPC 조성물은 약 5.0 x 106개 세포 내지 약 10.0 x 106개 세포의 범위, 예컨대 약 5.5 x 106개 세포 내지 약 9.5 x 106개 세포, 예컨대 약 6.0 x 106개 세포 내지 약 9.0 x 106개 세포, 예컨대 약 6.5 x 106개 세포 내지 약 8.5 x 106개 세포, 또는 예컨대 약 7.0 x 106개 세포 내지 약 8.0 x 106개 세포의 부피로 투여될 수 있다. 세포 수는 인용된 범위 내의 임의의 값 또는 하위 범위일 수 있다.
III.
사용 방법
본 개시내용에 따라 얻어진 OPC 조성물은 치료를 필요로 하는 대상체에서 하나 이상의 신경학적 기능을 개선시키기 위해 세포 요법에 사용될 수 있다. 일 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 OPC 세포 집단은 이를 필요로 하는 대상체에게 주입 또는 이식될 수 있다. 일 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 세포 집단은 척수 손상, 뇌졸중 또는 다발성 경화증을 치료하기 위해 이를 필요로 하는 대상체에게 이식될 수 있다.
일 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 세포 집단은 대상체의 이식 부위에서 벗겨진 축삭의 수초화를 유도할 수 있다. 일 실시양태에서, 본 개시내용의 방법에 따라 생성된 세포 집단은 향상된 생착 및 이동 능력을 나타낼 수 있다. 일 실시양태에서, 본 개시내용의 방법에 따라 생성된 세포 집단은 대상체의 신경 조직의 손상 후 복구 또는 재생을 개선할 수 있다.
본 개시내용에 따른 세포 집단은 집단을 대상체에 이식한 후 치료를 필요로 하는 대상체에서 감각 기능을 개선시킬 수 있다. 감각 기능의 개선은 핀 찌르기 및 가벼운 촉각 감각에 대한 우측 및 좌측의 감각 수준을 결정하는 것과 같은 척수 손상의 신경학적 분류에 대한 국제 표준(ISNCSCI) 시험을 사용하여 평가할 수 있다. 본 개시내용에 따른 세포 집단은 집단을 대상체에 이식한 후 치료를 필요로 하는 대상체에서 운동 기능을 개선할 수 있다. 개선된 운동 기능은 완전 마비에 대한 우측 및 좌측 운동 수준, 만져지거나 눈에 보이는 수축, 활동적인 움직임, 중력에 대한 전체 운동 범위 및 충분한 저항을 결정하는 것과 같은 ISNCSCI 시험을 사용하여 평가할 수 있다.
본 개시내용에 따른 세포 집단은 12개월 이내에 손상으로 유발된 중추신경계 실질 공동화의 부피를 감소시킬 수 있다. 일 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 세포 집단은 6개월 이하, 5개월 이하, 4개월 이하, 3개월 이하, 2개월 이하, 또는 1개월 미만에서 대상체에서 손상 유발된 중추신경계 실질 공동화의 부피를 감소시킬 수 있다.
CNS 외상성 손상 치료에서의 용도. 특정 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 세포 집단은 세포 집단을 포함하는 조성물을 척수 손상 부위에 이식한 후 척수 손상 부위에서 생착시킬 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 세포 집단은 척수 손상 부위에 조성물의 용량을 이식한 후 약 90일 이상의 기간 동안 대상체의 척수 손상 부위 내에 남아 있을 수 있다. 다른 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 세포 집단은 척수 손상 부위에 조성물의 용량을 이식한 후 약 1년 이상의 기간 동안 대상체의 척수 손상 부위 내에 남아 있을 수 있다. 추가의 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 세포 집단은 척수 손상 부위에 조성물의 용량을 이식한 후 약 2년 이상의 기간 동안 대상체의 척수 손상 부위 내에 남아 있을 수 있다. 추가의 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 세포 집단은 척수 손상 부위에 조성물의 용량을 이식한 후 약 3년 이상의 기간 동안 대상체의 척수 손상 부위 내에 남아 있을 수 있다. 추가의 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 세포 집단은 척수 손상 부위에 조성물의 용량을 이식한 후 약 4년 이상의 기간 동안 대상체의 척수 손상 부위 내에 남아 있을 수 있다. 또 다른 추가 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 세포 집단은 척수 손상 부위에 조성물의 용량을 이식한 후 약 5년 이상의 기간 동안 대상체의 척수 손상 부위 내에 남아 있을 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 세포 조성물은 상기 대상체에게 투여될 때 척수 손상이 있는 인간 대상체에서 상지 운동 기능을 개선시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 대상체는 경추 척수 손상을 갖는다. 다른 실시양태에서, 대상체는 흉부 척수 손상을 갖는다.
일 실시양태에서, 본 개시내용은 척수 손상 부위에 생착할 수 있는 동종 인간 희소돌기아교세포의 집단을 포함하는 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 척수 손상이 있는 인간 대상체에서 상지 운동 기능을 개선하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 조성물을 투여하는 것은 조성물을 척수 손상 부위에 주사하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 척수 손상 발생지의 대략 2-10 mm 꼬리쪽으로 주사된다. 추가 실시양태에서, 조성물은 척수 손상 발생지의 대략 5 mm 꼬리쪽으로 주사된다. 일부 실시양태에서, 대상체는 경추 척수 손상을 갖는다. 다른 실시양태에서, 대상체는 흉부 척수 손상을 갖는다.
특정 실시양태에서, 동종 인간 희소돌기아교세포의 집단을 포함하는 조성물이 본 개시내용의 방법에 따라 투여되는 대상체는, 적어도 하나의 운동 수준(척수 손상의 신경학적 분류에 대한 국제 표준[ISNCSCI]에 기초하여 정의됨)과 동일한 상지 운동 기능의 개선을 얻는다. 기능의 개선은 일측성 또는 양측성일 수 있다. 다른 실시양태에서, 동종 인간 희소돌기아교세포 집단을 포함하는 조성물이 본 개시내용의 방법에 따라 투여되는 대상체는, 일측 또는 양측 중 적어도 2개의 운동 수준과 동일한 상지 운동 기능의 개선을 얻는다. 특정 실시양태에서, 대상체는 한쪽에서 적어도 하나의 운동 수준 및 다른 쪽에서 적어도 2개의 운동 수준과 동일한 상지 운동 기능의 개선을 얻는다. 특정 실시양태에서, 대상체는 본 개시내용의 방법에 따라 동종 인간 희소돌기아교세포의 집단을 투여하기 전에 대상체 기준선 점수에 비해 개선된 상지 운동 점수(UEMS: upper extremity motor score)를 나타낸다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 세포 조성물은 척추 실질 내로 전달 또는 투여를 위해, 도는 경막, 지주막 또는 연질막 아래 손상 부위에 인접하거나 손상 부위에서 말초 관류를 통해 제형화된다.
IV. 미분화 다능성 줄기 세포의 증식 및 배양
본 개시내용에 따른 다능성 세포의 분화는 임의의 적합한 다능성 줄기 세포를 출발 물질로서 사용하여 수행될 수 있다. 일 실시양태에서, 방법은 인간 배아 줄기 세포(hESC) 주에서 수행될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 유도 다능성 줄기 세포(iPSC)를 사용하여 방법을 수행할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 방법은 H1, H7, H9, H13, 또는 H14 세포주로부터 유래된 세포를 사용하여 수행될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 방법은 영장류 다능성 줄기(pPS) 세포주에서 수행될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 방법은 수정 없이 hESC를 생산하도록 자극된 배아인 반수성개체(parthenote)로부터 유래된 미분화 줄기 세포를 사용하여 수행할 수 있다.
미분화 다능성 줄기 세포의 증식 및 배양 방법은 이전에 설명되었다. 다능성 줄기 세포의 조직 및 세포 배양과 관련하여, 판독자는 당업계에서 이용 가능한 수많은 간행물, 예를 들어, 기형암종 및 배아 줄기 세포: 실제적인 접근법(E. J. Robertson, ed., IRL Press Ltd. 1987); 마우스 개발 기술 가이드(P. M. Wasserman et al., Eds., Academic Press 1993); 시험관내 배아 줄기 세포 분화(M. V. Wiles, Meth. Enzymol. 225:900, 1993); 배아 줄기 세포의 특성 및 용도: 인간 생물학 및 유전자 치료에 대한 응용 전망(P. D. Rathjen et al., Reprod. Fertil. Dev. 10:31, 1998; and R. I. Freshney, Culture of Animal Cells, Wiley-Liss, New York, 2000) 중 어느 하나를 참조하기를 원할 수 있다. 이들 각각은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
미분화 다능성 줄기 세포는 추가 영양공급 세포(feeder cell) 없이 미분화 상태로 유지될 수 있다(예를 들어, 문헌[(2004) Rosler et al., Dev. Dynam. 229:259] 참조). 영양공급 세포가 없는 배양물(feeder-free culture)은 전형적으로 분화 없이 세포의 증식을 촉진하는 인자를 함유하는 영양 배지에 의해 뒷받침된다(예를 들어, 미국 특허 제6,800,480호 참조). 일 실시양태에서, 이러한 인자를 함유하는 컨디셔닝된 배지가 사용될 수 있다. 컨디셔닝된 배지는 이러한 인자를 분비하는 세포와 함께 배지를 배양하여 얻을 수 있다. 적합한 세포는 조사된(4,000 Rad) 일차 마우스 배아 섬유아세포, 텔로머화된 마우스 섬유아세포, 또는 pPS 세포로부터 유래된 섬유아세포-유사 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다(미국 특허 제6,642,048호). 배지는 20% 혈청 대체 및 4 ng/mL bFGF가 보충된 녹아웃 DMEM과 같은 무혈청 배지에 영양공급 세포를 플레이팅하여 컨디셔닝될 수 있다. 1-2일 동안 컨디셔닝된 배지에 추가의 bFGF가 보충될 수 있고, 1-2일 동안 pPS 세포 배양을 지원하기 위해 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌(WO 01/51616; Xu et al., (2001) Nat. Biotechnol. 19:971) 참조).
대안적으로, 미분화 형태로 세포의 증식을 촉진하는 추가 인자(예컨대 섬유아세포 성장 인자 또는 포스콜린)가 보충된 신선하거나 컨디셔닝되지 않은 배지를 사용할 수 있다. 비제한적인 예에는 40-80 ng/mL의 bFGF가 보충되고 선택적으로 SCF(15 ng/mL) 또는 Flt3 리간드(75 ng/mL)를 함유하는 X-VIVOTM 10(Lonza, Walkersville, MD.), 또는 QBSFTM-60(Quality Biological Biology Inc. Gaithersburg, MD.), 또는 mTeSR1, mTeSR plus, 또는 NutriSTem(Biological Industries, Cromwell, CT)과 같은 기본 배지가 포함된다(예를 들어, 문헌[Xu et al., (2005) Stem Cells 23(3):315] 참조). 이들 배지 제형은 다른 시스템에서 2-3배의 속도로 세포 성장을 지원하는 이점을 갖는다(예를 들어, WO 03/020920 참조). 일 실시양태에서, 미분화 다능성 세포, 예컨대 hES 세포는 bFGF 및 TGFβ를 포함하는 배지에서 배양될 수 있다. bFGF의 비제한적인 예의 농도는 약 80 ng/ml를 포함한다. TGFβ의 비제한적인 예의 농도는 약 0.5 ng/ml를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 미분화 다능성 줄기 세포는 mTeSKtm(Stem Cell Technologies, Vancouver, Canada)과 같은 상업적으로 입수 가능한 완전 배지에서 유지될 수 있다.
미분화 다능성 세포는 영양공급 세포, 전형적으로 배아 또는 태아 조직으로부터 유래된 섬유아세포의 층에서 배양될 수 있다(Thomson et al. (1998) Science 282:1145). 영양공급 세포는 인간 또는 뮤린 공급원으로부터 유래될 수 있다. 인간 영양공급 세포는 다양한 인간 조직으로부터 단리될 수 있거나, 인간 배아 줄기 세포를 섬유아세포로의 분화를 통해 유도될 수 있다(예를 들어, WO 01/51616 참조). 사용될 수 있는 인간 영양공급 세포는 태반 섬유아세포(예를 들어, 문헌[Genbacev et al. (2005) Fertil. Steril. 83(5):1517] 참조), 나팔관 상피 세포(예를 들어, 문헌[Richards et al. (2002) Nat. Biotechnol., 20:933] 참조), 포피 섬유아세포(예를 들어, 문헌[Amit et al. (2003) Biol. Reprod.68:2150] 참조), 및 자궁 자궁 내막 세포(예를 들어, 문헌[Lee et al. (2005) Biol. Reprod. 72(1):42] 참조)를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
다양한 고체 표면이 미분화 다능성 세포의 배양에 사용될 수 있다. 이러한 고체 표면에는 상업적으로 입수 가능한 표준 조직 배양 플라스크 또는 세포 배양 플레이트, 예컨대 6웰, 24웰, 96웰 또는 144웰 플레이트가 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 기타 고체 표면에는 마이크로캐리어 및 디스크가 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 미분화 다능성 세포를 성장시키기에 적합한 고체 표면에는 폴리스티렌, 폴리비닐클로라이드, 폴리카보네이트, 폴리테트라플루오르에틸렌, 멜리넥스, 테르마녹스, 또는 이들의 조합과 같은 유리 또는 플라스틱이 포함되지만 이에 제한되지 않는 다양한 물질로 만들어질 수 있다. 적합한 표면은, 예를 들어, 하나 이상의 아크릴레이트와 같은 하나 이상의 중합체를 포함할 수 있다. 고체 표면은 3차원 형상일 수 있다. 3차원 고체 표면의 비제한적인 예는, 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2005/0031598에 이전에 기재되어 있다.
미분화 줄기 세포는 또한 성장 기질 상에서 영양공급 세포가 없는 조건 하에 성장할 수 있다. 성장 기질은 Matrigel® 매트릭스(예를 들어, Matrigel®, Matrigel® GFR), 재조합 라미닌, 라미닌-511 재조합 단편 E8 또는 비트로넥틴일 수 있다. 본 개시내용의 특정 실시양태에서, 성장 기질은 재조합 인간 라미닌 521(Biolamina, Sweden, Corning Inc., Corning, NY에 의해 유통됨)이다. 다른 실시양태에서, 기질은, 예를 들어, Synthemax®-II SC 기질과 같은 합성 기질이다.
미분화 줄기 세포는 콜라게나제를 사용하거나 수동 스크래핑(manual scraping)과 같은 다양한 방법을 사용하여 계대되거나 계대배양할 수 있다. 미분화 줄기 세포는 Accutase®(Sigma Aldrich, MO에 의해 유통됨) 또는 유사한 트립시나제를 사용하는 것과 같이 단일 세포 현탁액을 생성하는 효소 수단에 의해 계대배양될 수 있다. 대안적으로, 미분화 줄기 세포는 PBS 중의 0.5 mM EDTA와 같은 비효소적 수단을 사용하거나, 예를 들어, ReLeSR(Stem Cell Technologies, Vancouver, Canada)을 사용하여 계대배양될 수 있다.
일 실시양태에서, 복수의 미분화 줄기 세포는 세포가 약 3일 내지 약 10일 내에 컨플루언스에 도달할 수 있도록 하는 시딩 밀도로 시딩되거나 계대배양된다. 일 실시양태에서, 시딩 밀도는 약 6.0 x 103개의 세포/cm2 내지 약 5.0 x 105개의 세포/cm2, 예컨대 약 1.0 x 104개의 세포/cm2, 예컨대 약 5.0 x 104개의 세포/cm2, 예컨대 약 1.0 x 105개의 세포/cm2, 또는 예컨대 약 3.0 x 105개의 세포/성장 표면의 cm2의 범위일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 시딩 밀도는 약 6.0 x 103개의 세포/cm2 내지 약 1.0 x 104개의 세포/성장 표면의 cm2, 예컨대 약 6.0 x 103개의 세포/cm2 내지 약 9.0 x 103개의 세포/cm2, 예컨대 약 7.0 x 103개의 세포/cm2 내지 약 1.0 x 104개의 세포/cm2, 예컨대 약 7.0 x 103개의 세포/cm2 내지 약 9.0 x 103개의 세포/cm2, 또는 예컨대 약 7.0 x 103개의 세포/cm2 내지 약 8.0 x 103개의 세포/성장 표면의 cm2의 범위일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 시딩 밀도는 약 1.0 x 104개의 세포/cm2 내지 약 1.0 x 105개의 세포/성장 표면의 cm2, 예컨대 약 2.0 x 104개의 세포/cm2 내지 약 9.0 x 104개의 세포/cm2, 예컨대 약 3.0 x 104개의 세포/cm2 내지 약 8.0 x 104개의 세포/cm2, 예컨대 약 4.0 x 104개의 세포/cm2 내지 약 7.0 x 104개의 세포/cm2, 또는 예컨대 약 5.0 x 104개의 세포/cm2 내지 약 6.0 x 104개의 세포/성장 표면의 cm2의 범위일 수 있다. 일 실시양태에서, 시딩 밀도는 약 1.0 x 105개의 세포/cm2 내지 약 5.0 x 105개의 세포/성장 표면의 cm2, 예컨대 약 1.0 x 105개의 세포/cm2 내지 약 4.5 x 105개의 세포/cm2, 예컨대 약 1.5 x 105개의 세포/cm2 내지 약 4.0 x 105개의 세포/cm2, 예컨대 약 2.0 x 105개의 세포/cm2 내지 약 3.5 x 105개의 세포/cm2, 또는 예컨대 약 2.5 x 105개의 세포/cm2 내지 약 3.0 x 105개의 세포/성장 표면의 cm2의 범위일 수 있다. 시딩 밀도는 인용된 범위 내의 임의의 값 또는 하위 범위일 수 있다.
임의의 다양한 적합한 세포 배양 및 계대배양 기술을 사용하여 본 개시내용의 방법에 따라 줄기 세포를 배양할 수 있다. 예를 들어, 세포 계대배양 약 2일 후에 개시하여 배양 배지를 매일 완전히 교환할 수 있다. 일 실시양태에서, 배양물이 약 90% 콜로니 커버리지에 도달하면, 정량화를 위한 단일 세포 현탁액을 얻기 위해, 예를 들어, Accutase®와 같은 하나 이상의 적합한 시약을 사용하여 후속 배양을 위해 세포를 분리하고 시딩할 수 있다. 일 실시양태에서, 미분화 줄기 세포는 이어서 세포가 적합한 기간, 예를 들어, 약 3 내지 10일에 걸쳐 컨플루언스에 도달할 수 있도록 하는 시딩 밀도로 적합한 성장 기질(예를 들어, 재조합 인간 라미닌-521)에 세포를 시딩하기 전에 계대 배양될 수 있다. 일 실시양태에서, 미분화 줄기 세포는 콜라게나제 IV를 사용하여 계대배양되고 재조합 라미닌에서 확장될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 미분화 줄기 세포는 콜라게나제 IV를 사용하여 계대배양되고 Matrigel®에서 확장될 수 있다. 일 실시양태에서, 미분화 줄기 세포는 ReLeSRTM을 사용하여 계대배양되고 재조합 인간 라미닌-521에서 확장될 수 있다.
미분화 줄기 세포를 시딩하는 경우, 시딩 밀도는 약 6.0 x 103개의 세포/cm2 내지 약 5.0 x 105개의 세포/cm2, 예컨대 약 1.0 x 104개의 세포/cm2, 예컨대 약 5.0 x 104개의 세포/cm2, 예컨대 약 1.0 x 105개의 세포/cm2, 또는 예컨대 약 3.0 x 105개의 세포/성장 표면의 cm2의 범위일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 시딩 밀도는 약 6.0 x 103개의 세포/cm2 내지 약 1.0 x 104개의 세포/성장 표면의 cm2, 예컨대 약 6.0 x 103개의 세포/cm2 내지 약 9.0 x 103개의 세포/cm2, 예컨대 약 7.0 x 103개의 세포/cm2 내지 약 1.0 x 104개의 세포/cm2, 예컨대 약 7.0 x 103개의 세포/cm2 내지 약 9.0 x 103개의 세포/cm2, 또는 예컨대 약 7.0 x 103개의 세포/cm2 내지 약 8.0 x 103개의 세포/성장 표면의 cm2의 범위일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 시딩 밀도는 약 1.0 x 104개의 세포/cm2 내지 약 1.0 x 105개의 세포/성장 표면의 cm2, 예컨대 약 2.0 x 104개의 세포/cm2 내지 약 9.0 x 104개의 세포/cm2, 예컨대 약 3.0 x 104개의 세포/cm2 내지 약 8.0 x 104개의 세포/cm2, 예컨대 약 4.0 x 104개 세포/cm2 내지 약 7.0 x 104개의 세포/cm2, 또는 예컨대 약 5.0 x 104개의 세포/cm2 내지 약 6.0 x 104개의 세포/성장 표면의 cm2의 범위일 수 있다. 일 실시양태에서, 시딩 밀도는 약 1.0 x 105개의 세포/cm2 내지 약 5.0 x 105개의 세포/성장 표면의 cm2, 예컨대 약 1.0 x 105개의 세포/cm2 내지 약 4.5 x 105개의 세포/cm2, 예컨대 약 1.5 x 105개의 세포/cm2 내지 약 4.0 x 105개의 세포/cm2, 예컨대 약 2.0 x 105개의 세포/cm2 내지 약 3.5 x 105개의 세포/cm2, 또는 예컨대 약 2.5 x 105개의 세포/cm2 내지 약 3.0 x 105개의 세포/성장 표면의 cm2의 범위일 수 있다. 시딩 밀도는 인용된 범위 내의 임의의 값 또는 하위 범위일 수 있다.
V. 인간 다능성 줄기 세포를 등쪽 신경외배엽 전구 세포로, 나아가 추가로 등쪽 유래 신경교 전구 세포 및 희소돌기아교세포 전구 세포로 분화
본 개시내용은 BMP 신호전달의 소분자 및 단백질 조절제 및 MAPK/ERK 키나제의 억제제의 조합을 사용하여 인간 다능성 줄기 세포를 등쪽 척수 표현형을 갖는 신경외배엽으로, 나아가 신경교 전구 세포 및 희소돌기아교세포 전구 세포로 분화시키는 방법을 제공한다. 임의의 특정 이론에 얽매이지 않고, 본 발명자들은 본 개시내용의 방법에 따라 얻어진 인간 등쪽 신경외배엽 전구 세포가 SHH 신호전달의 활성화의 부재 하에 척수 OPC로 용이하고 효율적으로 분화될 수 있다는 것을 발견하였다. 놀랍게도, 이 초기 등쪽 표현형은 생체 내에서 초기 OPC 생성 영역이 아님에도 불구하고 분화 과정의 21일차에 신경교 전구 세포를 생성하고 분화 과정의 28일차에 OPC를 생성한다. 본 개시내용에 따라 생성된 28일차 OPC는 표준(canonical) OPC 마커 NG2 및 PDGFRa를 발현하고, 척수 손상을 치료하기 위해 현재 임상 테스트 중인 대안적 방법을 사용하여 생성된 OPC와 (그의 전체 마커 발현 프로파일의 관점에서) 필적할만하다.
일 실시양태에서, 방법은 인간 다능성 줄기 세포를 골형성 단백질 (BMP) 신호전달의 하나 이상의 억제제와 조합된 미토겐-활성화 단백질 키나제/세포외 신호 조절 키나제(MAPK/ERK)의 하나 이상의 억제제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, MAPK/ERK 억제제는 소분자이다. 다른 실시양태에서, MAPK/ERK 억제제는 MAPK/ERK 키나제를 탈인산화하는 포스파타제와 같은 단백질이다. 특정 실시양태에서, BMP 신호전달의 억제제는 소분자이다. 다른 실시양태에서, BMP 신호전달의 억제제는 단백질이다. 일부 실시양태에서, BMP 신호전달의 억제제의 직접적인 표적은 액티빈 A 수용체, 유형 I(ACVR1)로도 알려진 ALK2이다. 특정 실시양태에서, MAPK/ERK 및 BMP 신호전달 억제에 후속하여, 세포는 꼬리형성제(caudalizing agent) 레티노산의 존재 하에 배양하여 등쪽 척수 표현형을 갖는 신경외배엽-제한된 전구 세포를 얻는다.
특정 실시양태에서, MAPK/ERK의 억제제는 PD0325901, AZD6244, GSK1120212, PD1 84352 및 코비메티닙, 및 이의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 특정 실시양태에서, BMP 신호전달의 억제제는 도르소모르핀, DMH-1, K02288, ML347, LDN193189 및 Noggin 단백질로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일 실시양태에서, 방법은 미분화 상태로 남아 있는 미분화 인간 다능성 줄기 세포를 얻는 단계; 제1 기간 동안 소분자 PD0325901 및 도르소모르핀 및 레티노산의 존재 하에 미분화 인간 다능성 줄기 세포를 부착적으로 배양하는 단계; 및 후속적으로 레티노산의 존재 하에 그리고 SHH 신호전달 활성화제의 부재 하에 제2 기간 동안 세포를 부착적으로 배양하여 등쪽 신경외배엽 세포를 얻는 단계를 포함한다. 일 실시양태에서, 제1 기간 및 제2 기간은 각각 약 1일 내지 약 6일, 예컨대 약 1일, 예컨대 약 2일, 예컨대 약 3일, 예컨대 약 4일, 예컨대 약 5일, 또는 예컨대 약 6일의 범위일 수 있다.
일 실시양태에서, 방법은 약 1 μM 내지 약 100 μM의 범위, 예컨대 약 2 μM, 예컨대 약 3 μM, 예컨대 약 4 μM, 예컨대 약 5 μM, 예컨대 약 6 μM, 예컨대 약 7 μM, 예컨대 약 8 μM, 예컨대 약 9 μM, 예컨대 약 10 μM, 예컨대 약 11 μM, 예컨대 약 12 μM, 예컨대 약 13 μM, 예컨대 약 14 μM, 예컨대 약 15 μM, 예컨대 약 20 μM, 예컨대 약 30 μM, 예컨대 약 40 μM, 예컨대 약 50 μM, 또는 예컨대 약 60 μM, 70 μM, 80 μM 또는 90 μM 농도의 PD0325901의 존재 하에 미분화 인간 다능성 줄기 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 방법은 10 μM 농도의 PD0325901의 존재 하에 미분화 인간 다능성 줄기 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 농도는 인용된 범위 내의 임의의 값 또는 하위 범위일 수 있다.
일 실시양태에서, 방법은 약 1 μM 내지 약 100 μM의 범위, 예컨대 약 2 μM, 예컨대 약 3 μM, 예컨대 약 4 μM, 예컨대 약 5 μM, 예컨대 약 6 μM, 예컨대 약 7 μM, 예컨대 약 8 μM, 예컨대 약 9 μM, 예컨대 약 10 μM, 예컨대 약 11 μM, 예컨대 약 12 μM, 예컨대 약 13 μM, 예컨대 약 14 μM, 예컨대 약 15 μM, 예컨대 약 20 μM, 예컨대 약 30 μM, 예컨대 약 40 μM, 예컨대 약 50 μM, 또는 예컨대 약 60 μM, 70 μM, 80 μM 또는 90 μM의 농도의 AZD6244의 존재 하에 미분화 인간 다능성 줄기 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 방법은 약 10 μM 농도의 AZD6244의 존재 하에 미분화 인간 다능성 줄기 세포를 배양하는 것을 포함한다. 미분화 인간 다능성 줄기 세포를 AZD6244의 존재 하에 약 10 μM의 농도로 배양하는 단계 포함한다. 농도는 인용된 범위 내의 임의의 값 또는 하위 범위일 수 있다.
일 실시양태에서, 방법은 약 1 μM 내지 약 100 μM의 범위, 예컨대 약 2 μM, 예컨대 약 3 μM, 예컨대 약 4 μM, 예컨대 약 5 μM, 예컨대 약 6 μM, 예컨대 약 7 μM, 예컨대 약 8 μM, 예컨대 약 9 μM, 예컨대 약 10 μM, 예컨대 약 11 μM, 예컨대 약 12 μM, 예컨대 약 13 μM, 예컨대 약 14 μM, 예컨대 약 15 μM, 예컨대 약 20 μM, 예컨대 약 30 μM, 예컨대 약 40 μM, 예컨대 약 50 μM, 또는 예컨대 약 60 μM, 70 μM, 80 μM 또는 90 μM의 농도의 GSK1120212의 존재 하에 미분화 인간 다능성 줄기 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 한 방법은 미분화 인간 다능성 줄기 세포를 GSK1120212의 존재 하에 약 10 μM의 농도로 배양하는 것을 포함한다. 농도는 인용된 범위 내의 임의의 값 또는 하위 범위일 수 있다.
일 실시양태에서, 방법은 약 1 μM 내지 약 100 μM의 범위, 예컨대 약 2 μM, 예컨대 약 3 μM, 예컨대 약 4 μM, 예컨대 약 5 μM, 예컨대 약 6 μM, 예컨대 약 7 μM, 예컨대 약 8 μM, 예컨대 약 9 μM, 예컨대 약 10 μM, 예컨대 약 11 μM, 예컨대 약 12 μM, 예컨대 약 13 μM, 예컨대 약 14 μM, 예컨대 약 15 μM, 예컨대 약 20 μM, 예컨대 약 30 μM, 예컨대 약 40 μM, 예컨대 약 50 μM, 또는 예컨대 약 60 μM, 70 μM, 80 μM 또는 90 μM 농도의 PD184352의 존재 하에 미분화 인간 다능성 줄기 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 방법은 약 10 μM 농도의 PD184352의 존재 하에 미분화 인간 다능성 줄기 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 농도는 언급된 범위 내의 임의의 값 또는 하위 범위일 수 있다.
일 실시양태에서, 방법은 약 1 μM 내지 약 100 μM의 범위, 예컨대 약 2 μM, 예컨대 약 3 μM, 예컨대 약 4 μM, 예컨대 약 5 μM, 예컨대 약 6 μM, 예컨대 약 7 μM, 예컨대 약 8 μM, 예컨대 약 9 μM, 예컨대 약 10 μM, 예컨대 약 11 μM, 예컨대 약 12 μM, 예컨대 약 13 μM, 예컨대 약 14 μM, 예컨대 약 15 μM, 예컨대 약 20 μM, 예컨대 약 30 μM, 예컨대 약 40 μM, 예컨대 약 50 μM, 또는 예컨대 약 60 μM, 70 μM, 80 μM 또는 90 μM 농도의 코비메티닙의 존재 하에 미분화 인간 다능성 줄기 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 방법은 약 10 μM 농도의 코비메티닙 존재 하에 미분화 인간 다능성 줄기 세포를 배양하는 단계 포함한다. 농도는 언급된 범위 내의 임의의 값 또는 하위 범위일 수 있다.
일 실시양태에서, 방법은 약 0.2 μM 내지 약 20 μM의 범위, 예컨대 약 0.5 μM, 예컨대 약 0.8 μM, 예컨대 약 1 μM, 예컨대 약 1.5 μM, 예컨대 약 2 μM, 예컨대 약 2.5 μM, 예컨대 약 3 μM, 예컨대 약 3.5 μM, 예컨대 약 4 μM, 예컨대 약 4.5 μM, 예컨대 약 5 μM, 예컨대 약 5.5 μM, 예컨대 약 6 μM, 예컨대 약 6.5 μM, 예컨대 약 7 μM, 예컨대 약 7.5 μM, 예컨대 약 8 μM, 예컨대 약 8.5 μM, 예컨대 약 9 μM, 예컨대 약 10 μM, 예컨대 약 11 μM, 예컨대 약 12 μM, 예컨대 약 13 μM, 예컨대 약 14 μM, 예컨대 약 15 μM, 예컨대 약 16 μM, 예컨대 약 17 μM, 예컨대 약 18 μM, 또는 예컨대 약 19 μM 농도의 도르소모르핀의 존재 하에 미분화 인간 다능성 줄기 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 방법은 약 0.2 μM 내지 약 1 μM, 예컨대 약 0.2 μM 내지 약 0.9 μM, 예컨대 약 0.3 μM 내지 약 0.8 μM, 예컨대 약 0.4 μM 내지 약 0.7 μM, 또는 예컨대 약 0.5 μM 내지 약 0.6 μM 범위의 농도의 도르소모르핀의 존재 하에 미분화 인간 다능성 줄기 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 방법은 약 1 μM 내지 약 10 μM, 예컨대 약 1 μM 내지 약 9 μM, 예컨대 약 2 μM 내지 약 8 μM, 예컨대 약 3 μM 내지 약 7 μM, 또는 예컨대 약 4 μM 내지 약 6 μM 범위의 농도의 도르소모르핀의 존재 하에 미분화 인간 다능성 줄기 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 일 실시양태에서, 방법은 약 10 μM 내지 약 20 μM, 예컨대 약 10 μM 내지 약 19 μM, 예컨대 약 12 μM 내지 약 18 μM, 예컨대 약 13 μM 내지 약 17 μM, 또는 예컨대 약 14 μM 내지 약 16 μM 범위의 농도로 도르소모르핀의 존재 하에 미분화 인간 다능성 줄기 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 일 실시양태에서, 방법은 약 2 μM 농도의 도르소모르핀의 존재 하에 미분화 인간 다능성 줄기 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 농도는 인용된 범위 내의 임의의 값 또는 하위 범위일 수 있다.
일 실시양태에서, 방법은 약 1 nM 내지 약 20 μM의 범위, 예컨대 약 10 nM, 약 50 nM, 약 100 nM, 약 150 nM, 약 200 nM, 약 500 nM, 약 1 μM, 약 5 μM, 약 10 μM, 또는 약 15 μM의 농도의 ALK2 억제제의 존재 하에 미분화 인간 다능성 줄기 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 농도는 인용된 범위 내의 임의의 값 또는 하위 범위일 수 있다.
일 실시양태에서, 방법은 약 1 μM 내지 약 10 μM 범위의 농도의 DMH-1의 존재 하에 미분화 인간 다능성 줄기 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 일 실시양태에서, 방법은 약 2 μM의 DMH-1의 존재 하에 미분화 인간 다능성 줄기 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 농도는 인용된 범위 내의 임의의 값 또는 하위 범위일 수 있다.
일 실시양태에서, 방법은 약 1 μM 내지 약 10 μM 범위의 농도의 K02288의 존재 하에 미분화 인간 다능성 줄기 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 일 실시양태에서, 방법은 약 2 μM의 K02288의 존재 하에 미분화 인간 다능성 줄기 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 농도는 인용된 범위 내의 임의의 값 또는 하위 범위일 수 있다.
일 실시양태에서, 방법은 약 1 μM 내지 약 10 μM 범위의 농도의 ML347의 존재 하에 미분화 인간 다능성 줄기 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 일 실시양태에서, 방법은 약 2 μM의 ML347의 존재 하에 미분화 인간 다능성 줄기 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 농도는 인용된 범위 내의 임의의 값 또는 하위 범위일 수 있다.
일 실시양태에서, 방법은 약 1 μM 내지 약 10 μM 범위의 농도의 LDN193189의 존재 하에 미분화 인간 다능성 줄기 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 일 실시양태에서, 방법은 약 2 μM의 LDN193189의 존재 하에 미분화 인간 다능성 줄기 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 농도는 인용된 범위 내의 임의의 값 또는 하위 범위일 수 있다.
부착 세포 배양에 적합한 임의의 조직 배양 용기는 본 개시내용에 따라 등쪽 신경외배엽 전구 세포를 얻기 위해 사용될 수 있다. 적합한 성장 기질에는, 예를 들어, 재조합 라미닌, 라미닌-511 재조합 단편 E8 또는 Matrigel® 매트릭스(예를 들어, Matrigel®, Matrigel® GFR), 도르소모르핀, PD0325901, 레티노산(RA), 아스코르브산(AA), 재조합 인간 EGF(rhEGF), 열 안정성(재조합 인간 염기성 FGF(rhbFGF), ROCK 억제제, rhLN521 또는 PDGF-A가 포함된다.
일 실시양태에서, 본 개시내용에 따라 얻어진 등쪽 신경외배엽 전구세포는 세포가 신경교 전구 세포로 성숙할 때까지 열 안정한 rhbFGF 및 EGF의 존재 하에 현탁 배양에서 응집체로서 수확되고 추가로 배양될 수 있다. 일 실시양태에서, 추가의 배양 기간은 약 5 내지 15일, 예컨대 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 8일, 약 9일, 약 10일, 약 11일, 약 12일, 약 13일, 약 14일, 또는 약 15일의 범위일 수 있다. 일 실시양태에서, 추가 배양 기간은 약 7일이다.
일 실시양태에서, 부착적으로 배양된 등쪽 신경외배엽 전구 세포는 효소적 수단에 의해 수확될 수 있다. 효소적 수단에는, 제한 없이, TrypLETM Select (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), Accutase®(Sigma Aldrich, MO) 또는 유사한 트립시나제가 포함된다. 대안적으로, 부착적으로 배양된 등쪽 신경외배엽 전구 세포는 비효소적 수단을 사용하여 수확될 수 있다. 비효소적 수단에는, 제한 없이, PBS 중의 0.5 mM EDTA, 또는 ReLeSRTM(Stem Cell Technologies, Vancouver, Canada)을 사용하는 것이 포함된다.
현탁 배양에 적합한 임의의 세포 배양 용기 또는 반응기는 본 개시내용에서 고려되는 비부착성 배양 단계에 사용될 수 있다. 혈관벽은 전형적으로 불활성이거나 배양된 세포의 부착에 저항성이 있다. 동적 현탁액의 경우, 자기적으로 또는 기계적으로 구동되는 교반 막대 또는 패들과 같은 교반 메커니즘, 흔들림 메커니즘(전형적으로 외부에 의해 용기에 부착됨), 또는 반전 메커니즘(즉, 세포에 대한 중력의 방향을 변경하도록 용기를 회전시키는 디바이스)과 같은 세포가 침전되는 것을 방지하기 위한 수단도 있다.
공정 개발을 위한 현탁 배양에 적합한 용기에는 상업적으로 입수 가능한 스피너, 스피너 플라스크, 로커 백(rocker bag) 또는 셰이커 플라스크의 일반적인 범위가 포함된다. 상업적 생산에 적합한 예시적인 생물반응기에는 VerticalWheelTM 생물반응기(PBS Biotech, Camarillo, CA)가 포함된다.
응집체는 또한 동적 현탁액 전에 형성될 수 있다. 예를 들어, 세포를 AggreWellTM 플레이트에 배치하여 균일한 세포 응집체를 생성할 수 있다. 약 3일 후, 세포 응집체를 동적 현탁액으로 옮길 수 있다.
일 실시양태에서, 본 개시내용에 따라 얻은 신경교 전구 세포는 세포가 희소돌기아교세포 전구 세포로 성숙할 때까지 표피 성장 인자(EGF)의 존재 하에 추가의 기간 동안 수확되고 플레이팅되고 부착적으로 배양될 수 있다. 특정 실시양태에서, 배양 배지는 혈소판 유래 성장 인자 AA(PDGF-AA)를 추가로 포함한다. 일 실시양태에서, 추가의 배양 기간은 약 7일 내지 14일, 예컨대 약 7일, 약 10일, 약 12일, 또는 약 14일의 범위일 수 있다. 일 실시양태에서, 추가 배양 기간은 약 14일 내지 25일, 예컨대 약 15일, 약 16일, 약 17일, 약 19일, 약 20일, 약 21일, 약 22일, 약 23일, 약 24일, 또는 약 25일의 범위이다. 배양 기간은 종점을 포함하여 인용된 범위 내의 임의의 값 또는 하위 범위일 수 있다.
VI. 바람직하지 않은 세포 유형
본 개시내용에 따라 얻은 OPC 집단은, 예를 들어, 유세포 분석에 의한 바람직하지 않은 세포 유형과 관련된 마커의 정량화에 의해 측정되는 바와 같이, 낮은 수준의 바람직하지 않은 세포 유형을 함유한다. 비제한적인 예에서, 본 개시내용에 따라 얻은 35일차 OPC는 상피 세포 관련 마커 시토케라틴 7(CK7), EpCAM, CD49f, 및 CLDN6을 발현하는 낮은 수준의 세포를 함유할 수 있다. 또 다른 비제한적인 예에서, 본 개시내용에 따라 얻은 42일차 OPC는 마커 TRA-1-60 및 OCT4와 연관된 hESC 잔류물이 없는 상피 세포 관련 마커 ck7, EpCAM, CD49f, 및 CLDN6을 발현하는 낮은 수준의 세포를 함유할 수 있다.
바람직하지 않은 세포 유형과 연관된 마커는 약 20% 미만의 바람직하지 않은 세포 유형, 예컨대 약 19% 미만, 예컨대 약 18% 미만, 예컨대 약 17% 미만, 예컨대 약 16% 미만, 예컨대 약 15% 미만, 예컨대 약 14% 미만, 예컨대 약 13% 미만, 예컨대 약 12% 미만, 예컨대 약 11% 미만, 예컨대 약 10% 미만, 예컨대 약 9% 미만, 예컨대 약 8% 미만, 예컨대 약 7% 미만, 예컨대 약 6% 미만, 예컨대 약 5% 미만, 예컨대 약 4% 미만, 예컨대 약 3% 미만, 예컨대 약 2% 미만, 예컨대 약 1% 미만, 예컨대 약 0.5% 미만, 예컨대 약 0.1% 미만, 예컨대 약 0.05% 미만, 또는 예컨대 약 0.01% 미만의 바람직하지 않은 세포 유형을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 세포 집단은 약 15% 내지 약 20%의 바람직하지 않은 세포 유형, 예컨대 약 19% 내지 약 20%, 예컨대 약 18% 내지 약 20%, 예컨대 약 17% 내지 약 20%, 예컨대 약 16% 내지 약 20%, 예컨대 약 15% 내지 약 19%, 또는 예컨대 약 16% 내지 약 18%의 바람직하지 않은 세포 유형을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 세포 집단은 약 10% 내지 약 15%의 바람직하지 않은 세포 유형, 예컨대 약 14% 내지 약 15%, 예컨대 약 13% 내지 약 15%, 예컨대 약 12% 내지 약 15%, 예컨대 약 11% 내지 약 15%, 또는 예컨대 약 12% 내지 약 14%의 바람직하지 않은 세포 유형을 포함할 수 있다. 일 실시양태에서, 세포 집단은 약 1% 내지 약 10%의 바람직하지 않은 세포 유형, 예컨대 약 2% 내지 약 10%, 예컨대 약 1% 내지 약 9%, 예컨대 약 2% 내지 약 8%, 예컨대 약 3% 내지 약 7%, 또는 예컨대 약 4% 내지 약 6%의 바람직하지 않은 세포 유형을 포함할 수 있다. 일 실시양태에서, 세포 집단은 약 0.1% 내지 약 1%의 바람직하지 않은 세포 유형, 예컨대 약 0.2% 내지 약 1%, 예컨대 약 0.1% 내지 약 0.9%, 예컨대 약 0.2% 내지 약 0.8%, 예컨대 약 0.3% 내지 약 0.7%, 또는 예컨대 약 0.4% 내지 약 0.6%의 바람직하지 않은 세포 유형을 포함할 수 있다. 일 실시양태에서, 세포 집단은 약 0.01% 내지 약 0.1%의 바람직하지 않은 세포 유형, 예컨대 약 0.02% 내지 약 0.1%, 예컨대 약 0.01% 내지 약 0.09%, 예컨대 약 0.02% 내지 약 0.08%, 예컨대 약 0.03% 내지 약 0.07%, 또는 예컨대 약 0.04% 내지 약 0.06%의 바람직하지 않은 세포 유형을 포함할 수 있다. 일 실시양태에서, 바람직하지 않은 세포 유형의 낮은 수준은 약 15% 미만의 바람직하지 않은 세포 유형이 존재함을 나타낼 수 있다.
일 실시양태에서, 바람직하지 않은 세포 유형은 ck7, CD49f, CLDN6, 또는 EpCAM으로부터 선택된 하나 이상의 마커를 발현하는 세포를 포함할 수 있다.
VII.
동결보존
수확 후, OPC의 확장된 집단은 특정 치료 용량(예를 들어, 세포 수)으로 제형화되고 클리닉으로 배송하기 위해 동결보존될 수 있다. 이어서, 투여 준비 완료(RTA: Ready to Administration) OPC 요법 조성물은 추가 처리 없이 해동 후 직접 투여될 수 있다. 동결보존에 적합한 배지의 예로는 90% 인간 혈청/10% DMSO, 배지 3 10%(CS10), 배지 2 5%(CS5) 및 배지 1 2%(CS2), 줄기 세포 은행, PRIME XV® FREEZIS, HYPOTHERMASOL®, CSB, 트레할로스 등이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 약 0 내지 약 8시간 동안 동결보존 배지에 보관된 여과후 세포의 생존율은 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%이다. 다른 실시양태에서, 약 0 내지 약 8시간 동안 동결보존 배지에 보관된 여과후 세포의 회수율은 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%이다. 생존 가능성은 인용된 범위 내의 임의의 값 또는 하위 범위일 수 있다.
추가의 실시양태에서, 약 0 내지 약 8시간 동안 중화 배지에 보관된 후 약 0 내지 약 8시간 동안 동결보존 배지에 보관된 여과후 세포의 생존율은 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%이다. 다른 실시양태에서, 약 0 내지 약 8시간 동안 중화 배지에 보관된 후 약 0 내지 약 8시간 동안 동결보존 배지에 보관된 여과후 세포의 회수율은 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%이다. 생존 가능성은 인용된 범위 내의 임의의 값 또는 하위 범위일 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 동결보존된 조성물의 해동 후, 약 0 내지 약 8시간 동안 중화 배지에 보관된 후 약 0 내지 약 8시간 동안 동결보존 배지에 보관된, 여과후 세포의 생존율은 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%이다. 또 다른 실시양태에서, 동결보존된 조성물의 해동 후, 약 0 내지 약 8시간 동안 중화 배지에 보관 후 약 0 내지 약 8시간 동안 동결보존 배지에 보관된, 여과후 세포의 회수율은 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%이다. 생존 가능성은 인용된 범위 내의 임의의 값 또는 하위 범위일 수 있다.
일부 실시양태에서, 동결보존된 조성물의 해동 후, 약 0 내지 약 8시간 동안 중화 배지에 보관 후 약 0 내지 약 8시간 동안 동결보존 배지에 보관된, 여과후 OPC는 데코린을 분비할 수 있다. 다른 실시양태에서, 동결보존된 조성물의 해동 후, 약 0 내지 약 8시간 동안 중화 배지에 보관 후 약 0 내지 약 8시간 동안 동결보존 배지에 보관된, 여과후 OPC는 확장될 수 있다.
일부 실시양태에서, 실온에서 약 0 내지 약 8시간 동안 중화 배지에 보관된, 여과후 OPC의 생존율은 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%이다. 일부 실시양태에서, 실온에서 약 0 내지 약 8시간 동안 동결보존 배지에 보관된, 여과후 OPC의 생존율은 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%이다. 추가의 실시양태에서, 실온에서 약 0 내지 약 8시간 동안 중화 용액에 보관된 후 실온에서 약 0 내지 약 8시간 동안 동결보존 배지에 보관된, 여과후 세포의 생존율은 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%이다. 더 추가의 실시양태에서, 실온에서 약 0 내지 약 8시간 동안 중화 용액에 보관된 후 실온에서 약 0 내지 약 8시간 동안 동결보존 배지에 보관된, 여과후 세포의 회수율은 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 105%, 110%, 115%, 120%, 125%, 130%, 140%, 150%이다. 생존 가능성은 인용된 범위 내의 임의의 값 또는 하위 범위일 수 있다.
해동 후 즉시 투여(RTA) 적용에 적절한 동결보존 배지에 제형화된 OPC는 아데노신, 덱스트란-40, 락토비온산, HEPES(N-(2-하이드록시에틸) 피페라진-N'-(2-에탄설폰산)), 수산화나트륨, L-글루타티온, 염화칼륨, 중탄산칼륨, 인산칼륨, 덱스트로스, 수크로스, 만니톨, 염화칼슘, 염화마그네슘, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 디메틸 설폭사이드(DMSO), 및 물에 현탁된 OPC를 포함할 수 있다. 이러한 동결보존 배지의 예는 상표명 CRYOSTOR® 하에 상업적으로 입수 가능하며, BioLife Solutions, Inc.에 의해 제조된다.
DMSO는 동결보존 과정에서 세포를 죽일 수 있는 얼음 결정의 형성을 방지하기 위한 동결보호제로 사용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 동결보존 가능한 OPC 요법 조성물은 약 0.1% 및 약 2% DMSO(v/v)를 포함한다. 일부 실시양태에서, RTA OPC 요법 조성물은 약 1% 및 약 20% DMSO를 포함한다. 일부 실시양태에서, RTA OPC 요법 조성물은 약 10% DMSO를 포함한다. 일부 실시양태에서, RTA OPC 세포치료제 조성물은 약 5% DMSO를 포함한다. 농도는 인용된 범위 내의 임의의 값 또는 하위 범위일 수 있다.
일부 실시양태에서, 해동 후 즉시 투여(RTA) 적용에 적합한 동결보존 배지에서 제형화된 OPC 요법은 DMSO를 함유하지 않는 동결보존 배지에 현탁된 OPC를 포함할 수 있다. 예를 들어, RTA OPC 치료 세포 조성물은 DMSO(디메틸 설폭사이드, (CH3)2S0) 없이 트롤록스, Na+, K+, Ca2+, Mg2+, c1-, H2P04-, HEPES, 락토비오네이트, 수크로스, 만니톨, 글루코스, 덱스트란-40, 아데노신, 글루타티온 또는 임의의 다른 쌍극성 비양자성 용매 중에 현탁된 OPC를 포함할 수 있다. 이러한 동결보존 배지의 예는 상표명 HYPOTHERMOSOL® 또는 HYPOTHERMOSOL®-FRS 하에 상업적으로 입수 가능하며, 또한 BioLife Solutions, Inc.에 의해 제조된다. 다른 실시양태에서, 해동 후 즉시 투여 적용에 적절한 동결보존 배지에서 제형화된 OPC 조성물은 트레할로스에 현탁된 OPC를 포함할 수 있다.
RTA OPC 요법 조성물은 선택적으로 OPC 생착, 통합, 생존, 효능 등을 지원하는 추가 인자를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, RTA OPC 요법 조성물은 본원에 기재된 OPC 제형의 기능의 활성화제를 포함한다.
일부 실시양태에서, RTA OPC 요법 조성물은 자유 라디칼의 소거, pH 완충, 종양/삼투압 지원 및 이온 농도 균형의 유지에 의해 동결 및 해동 과정 동안 분자 세포 스트레스를 감소시키는 성분을 포함하는 배지에서 제형화될 수 있다.
일부 실시양태에서, 해동 후 즉시 투여 적용에 적절한 동결보존 배지에서 제형화된 OPC 요법은 하나 이상의 면역억제 화합물을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 해동 후 즉시 투여 적용에 적절한 동결보존 배지에서 제형화된 OPC 요법은 하나 이상의 면역억제 화합물의 서방성을 위해 제형화된 하나 이상의 면역억제 화합물을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 제형과 함께 사용하기 위한 면역억제 화합물은 다음 부류의 면역억제 약물에 속할 수 있다: 글루코코르티코이드, 세포증식억제제(예를 들어, 알킬화제 또는 항대사물질), 항체(다클론 또는 단클론), 면역필린에 작용하는 약물(예를 들어, 사이클로스포린, 타크롤리무스 또는 시롤리무스). 추가 약물에는 인터페론, 오피오이드, TNF 결합 단백질, 마이코페놀레이트 및 소형 생물학적 제제가 포함된다. 면역억제 약물의 예는 다음을 포함한다: 중간엽 줄기 세포, 항-림프구 글로불린(ALG) 다클론 항체, 항흉선세포 글로불린(ATG) 다클론 항체, 아자티오프린, BAS 1L1 X 1MABO(항-IL-2Ra 수용체 항체), 사이클로스포린(사이클로스포린 A), DACLIZUMAB®(항-IL-2Ra 수용체 항체), 에베로리무스, 마이코페놀산, RITUX1MABO(항-CD20 항체), 시롤리무스, 타크로리무스, 타크로리무스 및 또는 미코페놀레이트 모페틸.
이제 본 발명을 일반적으로 설명하였으므로, 동일한 것은 예시의 방법으로 제공되는, 그리고 특정되지 않는 한, 본 개시내용을 제한하는 것으로 의도되지 않는 다음의 실시예들을 참조하여 보다 쉽게 이해될 것이다. 본원에 기재된 실시예 및 실시양태는 단지 예시적인 목적을 위한 것이며, 그에 따른 다양한 변형 또는 변경은 당업자에게 제안될 것이며, 본 출원의 사상 및 범위 및 첨부된 청구범위의 범위 내에 포함되어야 한다는 것이 이해된다. 본원에 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
실시예
실시예 1: OPC1 해동 및 주사(TAI) 의약품(DP) 제형 확립
본 실시예의 목적은 새로운 희소돌기아교세포 전구 세포(OPC1) 해동 및 주사(TAI) 의약품 제형의 확립을 입증하는 것이다. TAI용 OPC1 의약품(DP)은 해동하여 임상 현장에서 직접 적용할 수 있도록 개발되었다. 이전에는 OPC1 세포의 향상된 스케일 업 생산 및 수확 과정을 개발하기 위한 일련의 연구가 수행되었다. 본 실시예의 초점은 OPC1 TAI 바이알을 해동하는 방법뿐만 아니라 바이알당 300 μl의 최종 부피로 ml당 100 x 106개의 살아있는 세포의 임상 투여량을 생성하기 위한 동결보존 배지로서 CryoStor 10(CS10)을 사용하는 TAI DP 제형을 확립하는 것이다.
다음의 양상들이 본 실시예에서 구체적으로 확립된다; CS10에서 ml당 100 x 106개의 살아있는 세포로 OPC1 TAI 제형의 확립, 이때 최종 부피는 바이알당 300 μl의 세포 현탁액임; 300 μl를 함유하는 OPC1 TAI 바이알의 해동 절차 확립; LN521-확장 세포 대 iMatrix511-E8-확장 세포로부터 얻은 OPC1 TAI의 비교가능성(comparability) 평가; 최적의 세포 해리 효소 중화 용액의 평가; 및 모든 허용 기준을 충족하는 OPC1 TAI를 생성하기 위해 최적화된 스케일 업 OPC 분화 과정의 능력을 확인.
본 실시예에서는 다음의 약어와 정의가 사용된다. CF - 세포 팩토리(세포 배양 용기). CS10 - CryoStor 10(세포 동결보존제). DMEM/F12 - 세포 배양 배지. DP - 의약품. DS - 약물 물질. GF - 성장 인자. HSA - 인간 혈청 알부민. ICB - 중간 세포 은행. iMatrix511-E8 - 단편화된 라미닌-511 코팅 매트릭스. LN521 - 라미닌-521 코팅 매트릭스. Min. - 분. HSA가 포함된 NUTS (-) - 인간 혈청 알부민을 함유하는 NutriStem(세포 배양 배지). OPC1 TAI - OPC1® '해동-및-주사' 식. RT - 실온. Sec. - 초. TS - TrypLE 선택(세포 해리 효소).
아래 표 1 및 2에는 본 실시예에 사용된 재료와 장비가 나열되어 있다.
[표 1] 연구 재료
[표 2] 장비
도 1은 OPC1 TAI 수확 및 동결보존을 위한 실험 절차의 개요를 나타낸다. 나타낸 바와 같이, OPC1 세포는 28-35일 또는 35-42일까지 배양된다. 다음으로, OPC1 세포를 TS를 사용하여 수확한 다음, 세포 해리 효소를 중화하고, 70 um 세포 여과기를 통해 여과하고, 원심분리하고, CS10에 세포를 재현탁한다. OPC1 TAI 제형을 CS10에 mL당 100 x 106개의 살아있는 세포로 농축하고, 0.5 mL 바이알에 300 uL당 30 x 106개의 살아있는 세포의 농도로 보관한다. 마지막으로, OPC1 TAI 동결보존이 수행되고, 궁극적으로 OPC1 TAI 바이알을 해동한다.
아래 표 3에는 여러 TAI 실험에 대한 세부사항과 목적이 나열되어 있다.
[표 3] 테스트 조건
상기 표 3에서, 2층 CF가 OPC1 확장을 지원하지 않는 것으로 밝혀졌기 때문에 실험 TAI #9 및 TAI #10은 포함되지 않는다.
OPC1 배양 (단계 II)
OPC1 세포를 CF(iMatrix511-E8로 직접 코팅되거나 LN521로 사전 코팅됨)에서 7일 동안 배양하였다. 최종 DP의 부피 및 세포 농도의 초기 적격성은 LN521-코팅된 용기에서 mTeSR1(TAI #3 및 #4) 또는 mTeSR Plus 배지(TAI #5-13)를 사용하여 배양하고 배양 배지로서 GPM(+)으로 분화한 H1 세포에서 유래한 OPC1 세포를 사용하여 실행하였다. TAI #11 및 TAI#12는 나중에 LN521 코팅된 플라스크 대신 iMatrix511-E8 보충 시딩 배지를 사용하여 직접 코팅 방법을 적용할 때 배양된 세포로부터 DP 제형을 확립하였다.
OPC 수확
세포를 TS를 사용하여 35일차 또는 42일차에 수확하였다. 3개의 세포 해리 효소(TS) 중화 용액(TAI #6 및 #12)을 테스트하여 TAI 세포 품질 속성 및 원료의 GMP 등급 업그레이드에 미치는 영향을 평가하였다: OPC 배양을 위해 원래 확립된 용액인 GPM+(GF 없음), DMEM/F12 - 있는 그대로 또는 1% HSA가 보충됨 - 및 HSA가 포함된 NUT(-). HSA가 포함된 선택된 세포 해리 효소(TS) 중화 용액인 NUT (-)를 연구 TAI # 13 및 DEVOPC_테스트 # 25에 적용하였다.
OPC1 DS의 여과 및 원심분리
OPC1 TAI는 단일 세포 현탁액으로서 투여되도록 의도된다. 단일 세포 DS를 얻기 위해서는 세포 수확으로부터 얻은 DS가 70 μm 세포 여과기를 통해 통과해야 했다. 여과 후, 세포 현탁액을 원심분리하고(sup 폐기) 즉시 DP의 최종 제형화를 계속하였다.
OPC1 TAI DP 제형
DS 원심분리 후 얻은 세포 펠릿을 CS10에 재현탁하여 100 x 106개의 살아있는 세포/ml의 최종 DP 세포 농도를 생성하였다.
바이알에 DP 분취
최종 제형 후 DP를 즉시 바이알에 분취하고; 바이알당 300 μl당 30 x 106개의 살아있는 세포를 - 자동 디스펜서 및 캐퍼/디캐퍼를 사용하여 - 이어서 계속해서 동결보존한다.
OPC1 TAI 바이알 해동
세포 분석을 위해 이 연구 과정에서 생성된 TAI 바이알의 해동의 필요성은 37℃ 수조를 사용하는 표준 해동 방법과 비교하여 바이알을 수용하기 위한 맞춤형 가열 블록이 있는 MD-미니 건식 조를 사용하여 건식 조 기반 해동 방법을 평가하는 비교가능성 테스트를 수행해야 했다.
QC 검정
해동된 TAI 바이알을 35일 또는 42일차에 바이오마커 발현에 대해 검정하였다. 해동된 세포를 데코린 분비에 대해 검정하였다.
허용 기준
순도 마커(PDGFRα) > 95.00%. 불순물 마커(Claudin 6, EpCAM, CK7) < 2.00%. 데코린 분비(42일차 세포) ≥ 15 ng/ml. 모폴로지: 작고 조밀한 세포, 길쭉한 방추형 모폴로지가 없음.
회수율 계산
회수율은 100 x 106개의 살아있는 세포/ml의 표적 최종 DP 농도를 기준으로 계산하였다.
결과
OPC1 TAI 바이알의 해동 방법 확립. OPC1 TAI는 해동하여 임상 현장에서 직접 적용하도록 개발되었으며 따라서 증기상 LN2에 동결보존 및 보관된 바이알을 해동하기 위한 강력하고 휴대 가능하며 간단한 방법을 확립해야 한다. 이는 37℃ 수조를 사용하는 일반적인 해동 방법과 비교하여 바이알 수용을 위한 맞춤형 히팅 블록을 갖춘 MD-Mini 건식 조를 사용하는 건식 조 기반 해동 방법을 평가하는 비교가능성 테스트를 수행해야 했다. 임상 바이알의 실제 부피를 시뮬레이션하기 위해 300 μl CS10으로 채워진 0.5 ml 극저온 바이알을 사용한 예비 연구에서는 MD-Mini 건식 조에서 2분, 37℃ 수조에서 1분 25초로 최적의 해동 시간을 확립하였다. 또한, 해동된 세포를 NC-200 세포 계수기를 사용하여 회수율% 및 생존율%를 검정하기 전에 GPM+에서 2분 동안 인큐베이션해야 한다는 것이 확립되었다(TAI#3/4). 그 후, 모든 TAI 바이알은 R&D 및 QC 분석 둘 모두를 위해 상기 언급된 방법 중 하나로 해동되었다.
OPC1 TAI DP 세포 농도 및 부피 확립
OPC1 TAI DP는 바이알당 총 30 x 106개의 살아있는 세포에 대해 100 x 106개의 살아있는 세포/ml 농도의 300 μl CS10 세포 현탁액으로 확립되었다. 다음 표 4에는 관련 연구의 TAI 바이알의 해동 후 회수율% 및 생존율% 값이 요약되어 있다.
[표 4] TAI 해동 후 회수율% 및 생존율% 결과
GPM(+)으로 중화된 DS로부터 얻어진 해동된 DP TAI 세포의 생존율% 범위는 모든 테스트에서 88%-98%였고, 이들 테스트에서의 회수율% 범위는 90%-117%였다(표 6). 비교적 넓은 범위의 회수율%는 원하는 농도의 최종 DP 제형을 생성하기 위해 이러한 각 테스트에서 사용된 매우 작은 작업 부피의 DP - 일반적으로 수백 μl - 와 결합된 높은 세포 농도를 처리할 때 누적된 오류에 기인한다. TAI #7은 LN521 코팅된 플라스크로부터 35일차에 수확된 세포가 생존율% 및 회수율% 측면에서 42일차 TAI 바이알만큼 우수한 TAI 바이알을 생성한다는 것을 보여주었다. 그러나, 약간 더 낮은 PDGFRα 마커 발현 값(표 6)은 LN521-코팅된 1-층 CF로부터 수확된 세포를 사용하여 TAI #13에서 이러한 결과를 확증해야 했다. 실제로, TAI #13 결과는 모든 허용 기준을 충족했다. LN521 코팅된 플라스크 유래 세포로부터 35일차에 TAI DP를 생성하는 능력을 입증한 TAI #11, TAI#12 및 DEVOPC-테스트 #25는 iMatrix511-E8 보충 배지를 사용할 때 TAI DP 생성 가능성을 입증했으며, 회수율% 및 생존율% 결과는 LN521 코팅된 플라스크 유래 DP 세포만큼 우수하다. TAI #6 및 TAI#12는 효소 중화 용액을 DMEM/F12(TAI #6에 있거나 TAI #12에서 1%HSA가 보충됨) 또는 NUT(-)를 HSA로 대체할 가능성을 평가하는 것을 목표로 했다.
결과는 HSA가 포함된 GPM(+)과 NUT(-) 둘 모두 매우 유사한 생존율% 및 회수율% 결과를 제공함을 보여준다. 마커 발현 분석에는 또한 HSA가 포함된 NUT(-)가 현재 확립된 GPM(+) 효소 중화 용액과 유사하며 모든 관련 마커가 현재 허용 기준을 충족하는 것으로 나타났다(표 6). 또한, 효소 중화 용액으로 DMEM/F12를 그대로 또는 1% HSA, TAI#6 및 TAI#12의 그룹 B로 보충하여 사용하면 세포의 해동 후 생존율%가 약 8% 감소하지만 회수율%에는 큰 영향을 미치지 않는 것이 명백하다. HSA가 포함된 NUT(-)도 TS 중화 용액으로 적용된 DEVOPC-테스트 #25에서 이 데이터가 추가로 확증되었다.
아래 표 5 및 6은 마커 발현 및 데코린 분비 분석 결과를 나타낸다.
[표 5] 마커 발현 분석 결과
불순물 마커를 포함한 마커 발현 값은 95.00%보다 약간 낮은 TAI #7에서의 PDGFRα 발현을 제외하고 모든 테스트에서 각각의 허용 기준을 충족시켰다(표 5). 이러한 결과는 원래 RD 실행과 상관관계가 있으며; 따라서, 이러한 약간의 감소는 OPC1 TAI 동결보존 방법에 기인하지 않는다.
NG2 발현은 테스트마다 달라지는 것으로 보이지만, 그 발현은 수확 절차에 의해 크게 영향을 받는 것으로 확인되었으므로, NG2 양성 세포의 감소가 반드시 OPC 동일성의 잠재적 손실을 나타내는 것은 아니며, 특히 NG2 발현이 밤새 배양 세션 후에 완전히 회복된다는 것이 확립되었으며; 밤새 배양 세션 후에 GMP 배치를 NG2 발현에 대해 검정한다.
[표 6] 데코린 분비 검정 결과
모든 테스트 및 조건에서 데코린 분비는 허용 기준(> 20.00 ng/ml, 표 8)을 충족하였다. TAI#6의 데코린 분비 값은 다른 테스트와 비교하여 세 가지 조건 모두에서 상대적으로 낮았는데, 이는 TAI #6과 동일한 테스트 조건을 적용한 TAI#12에서 더 분명해지듯이 이는 테스트 조건의 직접적인 결과라기보다는 세포 공급원에 기인할 수 있다고 추정된다.
논의
최적화된 OPC 분화 과정 단계 II에서 생성된 OPC TAI DP의 최종 제형을 확립하는 동시에 TAI 바이알을 해동하는 방법을 확립하는 것이 이 연구의 초점이었다.
OPC DP가 임상 연구에 참여하려면 표적으로 살아있는 세포 농도를 ml당 100 x 106개 세포로 유지하면서 100 μl에서 10x106개 세포의 임상 용량을 허용하는 OPC1 TAI DP를 제형화해야 했다. 따라서, 각 임상 바이알에는 300 μl의 CS10 세포 현탁액에 30 x 106개의 살아있는 세포가 들어 있다.
임상 연구를 수행하기 위해 OPC1 TAI 바이알을 해동하기 위한 강력하고 간단한 방법은 이 연구 과정 동안 OPC1 TAI 세포의 추가 분석을 허용하기 위한 전제 조건이었다. 따라서, 37℃ 수조를 사용하는 표준 해동 방법을 MD-Mini 장치를 사용하는 37℃ 건식 조와 비교하였다.
300 μl CS10으로 채워진 0.5 ml NUNC 바이알로 임상 TAI 바이알을 시뮬레이션하고, MD-Mini 건식 조를 사용한 해동하는 것은 2분 절차로 확립되었으며, 이는 37℃ 수조(바이알은 해동 시간이 끝날 때 눈에 보이는 얼음 조각이 있는 바이알 포함)에서 1분 25초 해동 절차와 동일한 것으로 나타났다. 그 후, 이 연구의 모든 TAI 바이알을 MD-mini 건식 조에서 해동하였다. 또한, NC-200 분석에 필요한 희석에서 해동된 세포의 인큐베이션 시간은 GPM(+)에서 RT에서 2분으로 설정되었다.
OPC TAI DP의 초기 적격성은 OPC 분화 과정 단계 I에서 mTeSR1과 OPC 분화 과정 단계 II에 따라 배양 배지로서 GPM(+)을 갖는 LN521 코팅된 용기를 사용하여 분화되고 배양된 세포로 확립되었다(테스트 TAI#3 및 TAI#4, 표 3). 이는 새롭게 최적화된 OPC 분화 과정 단계 II에서 마커 발현 및 효능(데코린 분비)을 포함한 모든 허용 기준을 충족하는 TAI 세포를 생성할 수 있는 가능성을 입증하여 추가 공정 스케일 업을 위한 길을 열었다.
OPC1 TAI DP 품질 특성을 유지할 뿐만 아니라 수확일에 비임상 등급 및 동물 유래 배지 성분(B27 및 T3 보충제)을 제거할 수 있는 세포 해리 효소 중화 용액 사용의 가능성을 입증하는 것이 TAI #6 및 TAI#12의 목표였다(표 3). 3가지 용액 유형을 비교해 보면, HSA를 포함한 NUT(-)를 사용하는 것이 세포 해리 효소를 중화하기 위한 표준 GPM(+)만큼 우수했으며, 세포 품질 특성은 모든 허용 기준(표 4 및 5)을 충족하고 생존율% 및 회수율% 결과는 해당 목적으로 GPM(+)을 사용했을 때 얻은 결과만큼 우수하다는 것을 보여주었다(표 4).
14일차 ICB 배양물로부터 유래하고 42일차에 수확된 OPC 세포로부터 생성된 OPC1 TAI DP의 제조 가능성을 평가하는 것이 TAI#11의 목표였다. 결과는 세포 품질 특성이 42일차에 수확된 진행 중인 배양으로부터 얻어진 세포의 특성과 동등하다는 것을 보여주었다(표 4 및 5).
또한 35일차에 수확된 세포를 사용하여 제형화된 TAI DP를 평가하고, 42일차에 수확된 세포로 제형화된 OPC1 TAI DP의 품질 속성과 이들의 품질 속성을 비교하기 위한 테스트도 실행하였다. TAI #7 및 TAI#13의 결과는 (TAI #7은 그의 공급원 배양물에 비해 약간 더 낮은 PDGFRα 마커 발현을 나타내지만) 이들 세포가 모든 허용 기준을 충족시킨다는 것을 보여주었다. 또한, TAI#13에서 생성된 35일차 TAI DP는 35일차에 세포 팩토리 용기에서 얻은 세포의 품질을 확증했을 뿐만 아니라 수확 동안 세포 해리 효소 중화 용액으로 NUT(-) HSA를 사용하는 이점도 확증하였다.
마지막으로, 테스트 DEVOPC_테스트#25는, 이 테스트에는 iMatrix511-E8을 사용하는 직접 코팅 방법을 적용하는 CF의 세포 확장 공정과 60μm 필터 키트를 사용하는 최적화된 스케일 업 여과 절차 및 CryoMed를 사용하는 OPC1 TAI DP 동결보존 공정이 둘 모두 포함되어 있기 때문에 스케일 업 OPC 분화 과정 단계 II의 견고성과 반복성을 완전히 완전한 공정으로서 입증하였다. CryoMed에서 동결보존된 60 μm 여과된 세포에서 생성된 OPC1 TAI의 마커 발현 및 데코린 분비 값 둘 모두는 허용 기준을 충족하였다.
전반적으로, 이 연구에서 제시된 데이터는 OPC1 TAI DP를 0.5 ml NUNC 바이알당 300 μl의 최종 부피에서 CS10에서 ml당 100 x 106개의 살아있는 세포의 세포 현탁액으로 지원하고 확립한다. 또한, 이 연구는 iMatrix511-E8 보충 배지를 사용하여 직접 코팅된 1층 CF에서 배양하고, 35일차 또는 42일차에 TS 및 TS 중화제로서 HSA를 포함한 NUT(-)를 사용하여 수확하고, CryoMed에서 동결보존하기 전에 60μm 필터 키트를 통해 여과한 세포로부터 OPC1 TAI DP를 생성하는 OPC의 스케일 업 제조 공정 능력을 확증한다. 이러한 최적화된 스케일 업 제조 공정에서 얻은 세포는 OPC1 허용 기준을 충족했으며 OPC1 TAI의 기능적 생물학적 활성을 입증하였다.
OPC TAI는 CS10에서 100 x 106개의 살아있는 세포/ml 현탁액으로 확립되며; 0.5 ml 바이알에는 300 μl당 30 x 106개의 살아있는 세포가 들어 있다. OPC TAI 바이알을 37℃ MD-Mini 건식 조에서 2분 동안 해동하는 것은 37℃ 수조에서 해동하는 것만큼 우수하고 강력하다. iMatrix511-E8-보충 배지를 사용하여 직접-코팅된 1층 CF에서 배양된 세포로부터 생성된 OPC1 TAI DP는 LN521 사전 코팅된 용기에서 배양된 세포로부터 얻어진 OPC1 TAI DP만큼 우수하다. TAI DP를 생성하기 위한 OPC 분화 과정 단계 II의 35일차에 세포를 수확하는 것은 상기 언급된 공정 조건 하에서 실행 가능하다. 세포 해리 효소 중화 용액으로서 HSA를 포함한 NUT(-)는 35일차 또는 42일차에 수확된 세포로부터 OPC1 TAI DP를 생성하는데 GPM(+)만큼 우수하다. 14일차 ICB는 진행 중인 세포 배양에서 얻은 DP와 동등한 품질 속성을 나타내는 OPC1 TAI DP를 생성하는 것으로 나타났다. 60 μm 필터 키트를 사용하여 최적화된 스케일 업 제조 공정에서 제조되고 CryoMed에서 동결보존된 OPC1 TAI DP는 모든 허용 기준을 충족하며 기능적 생물학적 활성을 나타낸다.
실시예 2: 아급성 척수 손상(SCI)의 치료를 위한 1회 투여를 위한 OPC1
본 실시예의 목적은 OPC1(LTCOPC1로도 지칭됨) CMC 프로그램의 개발 동안 생성된 과학적 데이터를 제시하는 것이다. 제공된 정보에는 개선된 제조 공정의 R&D 실행을 기반으로 한 예비 비교가능성 결과, GPOR과 LCT R&D 제조 물질 간의 비교가능성, 새롭게 제안된 효능 검정 도입, GPOR 생체내 데이터에 기반한 OPC1 안전성 상태 검토 및 개선된 분석 방법을 활용한 GPOR 로트 재분석과 관련하여 LCTOPC1의 개발 계획이 포함되어 있다.
이전에 GRNOPC1 및 AST-OPC1로 지칭되었던 LCTOPC1(OPC1)은 아급성 척수 손상(SCI)의 치료를 위한 1회 투여용으로 의도된 H1 hESC 계통으로부터 유래된 희소돌기아교세포 전구 세포 집단이다. OPC1은 전임상 연구에서 신경영양 인자를 생성하고, 척수 실질로 이동하고, 혈관 형성을 자극하고, 벗겨진 축삭의 재수초화를 유도하는 것으로 나타났으며, 이 모든 것은 희소돌기아교세포 전구체의 필수 기능이며 축삭의 생존, 재성장 및 기능에 중요하다.
LCTOPC1의 임상 평가는 2010년에 시작되었다. 첫 번째 임상 시험은 2 x 106개 OPC1 세포의 저용량을 아급성, 신경학적으로 완전한 흉추 T3-T11 손상이 있는 대상체의 병변 부위에 주입한 1상 안전성 연구(NCT01217008)였다. 계획된 8명 중 총 5명의 대상체가 2010년 10월부터 2011년 11월까지 원래의 1상 CP35A007 안전성 연구의 일환으로 OPC1을 투여받았다. 이 임상 시험 등록은 2011년 11월에 중단되었다.
2014년에는 아급성 감각운동 완전(미국 척수 손상 협회 손상 척도 A(ASIA 손상 척도 A)), 단일 신경학적 수준(SNL)이 C5~C7인 경추 척수 손상 대상체로 OPC1의 용량을 증량하는 임상 1/2a상 연구(NCT02302157)를 시작했으며, 이후 상지 운동 점수(UEMS: Upper Extremity Motor Score)가 1 이상인 경우 C4 신경학적 손상 수준(NLI: Neurological Level of Injury)이 있는 환자를 대상으로 연구를 확대하고 척수 손상 후 투약 기간을 14~30일에서 21-42일로 변경하였다. 5개 코호트에 걸쳐 총 25명의 대상체가 연구에 등록되어 전용 수술 절차 동안 주사기 위치 지정 장치(Syringe Positioning Device)를 사용하여 척수 손상 부위에 실질내 주사 전달된 OPC1 세포를 단일 투여받았다. 연구 등록은 2017년 12월에 완료되었다.
2018년 11월에, 무작위 대조 단일 맹검 2상 연구가 FDA에 제안되었으며 FDA는 제안된 2상 임상 연구에서 OPC1 의약품 로트 M26D1A를 사용하는 데 반대하지 않았다.
간략히, 새로운 MCB(Master Cell Bank)의 기원은 H1 Bank 로트 번호 MCBH101이다. MCBH101은 2009년 Geron Corporation(Geron, Foster City, CA)이 H1 OCB(Original Cell Bank)에서 직접 제조한 것이었다. 새로운 MCB는 H1 Bank - 로트 번호 MCBH101에서 직접 생산되었다. 잘 정의된 원료, 새로운 배양 시스템 및 수확 절차를 사용하여 영양공급 세포가 없는 조건에서 제조되었으며 hESC 맞춤형 동결보존 공정에 의해 동결보존되었다. 또한, H1 hESC 다능성 평가 방법이 최적화되었다. 새로운 WCB는 새로운 MCB에서 유래되었고 hESC 특성을 유지하면서 4 계대 동안 조직 배양에서 확장된 다음, 동결보존하였다. LCTOPC1 제조를 위한 출발 물질은 WCB에서 제공된다. 새로운 마스터 및 작업 세포 은행은 사전 정의된 출시 기준에 따라 출시되었으며 승인된 연구 프로토콜, 일반적으로 통용되는 업계 표준(ICH Q5A(R1), Q5D) 및 수시로 개정되는 현재 수행 중인 연구에 적용 가능한 현행 제조 관행("규정") 및 법률 따라 승인된 테스트 시험실을 사용하여 외래성 인자(adventitious agent)에 대한 테스트하였다.
OPC1은 2008년에서 2011년 사이에 제조된 Geron이 생산한 OPC1 임상 로트를 사용하여 1상 및 1/2a상 척추 손상 임상 연구에서 연구된 시험용 약물이다. Geron의 제조 공정(GPOR)은 원래 2000년대 초반에 개발되었다. 그 당시에는 잘 정의된 세포 치료 등급의 시약과 재료가 널리 사용되지 않았다. 따라서, GPOR 제조 공정의 단계 1에는 동물 유래 세포외 기질(ECM)인 Matrigel™에서 H1 배아 세포의 증식, 콜라게나제, 및 H1 배아 줄기 세포의 수확, 계대 및 확장을 위한 배양 접시 표면의 수동 긁기가 포함되었다.
또한, GPOR 제조 공정은 자발적 분화에 대한 민감성이 강한 배아체 형태(0일차부터 26일차, 도 2)의 다능성 H1 세포로부터 직접 시작하는 세포 집합체에서 발생하는 분화 과정을 기반으로 하였다. 다능성 H1 세포에서 직접 시작하여 자연 분화에 대한 감수성이 강한 배아체 형태(0일에서 26일, 도 2)로 세포 응집체에서 발생하는 분화 과정을 기반으로 하였다. 27일차부터, 희소돌기아교세포 전구체 확장 및 성숙을 위해 Matrigel™ 코팅된 부착 표면 상에서 분화가 완료되었다. 따라서, GPOR 제조 공정은 수율이 낮았고 순도/불순물/비표적 세포 집단 마커로 정의된 주요 품질 속성은 제한된 재현성을 나타냈다. 또한, 최종 동결보존된 제품은 투여 전에 해동, 세척 및 제형 제조 시 필요하다.
본 개시내용에 따른 개선된 제조 공정의 개발은 가능한 경우 세포 치료 등급 물질을 사용하여 분화 경로를 억제하거나 유도하기 위해 특정 서열의 성장 인자 및 소분자에 의해 OPC로의 H1의 분화를 보다 제어된 방향으로 유도하는 것이다(도 3에 자세히 설명되어 있음). 또한, 새로운 공정은 자발적인 이상 분화가 발생하기 쉬운 다능성 세포 상태로부터 Geron이 사용하는 긴 응집 단계를 직접 26일에서 H1 세포의 신경외배엽으로의 단층 유도 분화 14일 후 7일로 감소시켜 응집 단계에서 자발적인 분화 가능성을 감소시킨다. GPOR 대 LCTOPC1 분화 과정은 도 2에 요약되어 있다. 개선된 분화 과정의 유도 및 억제 인자에 대한 생물학적 근거는 도 4에 기재되어 있다. 또한, 도 4에 상세히 설명된 바와 같이, 분화 과정을 더 잘 모니터링하고 특성화하기 위해 새로운 공정 중 제어(IPC: in-process control)가 추가되었다.
마지막으로, 제품은 OPC1 제형인 "해동 및 주사(TAI)"로 본원에서 지칭되는, 즉시 주사 가능한 상태로 동결보존된다. OPC1 세포를 제조하는 데 사용되는 재료(원래 GPOR 및 변형된 공정 둘 모두)는 아래 표 7에 요약되어 있다.
[표 7] OPC 세포 생산 동안 사용되는 재료 (GPOR 및 LCTOPC1 공정).
단계 I - H1 확장
다능성 H1 세포를 해동하고 라미닌 코팅된 용기에서 mTeSR Plus 배지에서 12-15일 동안 배양한다. 세포는 비효소 시약인 ReLeSR을 사용하여 계대하고 확장된다. 확장 동안, 세포는 형태학적으로 평가되고, 3회 계대가 끝나면(분화 과정의 개시 전), hESC 다능성은 유세포 분석 기반 방법에 의해 평가된다.
단계 II - OPC1로의 H1 분화
분화 0일차부터 과정이 끝날 때까지 세포는 B27 및 T3가 보충된 DMEM/F-12인 신경교 전구 배지(GPM)에서 배양된다.
0-7일차 - 0일차에 H1 배양이 락테이트 농도 및 세포 모폴로지에 의해 정의되는 필수 기준에 도달하면 라미닌 코팅된 용기에서 배양된 확장된 다능성 hESC에 대한 배지를 다음과 같이 변경하여 분화 과정을 시작한다. 0-3일차에 분화 과정을 신경외배엽 경로로 유도하기 위해 GPM 배지에 레티노산(RA), 도르소모르핀 및 PD0325901가 보충된다(Kudoh, Wilson et al. 2002). 도르소모르핀은 BMP(Bone Morphogenic Protein) 신호전달(SMAD 경로)을 억제하여 중배엽 및 영양막 분화를 억제한다(Li and Parast 2014). PD0325901 MEK1 및 MEK2에서 다운스트림 bFGF 신호전달을 억제하고 다능성 및 내배엽 분화를 억제한다(Sui, Bouwens et al. 2013). 요약하면, RA 신호전달 경로의 활성화 외에도 다능성, 내배엽, 중배엽 및 영양막 형성의 억제는 신경관(신경외배엽) 형성을 촉진한다(Watabe and Miyazono 2009, Sui, Bouwens et al. 2013, Li and Parast 2014, Patthey and Gunhaga 2014, Janesick, Wu et al. 2015). 4-7일차에 배양물에 레티노산과 아스코르브산을 보충하여 신경외배엽 분화 유도를 계속한다(Duester 2008).
7-14일차 - 7일차에 세포를 TrypLE Select를 사용하여 효소적으로 수확한 다음, 7일부터 14일차까지 라미닌 코팅된 용기에서 단층 배양으로 시딩하고 rhEGF, hsFGF 및 ROCK 억제제(처음 48시간 동안만 ROCK 억제제)가 보충된 GPM에서 배양한다(Hu, Du et al. 2009, Patthey and Gunhaga 2014, Zheng, Li et al. 2018).
14-21일차 - 14일차에, 신경체(NB) 응집체 형성을 촉진하기 위해, 세포를 TrypLE Select를 사용하여 효소적으로 수확하고, ROCK 억제제(처음 48시간 동안) 및 rhEGF 및 hs-rhFGF가 전체에 걸쳐 보충된 GPM에서 동적 현탁 배양물로서 일주일 동안 배양한다.
21-42일차 - 21일차에 응집체를 rhEGF 및 PDGF가 보충된 GPM의 라미닌 코팅된 용기에 부착 배양물로서 다시 플레이팅한 다음(Ota and Ito 2006, Koch, Lehal et al. 2013), 28일차에 세포를 TrypLE Select를 사용하여 효소적으로 수확하고, 최종 확장 및 성숙을 위해 35-42일차까지 rhEGF 및 PDGF가 보충된 GPM의 라미닌 코팅된 용기에서 부착 배양물로서 확장하고, TrypLE Select를 사용하여 ~7일마다 효소 계대하였다.
확장 과정이 끝나면 OPC1 세포를 TrypLE Select를 사용하여 수확하고 해동 및 주사(TAI) 제형으로서 CryoStor®10(CS10; BioLife Solution, Inc.) 동결보존 용액에 동결보존된다. LCTOPC1 생산 공정 흐름은 도 4에 도시되어 있다.
공정 중 제어 테스트는 도 4에 도시된 바와 같이 hESC에서 OPC1로의 분화 과정 동안 모든 주요 단계에서 수행된다. 바이오마커 단백질 및 mRNA 발현은 다색 유세포 분석(FCM) 및 qPCR 방법(각각)을 사용하여 평가된다. 세포는 OPC1, 상피, 중배엽, 성상교세포 및 신경 바이오마커, 및 잔류 hESC의 발현에 대해 테스트한다. 또한, 생존력, 세포 수율 및 대사 활성(예를 들어, 락테이트)이 과정 동안 평가된다. 락테이트 농도는 0일차부터 분화를 시작하는 지표로 사용되며, 21일차에는 pre-OPC 생성 및 확장을 위한 응집체 플레이팅에 필요한 표면적을 결정하기 위해 세포 계수에 대한 대용으로 사용된다.
해동 및 주사 제형으로서의 LCTOPC1 DP의 동결보존
개선된 LCTOPC1 의약품(DP)은 해동 후 척수에 주사하기 전에 전달 장치에 즉시 로딩되는 해동 후 주사(TAI) 제형으로 개발되고 있다. 이러한 개선은 투여 전 최종 제형을 위한 세척 및 재현탁과 같은 임상 현장에서의 추가 조작과 관련된 위험을 크게 줄이고 제품 일관성, 안전성 및 품질에 대한 관리를 증가시킨다.
TAI DP 제형의 개발에는 바이알당 300 μL의 최종 부피로 mL당 100 x 106개의 생존 세포를 표적으로 하는 임상 용량을 생성하기 위한 동결보존 배지로서 CryoStor®10(CS10)을 사용하는 것이 포함되며 다음 사항에 중점을 두고 있다: 최적의 세포 해리 효소 중화 용액 평가 및 동결보존 전 여과 단계 추가; 바이알당 300 μL 세포 현탁액의 최종 부피로 CS10에서 mL당 100 x 106개의 살아있는 세포를 표적으로 하는 OPC1 TAI 제형 확립; 300 μL를 함유한 OPC1 TAI 바이알의 해동 절차 확립; 및 최적화된 스케일 업 OPC1 개선된 제조 공정이 모든 허용 기준을 충족하는 OPC1 TAI를 생성한다는 것을 확인.
개발 연구는 0.5 mL NUNC 바이알에서 300 μL의 최종 부피로 CS10에서 mL당 100 x 106개의 살아있는 세포를 표적으로 하는 세포 현탁액으로 LCT OPC1 TAI DP를 지원하고 확립한다. 또한, 이 연구는 LCT OPC1의 스케일 업 제조 공정이 OPC1 TAI DP를 생성하고, TrypLE Select 중화제로서 HSA를 포함한 TrypLE Select 및 NUT(-)로 수확하고, CryoMed 제어 속도 냉동고에서 동결보존하기 전에 60 μm 필터 키트를 통해 여과하는 능력을 입증한다. 이러한 최적화되고 스케일 업 제조 공정에서 얻은 세포는 허용 가능한 품질 속성, 생존력 및 회복력, 및 기능적 생물학적 활성을 보여준다.
재료의 제어
보조 재료의 관리. LCTOPC1 제조에 사용되는 각 보조 재료는 위험 수준 평가(USP NF<1043>) 및 제품 및/또는 공정 품질에 대한 재료의 중요도를 기반으로 공정 개발 연구 및 개별 자격 요구 사항을 기반으로 고려된다. 위험 수준(RL)은 제조업체의 품질 시스템, 안전 위험(재료의 기원 및 제조 공정 관련 위험) 및 재료 등급(품질 표준)을 평가하기 위한 위험 평가 절차에 의해 결정된다. 공정/제품에 대한 중요도는 생산 절차 및/또는 제품 품질에 대한 물질적 영향을 평가하여 결정된다.
비세포 불순물. LCTOPC1 DP에서 잠재적 비세포 불순물의 추정량의 계산은 최종 DP 제형 및 DP 용량의 제조 전에 수행된 절차를 기반으로 한다. 위험 평가는 비세포 불순물 수준, 물질의 생물학적 안전성 및 약리학적 위험에 대한 이론적 계산을 기반으로 수행된다. 위험 평가 결과를 기반으로 특정 비세포 불순물의 검출 및 측정을 위한 DP의 분석 테스트, DP에서 물질 제거/감소, 필요에 따라 확장된 생물학적 안전성 테스트와 같은 추가 완화가 구현된다.
제안된 CMC 비교가능성 테스트
OPC1은 개선된 공정에 따라 GMP 시설에서 제조되고, 수정된 출시 파라미터에 따라 출시되며, 개발된 TAI 제형으로 동결보존된다. LCTOPC1 DP는 Geron이 제조한 대표 배치와 비교되며 새로운 공정을 통해 제조된 OPC1의 출시에 사용되는 업데이트된 분석 방법을 특징으로 한다. 계획에는 GPOR의 출시 기준으로 사용되는 속성과 확인된 추가 마커에 대한 테스트가 포함된다. 비교를 위한 스폰서 제안은 표 8에 설명된 대로 의약품을 특징짓는 품질 속성을 기반으로 한다.
LCTOPC1 배치와 GPOR OPC1 배치 간의 병렬 비교는 통계 분석을 기반으로 하며, GPOR OPC1 배치의 품질 속성을 정량적으로 측정하기 위한 예상 범위를 계산한다. LCTOPC1 배치에서 측정된 품질 속성의 값은 테스트된 품질 속성에 대한 예상 범위와 관련하여 평가된다. 비교가능성 데이터 분석은 LCTOPC1 공정에 대한 재현 가능한 출시 기준을 확립하고 LCTOPC1이 배치 간 가변성이 낮다는 것을 입증할 것으로 예상된다.
테스트된 품질 속성에는 각각 3-4개의 대표적인 GPOR 배치 및 LCT OPC1 배치에 대한 생존력, 동일성/순도, 불순물 집단 및 기능/효능 검정이 포함된다.
제안된 비교가능성 품질 속성은 다음과 같다: 생존력 - 모든 살아있는 세포 의약품의 중요한 품질 속성; 동일성/순도 평가 - 특징적인 희소돌기아교세포 전구 세포 단백질 마커: NG2, PDGFRα 및 PDGRFβ의 평가; 비표적 세포 집단/불순물; 및 시험관내 세포 기능/효능.
비표적 세포 불순물 집단과 관하여. 출발 물질로부터의 잔류 H1 hESC - 인간 배아 줄기 세포 단백질 마커 TRA-1-60 및 Oct-4는 다색 유세포 분석 테스트에서 조합된 기형 유발 물질에 대한 잠재적 공급원이다. TRA-1-60 및 Oct-4는 일반적으로 알려져 있고 배아 줄기 세포에 대한 마커로 사용되며 이전에 OPC1 출시 기준으로 사용되었다. 잠재적인 이상 분화 경로 평가. 상피 세포 단백질 마커: 알려진 상피 마커로서 케라틴 7, 클라우딘-6, EpCAM 및 CD49f. 중배엽 및 연골 마커로 알려진 중배엽 세포 단백질 마커 CXCR4 및 CD56. 성상교세포 마커로 알려진 성상교세포 세포 단백질 마커 GFAP. 상피-중간엽 전이를 유도하는 중간엽 세포 mRNA OLR1. 내배엽 마커로 알려진 내배엽 세포 mRNA 마커 FOXA2, SOX17. 새로운 데이터는 네스틴(Nestin)이 OPC에 특이적이지 않고 오히려 NSC 및 기타 세포 유형(웹사이트 ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5948302/ 참조)에 대한 마커를 나타내며 α-액티닌은 CXCR4/CD56의 조합으로 효과적으로 대체될 수 있기 때문에, 현재로서는 이전에 사용된 네스틴 및 α-액티닌 속성을 포함할 계획이 없다. CXCR4는 최종 내배엽 및 중배엽에서 발현된다: 웹사이트 pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/16258519/ 및 웹사이트 pnas.org/content/107/31/13742 참조.
시험관내 세포 기능/효능에 관하여. 데코린 분비 - OPC1의 효능 지표로서 분비되는 작은 세포 매트릭스 프로테오글리칸. 중추신경계의 뉴런과 성상교세포에 의해 발현되는 데코린은 흉터 조직 형성을 약화시키고 공동화를 억제하며 상처 치유를 촉진한다. 척추의 단일 주사 위치에서 가장 광범위한 해부학적 범위를 보장하기 위해 손상 부위에서 세포 운동성에 중요한 혈소판 유래 성장 인자-BB(PDGF-BB)에 대한 반응으로 OPC1 세포 이동. OPC1의 성숙 및 수초화 가능성을 평가하기 위한 새로운 효능 테스트 개발. 이러한 검정은 OPC1 세포의 필수 기능인 벗겨진 축삭의 재수초화를 기반으로 한다. 이러한 검정에서, OPC1 세포는 해동되어 OPC1의 희소돌기아교세포(OL)로의 성숙을 유도해야 하는 3D 조직 배양 환경(예를 들어, Matrigel 또는 나노섬유 튜브)의 특정 배지에 플레이팅된다. 3D 환경 나노튜브는 간단한 시험관내 환경서 OPC1 세포에 의한 수초화 활성을 유도하기 위해 벗겨진 축삭을 모방한다. 검정은 면역세포화학, 유세포 분석 및 qPCR에 의해 MBP, O4, MAG, MOG, PLP, CNpase와 같은 OL 기능 및 성숙 상태와 연관된 단백질의 발현을 측정한다.
LCTOPC1에 대한 제안된 출시 기준과 함께 GPOR OPC1 및 LCTOPC1을 검사하는 데 사용되는 제안된 테스트 패널은 아래 표 8에서 볼 수 있다.
[표 8] 제안된 테스트 패널 및 공정 개발, 출시 및 비교가능성에 사용되는 이론적 근거.
대표적인 실행으로부터 R&D LCTOPC1 배치의 예비 비교가능성은 아래 표 9-13에 제시되어 있다.
[표 9] 대표적인 GPOR OPC1 및 LCTOPC1 R&D 실행으로부터의 비교가능성 데이터 - 유세포 분석에 의한 OPC1 동일성 프로파일
[표 10] 대표적인 GPOR 및 LCTOPC1 R&D 실행의 비교가능성 데이터 - 유세포 분석에 의한 비표적/불순물 세포 집단 프로파일
[표 11] 대표적인 GPOR OPC1 및 LCTOPC1 R&D 실행의 비교가능성 데이터 - 유세포 분석에 의한 hESC 잔류물
[표 12] 대표적인 GPOR OPC1 및 LCTOPC1 R&D 실행의 비교가능성 데이터 - qPCR에 의한 비표적/불순물 세포 집단 유전자 프로필(GPOR OPC1 M08과 비교)
[표 13] 대표적인 GPOR OPC1 및 LCT OPC1 R&D 실행의 비교가능성 데이터 - 데코린 분비 및 이동 검정에 의해 결정된 시험관내 기능
OPC1 의약품의 출시 기준으로서의 이소성 조직 형성 평가 검토
이소성 조직(낭종) 형성 위험을 해결하기 위한 OPC1 프로그램의 역사적 접근법. 초기 OPC1 IND 제출의 일부로 수행되고 제공된 독성 연구는 특정 OPC1 배치를 받은 동물에서 낭성 구조의 이소성 조직 형성 및 과립상 증식(AGS)이 밝혀졌다. 로트간 상당한 변동이 있고 제안된 출시 기준이 의도한 임상 로트의 안전성을 예측하기에 충분하지 않다는 FDA의 우려로 인해 FDA는 출시 요건으로 각 의도된 임상 로트에 대해 9개월의 독성 연구를 수행하도록 요청했다. 시험관내 낭종 검정은 OPC1 로트를 스크리닝하는 데 사용되는 연구 도구로 제시되었다. 가설은 시험관내에서 낭종을 형성하는 경향이 강한 로트를 쉽게 식별할 수 있으며 모든 시험관내 낭종 양성 로트가 생체내에서 낭종 형성을 보일 것이라고 명시했다. 또한, 생체내 낭종 형성에 대한 예측 인자로서 시험관내 낭종 크기의 보다 일관된 염색 및 평가를 통해 낭종 식별을 개선하여 검정을 개선하기 위한 단계가 취해지고 있다고 명시되어 있다. 시험관내 낭종 검정에 대해 수행된 추가 작업에서는 다음과 같은 결론을 밝혀냈다: 수년간의 개발 노력에도 불구하고 낭종 검정은 QC 출시 방법에 대한 기본 요구 사항을 충족하지 않고; 시험관내 낭종 형성과 생체내 낭종 빈도 사이에는 선형 상관관계 또는 정확한 예측이 없다.
GPOR 데이터 및 비교가능성 테스트의 예비 결과, 통과/실패 GPOR 배치 간의 상관관계 및 신규/개발된 마커를 기반으로 OPC1 안전성 상태 검토 본 발명자들은 OPC1 제품에 대한 새로운 공정 중 제어, 출시 및 효능 테스트를 포함하여 OPC1 제조 공정의 개선을 위해 지속적으로 노력해 왔다. 제조된 재료에 대한 공정 개선 및 비교가능성 계획에 대한 이론적 근거는 이 실시예의 이전 섹션에서 제시되었다. 개발 노력의 일환으로, 본 발명자들은 새로 개발된 방법을 기반으로 개선된 제품 특성화 패널을 사용하여 관련 GPOR OPC1 GMP 배치에 대한 포괄적인 분석 및 재테스트를 수행하였다. 이러한 분석으로 Geron GMP 배치에 대한 GLP tox 연구로부터 이용 가능한 데이터와 순도 및 불순물/비표적 세포 집단 특이적 마커의 발현 수준 사이의 특정 상관관계가 밝혀졌다. 재테스트 결과 및 분석은 불순물과 생체내 배치 실패 간의 상관관계를 보여주며, 이는 상당히 낮은 수준의 불순물과 고순도 프로파일을 특징으로 하는 LCTOPC1이 GPOR OPC1보다 생체내에서 낭종 형성 가능성이 크게 감소함을 나타낸다.
요약
대표적인 GPOR 및 LCTOPC1 배치의 예비 비교가능성 데이터는 다음을 보여준다: GPOR OPC1 및 R&D는 R&D LCTOPC1에서 더 높고 개선된 OPC1 제조 공정(지정된 분화)으로 인해 발생할 수 있는 PDGFR-α 바이오마커를 제외하고 유사한 OPC1 동일성/순도 프로파일 프로파일을 입증할 LCTOPC1 있고; R&D LCTOPC1은 GPOR OPC1에 비해 상피, 성상교세포 및 신경 비표적 세포의 불순물 수준이 낮고; LCTOPC1과 GPOR OPC1 둘 모두 매우 드물게 검출 가능한 잔류 hESC(%TRA-1-60+/Oct4+에 의해 검출됨)를 갖지만, GPOR OPC1은 TRA-1-60+/Oct4- 및 CD49f+를 나타내는 세포 집단에 의해 입증된 바와 같이 LCTOPC1에 비해 다능성 세포의 비율이 더 높고; LCTOPC1은 GPOR OPC1에 비해 내배엽 및 중간엽 비표적 세포 유전자 발현 수준이 낮고; LCTOPC1 및 GPOR OPC1은 유사한 데코린 분비 및 이동 능력을 보여준다.
결론. 현재까지 축적된 데이터는 재현성이 높고 엄격하게 제어되는 분화 공정에 의해 정의된 세포 은행 시스템에서 생성되고 업데이트된 분석 방법으로 모니터링되는 개선된 공정으로 제조된 LCTOPC1 의약품이 GPOR OPC1과 유사한 필수 품질 속성을 나타내지만 순도 마커의 전반적인 높은 발현과 불순물/비표적 집단 마커의 낮은 발현의 이점을 보여준다. 따라서, LCTOPC1 의약품에 대한 안전성 프로필이 잠재적으로 증가한다.
실시예 3: 개념 증명 연구
본 연구의 목적은 OPC1 수초화 및 성숙 개념 증명 연구를 위한 실험 데이터를 제공하는 것이다.
LCT OPC1 세포는 표 14에 나열된 바와 같은 상이한 배지 성분의 96개 비전 플레이트에서 Matrigel(MG) 1:30에서 배양하였다. 각 배양 조건은 "시스템"으로 이루어진다. 세포를 배양 첫 5-6일 동안 GPM/E에서 배양한 다음, 성숙 시스템의 경우 표 14에 나열된 단계에 따라 배지를 교체하였다. 시스템 #2는 희소돌기아교세포 유사 세포로의 모폴로지 변화와 면역염색에 의한 MBP 발현을 보여주었다.
[표 14] 연구 설계
도 6 내지 도 9는 다양한 시스템에 대한 OPC 모폴로지를 나타낸다. 도 6은 10일차(시간 = 0, 7일차)의 제어 시스템 #1, GPM/E를 보여준다. OPC 모폴로지는 DCN ELISA 효능 검정에 일반적이다. 도 7은 치료 후 3일차에 시스템 #2, 50% GPM/E 및 50% N2.1(IBMX 없음)에 대한 OPC 모폴로지를 보여준다. 세포는 대조군에 비해 형태학적 변화를 나타낸다. 도 8은 12일차의 대조군 시스템 #1 및 DCN ELISA 효능 검정에 대한 전형적인 OPC 모폴로지를 나타낸다. 도 9는 치료 후 5일차에 시스템 #2, 100% N2.1(2일 동안 IBMX와 함께)을 나타낸다. 세포는 형태학적 변화를 보인다.
도 10은 13일차의 Hoechst 및 MBP에 대한 공초점 면역염색(고정 세포)을 보여준다. GPM/E의 제어 시스템 #1을 왼쪽에 나타내고 100% N2.1의 시스템 #2를 오른쪽에 나타낸다.
실시예 4: OPC 분화 프로토콜
[표 15] 원하는 최종 농도에 도달하기 위해 GPM ml당 추가할 스톡 용액의 부피
본 실시예의 목적은 hESC를 OPC로 분화하기 위한 GMP 조건의 확립을 입증하는 것이다.
0일차 - 배양 평가. 0일차 IPC: 단계 II 시작 전에 hESC 콜로니 평가를 수행한다. 분화는 다음 기준이 충족될 때만 시작할 수 있다: 배양의 컨플루언시는 ≥ 95%이고; 배양에서 분화의 %는 < 5%이고; 촘촘하게 패킹된 콜로니의 %는 > 50%이고; 배지의 락테이트 농도는 > 17.40 mM이다.
배지 교체, 0-6일차: 배지는 24시간 ± 4시간마다 교체해야 한다. 0일차와 4일차에, 5배 및 10배 배율을 사용하여 배양물을 관찰하고 사진을 찍는다. 3일차와 4일차에, 락테이트를 측정한다. 표 15에 따라 소분자를 해동하고 필요한 GPM 부피를 따뜻하게 한다. 표 15에 따라 따뜻한 GPM에 GFs 부피를 추가한다. 배지를 교체한다. 4일차부터는 표 15에 따라 GF는 변경된다.
수확, 7일차: 해당되는 경우, 수확 1일에서 1주일 전까지 필요한 수의 플라스크를 결정하고 10 μg/ml rh LN521로 코팅한다. 5x 및 10x 대물렌즈를 사용하여 배양물을 관찰하고 사진을 찍는다. 락테이트 수준을 측정한다. 2 ml의 CM을 2개의 극저온 바이알(각각 1 ml)로 나누고 -80℃에서 보관한다. 표 15에 따라 GF를 해동하고 필요한 GPM 부피를 따뜻하게 한다(GPM + GF 및 GF가 없는 GPM 최종 용액의 경우). 표 15에 따라 따듯한 GPM에 GF 부피를 추가한다.
수확 프로토콜: 배지를 흡인한다. 각 T25 플라스크에 3 ml PBS(-)를 추가한다. 플라스크를 2-3회 기울이고 RT에서 1분 동안 인큐베이션한다. 타이머를 사용한다. 흡인하고 1 ml/T25 TrypLE Select를 추가한다. 참고: 새 TS 병을 연다. 37℃ 및 5% CO2에서 6분 동안 인큐베이션한다. 타이머를 사용한다. 플라스크의 한쪽을 매우 세게 두드리고 플라스크를 기울여 세포를 세척하고 플라스크의 반대쪽을 매우 세게 두드린다. GF가 없는 5 ml의 GPM을 추가한다. 배지를 세포에 직접 추가하고 표면을 1-2회 부드럽게 세척한다. 세포를 원뿔형 튜브에 수집한다. GF가 없는 5 ml/T25 GPM을 추가하고 2-3회 부드럽게 헹군다. 세포를 수집한다. 원심분리한다: 200 g, 5분, RT. 타이머를 사용한다. 선택 사항: 켄칭 후 처리된 각 플라스크의 2.5x 대물렌즈를 사용하여 이미지를 촬영하여 나머지 세포의 %를 기록한다. 상층액을 흡인하고 펠릿을 세게 두드리고 5 ml 피펫을 사용하여 수확한 T25 플라스크당 5 ml GPM + GFS로 부드럽게 재현탁한다. 피펫을 과도하게 사용하지 않도록 주의한다.
세포 계수 프로토콜: 2개의 표시된 Eppendorf 튜브를 준비하고 ~100 μl의 세포 현탁액을 각각의 개별 Eppendorf 튜브에 옮긴다. x5 희석의 경우: 200 μl의 GPM + GF와 함께 2개의 추가 Eppendorf 튜브를 준비하고, 섹션 0에서 준비한 50 μl의 세포 현탁액을 250 μl의 최종 부피까지 각 배지 함유 튜브로 옮긴다. 잘 혼합한다. NC-200 세포 계수기를 사용하여 희석된 각 Eppendorf 튜브를 계수한다.
세포 시딩 프로토콜: 표 16에 따라, 시딩에 필요한 배지 부피와 세포 수를 계산한다(밀도 2.67 x 104개의 살아있는 세포/cm2).
[표 16] 시딩을 위한 세포의 부피 및 #
해당되는 경우, 냉장고에서 LN521 코팅된 플라스크를 꺼낸다. LN521 코팅된 플라스크의 경우: 각 T225 LN521 코팅된 플라스크에 6 ml GPM + GF를 추가한다. 플라스크를 RT에서 1분 동안 인큐베이션한다. 타이머를 사용한다. 플라스크에서 코팅 용액과 GPM + GF 배지를 흡인한다. 24 ml PBS(+)/T225로 세척한다. 계산된 GPM + GF를 플라스크에 추가한다. 피펫을 부드럽게 피펫팅하여 계산된 세포 부피에 세포 현탁액과 시드를 혼합한다. 용기를 인큐베이터로 옮기고 용기를 부드럽게 흔들어 용기 표면에 세포를 고르게 분포시킨다. IPC 7일차: 샘플용 세포를 동결보존한다.
배지 교체, 9-13일차: 9일, 11일, 13일차에 배양물을 관찰하고 2.5x, 5x 및 10x 대물렌즈를 사용하여 사진을 찍고 락테이트를 측정한다. 표 15에 따라 GF를 해동한다. 필요한 GPM 부피를 결정하고 37℃ 수조에서 따뜻하게 한다. 표 15에 따라 GF를 GPM에 추가한다. 배지를 흡인하고 각 T225 플라스크에 90 ml GPM + GF 배지를 추가한다.
수확, 14일차: PBS-휠 준비: 13일차에 PBS-휠에 70 ml의 GPM 배지를 라벨링하고 미리 로드하고 PBS를 기울이고 휠 벽을 세척한다. 37℃ 및 5% CO2에서 35 RPM에서 가습된 CO2 인큐베이터에서 밤새 인큐베이션한다. 14일차에 배양물을 관찰하고 2.5x, 5x 및 10x 대물렌즈를 사용하여 사진을 찍는다. 락테이트를 측정한다. 2 ml의 CM을 2개의 극저온 바이알(각각 1 ml)로 나누고 -80℃에서 보관한다. 표 15에 따라 GF를 해동하고 필요한 GPM 부피를 따뜻하게 한다(GPM + GF 및 GF가 없는 GPM의 최종 용액의 경우). 표 15에 따라 따뜻한 GPM에 GFs 부피를 추가한다.
수확: 배지를 흡인한다. 각 T225 플라스크에 24 ml PBS(-)를 추가한다. 플라스크를 2-3회 기울이고 RT에서 1분 동안 인큐베이션한다. 흡인하고 9 ml/T225 TrypLE Select를 추가한다. 37℃ 및 5% CO2에서 8분 동안 인큐베이션한다. 플라스크의 한쪽을 세게 두드리고 플라스크를 기울여 세포를 세척하고 플라스크의 반대쪽을 세게 두드린다. GF가 없는 18 ml의 GPM을 추가한다. 배지를 세포에 직접 추가한다. 세포를 원뿔형 튜브에 수집한다. GF가 없는 18 ml/T225 GPM을 추가하고 2-3회 부드럽게 헹군다. 세포를 수집한다. 원심분리한다: 170-180 g, 5분, 실온. 선택 사항: 켄칭 후 처리된 각 플라스크의 2.5x 대물렌즈를 사용하여 이미지를 촬영하여 나머지 세포의 %를 기록한다. 상층액을 흡인하고 펠릿을 세게 두드리고 수확한 T225 플라스크당 30 ml(먼저 5 ml 피펫에 5 ml를 넣어 재현탁한 다음, 25 ml 추가) GPM + GFS로 재현탁한다. 피펫을 과도하게 사용하지 않도록 주의한다.
세포 계수 : 2개의 표시된 Eppendorf 튜브를 준비하고 ~100 μl의 세포 현탁액을 각각의 개별 Eppendorf 튜브에 옮긴다. X4 희석의 경우: 150 μl의 GPM + GF와 함께 2개의 추가 Eppendorf 튜브를 준비하고, 50 μl의 세포 현탁액을 200 μl의 최종 부피까지 각 배지 함유 튜브로 옮긴다. 잘 혼합한다. NC-200 세포 계수기를 사용하여 희석된 각 Eppendorf 튜브를 계수한다.
세포 시딩: 표 17에 따라, 시딩에 필요한 배지 부피와 세포 수를 계산한다(128 x 106개의 살아있는 세포/0.1PBS 휠).
[표 17] 시딩을 위한 세포의 부피 및 #
휠에서 사전 로드된 배지를 흡인한다. 계산된 GPM + GF를 플라스크에 추가한다. 피펫을 부드럽게 피펫팅하여 계산된 세포 부피에 세포 현탁액과 시드를 혼합한다. PBS 휠 용기를 37℃ 및 5%에서 가습된 CO2 인큐베이터에 있는 PBSmini에 놓는다. PBSmini 속도를 24시간±4 동안 35 RPM으로 설정한다. IPC 14일차: 세포를 동결보존한다.
15일차: PBSmini 속도를 45 RPM으로 증가시킨다. PBSmini의 조명을 켜고 PBS 휠이 계속 회전하는 동안 응괴(clot)가 보이지 않는지 주의 깊게 검사한다. 응괴가 관찰된 경우에만 침전을 피하기 위해 신속하게 제거한다. 필요하지 않은 경우 PBSmini에서 PBS 휠을 제거하지 않는다.
배지 교체: 16, 18, 20일차: 6일, 18일, 20일차에 배양물을 관찰하고 2.5x 및 5x 대물렌즈를 사용하여 사진을 찍고 락테이트를 측정한다. 표 15에 따라 GF를 해동한다. 필요한 GPM 부피를 결정하고 37℃ 수조에서 따뜻하게 한다. 표 15에 따라 GF를 GPM에 추가한다. PBSmini에서 PBS-휠을 제거하고 표 18과 같이 하루에 표시된 정착 시간 동안 인큐베이터의 랙에 놓는다.
[표 18] 1일 정착 시간
배지를 교체하기 전에 침강을 검사한다. 응집체가 침강되지 않으면 침강 시간을 추가 5분 늘린다. 10 ml 피펫을 사용하여 PBS-휠에서 부피의 80%(56 ml)를 제거하고 락테이트 측정을 위해 보관한다. PBS-휠 측면에 56 ml(상기 섹션에서 제거한 것과 동일한 부피의 GPM + GF)를 추가한다. 응괴 형성이 있는지 PBS 휠을 검사하고, 응괴가 관찰되면 응괴를 제거하는데 검사 및 응괴 제거가 이 과정에 중요하기 때문이다. 37℃ 및 5% CO2, 45 RPM에서 가습된 CO2 인큐베이터에 있는 PBSmini에 PBS-휠을 다시 넣는다. 락테이트를 측정한다.
응집체의 편평화, 21일차: 수확 1일에서 1주일 전까지 T75/T150 플라스크의 수를 결정하고 적절한 코팅 용액(10 μg/ml rhLN521 또는 iMatrix-511-E8)으로 코팅한다. 시딩 용기를 결정하려면 배지 교체 후 약 24시간 후에 락테이트를 측정한다. 락테이트 농도가 15.00 mM 이하인 경우 하나의 T75에서 시드가 응집된다. 그렇지 않으면 시드가 하나의 T150에 응집된다. 2 ml의 CM을 2개의 극저온 바이알(각각 1ml)로 나누고 -80℃에서 보관한다. 배양물을 관찰하고 응집체의 사진을 찍는다. 표 15에 따라 GF를 해동하고 필요한 GPM 부피를 따뜻하게 한다(GPM + GF의 최종 용액의 경우). 표 15에 따라 따듯한 GPM에 GF 부피를 추가한다.
시딩을 위한 코팅된 용기의 준비: 냉장고에서 코팅된 플라스크를 꺼낸다. 각 플라스크에 라벨을 붙인다. 각 T75/T150 코팅된 플라스크에 2/4 ml GPM + GF를 추가한다. 플라스크를 RT에서 1분 동안 인큐베이션한다. 타이머를 사용한다. 플라스크에서 코팅 용액과 GPM + GF 배지를 흡인한다. LN521 코팅된 플라스크에만 -각 T75/T150 코팅된 용기에 대해 10/20 ml PBS(+)로 세척한다. T75/T150에 20/40 ml GPM + GF를 추가한다. 플레이팅할 때까지 용기를 37℃ 및 5% CO2에서 가습된 CO2 인큐베이터로 옮긴다. 25 ml 피펫을 사용하여 35 ml의 PBS-휠 내용물을 50 ml 원뿔형 튜브로 옮긴다. 응집체를 침강되도록 4분 동안 그대로 둔다. 25 ml 피펫을 사용하여 수동으로 흡인하고 별도의 50 ml 튜브에 30 ml의 GPM을 제거한다. 단계를 반복하여(25 ml 피펫으로 35 ml의 PBS-휠 내용물을 50 ml 원뿔형 튜브로 옮기고 응집체가 침강되도록 4분 동안 그대로 둠) PBS-휠에서 나머지 응집체를 "시딩 응집체"라고 표시된 동일한 50 ml 원뿔형 튜브로 옮긴다. 응집체가 침강되는 동안, 2 ml 피펫을 사용하여 PBS 휠에 남아있는 나머지 응집체를 수집하고 "시딩 응집체" 튜브의 바닥으로 천천히 옮긴다. 응집체가 50 ml 튜브에 침강되는 동안 20 ml GPM + GF를 PBS 휠에 추가한다. 단계를 1회 이상 반복한다(25 ml 피펫으로 35 ml의 PBS-휠 내용물을 50 ml 원뿔형 튜브에 옮기고 응집체가 침강하도록 4분 동안 그대로 두고, 응집체가 침강하는 동안 2 ml 피펫을 사용하여 "시딩 응집체"라고 표시된 동일한 50 ml 원뿔형 튜브에 PBS-휠로부터의 나머지 응집체를 옮기고, PBS-휠에 남아 있는 나머지 응집체를 수집하여 "시딩 응집체" 튜브의 바닥으로 천천히 옮기고, 응집체가 50 ml 튜브에 침강되는 동안 20 ml GPM + GF를 PBS-휠에 추가한다). PBS 휠의 세척액을 50 ml 튜브에 수집한다. PBS-휠을 기울이고, 2 ml 피펫으로 PBS-휠로부터 나머지 배지를 수집한다. 50 ml 원뿔형 튜브를 원심분리한다: 140 G, 3분, RT. 준비된 용기를 BSC로 옮긴다. 플라스크의 윗면이 깨끗한지 확인한다. 필요한 경우, 시딩 전에 배지로 표면을 세척한다. 상층액을 부드럽게 흡인한다. 25 ml 피펫을 사용하여 T75/T150 시딩당 5/10 ml GPM + GF로 펠릿을 재현탁한다(재현탁 전에 두드리지 않음). 현탁 부피를 측정한다. 지정된 용기에 총 부피를 신속하게 시딩한다(응집체가 불균일하게 부착되는 것을 방지하기 위해 플라스크를 수직으로 유지). 25 ml 피펫을 사용하여 여분의 부피로 튜브를 세척하고(각각 시딩된 75/150 cm2당 30/60 ml를 완료하기 위해) 용기에 추가한다. 플라스크를 37℃ 및 5% CO2에서 가습된 인큐베이터에서 인큐베이션한다. 인큐베이터에서 응집체가 플라스크에 균일하게 분포되어 있는지 확인한다.
배지 교체 23, 25, 27일차: 23일, 25일 및 27일차에 배양물을 관찰하고 5x 및 10x 대물렌즈를 사용하여 사진을 찍고 락테이트를 측정한다. 표 15에 따라 GF를 해동한다. 필요한 GPM 부피를 결정하고 37℃ 수조에서 따뜻하게 한다. 표 15에 따라 GF를 GPM에 추가한다. 배지를 흡인하고 각 T75/T150 플라스크에 30/60 ml GPM + GF 배지를 추가한다.
28일차: 해당되는 경우, 수확 1일에서 1주일 전까지 필요한 플라스크 수를 결정하고 10 μg/ml rhLN521로 코팅한다. 5x 및 10x 대물렌즈를 사용하여 배양물을 관찰하고 사진을 찍는다. 락테이트 수준을 측정한다. 2 ml의 CM을 2개의 극저온 바이알(각각 1 ml)로 나누고 -80℃에서 보관한다. 표 15에 따라 GF를 해동하고 필요한 GPM 부피를 따뜻하게 한다(GPM + GF 및 GF가 없는 GPM의 최종 용액의 경우). 표 15에 따라 따듯한 GPM에 GF 부피를 추가한다. 수확: 배지를 흡인한다. 각 T75/T150 플라스크에 8/16 ml PBS(-)를 추가한다. 플라스크를 2-3회 기울이고 RT에서 1분 동안 인큐베이션한다. 흡인하고 T75/T150 TrypLE Select당 3/6 ml를 추가한다. 37℃ 및 5% CO2에서 7분 동안 인큐베이션한다. 플라스크의 한쪽을 가볍게 두드리고 플라스크를 기울여 세포를 세척하고 플라스크의 반대쪽을 가볍게 두드린다. 25 ml 피펫을 사용하여 세포 표면에 GF가 없는 6/12 ml의 GPM을 부드럽게 추가한다. 세포를 원뿔형 튜브에 수집한다. 세포 표면을 세척하지 않는다. 원심분리한다: 260-270 g, 10분, RT. 상층액을 흡인하고 펠릿이 튜브에서 분리될 때까지 펠릿을 가볍게 두드리고 수확한 T75/T150 플라스크당 15/30 ml GPM + GFS로 재현탁한다. 먼저 25 ml 피펫을 사용하여 5 ml로 재현탁하고 2-3회 위아래로 피펫팅한 다음, 25 ml 피펫을 사용하여 나머지 부피를 추가한다. 피펫을 과도하게 사용하지 않도록 주의한다.
세포 계수 : 2개의 표시된 Eppendorf 튜브를 준비하고 ~150 μl의 세포 현탁액을 각각의 개별 Eppendorf 튜브에 옮기고 계수용 샘플을 위한 응집체를 옮기지 않도록 한다. X2 희석의 경우: 100 μl의 GPM + GF와 함께 Eppendorf 튜브 2개를 추가로 준비하고, 100 μl의 세포 현탁액을 200 μl의 최종 부피까지 각 배지 함유 튜브로 옮긴다. 잘 혼합한다. NC-200 세포 계수기를 사용하여 희석된 각 Eppendorf 튜브를 계수한다.
세포 시딩: 표 16에 따라, 시딩에 필요한 배지 부피와 세포 수를 계산한다(밀도 4.0 x 104개의 살아있는 세포/cm2).
[표 19] 시딩을 위한 세포의 부피 및 #
해당되는 경우, 냉장고에서 LN521 코팅된 플라스크를 꺼낸다. 각 플라스크에 라벨을 붙인다. LN521 코팅된 플라스크의 경우: 각 T225 LN521 코팅된 플라스크에 6ml GPM + GF를 추가한다. 플라스크를 RT에서 1분 동안 인큐베이션한다. 타이머를 사용한다. 플라스크에서 코팅 용액과 GPM + GF 배지를 흡인한다. 24 ml PBS(+)/T225로 세척한다. 계산된 GPM + GF를 플라스크에 추가한다. 해당되는 경우 배지+E8 풀(pool)을 준비한다. 피펫을 부드럽게 피펫팅하여 계산된 세포 부피에 세포 현탁액과 시드를 혼합한다. 플라스크를 인큐베이터로 옮기고 플라스크를 부드럽게 흔들어 용기 표면에 세포를 고르게 분포시킨다.
IPC 28일차: 세포를 동결보존한다. 배지 교체 30일, 32일. 34일차: 30일, 32일 및 34일차에, 배양물을 관찰하고 5x 및 10x 대물렌즈를 사용하여 사진을 찍고 락테이트를 측정한다. 표 15에 따라 GF를 해동한다. 필요한 GPM 부피를 결정하고 37℃ 수조에서 따뜻하게 한다. 표 15에 따라 GF를 GPM에 추가한다. 배지를 흡인하고 각 T225 플라스크에 90 ml GPM + GF 배지를 추가한다.
35일차: 35일차에 배양물을 관찰하고 5x 및 10x 대물렌즈를 사용하여 사진을 찍는다. 락테이트를 측정한다. 2 ml의 CM을 2개의 극저온 바이알(각각 1ml)로 나누고 -80℃에서 보관한다. 표 15에 따라 GF를 해동하고 필요한 GPM 부피를 따뜻하게 한다(GPM + GF 및 GF가 없는 GPM의 최종 용액의 경우). 추가 배양을 위해 세포를 시딩하지 않는 경우 GF를 해동하지 말고 GPM + GF를 준비하지 말고 GF가 없는 GPM만 필요하다. 표 15에 따라 따듯한 GPM에 GF 부피를 추가한다.
수확: 배지를 흡인한다. 각 T225 플라스크에 24 ml PBS(-)를 추가한다. 용기를 2-3회 기울이고 RT에서 1분 동안 인큐베이션한다. 흡인하고 9 ml/T225 TrypLE Select를 추가한다. 37℃ 및 5% CO2에서 7분 동안 인큐베이션한다. 용기의 한쪽을 가볍게 두드리고 플라스크를 기울여 세포를 세척하고 용기의 반대쪽 부드럽게 두드린다. GF가 없는 18 ml의 GPM을 추가한다. 배지를 세포에 직접 추가한다. 세포를 원뿔형 튜브에 수집한다. GF가 없는 18 ml/T225 GPM을 추가하고 2-3회 부드럽게 헹군다. 세포를 수집한다. 시딩 없이 세포만 수확하는 경우 세포 계수를 진행한다. 추가 배양을 위해 세포를 시딩하는 경우 원심분리한다: 260-270 g, 10분, RT. 상층액을 흡인하고 펠릿을 세게 두드리고 수확한 T225 용기당 30 ml GPM + GF로 재현탁한다. 먼저 5 ml로 재현탁하고 2-3회 위아래로 피펫팅한 다음, 25 ml 피펫을 사용하여 나머지 부피를 추가한다. 피펫을 과도하게 사용하지 않도록 주의한다.
세포 계수: 두 개의 추가 Eppendorf 튜브를 준비하고 각 튜브에 200 μl의 세포 현탁액을 옮긴다. NC-200 세포 계수기를 사용하여 각 튜브를 계수한다.
세포 시딩 (해당되는 경우): 표 16에 따라 시딩에 필요한 배지 부피와 세포 수를 계산한다(밀도 4.0 x 104개의 살아있는 세포/cm2).
[표 20] 시딩을 위한 세포의 부피 및 #
해당되는 경우, 냉장고에서 LN521 코팅된 플라스크를 꺼낸다. 각 플라스크에 라벨을 붙인다. LN521 코팅된 플라스크의 경우: 각 T225 LN521 코팅된 플라스크에 6 ml GPM + GF를 추가한다. 플라스크를 RT에서 1분 동안 인큐베이션한다. 타이머를 사용한다. 플라스크에서 코팅 용액과 GPM + GF 배지를 흡인한다. 계산된 GPM + GF를 플라스크에 추가한다. 해당되는 경우, 배지 + E8 풀을 준비한다. 피펫을 부드럽게 피펫팅하여 계산된 세포 부피에 세포 현탁액과 시드를 혼합한다. 플라스크를 인큐베이터로 옮기고 플라스크를 부드럽게 흔들어 플라스크 표면에 세포를 고르게 분포시킨다. IPC 35일차: 세포를 동결보존한다.
배지 교체 37일, 39일, 41일차: 37일, 39일 및 41일차에 배양물을 관찰하고 5x 및 10x 대물렌즈를 사용하여 사진을 찍고 락테이트를 측정한다. 표 15에 따라 GF를 해동한다. 필요한 GPM 부피를 결정하고 37℃ 수조에서 따뜻하게 한다. 표 15에 따라 GF를 GPM에 추가한다. 배지를 흡인하고 각 T225 플라스크에 90 ml GPM + GF 배지를 추가한다.
42일차: 42일차에 배양물을 관찰하고 5x 및 10x 대물렌즈를 사용하여 사진을 찍는다. 락테이트를 측정한다. 2 ml의 CM을 2개의 극저온 바이알(각각 1 ml)로 나누고 -80℃에서 보관한다. 필요한 GPM 부피를 따뜻하게 한다.
수확: 배지를 흡인한다. 각 T225 플라스크에 24 ml PBS(-)를 추가한다. 플라스크를 2-3회 기울이고 RT에서 1분 동안 인큐베이션한다. 흡인하고 9 ml/T225 TrypLE Select를 추가한다. 37℃ 및 5% CO2에서 7분 동안 인큐베이션한다. 플라스크의 한쪽을 가볍게 두드리고 플라스크를 기울여 세포를 세척하고 플라스크의 반대쪽을 가볍게 두드린다. GF가 없는 18 ml의 GPM을 추가한다. 참고: 배지를 세포에 직접 추가한다. 세포를 원뿔형 튜브에 수집한다. GF가 없는 18 ml/T225 GPM을 넣고 2-3회 부드럽게 헹군다. 세포 계수: 2개의 추가 Eppendorf 튜브를 준비하고 각 튜브에 200 μl의 세포 현탁액을 옮긴다. NC-200 세포 계수기를 사용하여 각 튜브를 계수한다. IPC 42일차: 세포를 동결보존한다.
실시예 5: 대규모 OPC 배치의 생산:
본 실시예의 목적은 OPC 생산을 위한 대규모 조건의 확립을 입증하는 것이다.
실험 절차: 도 13은 OPC 분화 프로토콜의 단계를 나타낸다.
hESC 배양(단계 1) - H1 hESC(PILOT-LCT-H1-002)를 LN521 코팅된 용기 상에서 ERIs #ERI-H1-01 및 #ERI-H1-02에 따라 3회 계대 동안 배양하였다. p30+6+4+2가 끝나면, OPC 분화 개시를 위해 세포를 4일 동안 시딩하였다.
OPC 분화 - 단계 1의 p30+6+4+3의 4일차에, OPC 분화는 도 13에 따라 6개의 T25 용기에서 시작되었다. (분화 프로토콜에 대한 0일차).
0-3일차 - 상기와 같이 배양한다. 2 μM 도르소모르핀, 10 μM PD0325901 및 1 μM RA가 보충된 GPM 배지를 매일 교체하였다.
4-6일차 - 실시예 5의 프로토콜에 따라 배양한다. 150 μM AA 및 1 μM RA가 보충된 GPM 배지를 매일 교체하였다.
7일차 - 세포를 TS와 함께 실시예 5의 프로토콜에 따라 수확하였다. LN521 코팅된 용기에 26,667개의 살아있는 세포/cm2로 10 ng/ml EGF, 10 ng/ml hs-FGF 및 10 μM RI가 보충된 GPM에 11개의 T225 용기를 시딩하였다.
9-13일차 - 실시예 5의 프로토콜에 따라 배양한다. 10 ng/ml EGF 및 10 ng/ml hs-FGF가 보충된 GPM 배지를 2일마다 교체하였다.
14일차 - 128 x 106개의 살아있는 세포/PBS 휠에서 10 ng/ml EGF, 10 ng/ml hs-FGF, 및 10 μM RI가 보충된 GPM에서 응집체 형성을 위해 시딩된 TS 및 12 PBS 휠(#20-EROPCRD-02 진행 중인 실행의 경우)을 사용하여 실시예 5의 프로토콜에 따라 세포를 수확하였다. 또한, 다른 모든 세포는 CS10에서 ICB로서 동결보존하였다.
14일차 해동 - ICB 해동을 위해, 동결보존된 세포를 해동하고 계수하고 #ER-ICBRD-02 연구 설계에 따라 PBS 휠에 시딩하였다. 128×106개의 살아있는 세포/PBS 휠은 실시예 5의 프로토콜에 따라 6개의 용기에 시딩하고, 105×106개의 살아있는 세포/PBS 휠은 하나의 용기에 시딩하였다.
16-20일차 - 실시예 5의 프로토콜에 따라 배양한다. 10 ng/ml EGF 및 10 ng/ml hs-FGF가 보충된 GPM 배지의 80%를 2일마다 교체하였다.
21일차 - 응집체를 21일차에 평편하게 하고 7개의 T75 LN521 코팅된 용기에 20 ng/ml EGF 및 10 ng/ml PDGF-AA가 보충된 GPM에 시딩하였다.
23-27일차 - 상기와 같이 배양한다. 20 ng/ml EGF 및 10 ng/ml PDGF-AA가 보충된 GPM 배지를 2일마다 교체하였다.
28일차 - 세포를 TS로 수확하고 36개의 T225 E8 직접 코팅된 용기에서 40,000개의 살아있는 세포/cm2로 10 ng/ml EGF 및 10 ng/ml PDGF-AA가 보충된 GPM에 시딩하였다.
29-34일차 - 상기와 같이 배양한다. 20 ng/ml EGF 및 10 ng/ml PDGF-AA가 보충된 GPM 배지를 2일마다 교체하였다.
35일차 - 세포를 TS로 수확하고 45개의 세포 팩토리 E8 직접 코팅된 용기에서 40,000개의 살아있는 세포/cm2로 10 ng/ml EGF 및 10 ng/ml PDGF-AA가 보충된 GPM에 시딩하였다. 35일차에 인큐베이터에서 CO2 수준의 편차가 보고되었다. 편차로부터 영향을 받은 용기와 다른 모든 용기 사이에 차이가 나타나지 않았기 때문에, 모폴로지 및 락테이트 수준 평가에 의해, 편차가 세포에 대한 경미한 위험을 수반하기 때문에 모든 용기에 대해 진행하기로 결정하였다.
36-41일차 - 상기와 같이 배양한다. 20 ng/ml EGF 및 10 ng/ml PDGF-AA가 보충된 GPM 배지를 2일마다 교체하였다.
42일차 - #ERI-OPC-07에 따라 TAI 제형에서 TS를 포함한 세포를 수확하고 동결보존한다.
QC 테스트 - 유세포 분석 - FACS에 의한 마커의 분석은 표 21에 따라 7일, 14일, 28일, 35일 및 42일차에 동결보존된 세포에 대해 수행하였다.
[표 21]: FACS 염색
배치 출시 허용 기준 - 42일차 세포의 배치 출시 테스트에 대해 제안된 허용 기준은 표 22에 제시되어 있다.
[표 22] 배치 출시 제안된 허용 기준.
결과: 계대 파라미터 - #20-EROPCRD-02 및 #ER-ICBRD-02에 관한 모든 계대 파라미터는 표 23 및 표 24에 제시되어 있다. 각 계대에서, 수율 및 PDL 값은 다음 식에 따라 계산되었다.
[표 23] 0-28일차 계대 파라미터
[표 24] 35-42일차 계대 파라미터
14일차까지 모든 계대 파라미터는 이전에 성공적인 실행 범위 내에 있었다(보고서 #OPC-REP-03). 반면에, 14-21일 사이에, 진행 중인 실행에서 대규모 응괴 형성이 관찰되었고, 따라서 21일차에 응집체의 수와 락테이트가 평균 6.57 mM로 감소하였다. 그 결과, 진행 중인 실행을 중단하고, 동결보존된 세포를 해동하고, 상기와 같이 시딩하였다. ICB 해동된 세포에서, 응괴 형성은 관찰되지 않았으며, 그 결과, 21일차의 락테이트는 더 높았다(평균 7.58 mM). 28-42일차의 계대 파라미터는 예상되고 허용 가능한 범위에 있었다.
마커 발현 - #20-EROPCRD-02 및 #ER-ICBRD-02의 마커 발현은 표 25에 제시되어 있다.
[표 25] 7-28일차의 마커 발현
[표 26] 35일차의 마커 발현
계대 파라미터에 설명된 바와 같이 - 35일까지의 마커 발현은 이전의 성공적인 실행과 어떠한 주요 불일치도 나타내지 않았다.
모폴로지 - 35일차부터 시작하여, 성공한 그룹과 실패한 그룹의 배양물은 모폴로지에 따라 상이하다. 도 12에서 #ER-ICBRD-02의 사진은 세포가 치밀하고 조밀한 세포로 구성되어 있으며 방추형의 '실패한' 모폴로지를 획득하지 않았음을 보여준다.
배치 출시 - 표 23에 따라 #ER-ICBRD-02 배치 출시 테스트를 요약하고 표 27에 제시되어 있다.
[표 27] #ER-ICBRD-02에 대한 배치 출시 테스트
배치 ER-ICBRD-02 세포는 배치 출시에 대해 제안된 모든 허용 기준을 충족하였다.
논의: 진행 중인 배치 #20-EROPCRD-02 실행 및 ICB 14일차 조작 실행에서 해동된 #ER-ICBRD-02 실행은 본격적인 LCTOPC1 배치 생산의 가능성을 입증하기 위해 R&D 실험실에서 생산되었으며, 해당 제품은 비교가능성 및 동물 연구 목적으로 지정되었다.
진행 중인 #20-EROPCRD-02 실행에서 여러 용기를 동시에 처리하면 모든 PBS 휠에 비정상적으로 더 많은 수의 응괴가 형성되고 이 실행이 종료된 것으로 보인다. 14-21일 사이의 PBS 휠에 응괴가 형성되면 21일의 응집체 손실과 21일차의 비지시적 락테이트 판독으로 인해 분화 과정에 해를 끼친다. 또한, 14일차 수확된 세포(LCTOPC1 ICB)의 동결보존 및 해동은, 동일한 세포의 지속적인 실행에 비해 14-21일차에 형성된 응괴의 수를 감소시킬 수 있다. 실제로, #20-EROPCRD-02 동안 생성된 ICB에서 시작된 #ER-ICBRD-02 실행에서는 PBS 휠에서 응괴가 관찰되지 않았다. 진행 중인 실행과 ICB 실행 간의 이러한 차이는 14일차 ICB의 동결보존 및 해동이 GMP 시설의 OPC1 공정에 유익하고 필요하다는 결론을 내렸다.
배치 #ER-ICBRD-02는 테스트된 검정에서 제안된 모든 IPC 및 배치 출시 기준을 통과하여 14일차에 ICB의 동결보존한 전체 규모 LCTOPC1 배치 제조가 가능함을 승인하였다. 이 배치 #ER-ICBRD-02는 LCTOPC1 GMP 공정 및 출시된 세포를 대표한다.
결론: #ER-ICBRD-02는 GMP 공정 및 LCTOPC1의 방출 세포의 대표적인 배치이며 배치 출시에 대해 제안된 모든 기준을 통과했다. 배치 출시를 위해 제안된 기준을 충족하는 전체 규모 OPC1 세포의 생산이 가능하다. 14일차에 ICB를 동결 보존하고 응집체 형성을 위해 시딩 전에 해동하는 것은 세포에 유익하고 응괴 형성을 예방한다.
실시예 6: OPC 생산을 위한 14일차 해동된 세포의 분화
본 실시예의 목적은 해동된 세포의 OPC로의 분화 조건의 확립을 입증하는 것이다.
실험 절차: 도 13은 OPC 분화 프로토콜의 단계를 나타낸다.
[표 28] 시험 조건:
HESC 배양(단계 1) - H1 hESC(PILOT-LCT-H1-002)를 LN521 코팅된 용기 상에서 3회 계대 배양하였다. p30+6+4+2가 끝나면, 세포를 OPC 분화 개시를 위해 4일 동안 시딩하였다.
OPC 분화 - 단계 1의 P30+6+4+3의 4일차에 OPC 분화가 시작되었다. 테스트된 모든 변경 사항은 표 28에 자세히 설명되어 있다.
0-3일차 - 세포는 2 μM 도르소모르핀, 10 μM PD0325901 및 1 μM RA가 보충된 GPM 배지에서 배양하고, 매일 교체하였다.
4-6일차 - 150 μM AA 및 1 μM RA가 보충된 GPM 배지에서 배양하고, 매일 교체하였다.
7일차 - 세포를 TS로 수확하고 LN521 코팅된 용기에 26,667개의 살아있는 세포/cm2로 10 ng/ml EGF, 10 ng/ml hs-FGF 및 10 μM RI가 보충된 GPM에 시딩하였다.
9-13일차 - 10 ng/ml EGF 및 10 ng/ml hs-FGF가 보충된 GPM 배지에서 배양하고, 2일마다 교체하였다.
14일차 - 세포를 TS로 수확하였다. 진행 중인 배양에서 시딩되지 않은 세포는 CS10에 동동보존하였다.
ICB 14일차 해동 - 세포를 해동하고, 재현탁하고, 계수하고, 128×106개의 살아있는 세포를 10 ng/ml EGF, 10 ng/ml hs-FGF 및 10 μM RI가 보충된 70 ml GPM 배지에 시딩하였다.
16-20일차 - 10 ng/ml EGF 및 10 ng/ml hs-FGF가 보충된 GPM 배지의 80%에서 배양하고 2일마다 교체하였다.
21일차 - LN521 코팅된 용기에서 20 ng/ml EGF 및 10 ng/ml PDGF-AA가 보충된 GPM에서 21일차에 락테이트 측정(락테이트 농도가 15.00 mM 미만인 경우 75 cm2 또는 락테이트 농도가 15.00 mM 이상인 경우 150 cm2에서 평편화)에 따라 응집체를 평편화하였다.
23-27일차 - 20 ng/ml EGF 및 10 ng/ml PDGF-AA 가 보충된 GPM 배지에서 배양하고, 2일마다 교체하였다.
28일차 - 세포를 TS로 수확하고 LN521 코팅된 용기에 40,000개의 살아있는 세포/cm2로 10 ng/ml EGF 및 10 ng/ml PDGF-AA가 보충된 GPM에 시딩하였다.
29-34일차 - 20 ng/ml EGF 및 10 ng/ml PDGF-AA가 보충된 GPM 배지에서 배양하고, 2일마다 교체하였다.
35일차 - 세포를 TS로 수확하고 LN521 코팅된 용기에 40,000개의 살아있는 세포/cm2로 10 ng/ml EGF 및 10 ng/ml PDGF-AA가 보충된 GPM에 시딩하였다.
36-41일차 - 상기와 같이 배양한다. 20 ng/ml EGF 및 10 ng/ml PDGF-AA가 보충된 GPM 배지를 2일마다 교체하였다.
42일차 - TS를 사용하여 세포를 수확하고 동결보존한다.
QC 테스트 - 유세포 분석 - FACS에 의한 마커 분석을 표 29에 따라 7일, 14일, 28일, 35일 및 42일차에 동결보존된 세포에 대해 수행하였다.
[표 29] FACS 염색
데코린 분비 - 35일과 42일차의 동결보존된 세포를 데코린 분비에 대해 테스트하였다.
허용 기준 - OPC 배치를 평가하기 위한 검정이 공정과 함께 개발됨에 따라 성공적인 배치는 다음 기준에 따라 정의되었다: 순도 마커(PDGFRα) > 95.00%, 불순물 마커(Claudin, EpCAM, CK7) < 2.00%, 데코린 분비(42일차 세포) > 25.00 ng/ml, 모폴로지 - 작고 치밀한 세포, 길쭉한 방추형 모폴로지 없음.
결과: 계대 파라미터 - 각 계대에서 다음 식에 따라 수율 및 PDL 값을 계산하였다:
[표 30] 계대 파라미터 21-35일차. 모든 ICB 14 실행은 다음과 같다.
[표 31] 계대 파라미터 42일차. 모든 ICB 14 실행은 다음과 같다.
락테이트 농도에서 주로 21일과 28일차에 RD 실행 계대 파라미터와 그 파생물인 ICB 실행 간에 몇 가지 유사점을 찾을 수 있으며; 다른 모든 파라미터는 허용 가능한 값을 나타냈다. 28일차에 실행 #10.1 그룹의 낮은 생존율은 수동 처리 조작과 관련이 있다.
마커 발현 - 각 계대에서 수율 및 PDL 값은 다음 식에 따라 계산되었다:
[표 32] 28일차의 마커 발현. 모든 ICB 14 실행은 다음과 같다.
[표 33] 35일차의 마커 발현. 모든 ICB 14 실행은 다음과 같다.
[표 34] 42일차의 마커 발현. 모든 ICB 14 실행은 다음과 같다.
실행 10.1 그룹 B 이외의 모든 ICB 그룹은 42일차에 마커 발현에 대해 제안된 허용 기준을 충족했으며, 이는 14일차의 동결보존 및 해동 절차가 세포 또는 OPC1 분화 과정에 해를 끼치지 않는다는 것을 나타낸다. 실행 10.1 그룹 B의 경우, 부착 방지 용액을 사용한 PBS 휠 처리는 공정을 개선하지 못했으며 GMP 시설의 최종 OPC1 공정에 ㅐㄷ한 자격을 갖추지 못할 것이다.
효능 검정 - 35일 및 42일차의 데코린 분비가 표 35에 제시되어 있다.
[표 35] 데코린 분비. 모든 ICB 14 실행은 다음과 같다.
모폴로지 - 35차부터 시작하여, 성공한 그룹과 실패한 그룹의 배양물은 모폴로지가 상이하다. 도 14 및 도 15에서, 진행 중인 실행의 모폴로지 사진을 ICB 해동 세포와 비교하여 제시한다. 35일 및 42일차에 세포는 치밀하고 조밀한 세포로 조직화되었으며 방추형의 '실패한' 모폴로지를 획득하지 못했다.
원래 실행과 그 파생된 ICB 간의 선명한 21일차 응집체 모폴로지 유사성은 도 14에 제시되어 있다.
논의: OPC1 분화 과정 동안 14일차에 ICB의 동결보존은 실행 실패를 초래한 PBS 휠의 응괴 형성 감소, 동일한 ICB로부터 다중 배치의 생산과 같은 큰 잠재적 이점을 가지며 9주 길이의 공정의 유연성을 허용한다. 결과는 진행 중인 전체 실행과 14일차 ICB 파생 실행 둘 모두에서 생산된 OPC1 세포가 OPC 집단에 대한 예상 기준을 획득했음을 보여주었다.
이 보고서에서는 14일차에 해동된 세포의 분화 결과를 기원 진행 중인 그룹과 비교하여 요약되어 있다. 계대 파라미터, 마커 발현 및 효능 분석(데코린 분비)은 실행 10.1 그룹 B 외에 14일차에 해동된 모든 세포가 OPC1 세포에 대해 제안된 허용 기준을 충족시키는 것으로 나타났다. 실행 10.1 그룹 B의 경우, PBS 휠을 부착 방지 용액으로 전처리한 후 14일차에 세포를 시딩하였다. 이러한 처리는 GPM을 사용한 사전 로딩과 비교하여 공정에 대한 명확한 이점을 나타내지 않았기 때문에 공정에서 이 재료를 사용하지 않기로 결정하였다. 또한, 본원에 기재된 ICB 동결보존 절차를 시행한 경우, 회수율%가 75%에서 92%까지 개선된 것으로 밝혀졌다(표 28 참조). 절차는 CCN OPC1 공정에서 수행될 것이다.
결론: 14일차는 OPC1 분화 프로토콜에 대한 중단점이 될 수 있다. 14일차 ICB 세포는 PBS 휠로 직접 해동되어 진행 중인 프로토콜의 확립된 공정을 계속할 수 있다. 14일차 ICB는 14-21일차 응집 단계에서 퇴적물을 감소시키는 데 분명한 이점을 보여준다. 본원에 설명된 방법에 따라 동결보존을 수행한 경우 해동 14일차에 더 나은 해동 후 회복이 얻어졌다.
참조문헌
본원에 제공된 모든 참고문헌(모든 비특허 문헌, 특허 및 특허 공보 포함)은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
Claims (38)
- 미분화 다능성 줄기 세포로부터 희소돌기아교세포 전구 세포(OPC) 집단을 얻는 방법으로서, 상기 방법은:
a) 미분화 다능성 인간 배아 줄기 세포(hESC)의 배양물을 얻는 단계;
b) hESC의 신경외배엽 세포 및 신경 전구 세포로의 분화를 유도하기에 충분한 배양 조건 하에 제1 기간 동안 미분화 다능성 hESC를 배양하는 단계; 및
c) 신경 전구 세포를 OPC로 분화시키기에 충분한 배양 조건 하에 제2 기간 동안 단계 b)로부터의 신경 전구 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 방법. - 청구항 1에 있어서, 단계 b)에서 상기 다능성 세포는 부착 조직 배양 용기, 또는 현탁 복합체, 또는 둘 모두 내 라미닌 상에서 배양되는 것인, 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 다능성 줄기 세포는 인간 배아 줄기 세포(hESC)인, 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 다능성 줄기 세포는 인간 유도 다능성 줄기 세포(hiPSC)인, 방법.
- 청구항 1에 있어서, 단계 b)의 상기 미분화 hESC는 도르소모르핀, PD0325901 및 RA의 존재 하에 배양되는 것인, 방법.
- 청구항 5에 있어서, AA 및 RA의 존재 하에 배양하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 청구항 1에 있어서, 단계 b)로부터의 상기 신경외배엽 세포는 EGF 및 hsbFGF의 존재 하에 배양되는 것인, 방법.
- 청구항 7에 있어서, EGF 및 PDGF-AA의 존재 하에 배양하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 제1 기간은 약 3일 내지 약 60일인, 방법.
- 청구항 9에 있어서, 상기 제1 기간은 약 10일 내지 약 15일인, 방법.
- 청구항 9에 있어서, 상기 제1 기간은 약 14일인, 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 제2 기간은 약 10일 내지 약 60일인, 방법.
- 청구항 12에 있어서, 상기 제2 기간은 약 20일 내지 약 40일인, 방법.
- 청구항 12에 있어서, 상기 제2 기간은 약 28일인, 방법.
- 청구항 1에 있어서, 단계 b)에서 상기 분화 hESC는 약 14일차에 동결보존되는, 방법.
- 청구항 15에 있어서, 상기 동결보존된 세포를 해동하고, 후속적으로 해동된 세포를 방법의 임의의 나머지 단계에서 배양하는, 방법.
- 청구항 15에 있어서, 제1 기간이 완료될 때 또는 완료될 무렵에 단계 b)로부터의 신경 전구 세포를 동결보존하는 단계를 포함하는, 방법.
- 청구항 16에 있어서, 상기 동결보존된 신경외배엽 세포를 해동하고 단계 c)에 따라 배양하는, 방법.
- 청구항 14에 있어서, 단계 c)의 OPC는 동결보존되는, 방법.
- 청구항 19에 있어서, 상기 동결보존된 OPC는 해동되는, 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 OPC는 신경/신경교 항원 2(NG2), 혈소판 유래 성장 인자 수용체 A(PDGFRα), 및 혈소판 유래 성장 인자 수용체 B(PDGFRβ)로부터 선택된 하나 이상의 마커를 발현하는, 방법.
- 해동 후 대상체에게 직접 투여하기 위한 희소돌기아교세포 전구 세포(OPC) 조성물을 제형화하는 방법으로서, 상기 방법은: (a) 청구항 1에 따른 OPC를 동결보존 배지에 현탁시켜 세포 현탁액을 형성하는 단계, (b) 상기 세포 현탁액을 동결보존 온도에서 보관하는 단계, 및 (c) 동결보존된 현탁액을 해동하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 동결보존 배지는 아데노신, 덱스트란-40, 락토비온산, HEPES(N-(2-하이드록시에틸) 피페라진-N'-(2-에탄설폰산)), 수산화나트륨, L-글루타티온, 염화칼륨, 중탄산칼륨, 인산칼륨, 덱스트로스, 수크로스, 만니톨, 염화칼슘, 염화마그네슘, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 디메틸 설폭사이드(DMSO), 및 물 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
- 대상체에게 투여하기 위한 약제학적 조성물로서, 상기 조성물은 청구항 1에 따른 OPC 및 동결보존 배지를 포함하는, 약제학적 조성물.
- 제24항에 있어서, 상기 동결보존 배지는 아데노신, 덱스트란-40, 락토비온산, HEPES(N-(2-하이드록시에틸) 피페라진-N'-(2-에탄설폰산)), 수산화나트륨, L-글루타티온, 염화칼륨, 중탄산칼륨, 인산칼륨, 덱스트로스, 수크로스, 만니톨, 염화칼슘, 염화마그네슘, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 디메틸 설폭사이드(DMSO), 및 물 중 하나 이상을 포함하는, 약제학적 조성물.
- 대상체의 척추 손상을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 치료학적 유효량의 청구항 22에 따른 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
- 청구항 26에 있어서, 투여는 척수 손상 부위 내로 또는 그에 인접하여 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
- 청구항 26에 있어서, 투여는 주사에 의한 것인, 방법.
- 청구항 26에 있어서, 투여는 이식(implantation)에 의한 것인, 방법.
- 청구항 26에 있어서, 투여는 이식(transplantation)에 의한 것인, 방법.
- 청구항 26에 있어서, 세포의 농도는 약 1×106개의 세포/mL 내지 약 100 x 106개의 세포/mL인, 약제학적 조성물.
- 청구항 26에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 약 100 마이크로리터 내지 약 1 밀리리터의 부피로 보관되는, 약제학적 조성물.
- 청구항 26에 있어서, 상기 세포의 농도는 100 x 106개의 세포/mL인, 약제학적 조성물.
- 청구항 26에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 250 마이크로리터의 부피로 보관되는, 약제학적 조성물.
- 청구항 26에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 300 마이크로리터의 부피로 보관되는, 약제학적 조성물.
- 청구항 26에 있어서, 상기 동결보존 배지는 동결용액인, 약제학적 조성물.
- 청구항 26에 있어서, 상기 동결용액은 CryoStor10(CS10)인, 약제학적 조성물.
- 청구항 26에 있어서, 상기 OPC는 신경/신경교 항원 2(NG2), 혈소판 유래 성장 인자 수용체 A(PDGFRα), 및 혈소판 유래 성장 인자 수용체 B(PDGFRβ)로부터 선택된 하나 이상의 마커를 발현하는, 약제학적 조성물.
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