JP2024512385A - 乏突起膠細胞前駆細胞を生成する方法及びその使用 - Google Patents

Abstract

ヒト多能性幹細胞を乏突起膠細胞前駆細胞（ＯＰＣ）に分化させるための方法が提供される。このような方法によって得られた細胞及び細胞組成物、並びにこのような細胞の使用もまた提供される。ヒト多能性幹細胞をＯＰＣに効率的に分化させるための方法及びプロトコルが更に提供される。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年３月１０日に出願された米国仮特許出願第６３／１５９，３５０号の利益を主張するものであり、その全体が、あらゆる目的のために、参照により本明細書に組み込まれる。

技術分野
本開示は、ヒト胚性幹細胞などの多能性幹細胞を、最初に背側脊髄前駆体表現型を有する神経外胚葉前駆細胞に、次いで更にグリア前駆細胞に、更に乏突起膠細胞前駆細胞に分化させるための新規の方法に関する。このような方法によって得られた細胞及び細胞組成物、並びにこのような細胞の使用もまた提供される。本開示は、１つ以上のマーカーを発現する、本発明による方法によって産生された細胞に更に関する。

背景
乏突起膠細胞前駆細胞（ＯＰＣ）は、脳の脳室帯及び脊髄で生じ、発達中のＣＮＳを通して移動した後、乏突起膠細胞に成熟する、中枢神経系（ＣＮＳ）におけるグリア細胞のサブタイプである。成熟乏突起膠細胞は、神経軸索を絶縁し、髄鞘が失われたＣＮＳ病変を再有髄化する髄鞘を産生する。乏突起膠細胞はまた、神経細胞生存を促進する神経栄養因子の産生を含む他の機構を通じて神経保護に寄与する（Ｗｉｌｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，２００１ Ｇｌｉａ ３６（１）：４８－５７（非特許文献１）、Ｄａｉ ｅｔ ａｌ．，２００３ ＪＮｅｕｒｏｓｃｉ．２３（１３）：５８４６－５３（非特許文献２）、Ｄｕ ａｎｄ Ｄｒｅｙｆｕｓ，２００２ ＪＮｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ．６８（６）：６４７－５４（非特許文献３））。ほとんどの前駆細胞とは異なり、ＯＰＣは成人ＣＮＳに豊富に残っており、新しい乏突起膠細胞を生成する能力を保持している。したがって、ＯＰＣ、及びＯＰＣに由来する成熟乏突起膠細胞は、脱髄障害及び髄鞘形成障害（多発性硬化症、副腎白質ジストロフィー及び副腎骨髄神経障害など）、他の神経変性障害（アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、及びハンチントン病など）、及び急性神経損傷（脳卒中及び脊髄損傷（ＳＣＩ）など）に対する重要な治療標的である。

胚性幹細胞（ＥＳＣ）及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）などのヒト多能性幹細胞を細胞療法に使用することができるＯＰＣに分化させるためのいくつかのプロトコルが開発されている。これらの方法は、研究目的でヒト多能性幹細胞からＯＰＣを生成することに成功しているが、既存のプロトコルを臨床的商業規模の生産プロセスに変換することと関連する商品の品質、スケーラビリティ、及びコストに関しては課題が残っている。

多能性幹細胞をＯＰＣに分化させるための改善された方法に対する必要性が存在する。理想的には、そのような方法は、所望の品質特性を有する標的細胞ＯＰＣを一貫して再現可能に産生しながら、細胞療法用途のための十分な量のＯＰＣを産生するように容易に拡張可能であるべきである。

Ｗｉｌｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，２００１ Ｇｌｉａ ３６（１）：４８－５７ Ｄａｉ ｅｔ ａｌ．，２００３ ＪＮｅｕｒｏｓｃｉ．２３（１３）：５８４６－５３ Ｄｕ ａｎｄ Ｄｒｅｙｆｕｓ，２００２ ＪＮｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ．６８（６）：６４７－５４

概要
本明細書に記載の様々な実施形態において、本開示は、とりわけ、ＥＳＣ及びｉＰＳＣなどのヒト多能性幹細胞を乏突起膠細胞前駆細胞（ＯＰＣ）に分化させるための堅牢で信頼性の高いプロトコルを提供する。

本開示は、ヒト多能性幹細胞が、ＳＨＨシグナル伝達によって媒介された神経外胚葉制限前駆細胞の腹側化の不在下で、脊髄ＯＰＣに容易かつ効率的に分化することができるという発見に部分的に基づいている。

一態様において、本明細書で提供されるのは、未分化多能性幹細胞から乏突起膠細胞前駆細胞（ＯＰＣ）の集団を得るための方法であり、この方法は、ａ）未分化多能性ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）の培養物を得ることと、ｂ）神経外胚葉細胞及び神経前駆細胞へのｈＥＳＣの分化を誘導するのに十分な培養条件下で、未分化多能性ｈＥＳＣを第１の期間培養することと、ｃ）神経前駆細胞をＯＰＣに分化するのに十分な培養条件下で、ステップｂ）からの神経前駆細胞を第２の期間培養することと、を含む。

実施形態において、ステップｂ）の多能性細胞が、接着組織培養容器中、若しくは懸濁複合体中、又は両方において、ラミニン上で培養される、方法。

実施形態において、多能性幹細胞が、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）である、方法。実施形態において、多能性幹細胞は、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）である。

実施形態において、ステップｂ）の未分化ｈＥＳＣが、ドルソモルフィン、ＰＤ０３２５９０１、及びＲＡ（レチノイン酸）の存在下で培養される。実施形態において、ＡＡ（アスコルビン酸）及びＲＡ（レチノイン酸）の存在下で更に含む培養するステップ。

実施形態において、ステップｂ）からの神経外胚葉細胞は、ＥＧＦ及びｈｓｂＦＧＦ（熱安定性塩基性線維芽細胞成長因子）の存在下で培養される、方法。実施形態において、ＥＧＦ（上皮成長因子）及びＰＤＧＦ－ＡＡ（血小板由来成長因子ＡＡ）の存在下で更に含む培養するステップ。

実施形態において、ステップｂ）における第１の期間が、約３日～約６０日である、方法。実施形態において、第１の期間が、約１０日～約１５日である。実施形態において、第１の期間が、約１４日である。

実施形態において、ステップｃ）からの第２の期間が、約１０日～約６０日である、方法。実施形態において、第２の期間が、約２０日～約４０日である。実施形態において、第２の期間が、約２８日である。

実施形態において、ステップｂ）における分化ｈＥＳＣが、約１４日目に凍結保存される、方法。

実施形態において、凍結保存された細胞が、解凍され、続いて解凍された細胞が、方法の任意の残りのステップで培養される、方法。

実施形態において、第１の期間の完了時、又は第１の期間のほぼ完了時に、ステップｂ）からの神経前駆細胞を凍結保存するステップを含む、方法。

実施形態において、凍結保存された神経外胚葉細胞が、解凍され、ステップｃ）に従って培養される、方法。

実施形態において、ステップｃ）のＯＰＣが、凍結保存される、方法。

実施形態において、凍結保存されたＯＰＣが、解凍される、方法。

実施形態において、ＯＰＣが、神経／グリア抗原２（ＮＧ２）、血小板由来成長因子受容体Ａ（ＰＤＧＦＲα）、及び血小板由来成長因子受容体Ｂ（ＰＤＧＦＲβ）から選択される１つ以上のマーカーを発現する、方法。

一態様において、本明細書で提供されるのは、解凍直後に対象に投与するための乏突起膠細胞前駆細胞（ＯＰＣ）組成物を製剤化する方法であり、当該方法は、（ａ）凍結保存培地中に上記の方法によるＯＰＣを懸濁して、細胞懸濁液を形成することと、（ｂ）細胞懸濁液を凍結保存温度で保存することと、（ｃ）凍結保存された懸濁液を解凍することと、を含む。

実施形態において、凍結保存培地が、アデノシン、デキストラン－４０、ラクトビオン酸、ＨＥＰＥＳ（Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－Ｎ’－（２－エタンスルホン酸））、水酸化ナトリウム、Ｌ－グルタチオン、塩化カリウム、重炭酸カリウム、リン酸カリウム、デキストロース、スクロース、マンニトール、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、及び水のうちの１つ以上を含む、方法。

一態様において、本明細書で提供されるのは、対象への投与のための医薬組成物であり、当該組成物は、上記の方法によるＯＰＣ及び凍結保存培地を含む。

実施形態において、凍結保存培地が、アデノシン、デキストラン－４０、ラクトビオン酸、ＨＥＰＥＳ（Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－Ｎ’－（２－エタンスルホン酸））、水酸化ナトリウム、Ｌ－グルタチオン、塩化カリウム、重炭酸カリウム、リン酸カリウム、デキストロース、スクロース、マンニトール、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、及び水のうちの１つ以上を含む、医薬組成物。

一態様において、本明細書で提供されるのは、対象における脊髄損傷を治療するための方法であり、方法は、治療有効量の上記の医薬組成物を当該対象に投与することを含む。

実施形態において、対象における脊髄損傷を治療するための方法であって、投与することが、組成物を、脊髄損傷部位内に、又は脊髄損傷部位に隣接して、投与することを含む、方法。

実施形態において、対象における脊髄損傷を治療するための方法であって、投与することが、注射による、方法。

実施形態において、対象における脊髄損傷を治療するための方法であって、投与することが、埋め込みによる、方法。

実施形態において、対象における脊髄損傷を治療するための方法であって、投与することが、移植による、方法。

実施形態において、細胞の濃度が、１ｍＬ当たり約１×１０^６個の細胞～１ｍＬ当たり約１００×１０^６個の細胞である、医薬組成物。

実施形態において、医薬組成物が、約１００マイクロリットル～約１ミリリットルの体積で保存される、医薬組成物。

実施形態において、細胞の濃度が、１ｍＬ当たり１００×１０^６個の細胞である、医薬組成物。

実施形態において、医薬組成物が、２５０マイクロリットルの体積で保存される、医薬組成物。

実施形態において、医薬組成物は、３００マイクロリットルの体積で保存される、医薬組成物。

実施形態において、凍結保存培地が、凍結溶液である、医薬組成物。

実施形態において、凍結溶液は、ＣｒｙｏＳｔｏｒ１０（ＣＳ１０）である、医薬組成物。

実施形態において、ＯＰＣが、神経／グリア抗原２（ＮＧ２）、血小板由来成長因子受容体Ａ（ＰＤＧＦＲα）、及び血小板由来成長因子受容体Ｂ（ＰＤＧＦＲβ）から選択される１つ以上のマーカーを発現する、医薬組成物。

本開示のＯＰＣの解凍及び注射（ＴＡＩ）の採取及び凍結保存プロセスの概要を示すフローチャートである。 本開示の改善されたＯＰＣ製造プロセス（上部）と比較したＧｅｒｏｎ Ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ Ｒｅｃｏｒｄｓ（ＧＰＯＲプロセス）（下部）の例示である。 本開示のＯＰＣ分化プロセスを確立するために使用された、多能性幹細胞から乏突起膠細胞前駆体へのシグナル伝達配列の概要を示すフローチャートである。 本開示のＯＰＣ製造プロセスのフロー及びタイムラインを示すフローチャートである。 本開示によるＯＰＣの１００ ＴＡＩバイアルを製造するための良好な製造プロセス（ＧＭＰ）を示すフローチャートである。 １０倍の倍率（左）及び２０倍の倍率（右）での、対照培養条件、１０日目（時間＝０、７日目）にグリア前駆体培地（ＧＰＭ／Ｅ）で培養した細胞のＯＰＣ形態を示す。 １０倍の倍率（左）及び２０倍の倍率（右）での、処理後３日目に５０％ＧＰＭ／Ｅ及び５０％Ｎ２．１（ＩＢＭＸなし）で培養した細胞のＯＰＣ形態を示す。 １０倍の倍率（左）及び２０倍の倍率（右）での、対照培養条件、１２日目にＧＰＭ／Ｅで培養した細胞のＯＰＣ形態を示す。 １０倍の倍率（左）及び２０倍の倍率（右）での、処理後５日目の１００％Ｎ２．１（２日間ＩＢＭＸあり）で培養した細胞のＯＰＣ形態を示す。 ＧＰＭ／Ｅで培養した対照系（左）及び１００％Ｎ２．１で培養した細胞（右）についての１３日目（固定細胞）のＨｏｅｃｈｓｔ（青）及びＭＢＰ（緑）の共焦点免疫染色を示す。 大規模バッチＯＰＣ分化プロトコルのフローチャートである。 ３５日目から開始して４２日目の細胞の形態の写真を示す。成功した群及び失敗した群の培養物は、異なる形態により異なっている。細胞のＥＲ－ＩＣＢＲＤ－０２バッチは、組織化された、小型で高密度の細胞形態を提示し、紡錘状の「失敗した」形態を取得しなかった。 解凍した細胞ＯＰＣ分化プロトコルのフローチャートである。 進行中の実行の形態の写真を示し、ＩＣＢ解凍細胞と比較して提示し、２１日目に最初の実行とそれらの誘導されたＩＣＢとの間の凝集体形態の類似性を提示する。 ３５日目及び４２日目に、進行中の実行の形態の写真が、ＩＣＢ解凍細胞と比較して提示されることを示す。最初の実行とそれらの誘導されたＩＣＢとの間の形態的類似性が提示され、細胞は、小型で高密度な細胞として組織化されている。 図１５－１の説明を参照。 図１５－１の説明を参照。

詳細な説明
本明細書は、本開示が実装され得る全ての異なる方式、又は本開示に追加され得る全ての特徴の、詳細な列記であることを意図していない。例えば、一実施形態に関して図示された特徴は、他の実施形態に組み込まれてもよく、特定の実施形態に関して図示された特徴は、その実施形態から削除されてもよい。したがって、本開示は、本開示のいくつかの実施形態において、本明細書に記載された任意の特徴又は特徴の組み合わせを除外又は省略することができることを企図している。加えて、本明細書に示唆された様々な実施形態に対する多数の変形及び追加が、本開示の観点から当業者に明らかになることとなり、それは本開示から逸脱しない。他の例では、周知の構造、インターフェース、及びプロセスは、本発明を不必要に不明瞭にしないために詳細に示されていない。本明細書のいかなる部分も、本発明の全範囲のいかなる部分の否定をもたらすと解釈されることを意図されていない。したがって、以下の説明は、本開示のいくつかの特定の態様を例示することを意図しており、それらの全ての順列、組み合わせ、及び変形を網羅的に指定することを意図していない。

別途定義されない限り、本明細書に使用されている全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書における本開示の説明で使用されている用語は、単に特定の実施形態を記載する目的のためであり、本開示を制限することを意図していない。

本明細書で引用される全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。

文脈が別途示さない限り、本明細書に記載されている本開示の様々な特徴は、任意の組み合わせで使用することができることが具体的に意図されている。更に、本開示はまた、本開示のいくつかの実施形態において、本明細書に記載されている任意の特徴又は特徴の組み合わせを除外又は省略することができることを企図している。

本明細書に開示されている方法は、記載された方法を達成するための１つ以上のステップ又は行動を含み得る。方法のステップ及び／又は行動は、本発明の範囲から逸脱することなく互いに交換されてもよい。換言すれば、態様の適切な動作のためにステップ又は行動の特定の順序が必要でない限り、特定のステップ及び／又は行動の順序及び／又は使用は、本発明の範囲から逸脱することなく修正されてもよい。

Ｉ．定義
本開示及び添付の特許請求の範囲の説明で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明示的に別途示さない限り、複数形も含むことが意図されている。

本明細書で使用される場合、「及び／又は」は、関連する列挙された項目のうちの１つ以上との任意及び全ての可能な組み合わせ、並びに代替（「又は」）で解釈される場合、組み合わせの欠如を指し、包含する。

本明細書で使用される場合、「約（ａｂｏｕｔ）」及び「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という用語は、パーセンテージ、密度、体積などの測定可能な値を指す場合、指定された量の±１０％、±５％、±１％、±０．５％、又は更に±０．１％の変動を包含することを意味する。

本明細書で使用される場合、「ＸとＹとの間」及び「約ＸとＹとの間」などの句は、Ｘ及びＹを含むと解釈されるべきである。本明細書で使用される場合、「約ＸとＹとの間」などの句は、「約Ｘと約Ｙとの間」を意味し、「約ＸからＹ」などの句は、「約Ｘから約Ｙ」を意味する。

本明細書で使用される場合、「乏突起膠細胞前駆細胞」（ＯＰＣ）は、神経外胚葉／グリア系統のものであり、特徴的なマーカーの神経／グリア抗原２（ＮＧ２）を発現し、乏突起膠細胞に分化することができる中枢神経系に見出される細胞を指す。

「グリア系統細胞」、「グリア前駆細胞」、及び「グリア細胞」という用語は、本明細書で互換的に使用され、神経外胚葉／神経前駆細胞に由来する非神経性ＣＮＳ細胞を指す。グリア前駆細胞を更に分化させて、ＯＰＣ／乏突起膠細胞又は星状膠細胞を形成することができる。ある特定の実施形態において、本開示のグリア前駆細胞は、カルシウム電圧ゲートチャネル補助サブユニットガンマ４（ＣＡＣＮＧ４）、脂肪酸結合タンパク質７（ＦＡＢＰ７）、及びネトリン－１受容体（ＤＣＣ）から選択される１つ以上のマーカーを発現する。

「神経外胚葉」、「神経外胚葉細胞」、「神経外胚葉前駆細胞」、「神経外胚葉前駆体」、「神経前駆体」、及び「神経前駆細胞」という用語は、本明細書において互換的に使用され、神経前駆細胞経路に沿って分化することができ、ＣＮＳ神経細胞、乏突起膠細胞、星状膠細胞、及び上衣細胞を形成することができる細胞を指す。ある特定の実施形態において、本開示の神経外胚葉細胞は、対になったボックス６（ＰＡＸ６）、ＨｅｓファミリーＢＨＬＨ転写因子５（ＨＥＳＳ）、並びにジンクフィンガー及びＢＴＢドメイン含有１６（ＺＢＴＢ１６）から選択される１つ以上のマーカーを発現する。

本明細書で使用される場合、「背側」及び「腹側」という用語は、発達中の脊髄における神経管の背側－腹側軸に沿って空間的に別個のドメインに配列された前駆細胞から出現する異なる神経細胞サブタイプを指す。背側－腹側パターニングとして知られるこのプロセスは、神経前駆細胞を分画する分泌シグナルによって制御される。ＢＭＰ及びＷｎｔシグナル伝達は、背側神経管からパターニングを開始し（Ｌｅｅ ａｎｄ Ｊｅｓｓｅｌｌ，１９９９ Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２：２６１－２９４）、一方、ＳＨＨの分泌は、腹側神経細胞の運命を確立する際に重要な役割を果たす（Ｃｈｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９６ Ｎａｔｕｒｅ ３８３：４０７－４１３、Ｅｒｉｃｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６ Ｃｅｌｌ ８７：６６１－６８３、Ｂｒｉｓｃｏｅ ｅｔ ａｌ．，２００１ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ７：１２７９－１２９１）。

「背側神経外胚葉前駆細胞」、「背側神経前駆細胞」、及び「ｄＮＰＣ」という用語は、本明細書において互換的に使用され、背側脊髄表現型を有し、外因性ＳＨＨ又はＳＨＨシグナル伝達活性化因子の不在下で多能性幹細胞を神経外胚葉制限前駆細胞に分化させることによって得られた神経前駆細胞を指す。ある特定の実施形態において、ｄＮＰＣは、ペアボックス３（ＰＡＸ３）、ペアボックス７（ＰＡＸ７）、及び活性化タンパク質２（ＡＰ２）から選択される１つ以上のマーカーを発現する。

本明細書で使用される場合、「胚様体」（ＥＢ）という用語は、３つ全ての胚葉に向かって自発的な分化を経た多能性幹細胞に由来する三次元細胞凝集体を指す。ＥＢは、多能性幹細胞が、分化を阻害する培養条件から除去されたときに形成される。例えば、ヒト胚性幹細胞の場合、培養培地からの塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）及び形質転換成長因子ベータ（ＴＧＥ１３）の除去は、３つ全ての胚葉への自発的な分化及びＥＢの形成をもたらす。

本明細書で使用される場合、「ＢＭＰシグナル伝達阻害剤」という用語は、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路に沿ってシグナル伝達を下方制御することができる小分子又はタンパク質モジュレーターを指す。ある特定の実施形態において、ＢＭＰシグナル伝達阻害剤は、アクチビン受容体様キナーゼ２（ＡＬＫ２）としても知られる、アクチビンＡ受容体、Ｉ型（ＡＣＶＲ１）を直接標的とする。ある特定の実施形態において、ＢＭＰシグナル伝達阻害剤は、ドルソモルフィン、ＤＭＨ－１、Ｋ０２２８８、ＭＬ３４７、ＬＤＮ１９３１８９、及びノギン（Ｎｏｇｇｉｎ）タンパク質からなる群から選択される。

本明細書で使用される場合、「ＭＡＰＫ／ＥＲＫ阻害剤」という用語は、ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼを阻害する小分子又はタンパク質モジュレーターを指す。ある特定の実施形態において、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ阻害剤は、ＰＤ０３２５９０１、ＡＺＤ６２４４、ＧＳＫ１１２０２１２、ＰＤ１８４３５２、及びコビメチニブからなる群から選択される。

「ＳＨＨシグナル伝達活性化因子」、「ＳＨＨシグナル伝達アゴニスト」、「ＳＨＨ活性化因子」、及び「ＳＨＨアゴニスト」という用語は、本明細書において互換的に使用され、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＥ）シグナル伝達経路を活性化し得る小分子又はタンパク質モジュレーターを指す。ＳＨＥシグナル伝達活性化因子の非限定的な例には、プルモルファミン（ＰＭＡ）、スムーズンドアゴニスト（ＳＡＧ、ＣＡＳ ３６４５９０－６３－６）、及びソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）タンパク質が含まれる。

本明細書で使用される場合、「ＦＧＦ」又は「ｂＦＧＦ」という用語は、ＦＧＦ２遺伝子によってコードされる成長因子及びシグナル伝達タンパク質である、ヒト塩基性線維芽細胞成長因子、又はＦＧＦ－２を指す。これらの用語はまた、市販の「熱安定性」ＦＧＦ（ｈｓ－ＦＧＦ、ｈｓ－ｂＦＧＦ、ｈｓ－ｈｂＦＧＦ、及び／又はｈｓｂＦＧＦ）を含む、任意の配列バリアント又はそのコンジュゲートを指すために互換的に使用される。

本明細書で使用される場合、「望ましくない細胞型」という用語は、埋め込み時に異所性組織の形成を引き起こし得るか、又は本明細書に記載される嚢胞アッセイにおいて１つ以上の嚢胞の形成を引き起こす、神経外胚葉系列以外の細胞を指す。一実施形態において、「望ましくない細胞型」には、神経前駆細胞及び上皮細胞の両方によって発現されるマーカーであるＣＤ４９ｆが陽性である細胞、又は多能性細胞及び上皮細胞の両方によって発現される２つのマーカーであるＣＬＤＮ６若しくはＥｐＣＡＭが陽性である細胞などの上皮系列細胞が含まれ得る。

本明細書で使用される場合、「埋め込み」又は「移植」は、適切な送達技術を使用して（例えば、注射デバイスを使用して）標的組織に細胞集団を投与することを指す。

本明細書で使用される場合、「対象」は、動物又はヒトを指す。

本明細書で使用される場合、「それを必要とする対象」は、中枢神経系において損傷した組織を有する動物又はヒトを指す。一実施形態において、動物又はヒトは、運動機能の喪失を経験している。

「中枢神経系」及び「ＣＮＳ」という用語は、本明細書において互換的に使用され、身体の１つ以上の活動を制御する神経組織の複合体を指し、これには、脊椎動物の脳及び脊髄が含まれるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される場合、状態又は疾患に関する「治療」又は「治療すること」は、状態又は疾患が患者に現れた後に、好ましくは臨床結果を含む有益な又は所望の結果を得るためのアプローチである。疾患に関する有益な又は所望の結果には、以下のうちの１つ以上が含まれるが、これらに限定されない：疾患と関連した状態の改善、疾患の治癒、疾患の重症度の軽減、疾患の進行の遅延、疾患と関連した１つ以上の症状の緩和、疾患に罹患している人の生活の質の向上、生存期間の延長、及びそれらの任意の組み合わせ。同様に、本開示の目的のために、状態に関する有益な又は所望の結果には、以下のうちの１つ以上が含まれるが、これらに限定されない：状態の改善、状態の治癒、状態の重症度の軽減、状態の進行の遅延、状態と関連した１つ以上の症状の緩和、状態に罹患している人の生活の質の向上、生存期間の延長、及びそれらの任意の組み合わせ。

Ｉ．ＯＰＣ組成物
本開示の方法は、細胞療法に好適な乏突起膠細胞前駆細胞（ＯＰＣ）を含む組成物を得るために使用することができる。本開示に従って得られたＯＰＣは、ＯＰＣの特徴である高レベルのプロテオグリカンＮＧ２、ＰＤＧＦＲａ、及び／又はＰＤＧＦＲβ、並びにＣＤ４９ｆなどの望ましくない細胞型と関連する低レベルの非ＯＰＣマーカーを発現し、これは、神経前駆細胞及び上皮細胞の両方によって発現され得、インビトロでの嚢胞形成（Ｄｅｂｎａｔｈ Ｊ，Ｍｕｔｈｕｓｗａｍｙ ＳＫ，Ｂｒｕｇｇｅ ＪＳ．Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｏｎｃｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ＭＣＦ－１０Ａ ｍａｍｍａｒｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ａｃｉｎｉ ｇｒｏｗｎ ｉｎ ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｂａｓｅｍｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｕｌｔｕｒｅｓ．２００３ Ｍｅｔｈｏｄｓ．３：２５６－６８）、サイトケラチン７（ＣＫ７）、又は多能性細胞及び上皮細胞の両方によって発現される２つのマーカーである、ＣＬＤＮ６及びＥｐＣＡＭ（Ｌｉｎ Ｄ，Ｇｕｏ Ｙ，Ｌｉ Ｙ，Ｒｕａｎ Ｙ，Ｚｈａｎｇ Ｍ，Ｊｉｎ Ｘ，Ｙａｎｇ Ｍ，Ｌｕ Ｙ，Ｓｏｎｇ Ｐ，Ｚｈａｏ Ｓ，Ｄｏｎｇ Ｂ，Ｘｉｅ Ｙ，Ｄａｎｇ Ｑ，Ｑｕａｎ Ｃ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｃｌａｕｄｉｎ－６ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｏｎｃｏｌ Ｒｅｐ．２０１７ Ａｕｇ；３８（２）：８７５－８８５、Ｈｕａｎｇ Ｌ，Ｙａｎｇ Ｙ，Ｙａｎｇ Ｆ，Ｌｉｕ Ｓ，Ｚｈｕ Ｚ，Ｌｅｉ Ｚ，Ｇｕｏ Ｊ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ＥｐＣＡＭ ｉｎ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅｓ（Ｒｅｖｉｅｗ）．Ｉｎｔ ＪＭｏｌ Ｍｅｄ．２０１８ Ｏｃｔ；４２（４）：１７７１－１７８５）と関連する。

ある特定の実施形態において、本開示に従って生成されたＯＰＣは、ヒト多能性幹細胞のインビトロ分化子孫である。ある特定の実施形態において、本開示に従って得られたＯＰＣは、ヒト胚性幹細胞のインビトロ分化子孫である。他の実施形態において、本開示に従って得られたＯＰＣは、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞のインビトロ分化子孫である。

得られたＯＰＣ集団の１つ以上の特徴は、フローサイトメトリーを使用して様々な細胞マーカーを定量化することによって、例えば、細胞集団の何パーセンテージが特定のマーカー若しくはマーカーのセットに対して陽性であるかを決定するため、又はＯＰＣ集団に存在する望ましくない細胞型を特定するために決定され得る。

本開示に従って得られたＯＰＣ集団は、約３０％～約１００％のＯＰＣ、例えば少なくとも約３５％、例えば少なくとも約４０％、例えば少なくとも約４５％、例えば少なくとも約５０％、例えば少なくとも約５５％、例えば少なくとも約６０％、例えば少なくとも約６５％、例えば少なくとも約７０％、例えば少なくとも約７５％、例えば少なくとも約８０％、例えば少なくとも約８５％、例えば少なくとも約９０％、例えば少なくとも約９５％、例えば少なくとも約９８％、例えば少なくとも約９９％、例えば少なくとも約９９．５％、例えば少なくとも約９９．８％、又は例えば少なくとも約９９．９％のＯＰＣを含むことができる。パーセンテージは、エンドポイントを含む、列挙された範囲内の任意の値又は部分範囲であり得る。集団中のＯＰＣのパーセンテージは、例えば、ＯＰＣの陽性マーカーの存在及び／又はＯＰＣの陰性マーカーの不在によって決定され得る。ＯＰＣ陽性マーカーの例には、ＮＧ２、ＰＤＧＦＲａ、及び／又はＰＤＧＦＲβが含まれるが、これらに限定されない。例えば、ＯＰＣ及び他の細胞型のマーカー、細胞を分化する方法、分化した細胞を使用する方法、細胞型、試薬、並びに全ての他の方法、組成物、及び開示を含む、ＯＰＣマーカーの更なる例は、ＷＯ２０２０／１５４５３３に見出すことができ、これは、本明細書に開示される全てについて参照により本明細書に組み込まれる。

本開示に従って得られたＯＰＣ集団は、約３０％～約１００％のＮＧ２陽性細胞、例えば少なくとも約３５％、例えば少なくとも約４０％、例えば少なくとも約４５％、例えば少なくとも約５０％、例えば少なくとも約５５％、例えば少なくとも約６０％、例えば少なくとも約６５％、例えば少なくとも約７０％、例えば少なくとも約７５％、例えば少なくとも約８０％、例えば少なくとも約８５％、例えば少なくとも約９０％、例えば少なくとも約９５％、例えば少なくとも約９８％、例えば少なくとも約９９％、例えば少なくとも約９９．５％、例えば少なくとも約９９．８％、又は例えば少なくとも約９９．９％のＮＧ２陽性細胞を含むことができる。ある特定の実施形態において、本開示に従って得られたＯＰＣ集団は、約４５％～約７５％のＮＧ２陽性細胞、例えば約４５％～約５０％、例えば約５０％～約５５％、例えば約５５％～約６０％、例えば約６０％～約６５％、例えば約６５％～約７０％、例えば約７０％～約７５％、例えば約５０％～約７０％、例えば約５５％～約６５％、又は例えば約５８％～約６３％のＮＧ２陽性細胞を含むことができる。他の実施形態において、本開示に従って得られたＯＰＣ集団は、約６０％～約９０％のＮＧ２陽性細胞、例えば約６０％～約６５％、例えば約６５％～約７０％の陽性細胞を含むことができる。パーセンテージは、エンドポイントを含む、列挙された範囲内の任意の値又は部分範囲であり得る。

本開示に従って得られたＯＰＣ集団は、約３０％～約１００％のＰＤＧＦＲａ陽性細胞、例えば少なくとも約３５％、例えば少なくとも約４０％、例えば少なくとも約４５％、例えば少なくとも約５０％、例えば少なくとも約５５％、例えば少なくとも約６０％、例えば少なくとも約６５％、例えば少なくとも約７０％、例えば少なくとも約７５％、例えば少なくとも約８０％、例えば少なくとも約８５％、例えば少なくとも約９０％、例えば少なくとも約９５％、例えば少なくとも約９８％、例えば少なくとも約９９％、例えば少なくとも約９９．５％、例えば少なくとも約９９．８％、又は例えば少なくとも約９９．９％のＰＤＧＦＲａ陽性細胞を含むことができる。ある特定の実施形態において、本開示に従って得られたＯＰＣ集団は、約４５％～約７５％のＰＤＧＦＲａ陽性細胞、例えば約４５％～約５０％、例えば約５０％～約５５％、例えば約５５％～約６０％、例えば約６０％～約６５％、例えば約６５％～約７０％、例えば約７０％～約７５％、例えば約５０％～約７０％、例えば約５５％～約６５％、又は例えば約５８％～約６３％のＰＤＧＦＲａ陽性細胞を含むことができる。他の実施形態において、本開示に従って得られたＯＰＣ集団は、約６０％～約９０％のＰＤＧＦＲａ陽性細胞、例えば約６０％～約６５％、例えば約６５％～約７０％の陽性細胞を含むことができる。パーセンテージは、エンドポイントを含む、列挙された範囲内の任意の値又は部分範囲であり得る。

本開示に従って得られたＯＰＣ集団は、約３０％～約１００％のＰＤＧＦＲβ陽性細胞、例えば少なくとも約３５％、例えば少なくとも約４０％、例えば少なくとも約４５％、例えば少なくとも約５０％、例えば少なくとも約５５％、例えば少なくとも約６０％、例えば少なくとも約６５％、例えば少なくとも約７０％、例えば少なくとも約７５％、例えば少なくとも約８０％、例えば少なくとも約８５％、例えば少なくとも約９０％、例えば少なくとも約９５％、例えば少なくとも約９８％、例えば少なくとも約９９％、例えば少なくとも約９９．５％、例えば少なくとも約９９．８％、又は例えば少なくとも約９９．９％のＰＤＧＦＲβ陽性細胞を含むことができる。ある特定の実施形態において、本開示に従って得られたＯＰＣ集団は、約４５％～約７５％のＰＤＧＦＲβ陽性細胞、例えば約４５％～約５０％、例えば約５０％～約５５％、例えば約５５％～約６０％、例えば約６０％～約６５％、例えば約６５％～約７０％、例えば約７０％～約７５％、例えば約５０％～約７０％、例えば約５５％～約６５％、又は例えば約５８％～約６３％のＰＤＧＦＲβ陽性細胞を含むことができる。他の実施形態において、本開示に従って得られたＯＰＣ集団は、約６０％～約９０％のＰＤＧＦＲβ陽性細胞、例えば約６０％～約６５％、例えば約６５％～約７０％の陽性細胞を含むことができる。パーセンテージは、エンドポイントを含む、列挙された範囲内の任意の値又は部分範囲であり得る。

一実施形態において、本開示に従って得られたＯＰＣ集団は、本開示の実施例８に記載されるように、嚢胞アッセイにおいて１００，０００個の細胞当たり４個以下の上皮嚢胞を形成することが可能であり得る。別の実施形態において、本開示に従って得られたＯＰＣ集団は、嚢胞アッセイにおいて１００，０００個の細胞当たり３個以下の上皮嚢胞を形成することが可能であり得る。別の実施形態において、本開示に従って得られたＯＰＣ集団は、嚢胞アッセイにおいて１００，０００個の細胞当たり２個以下の上皮嚢胞を形成することが可能であり得る。更に別の実施形態において、本開示に従って得られたＯＰＣ集団は、本開示の実施例８に記載されるように、嚢胞アッセイにおいて１００，０００個の細胞当たり１個以下の上皮嚢胞を形成することが可能であり得る。

ＩＩ．医薬製剤
本開示によるＯＰＣ組成物は、薬学的に許容される担体を更に含むことができる。一実施形態において、薬学的に許容される担体は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含むことができる。一実施形態において、薬学的に許容される担体は、ジメチルスルホキシドを含まない。上述のように、組成物は、－８０℃～－１９５℃以下での凍結保存に更に適応させることができる。実施形態において、組成物は、解凍するように製剤化することができ、投与前に追加の操作を行うことなく、例えば、注射によって、対象に直接投与することができる。実施形態において、凍結保存媒体として、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）１０（ＣＳ１０）などの凍結溶液を含む組成物を製剤化することができる。一実施形態において、組成物は、凍結保存前に６０ｕｍのフィルターキットを使用して濾過することができる。

本開示によるＯＰＣ組成物は、対象の脊髄への直接注射を介して投与するために製剤化され得る。一実施形態において、本開示によるＯＰＣ組成物は、対象への脳内、脳室内、くも膜下腔内、鼻腔内、又は大槽内投与のために製剤化され得る。一実施形態において、本開示によるＯＰＣ組成物は、対象の脳内の梗塞空洞への直接的な、又は梗塞空洞に直接隣接する注射を介した投与のために製剤化され得る。一実施形態において、本開示による組成物は、埋め込みによる投与のために製剤化され得る。一実施形態において、本開示による組成物は、溶液として製剤化され得る。

本開示によるＯＰＣ組成物は、１ミリリットル当たり約１×１０^６～約２００×１０^６個の細胞、例えば、１ミリリットル当たり約１×１０^６個の細胞、例えば、１ミリリットル当たり約２×１０^６個の細胞、例えば、１ミリリットル当たり約３×１０^６個の細胞、例えば、１ミリリットル当たり約４×１０^６個の細胞、例えば、１ミリリットル当たり約５×１０^６個の細胞、例えば、１ミリリットル当たり約６×１０^６個の細胞、例えば、例えば、１ミリリットル当たり約７×１０^６個の細胞、例えば、１ミリリットル当たり約８×１０^６個の細胞、例えば、１ミリリットル当たり約９×１０^６個の細胞、例えば、１ミリリットル当たり約１０×１０^６個の細胞、例えば、１ミリリットル当たり約２０×１０^６個の細胞、例えば、１ミリリットル当たり約３０×１０^６個の細胞、例えば、１ミリリットル当たり約４０×１０^６個の細胞、例えば、１ミリリットル当たり約５０×１０^６個の細胞、例えば、１ミリリットル当たり約６０×^６個の細胞、例えば、１ミリリットル当たり約７０×１０^６個の細胞、例えば、１ミリリットル当たり約８０×１０^６個の細胞、例えば、１ミリリットル当たり約９０×１０^６個の細胞、例えば、１ミリリットル当たり約１００×１０^６個の細胞、例えば、１ミリリットル当たり約１０１×１０^６個の細胞、例えば、１ミリリットル当たり約１０２×１０^６個の細胞、例えば、１ミリリットル当たり約１０３×１０^６個の細胞、例えば、１ミリリットル当たり約１０４×１０^６個の細胞、例えば、１ミリリットル当たり約１０５×１０^６個の細胞、例えば、１ミリリットル当たり約１０６×１０^６個の細胞、例えば、１ミリリットル当たり約１０７×１０^６個の細胞、例えば、１ミリリットル当たり約１０８×１０^６個の細胞、例えば、１ミリリットル当たり約１０９×１０^６個の細胞、例えば、１ミリリットル当たり約１１０×１０^６個の細胞、例えば、１ミリリットル当たり約１２０×１０^６個の細胞、例えば、１ミリリットル当たり約１３０×１０^６個の細胞、例えば、１ミリリットル当たり約１４０×１０^６個の細胞、例えば、１ミリリットル当たり約１５０×１０^６個の細胞、例えば、１ミリリットル当たり約１６０×１０^６個の細胞、例えば、１ミリリットル当たり約１７０×１０^６個の細胞、例えば、１ミリリットル当たり約１８０×１０^６個の細胞、例えば、１ミリリットル当たり約１９０×１０^６個の細胞、例えば、１ミリリットル当たり約２００×１０^６個の細胞を含むことができる。細胞の数は、列挙された範囲内の任意の値又は部分範囲であり得る。

更に別の実施形態において、本開示によるＯＰＣ組成物は、約２５０マイクロリットル～約１ミリリットルの範囲の体積、例えば約３００マイクロリットル、例えば約４００マイクロリットル、例えば約５００マイクロリットル、例えば約６００マイクロリットル、例えば約７００マイクロリットル、例えば約８００マイクロリットル、例えば約９００マイクロリットル、又は例えば約１ミリリットルを有することができる一実施形態において、本開示による組成物は、約２５０マイクロリットル～約１ミリリットル、例えば約２５０マイクロリットル～約９００マイクロリットル、例えば約３００マイクロリットル～約８００マイクロリットル、例えば約４００マイクロリットル～約７００マイクロリットル、又は例えば約５００マイクロリットル～約６００マイクロリットルの範囲の体積を有することができる。別の実施形態において、本開示による組成物は、約１００マイクロリットル～約１ミリリットル、例えば約２００マイクロリットル～約９００マイクロリットル、例えば約３００マイクロリットル～約８００マイクロリットル、例えば約４００マイクロリットル～約７００マイクロリットル、又は例えば約５００マイクロリットル～約６００マイクロリットルの範囲の体積を有することができる。体積は、列挙された範囲内の任意の値又は部分範囲であり得る。一実施形態において、本開示によるＯＰＣ組成物は、凍結保存又はそれを必要とする対象への投与のために構成された容器内にあり得る。一実施形態において、容器は、充填済み注射器であり得る。

一実施形態において、本開示によるＯＰＣ組成物は、約５０マイクロリットル～約１００マイクロリットルの範囲の体積、例えば約５５マイクロリットル、例えば約６０マイクロリットル、例えば約６５マイクロリットル、例えば約７０マイクロリットル、例えば約７５マイクロリットル、例えば約８０マイクロリットル、例えば約８５マイクロリットル、例えば約９０マイクロリットル、例えば約９５マイクロリットル、又は例えば約１００マイクロリットルで投与され得る。一実施形態において、本開示によるＯＰＣ組成物は、約５０マイクロリットル～約１００マイクロリットル、例えば約５５マイクロリットル～約９５マイクロリットル、例えば約６０マイクロリットル～約９０マイクロリットル、例えば約６５マイクロリットル～約８５マイクロリットル、又は例えば約７０マイクロリットル～約８０マイクロリットルの範囲の体積で投与され得る。体積は、列挙された範囲内の任意の値又は部分範囲であり得る。

一実施形態において、本開示によるＯＰＣ組成物は、約５．０×１０^６個の細胞～約１０．０×１０^６個の細胞の範囲の体積、例えば約５．５×１０^６個の細胞、例えば約６．０×１０^６個の細胞、例えば約６．５×１０^６個の細胞、例えば約７．０×１０^６個の細胞、例えば約７．５×１０^６個の細胞、例えば約８．０×１０^６個の細胞、例えば約８．５×１０^６個の細胞、例えば約９．０×１０^６個の細胞、例えば約９．５×１０^６個の細胞、又は例えば約１０．０×１０^６個の細胞で投与され得る。一実施形態において、本開示によるＯＰＣ組成物は、約５．０×１０^６個の細胞～約１０．０×１０^６個の細胞、例えば約５．５×１０^６個の細胞～約９．５×１０^６個の細胞、例えば約６．０×１０^６個の細胞～約９．０×１０^６個の細胞、例えば約６．５×１０^６個の細胞～約８．５×１０^６個の細胞、又は例えば約７．０×１０^６個の細胞～約８．０×１０^６個の細胞の範囲の体積で投与され得る。細胞の数は、列挙された範囲内の任意の値又は部分範囲であり得る。

ＩＩＩ．使用方法
本開示に従って得られたＯＰＣ組成物は、治療を必要とする対象において１つ以上の神経機能を改善するために細胞療法において使用され得る。一実施形態において、本開示によるＯＰＣ細胞集団は、それを必要とする対象に注射又は埋め込まれ得る。一実施形態において、本開示による細胞集団は、脊髄損傷、脳卒中、又は多発性硬化症の治療のために、それを必要とする対象に埋め込まれ得る。

一実施形態において、本開示による細胞集団は、対象における埋め込み部位において剥離された軸索のミエリン化を誘導することが可能であり得る。一実施形態において、本開示の方法に従って生成された細胞集団は、生着及び移動についての改善された能力を示すことができる。一実施形態において、本開示の方法に従って生成された細胞集団は、対象における神経組織の損傷後修復又は再生を改善することが可能であり得る。

本開示による細胞集団は、集団の対象への埋め込み後に治療を必要とする対象において感覚機能を改善することが可能であり得る。感覚機能の改善は、ピンで刺すこと、及び軽い触覚についての右側及び左側の感覚レベルを決定することなどの、脊髄損傷の神経学的分類のための国際標準（ＩＳＮＣＳＣＩ）試験を使用して評価することができる。本開示による細胞集団は、集団の対象への埋め込み後に治療を必要とする対象において運動機能を改善することが可能であり得る。改善された運動機能は、完全な麻痺、触知可能又は目に見える収縮、活動的な動き、重力に対する全可動域、及び十分な抵抗についての右側及び左側の運動レベルを決定することなどの、ＩＳＮＣＳＣＩ試験を使用して評価することができる。

本開示による細胞集団は、１２ヶ月以内に傷害誘発性中枢神経系実質空洞形成の体積を減少させることが可能であり得る。一実施形態において、本開示による細胞集団は、対象における傷害誘発性中枢神経系実質空洞形成の体積を、６ヶ月以下、５ヶ月以下、４ヶ月以下、又は３ヶ月以下、又は２ヶ月以下、又は１ヶ月未満で減少させることが可能であり得る。

ＣＮＳ外傷の治療における使用。ある特定の実施形態において、本開示による細胞集団は、細胞集団を含む組成物を脊髄損傷部位に埋め込んだ後、脊髄損傷部位で生着することが可能であり得る。

ある特定の実施形態において、本開示による細胞集団は、脊髄損傷部位へのある用量の組成物の埋め込み後、約９０日間以上の期間、対象の脊髄損傷部位内に留まることが可能である。他の実施形態において、本開示による細胞集団は、脊髄損傷部位へのある用量の組成物の埋め込み後、約１年以上の期間、対象の脊髄損傷部位内に留まることが可能である。更なる実施形態において、本開示による細胞集団は、脊髄損傷部位へのある用量の組成物の埋め込み後、約２年以上の期間、対象の脊髄損傷部位内に留まることが可能である。更なる実施形態において、本開示による細胞集団は、脊髄損傷部位へのある用量の組成物の埋め込み後、約３年以上の期間、対象の脊髄損傷部位内に留まることが可能である。更なる実施形態において、本開示による細胞集団は、脊髄損傷部位へのある用量の組成物の埋め込み後、約４年以上の期間、対象の脊髄損傷部位内に留まることが可能である。なお更なる実施形態において、本開示による細胞集団は、脊髄損傷部位へのある用量の組成物の埋め込み後、約５年以上の期間、対象の脊髄損傷部位内に留まることが可能である。

ある特定の実施形態において、本開示による細胞組成物は、脊髄損傷を有するヒト対象に投与されたときに当該対象において上肢運動機能を改善することが可能である。ある特定の実施形態において、対象は、頸髄損傷を有する。他の実施形態において、対象は、胸髄損傷を有する。

一実施形態において、本開示は、脊髄損傷を有するヒト対象において上肢運動機能を改善する方法であって、脊髄損傷部位に生着することが可能な同種異系のヒト乏突起膠細胞の集団を含む組成物を当該対象に投与することを含む、方法を提供する。ある特定の実施形態において、組成物を投与することは、組成物を脊髄損傷部位に注射することを含む。いくつかの実施形態において、組成物は、脊髄損傷の発生地の後端約２～１０ｍｍに注射される。更なる実施形態において、組成物は、脊髄損傷の発生地の後端約５ｍｍに注射される。いくつかの実施形態において、対象は、頸髄損傷を有する。他の実施形態において、対象は、胸髄損傷を有する。

ある特定の実施形態において、本開示の方法に従って、同種異系ヒト乏突起膠細胞集団を含む組成物が投与される対象は、少なくとも１つの運動レベル（脊髄損傷の神経学的分類のための国際標準［ＩＳＮＣＳＣＩ］に基づいて定義される）に等しい上肢運動機能の改善を得る。機能の改善は、片側又は両側であり得る。他の実施形態において、本開示の方法に従って、同種異系ヒト乏突起膠細胞集団を含む組成物が投与される対象は、片側又は両側のいずれかの少なくとも２つの運動レベルに等しい上肢運動機能の改善を得る。ある特定の実施形態において、対象は、一方の側の少なくとも１つの運動レベルに等しく、他方の側の少なくとも２つの運動レベルに等しい上肢運動機能の改善を得る。ある特定の実施形態において、対象は、本開示の方法に従う同種異系ヒト乏突起膠細胞集団の投与前の対象ベースラインスコアと比較して、改善された上肢運動スコア（ＵＥＭＳ）を示す。

ある特定の実施形態において、本開示に従う細胞組成物は、脊椎実質への、若しくは硬膜、くも膜、若しくは軟膜下の損傷部位に隣接する、又はその損傷部位での末梢灌流を介する送達若しくは投与のために製剤化される。

ＩＶ．未分化多能性幹細胞の増殖及び培養
本開示による多能性幹細胞の分化は、任意の好適な多能性幹細胞を出発物質として使用して実施され得る。一実施形態において、方法は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）株上で実施され得る。別の実施形態において、方法は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を使用して実施され得る。別の実施形態において、方法は、Ｈ１、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１３、又はＨ１４細胞株に由来する細胞を使用して実施され得る。別の実施形態において、方法は、霊長類多能性幹（ｐＰＳ）細胞株上で実施され得る。更に別の実施形態において、方法は、受精せずにｈＥＳＣを産生するように刺激された胚である、単為生殖生物に由来する未分化幹細胞を使用して実施され得る。

未分化多能性幹細胞の増殖及び培養方法は、以前に記載されている。多能性幹細胞の組織及び細胞培養物に関して、読者は、当該技術分野で利用可能な多数の刊行物、例えば、Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｅｄ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ．１９８７）、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｏｕｓｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（Ｐ．Ｍ．Ｗａｓｓｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９３）、Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ（Ｍ．Ｖ．Ｗｉｌｅｓ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２２５：９００，１９９３）、Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ Ｕｓｅｓ ｏｆ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ｆｏｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ Ｈｕｍａｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｐ．Ｄ．Ｒａｔｈｊｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖ．１０：３１，１９９８、及びＲ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２０００）のうちのいずれかを参照することを望むことができる。これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

未分化多能性幹細胞は、添加されたフィーダー細胞なしで未分化状態で維持することができる（例えば、（２００４）Ｒｏｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｄｙｎａｍ．２２９：２５９を参照されたい）。フィーダーフリー培養物は、典型的には、分化することなく細胞の増殖を促進する因子を含有する栄養培地によって支持される（例えば、米国特許第６，８００，４８０号を参照されたい）。一実施形態において、そのような因子を含有する条件付き培地を使用することができる。条件付き培地は、そのような因子を分泌する細胞で培地を培養することによって得ることができる。好適な細胞としては、照射された（４，０００Ｒａｄ）初代マウス胚性線維芽細胞、テロメライズされたマウス線維芽細胞、又はｐＰＳ細胞に由来する線維芽細胞様細胞が挙げられるが、これらに限定されない（米国特許第６，６４２，０４８号）。培地は、２０％の血清置換及び４ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを補充したノックアウトＤＭＥＭなどの無血清培地中でフィーダーをプレーティングすることによって条件付けることができる。１～２日間条件付けされた培地は、更なるｂＦＧＦで補充することができ、１～２日間ｐＰＳ細胞培養物を支持するために使用することができる（例えば、ＷＯ０１／５１６１６、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：９７１を参照されたい）。

代替的に、未分化形態での細胞の増殖を促進する追加の因子（線維芽細胞成長因子又はフォルスコリンなど）で補充されている、新鮮又は非条件付き培地を使用することができる。非限定的な例としては、Ｘ－ＶＩＶＯ（商標）１０（Ｌｏｎｚａ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ．）、又はＱＢＳＦＴＭ－６０（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ．）、又はｍＴｅＳＲ１、ｍＴｅＳＲプラス、又は４０～８０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを補充し、任意選択的にＳＣＦ（１５ｎｇ／ｍＬ）、若しくはＦｌｔ３リガンド（７５ｎｇ／ｍＬ）を含有するＮｕｔｒｉＳＴｅｍ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｃｒｏｍｗｅｌｌ，ＣＴ）のような基礎培地が挙げられる（例えば、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２３（３）：３１５を参照されたい）。これらの培地製剤は、他のシステムにおける速度の２～３倍で細胞増殖を支持するという利点を有する（例えば、ＷＯ０３／０２０９２０を参照されたい）。一実施形態において、ｈＥＳ細胞などの未分化の多能性細胞を、ｂＦＧＦ及びＴＧＦβを含む培地中で培養することができる。ｂＦＧＦの非限定的な例の濃度は、約８０ｎｇ／ｍｌを含む。ＴＧＦβの非限定的な例の濃度は、約０．５ｎｇ／ｍｌを含む。更に別の実施形態において、未分化多能性幹細胞は、ｍＴｅＳｋ^ｒｍ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）などの市販の完全培地中で維持することができる。

未分化多能性細胞は、フィーダー細胞、典型的には胚組織又は胎児組織に由来する線維芽細胞の層上で培養され得る（Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５）。フィーダー細胞は、ヒト又はマウスの供給源に由来し得る。ヒトフィーダー細胞は、様々なヒト組織から単離され得るか、又はヒト胚性幹細胞の線維芽細胞への分化を介して誘導され得る（例えば、ＷＯ０１／５１６１６を参照されたい）。使用され得るヒトフィーダー細胞には、胎盤線維芽細胞（例えば、Ｇｅｎｂａｃｅｖ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｆｅｒｔｉｌ．Ｓｔｅｒｉｌ．８３（５）：１５１７を参照されたい）、卵管上皮細胞（例えば、Ｒｉｃｈａｒｄｓ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０：９３３を参照されたい）、包皮線維芽細胞（例えば、Ａｍｉｔ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．６８：２１５０を参照されたい）、及び子宮内膜細胞（例えば、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．７２（１）：４２を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されない。

様々な固体表面を、未分化多能性細胞の培養に使用することができる。これらの固体表面には、６ウェル、２４ウェル、９６ウェル、又は１４４ウェルプレートなどの標準的な市販の組織培養フラスコ又は細胞培養プレートが含まれるが、これらに限定されない。他の固体表面には、マイクロキャリア及びディスクが含まれるが、これらに限定されない。未分化多能性細胞の増殖に好適な固体表面は、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン、メリネックス、サーマノックス、又はそれらの組み合わせなどのガラス又はプラスチックを含むが、これらに限定されない、様々な物質から作製され得る。好適な表面は、例えば、１つ以上のアクリレートなどの１つ以上のポリマーを含むことができる。固体表面は、形状が三次元であり得る。三次元固体表面の非限定的な例は、例えば、米国特許公開第２００５／００３１５９８号に以前に記載されている。

未分化幹細胞はまた、増殖基質上のフィーダーフリー条件下で増殖させることができる。増殖基質は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）マトリックス（例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）ＧＦＲ）、組換えラミニン、ラミニン－５１１組換え断片Ｅ８、又はビトロネクチンであり得る。本開示のある特定の実施形態において、増殖基質は、組換えヒトラミニン－５２１（Ｂｉｏｌａｍｉｎａ、Ｓｗｅｄｅｎ、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹによって流通）である。他の実施形態において、基質は、例えば、Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ（登録商標）－ＩＩ ＳＣ基質などの合成基質である。

未分化幹細胞は、コラゲナーゼを使用するなどの様々な方法、又は手動剥離などを使用して継代又は継代培養することができる。未分化幹細胞は、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ＭＯによって流通）又は同様のトリプシナーゼを使用するなどの、単一の細胞懸濁液を生成する酵素的手段によって継代培養することができる。代替的に、未分化幹細胞は、ＰＢＳ中の０．５ｍＭのＥＤＴＡなどの非酵素的手段、又はＲｅＬｅＳＲ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）などを使用して継代培養することができる。

一実施形態において、複数の未分化幹細胞を、細胞が約３～約１０日でコンフルエンスに到達することを可能にする播種密度で播種又は継代培養する。一実施形態において、播種密度は、増殖表面の約６．０×１０^３個の細胞／ｃｍ^２～約５．０×１０^５個の細胞／ｃｍ^２の範囲、例えば、約１．０×１０^４個の細胞／ｃｍ^２、例えば、約５．０×１０^４個の細胞／ｃｍ^２、例えば、約１．０×１０^５個の細胞／ｃｍ^２、又は例えば、約３．０×１０^５個の細胞／ｃｍ^２であり得る。別の実施形態において、播種密度は、増殖表面の約６．０×１０^３個の細胞／ｃｍ^２～約１．０×１０^４個の細胞／ｃｍ^２の範囲、例えば、増殖表面の約６．０×１０^３個の細胞／ｃｍ^２～約９．０×１０^３個の細胞／ｃｍ^２、例えば、約７．０×１０^３個の細胞／ｃｍ^２～約１．０×１０^４個の細胞／ｃｍ^２、例えば、約７．０×１０^３個の細胞／ｃｍ^２～約９．０×１０^３個の細胞／ｃｍ^２、又は例えば、約７．０×１０の^３個の細胞／ｃｍ^２～約８．０×１０^３個の細胞／ｃｍ^２であり得る。更に別の実施形態において、播種密度は、増殖表面の約１．０×１０^４個の細胞／ｃｍ^２～約１．０×１０^５個の細胞／ｃｍ^２の範囲、例えば、増殖表面の約２．０×１０^４個の細胞／ｃｍ^２～約９．０×１０^４個の細胞／ｃｍ^２、例えば、約３．０×１０^４個の細胞／ｃｍ^２～約８．０×１０^４個の細胞／ｃｍ^２、例えば、約４．０×１０^４個の細胞／ｃｍ^２～約７．０×１０^４個の細胞／ｃｍ^２、又は例えば、約５．０×１０^４個の細胞／ｃｍ^２～約６．０×１０^４個の細胞／ｃｍ^２であり得る。一実施形態において、播種密度は、増殖表面の約１．０×１０^５個の細胞／ｃｍ^２～約５．０×１０^５個の細胞／ｃｍ^２の範囲、例えば、増殖表面の約１．０×１０^５個の細胞／ｃｍ^２～約４．５×１０^５個の細胞／ｃｍ^２、例えば、約１．５×１０^５個の細胞／ｃｍ^２～約４．０×１０^５個の細胞／ｃｍ^２、例えば、約２．０×１０^５個の細胞／ｃｍ^２～約３．５×１０^５個の細胞／ｃｍ^２、又は例えば、約２．５×１０の^５個の細胞／ｃｍ^２～約３．０×１０^５個の細胞／ｃｍ^２であり得る。播種密度は、列挙された範囲内の任意の値又は部分範囲であり得る。

多様な好適な細胞培養技術及び継代培養技術のうちのいずれかを使用して、本開示の方法に従って幹細胞を培養することができる。例えば、培養培地は、細胞の継代培養の約２日後に開始して、毎日完全に交換することができる。一実施形態において、培養物が約９０％のコロニーカバレッジに達すると、定量化のために単一の細胞懸濁液を達成するために、例えば、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）などの１つ以上の好適な試薬を使用して、細胞を解離し、その後の培養のために播種することができる。一実施形態において、未分化幹細胞は、次いで、細胞を好適な増殖基質（例えば、組換えヒトラミニン－５２１）上に播種する前に、細胞が、好適な期間、例えば、約３～１０日でコンフルエンスに達することを可能にする播種密度で継代培養され得る。一実施形態において、未分化幹細胞を、コラゲナーゼＩＶを使用して継代培養し、組換えラミニン上で増殖させることができる。別の実施形態において、未分化幹細胞を、コラゲナーゼＩＶを使用して継代培養し、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）上で増殖させることができる。一実施形態において、未分化幹細胞を、ＲｅＬｅＳＲ（商標）を使用して継代培養し、組換えヒトラミニン－５２１上で増殖させることができる。

未分化幹細胞を播種するために、播種密度は、増殖表面の約６．０×１０^３個の細胞／ｃｍ^２～約５．０×１０^５個の細胞／ｃｍ^２の範囲、例えば、約１．０×１０^４個の細胞／ｃｍ^２、例えば、約５．０×１０^４個の細胞／ｃｍ^２、例えば、約１．０×１０^５個の細胞／ｃｍ^２、又は例えば、約３．０×１０^５個の細胞／ｃｍ^２であり得る。別の実施形態において、播種密度は、増殖表面の約６．０×１０^３個の細胞／ｃｍ^２～約１．０×１０^４個の細胞／ｃｍ^２の範囲、例えば、増殖表面の約６．０×１０^３個の細胞／ｃｍ^２～約９．０×１０^３個の細胞／ｃｍ^２、例えば、約７．０×１０^３個の細胞／ｃｍ^２～約１．０×１０^４個の細胞／ｃｍ^２、例えば、約７．０×１０^３個の細胞／ｃｍ^２～約９．０×１０^３個の細胞／ｃｍ^２、又は例えば、約７．０×１０の^３個の細胞／ｃｍ^２～約８．０×１０^３個の細胞／ｃｍ^２であり得る。更に別の実施形態において、播種密度は、増殖表面の約１．０×１０^４個の細胞／ｃｍ^２～約１．０×１０^５個の細胞／ｃｍ^２の範囲、例えば、増殖表面の約２．０×１０^４個の細胞／ｃｍ^２～約９．０×１０^４個の細胞／ｃｍ^２、例えば、約３．０×１０^４個の細胞／ｃｍ^２～約８．０×１０^４個の細胞／ｃｍ^２、例えば、約４．０×１０^４個の細胞／ｃｍ^２～約７．０×１０^４個の細胞／ｃｍ^２、又は例えば、約５．０×１０^４個の細胞／ｃｍ^２～約６．０×１０^４個の細胞／ｃｍ^２であり得る。一実施形態において、播種密度は、増殖表面の約１．０×１０^５個の細胞／ｃｍ^２～約５．０×１０^５個の細胞／ｃｍ^２の範囲、例えば、増殖表面の約１．０×１０^５個の細胞／ｃｍ^２～約４．５×１０^５個の細胞／ｃｍ^２、例えば、約１．５×１０^５個の細胞／ｃｍ^２～約４．０×１０^５個の細胞／ｃｍ^２、例えば、約２．０×１０^５個の細胞／ｃｍ^２～約３．５×１０^５個の細胞／ｃｍ^２、又は例えば、約２．５×１０の^５個の細胞／ｃｍ^２～約３．０×１０^５個の細胞／ｃｍ^２であり得る。播種密度は、列挙された範囲内の任意の値又は部分範囲であり得る。

Ｖ．ヒト多能性幹細胞の背側神経外胚葉前駆細胞への分化、更には背側由来のグリア前駆細胞及び乏突起膠細胞前駆細胞への分化
本開示は、ＢＭＰシグナル伝達の小分子及びタンパク質モジュレーター並びにＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼの阻害剤の組み合わせを使用して、ヒト多能性幹細胞を、背側脊髄表現型を有する神経外胚葉、更にはグリア前駆細胞及び乏突起膠細胞前駆細胞に分化させるための方法を提供する。いかなる特定の理論にも拘束されることなく、本発明者らは、本開示の方法に従って得られたヒト背側神経外胚葉前駆細胞が、ＳＨＨシグナル伝達の活性化がない場合に、脊髄ＯＰＣに容易かつ効率的に分化され得ることを発見した。驚くべきことに、この初期の背側表現型は、インビボでの初期のＯＰＣ生成領域ではないにもかかわらず、分化プロセスの２１日目までにグリア前駆細胞を生じさせ、分化プロセスの２８日目までにＯＰＣを生じさせる。本開示に従って生成された２８日目のＯＰＣは、正準ＯＰＣマーカーＮＧ２及びＰＤＧＦＲａを発現し、脊髄損傷を治療するために現在臨床試験中の代替方法を使用して生成されたＯＰＣと（それらの全体的なマーカー発現プロファイルに関して）同等である。

一実施形態において、方法は、ヒト多能性幹細胞を、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達の１つ以上の阻害剤と組み合わせた、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ／細胞外シグナル調節キナーゼ（ＭＡＰＫ／ＥＲＫ）の１つ以上の阻害剤と接触させることを含む。ある特定の実施形態において、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ阻害剤は、小分子である。他の実施形態において、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ阻害剤は、ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼを脱リン酸化するホスファターゼなどのタンパク質である。ある特定の実施形態において、ＢＭＰシグナル伝達の阻害剤は、小分子である。他の実施形態において、ＢＭＰシグナル伝達の阻害剤は、タンパク質である。いくつかの実施形態において、ＢＭＰシグナル伝達の阻害剤の直接標的は、アクチビンＡ受容体Ｉ型（ＡＣＶＲ１）としても知られるＡＬＫ２である。ある特定の実施形態において、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ及びＢＭＰシグナル伝達阻害に続いて、細胞は尾側化剤であるレチノイン酸の存在下で培養され、それによって、背側脊髄表現型を有する神経外胚葉制限前駆細胞を得る。

ある特定の実施形態において、ＭＡＰＫ／ＥＲＫの阻害剤は、ＰＤ０３２５９０１、ＡＺＤ６２４４、ＧＳＫ１１２０２１２、ＰＤ１８４３５２、及びコビメチニブ、並びにそれらの誘導体からなる群から選択することができる。ある特定の実施形態において、ＢＭＰシグナル伝達の阻害剤は、ドルソモルフィン、ＤＭＨ－１、Ｋ０２２８８、ＭＬ３４７、ＬＤＮ１９３１８９、及びノギンタンパク質からなる群から選択することができる。

一実施形態において、方法は、未分化状態に留まる未分化ヒト多能性幹細胞を得ることと、第１の期間、小分子ＰＤ０３２５９０１及びドルソモルフィン及びレチノイン酸の存在下で未分化ヒト多能性幹細胞を接着的に培養することと、その後、第２の期間、レチノイン酸の存在下及びＳＨＨシグナル伝達活性化剤の不在下で細胞を接着的に培養し、それによって背側神経外胚葉細胞を得ることと、を含む。一実施形態において、第１の期間及び第２の期間は各々、約１日～約６日の範囲、例えば約１日、例えば約２日、例えば約３日、例えば約４日、例えば約５日、又は例えば約６日であり得る。

一実施形態において、方法は、約１μＭ～約１００μＭの範囲、例えば約２μＭ、例えば約３μＭ、例えば約４μＭ、例えば約５μＭ、例えば約６μＭ、例えば約７μＭ、例えば約８μＭ、例えば約９μＭ、例えば約１０μＭ、例えば約１１μＭ、例えば約１２μＭ、例えば約１３μＭ、例えば約１４μＭ、例えば約１５μＭ、例えば約２０μＭ、例えば約３０μＭ、例えば約４０μＭ、例えば約５０μＭ、又は例えば約６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ若しくは９０μＭの濃度で、ＰＤ０３２５９０１の存在下で未分化ヒト多能性幹細胞を培養することを含む。別の実施形態において、方法は、約１０μＭの濃度で、ＰＤ０３２５９０１の存在下で未分化ヒト多能性幹細胞を培養することを含む。濃度は、列挙された範囲内の任意の値又は部分範囲であり得る。

一実施形態において、方法は、約１μＭ～約１００μＭの範囲、例えば約２μＭ、例えば約３μＭ、例えば約４μＭ、例えば約５μＭ、例えば約６μＭ、例えば約７μＭ、例えば約８μＭ、例えば約９μＭ、例えば約１０μＭ、例えば約１１μＭ、例えば約１２μＭ、例えば約１３μＭ、例えば約１４μＭ、例えば約１５μＭ、例えば約２０μＭ、例えば約３０μＭ、例えば約４０μＭ、例えば約５０μＭ、又は例えば約６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ若しくは９０μＭの濃度で、ＡＺＤ６２４４の存在下で未分化ヒト多能性幹細胞を培養することを含む。別の実施形態において、方法は、約１０μＭの濃度で、ＡＺＤ６２４４の存在下で未分化ヒト多能性幹細胞を培養することを含む。濃度は、列挙された範囲内の任意の値又は部分範囲であり得る。

一実施形態において、方法は、ＰＤ０３２５９０１の約１μＭ～約１００μＭの範囲、例えば約２μＭ、例えば約３μＭ、例えば約４μＭ、例えば約５μＭ、例えば約６μＭ、例えば約７μＭ、例えば約８μＭ、例えば約９μＭ、例えば約１０μＭ、例えば約１１μＭ、例えば約１２μＭ、例えば約１３μＭ、例えば約１４μＭ、例えば約１５μＭ、例えば約２０μＭ、例えば約３０μＭ、例えば約４０μＭ、例えば約５０μＭ、又は例えば約６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ若しくは９０μＭの濃度で、ＧＳＫ１１２０２１２の存在下で未分化ヒト多能性幹細胞を培養することを含む。別の実施形態において、方法は、約１０μＭの濃度で、ＧＳＫ１１２０２１２の存在下で未分化ヒト多能性幹細胞を培養することを含む。濃度は、列挙された範囲内の任意の値又は部分範囲であり得る。

一実施形態において、方法は、約１μＭ～約１００μＭの範囲、例えば約２μＭ、例えば約３μＭ、例えば約４μＭ、例えば約５μＭ、例えば約６μＭ、例えば約７μＭ、例えば約８μＭ、例えば約９μＭ、例えば約１０μＭ、例えば約１１μＭ、例えば約１２μＭ、例えば約１３μＭ、例えば約１４μＭ、例えば約１５μＭ、例えば約２０μＭ、例えば約３０μＭ、例えば約４０μＭ、例えば約５０μＭ、又は例えば約６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ若しくは９０μＭの濃度で、ＰＤ１８４３５２の存在下で未分化ヒト多能性幹細胞を培養することを含む。別の実施形態において、方法は、約１０μＭの濃度で、ＰＤ１８４３５２の存在下で未分化ヒト多能性幹細胞を培養することを含む。濃度は、列挙された範囲内の任意の値又は部分範囲であり得る。

一実施形態において、方法は、約１μＭ～約１００μＭの範囲、例えば約２μＭ、例えば約３μＭ、例えば約４μＭ、例えば約５μＭ、例えば約６μＭ、例えば約７μＭ、例えば約８μＭ、例えば約９μＭ、例えば約１０μＭ、例えば約１１μＭ、例えば約１２μＭ、例えば約１３μＭ、例えば約１４μＭ、例えば約１５μＭ、例えば約２０μＭ、例えば約３０μＭ、例えば約４０μＭ、例えば約５０μＭ、又は例えば約６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ若しくは９０μＭの濃度で、コビメチニブの存在下で未分化ヒト多能性幹細胞を培養することを含む。別の実施形態において、方法は、約１０μＭの濃度で、コビメチニブの存在下で未分化ヒト多能性幹細胞を培養することを含む。濃度は、列挙された範囲内の任意の値又は部分範囲であり得る。

一実施形態において、方法は、約０．２μＭ～約２０μＭの範囲、例えば約０．５μＭ、例えば約０．８μＭ、例えば約１μＭ、例えば約１．５μＭ、例えば約２μＭ、例えば約２．５μＭ、例えば約３μＭ、例えば約３．５μＭ、例えば約４μＭ、例えば約４．５μＭ、例えば約５μＭ、例えば約５．５μＭ、例えば約６μＭ、例えば約６．５μＭ、例えば約７μＭ、例えば約７．５μＭ、例えば約８μＭ、例えば約８．５μＭ、例えば約９μＭ、例えば約１０μＭ、例えば約１１μＭ、例えば約１２μＭ、例えば約１３μＭ、例えば約１４μＭ、例えば約１５μＭ、例えば約１６μＭ、例えば約１７μＭ、例えば約１８μＭ、又は例えば約１９μＭの濃度で、ドルソモルフィンの存在下で未分化ヒト多能性幹細胞を培養することを含む。別の実施形態において、方法は、約０．２μＭ～約１μＭの範囲、例えば約０．２μＭ～約０．９μＭ、例えば約０．３μＭ～約０．８μＭ、例えば約０．４μＭ～約０．７μＭ、又は例えば約０．５μＭ～約０．６μＭの濃度で、ドルソモルフィンの存在下で未分化ヒト多能性幹細胞を培養することを含む。更に別の実施形態において、方法は、約１μＭ～約１０μＭの範囲、例えば約１μＭ～約９μＭ、例えば約２μＭ～約８μＭ、例えば約３μＭ～約７μＭ、又は例えば約４μＭ～約６μＭの濃度で、ドルソモルフィンの存在下で未分化ヒト多能性幹細胞を培養することを含む。一実施形態において、方法は、約１０μＭ～約２０μＭの範囲、例えば約１０μＭ～約１９μＭ、例えば約１２μＭ～約１８μＭ、例えば約１３μＭ～約１７μＭ、又は例えば約１４μＭ～約１６μＭの濃度で、ドルソモルフィンの存在下で未分化ヒト多能性幹細胞を培養することを含む。一実施形態において、方法は、約２μＭの濃度で、ドルソモルフィンの存在下で未分化ヒト多能性幹細胞を培養することを含む。濃度は、列挙された範囲内の任意の値又は部分範囲であり得る。

一実施形態において、方法は、約１ｎＭ～約２０μＭの範囲、例えば、約１０ｎＭ、約５０ｎＭ、約１００ｎＭ、約１５０ｎＭ、約２００ｎＭ、約５００ｎＭ、約１μＭ、約５μＭ、約１０μＭ、又は約１５μＭの濃度で、ＡＬＫ２阻害剤の存在下で、未分化ヒト多能性幹細胞を培養することを含む。濃度は、列挙された範囲内の任意の値又は部分範囲であり得る。

一実施形態において、方法は、約１μＭ～約１０μＭの範囲の濃度で、ＤＭＨ－１の存在下で未分化ヒト多能性幹細胞を培養することを含む。一実施形態において、方法は、約２μＭでＤＭＨ－１の存在下で未分化ヒト多能性幹細胞を培養することを含む。濃度は、列挙された範囲内の任意の値又は部分範囲であり得る。

一実施形態において、方法は、約１μＭ～約１０μＭの範囲の濃度で、Ｋ０２２８８の存在下で未分化ヒト多能性幹細胞を培養することを含む。一実施形態において、方法は、約２μＭでＫ０２２８８の存在下で未分化ヒト多能性幹細胞を培養することを含む。濃度は、列挙された範囲内の任意の値又は部分範囲であり得る。

一実施形態において、方法は、約１μＭ～約１０μＭの範囲の濃度で、ＭＬ３４７の存在下で未分化ヒト多能性幹細胞を培養することを含む。一実施形態において、方法は、約２μＭでＭＬ３４７の存在下で未分化ヒト多能性幹細胞を培養することを含む。濃度は、列挙された範囲内の任意の値又は部分範囲であり得る。

一実施形態において、方法は、約１μＭ～約１０μＭの範囲の濃度で、ＬＤＮ１９３１８９の存在下で未分化ヒト多能性幹細胞を培養することを含む。一実施形態において、方法は、約２μＭでＬＤＮ１９３１８９の存在下で未分化ヒト多能性幹細胞を培養することを含む。濃度は、列挙された範囲内の任意の値又は部分範囲であり得る。

接着細胞培養に好適な任意の組織培養容器を、本開示に従って背側神経外胚葉前駆細胞を得るために使用することができる。好適な成長基質としては、例えば、組換えラミニン、ラミニン－５１１組換え断片Ｅ８又はＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）マトリックス（例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）ＧＦＲ）、ドルソモルフィン、ＰＤ０３２５９０１、レチノイン酸（ＲＡ）、アスコルビン酸（ＡＡ）、組換えヒトＥＧＦ（ｒｈＥＧＦ）、熱安定（組換えヒト塩基ＦＧＦ（ｒｈｂＦＧＦ）、ＲＯＣＫ阻害剤、ｒｈＬＮ５２１又はＰＤＧＦ－Ａが挙げられる。

一実施形態において、本開示に従って得られた背側神経外胚葉前駆細胞は、細胞がグリア前駆細胞に成熟するまで、熱安定性ｒｈｂＦＧＦ及びＥＧＦの存在下で、懸濁培養物中で凝集体として更に採取及び培養され得る。一実施形態において、更なる培養期間は、約５～１５日間の範囲、例えば約５日間、約６日間、約７日間、約８日間、約９日間、約１０日間、約１１日間、約１２日間、約１３日間、約１４日間、又は約１５日間であり得る。一実施形態において、更なる培養期間は、約７日間である。

一実施形態において、接着培養された背側神経外胚葉前駆細胞は、酵素的手段によって採取され得る。酵素的手段としては、ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｓｅｌｅｃｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ＭＯ）又は同様のトリプシナーゼが挙げられるが、これらに限定されない。代替的に、接着培養された背側神経外胚葉前駆細胞は、非酵素的手段を使用して採取され得る。非酵素的手段としては、ＰＢＳ中の０．５ｍＭのＥＤＴＡ、又はＲｅＬｅＳＲ（商標）（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）を使用するなどが挙げられるが、これらに限定されない。

懸濁培養に好適な任意の細胞培養容器又は反応器を、本開示で企図される非接着培養ステップに使用することができる。容器壁は、典型的には、培養された細胞の接着に対して不活性又は耐性である。動的懸濁液の場合、磁気的又は機械的に駆動される撹拌バー又はパドルのような撹拌機構、振動機構（典型的には外側によって容器に取り付けられる）、又は反転機構（すなわち、細胞上の重力方向を変化させるように容器を回転させるデバイス）などの、細胞が沈降するのを防ぐための手段もまた存在する。

プロセス開発のための懸濁培養に好適な容器には、市販のスピナー、スピナーフラスコ、ロッカーバッグ、又はシェーカーフラスコの通常の範囲が含まれる。商業生産に好適なバイオリアクターの例としては、ＶｅｒｔｉｃａｌＷｈｅｅｌ（商標）バイオリアクター（ＰＢＳ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）が挙げられる。

動的懸濁液の前に凝集体を形成することもできる。例えば、細胞をＡｇｇｒｅＷｅｌｌ（商標）プレート上に配置して、均一な細胞凝集体を生成することができる。約３日後、細胞凝集体を動的懸濁液に移すことができる。

一実施形態において、本開示に従って得られたグリア前駆細胞は、細胞が乏突起膠細胞前駆細胞に成熟するまで、上皮成長因子（ＥＧＦ）の存在下で採取され、プレートダウンされ、更なる期間にわたって接着培養され得る。ある特定の実施形態において、培養培地は、血小板由来成長因子ＡＡ（ＰＤＧＦ－ＡＡ）を更に含む。一実施形態において、更なる培養期間は、約７～１４日間の範囲、例えば約７日間、約１０日間、約１２日間、又は約１４日間であり得る。一実施形態において、更なる培養期間は、約１４～２５日間の範囲、例えば約１５日間、約１６日間、約１７日間、約１９日間、約２０日間、約２１日間、約２２日間、約２３日間、約２４日間、又は約２５日間である。培養期間は、エンドポイントを含む、列挙された範囲内の任意の値又は部分範囲であり得る。

ＶＩ．望ましくない細胞型
本開示に従って得られたＯＰＣ集団は、例えば、フローサイトメトリーによって、望ましくない細胞型と関連するマーカーの定量化によって測定される、低レベルの望ましくない細胞型を含有する。非限定的な例では、本開示に従って得られた３５日目のＯＰＣは、上皮細胞関連マーカーであるサイトケラチン７（ＣＫ７）、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ４９ｆ、及びＣＬＤＮ６を発現する低レベルの細胞を含有し得る。別の非限定的な例では、本開示に従って得られた４２日目のＯＰＣは、マーカーＴＲＡ－１－６０及びＯＣＴ４と関連するｈＥＳＣ残留物なしで、上皮細胞関連マーカーであるｃｋ７、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ４９ｆ、及びＣＬＤＮ６を発現する低レベルの細胞を含有し得る。

望ましくない細胞型と関連するマーカーは、約２０％未満の望ましくない細胞型、例えば約１９％未満、例えば約１８％未満、例えば約１７％未満、例えば約１６％未満、例えば約１５％未満、例えば約１４％未満、例えば約１３％未満、例えば約１２％未満、例えば約１１％未満、例えば約１０％未満、例えば約９％未満、例えば約８％未満、例えば約７％未満、例えば約６％未満、例えば約５％未満、例えば約４％未満、例えば約３％未満、例えば約２％未満、例えば約１％未満、例えば約０．５％未満、例えば約０．１％未満、例えば約０．０５％未満、又は例えば、約０．０１％未満の望ましくない細胞型を含み得る。別の実施形態において、細胞集団は、約１５％～約２０％の望ましくない細胞型、例えば約１９％～約２０％、例えば約１８％～約２０％、例えば約１７％～約２０％、例えば約１６％～約２０％、例えば約１５％～約１９％、又は例えば約１６％～約１８％の望ましくない細胞型を含み得る。更に別の実施形態において、細胞集団は、約１０％～約１５％の望ましくない細胞型、例えば約１４％～約１５％、例えば約１３％～約１５％、例えば約１２％～約１５％、例えば約１１％～約１５％、又は例えば約１２％～約１４％の望ましくない細胞型を含み得る。一実施形態において、細胞集団は、約１％～約１０％の望ましくない細胞型、例えば約２％～約１０％、例えば約１％～約９％、例えば約２％～約８％、例えば約３％～約７％、又は約４％～約６％の望ましくない細胞型を含み得る。一実施形態において、細胞集団は、約０．１％～約１％の望ましくない細胞型、例えば約０．２％～約１％、例えば約０．１％～約０．９％、例えば約０．２％～約０．８％、例えば約０．３％～約０．７％、又は約０．４％～約０．６％の望ましくない細胞型を含み得る。一実施形態において、細胞集団は、約０．０１％～約０．１％の望ましくない細胞型、例えば約０．０２％～約０．１％、例えば約０．０１％～約０．０９％、例えば約０．０２％～約０．０８％、例えば約０．０３％～約０．０７％、又は約０．０４％～約０．０６％の望ましくない細胞型を含み得る。一実施形態において、低レベルの望ましくない細胞型は、約１５％未満の望ましくない細胞型の存在を示すことができる。

一実施形態において、望ましくない細胞型は、ｃｋ７、ＣＤ４９ｆ、ＣＬＤＮ６、又はＥｐＣＡＭから選択される１つ以上のマーカーを発現する細胞を含み得る。

ＶＩＩ．凍結保存
採取後、増殖したＯＰＣの集団を、特定の治療用量（例えば、細胞数）で製剤化し、クリニックに輸送するために凍結保存することができる。すぐに投与可能な（ＲＴＡ）ＯＰＣ療法組成物は、次いで、更に処理することなく、解凍後に直接投与され得る。凍結保存に好適な培地の例としては、９０％ヒト血清／１０％ＤＭＳＯ、培地３ １０％（ＣＳ１０）、培地２ ５％（ＣＳ５）及び培地１ ２％（ＣＳ２）、幹細胞バンカー、ＰＲＩＭＥ ＸＶ（登録商標）ＦＲＥＥＺＩＳ、ＨＹＰＯＴＨＥＲＭＡＳＯＬ（登録商標）、ＣＳＢ、トレハロースなどが挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態において、約０～約８時間凍結保存培地中に保存された、濾過後の細胞の生存パーセントは、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である。他の実施形態において、約０～約８時間凍結保存培地中に保存された、濾過後の細胞の回収パーセントは、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である。生存は、列挙された範囲内の任意の値又は部分範囲であり得る。

更なる実施形態において、約０～約８時間中和培地中で保存され、続いて約０～約８時間凍結保存培地中で保存された、濾過後の細胞の生存パーセントは、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である。他の実施形態において、約０～約８時間中和培地中で保存され、続いて約０～約８時間凍結保存培地中で保存された、濾過後の細胞の回収パーセントは、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である。生存は、列挙された範囲内の任意の値又は部分範囲であり得る。

更に他の実施形態において、凍結保存された組成物の解凍後、約０～約８時間中和培地中で保存され、続いて約０～約８時間凍結保存培地中で保存された、濾過後の細胞の生存パーセントは、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である。更に他の実施形態において、凍結保存された組成物の解凍後、約０～約８時間中和培地中で保存され、続いて約０～約８時間凍結保存培地中で保存された、濾過後の細胞の回収パーセントは、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である。生存は、列挙された範囲内の任意の値又は部分範囲であり得る。

いくつかの実施形態において、凍結保存された組成物の解凍後、約０～約８時間中和培地中で保存され、続いて約０～約８時間凍結保存培地中で保存された、濾過後のＯＰＣは、デコリンを分泌することができる。他の実施形態において、凍結保存された組成物の解凍後、約０～約８時間中和培地中で保存され、続いて約０～約８時間凍結保存培地中で保存された、濾過後のＯＰＣは、増殖することができる。

いくつかの実施形態において、室温で約０～約８時間中和培地中に保存された、濾過後のＯＰＣの生存パーセントは、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である。いくつかの実施形態において、室温で約０～約８時間凍結保存培地中に保存された、濾過後のＯＰＣの生存パーセントは、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である。更なる実施形態において、室温で約０～約８時間中和溶液中に保存され、続いて室温で約０～約８時間凍結保存培地中に保存された、濾過後の細胞の生存パーセントは、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である。なお更なる実施形態において、室温で約０～約８時間中和溶液中に保存され、続いて室温で約０～約８時間凍結保存培地中に保存された、濾過後の細胞の回収パーセントは、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１０５％、１１０％、１１５％、１２０％、１２５％、１３０％、１４０％、１５０％である。生存は、列挙された範囲内の任意の値又は部分範囲であり得る。

解凍後の投与準備（ＲＴＡ）用途に適した凍結保存培地中で製剤化されたＯＰＣは、アデノシン、デキストラン－４０、ラクトビオン酸、ＨＥＰＥＳ（Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－Ｎ’－（２－エタンスルホン酸））、水酸化ナトリウム、Ｌ－グルタチオン、塩化カリウム、重炭酸カリウム、リン酸カリウム、デキストロース、スクロース、マンニトール、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、及び水に懸濁されたＯＰＣを含み得る。この凍結保存培地の例は、商標名ＣＲＹＯＳＴＯＲ（登録商標）として市販されており、ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃによって製造されている。

ＤＭＳＯは、凍結保存プロセス中に細胞を死滅させることができる氷結晶の形成を防止するための凍結保護剤として使用され得る。いくつかの実施形態において、凍結保存可能ＯＰＣ療法組成物は、約０．１％～約２％のＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）を含む。いくつかの実施形態において、ＲＴＡ ＯＰＣ療法組成物は、約１％～約２０％のＤＭＳＯを含む。いくつかの実施形態において、ＲＴＡ ＯＰＣ療法組成物は、約１０％のＤＭＳＯを含む。いくつかの実施形態において、ＲＴＡ ＯＰＣ細胞療法組成物は、約５％のＤＭＳＯを含む。濃度は、列挙された範囲内の任意の値又は部分範囲であり得る。

いくつかの実施形態において、解凍後の投与準備（ＲＴＡ）用途に適した凍結保存培地中に製剤化されたＯＰＣ療法は、ＤＭＳＯを含有しない凍結保存培地中に懸濁されたＯＰＣを含み得る。例えば、ＲＴＡ ＯＰＣ治療細胞組成物は、Ｔｒｏｌｏｘ、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、ｃ１－、Ｈ２Ｐ０４－、ＨＥＰＥＳ、ラクトビオネート、スクロース、マンニトール、グルコース、デキストラン－４０、アデノシン、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド、（ＣＨ３）２Ｓ０）又は任意の他の二極性非プロトン性溶媒を含まないグルタチオンに懸濁したＯＰＣを含み得る。この凍結保存培地の例は、商品名ＨＹＰＯＴＨＥＲＭＯＳＯＬ（登録商標）又はＨＹＰＯＴＨＥＲＭＯＳＯＬ（登録商標）－ＦＲＳとして市販されており、ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃによっても製造されている。他の実施形態において、解凍後の投与準備用途に適した凍結保存培地中に製剤化されたＯＰＣ組成物は、トレハロースに懸濁しているＯＰＣを含み得る。

ＲＴＡ ＯＰＣ療法組成物は、任意選択で、ＯＰＣ生着、統合、生存、有効性などを支持する追加の因子を含み得る。いくつかの実施形態において、ＲＴＡ ＯＰＣ療法組成物は、本明細書に記載のＯＰＣ調製物の機能の活性化剤を含む。

いくつかの実施形態において、ＲＴＡ ＯＰＣ療法組成物は、フリーラジカルの除去、ｐＨ緩衝、膨張／浸透圧支持、及びイオン濃度バランスの維持によって、凍結及び解凍プロセス中の分子細胞ストレスを低減する成分を含む培地中に製剤化され得る。

いくつかの実施形態において、解凍後の投与準備用途に適した凍結保存培地中に製剤化されたＯＰＣ療法は、１つ以上の免疫抑制性化合物を含み得る。ある特定の実施形態において、解凍後の投与準備用途に適した凍結保存培地中に製剤化されたＯＰＣ療法は、１つ以上の免疫抑制性化合物の持続放出のために製剤化された１つ以上の免疫抑制性化合物を含み得る。本明細書に記載される製剤とともに使用するための免疫抑制化合物は、以下のクラスの免疫抑制薬に属し得る。グルココルチコイド、細胞増殖抑制剤（例えば、アルキル化剤又は代謝拮抗剤）、抗体（ポリクローナル又はモノクローナル）、イムノフィリンに作用する薬物（例えば、シクロスポリン、タクロリムス、又はシロリムス）。追加の薬物としては、インターフェロン、オピオイド、ＴＮＦ結合タンパク質、ミコフェノール酸、及び小さい生物学的作用物質が挙げられる。免疫抑制薬の例としては、間葉系幹細胞、抗リンパ球グロブリン（ＡＬＧ）ポリクローナル抗体、抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）ポリクローナル抗体、アザチオプリン、ＢＡＳ １Ｌ１ Ｘ １ＭＡＢＯ（抗Ｉ Ｌ－２Ｒａ受容体抗体）、シクロスポリン（シクロスポリンＡ）、ＤＡＣＬＩＺＵＭＡＢ（登録商標）（抗Ｉ Ｌ－２Ｒａ受容体抗体）、エベロリムス、ミコフェノール酸、ＲＩＴＵＸ１ＭＡＢＯ（抗ＣＤ２０抗体）、シロリムス、タクロリムス、Ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ、及び又はミコフェノール酸モフェチルが挙げられる。

ここで概して本発明を説明してきたが、同じことは、例示として提供される以下の実施例を参照することによってより容易に理解され、指定されない限り、本開示の限定であることは意図されないであろう。本明細書に記載される例及び実施形態は、例示的な目的のためだけのものであり、そのための様々な修正又は変更が当業者に提案され、本出願の趣旨及び範囲並びに添付の特許請求の範囲内に含まれることが理解される。本明細書で引用される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、全ての目的のために、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

実施例１：ＯＰＣ１の解凍及び注射（ＴＡＩ）の医薬品（ＤＰ）製剤の確立
この実施例の目的は、新しい乏突起膠細胞前駆細胞（ＯＰＣ１）の解凍及び注射（ＴＡＩ）の医薬品製剤化の確立を実証することである。ＴＡＩのためのＯＰＣ１医薬品（ＤＰ）は、解凍され、臨床部位に直接適用されるように開発された。以前は、ＯＰＣ１細胞の改善されたスケールアップ産生及び採取プロセスを開発するために、一連の研究が実施された。この実施例の焦点は、バイアル当たり３００μｌの細胞懸濁液の最終体積を有する１ｍｌ当たり１００×１０^６個の生細胞の臨床用量を生成するための凍結保存培地としてＣｒｙｏＳｔｏｒ １０（ＣＳ１０）を使用してＴＡＩ ＤＰ製剤、及びＯＰＣ１ ＴＡＩバイアルを解凍するための方法を確立することである。

以下の態様は、この実施例で具体的に確立されている。１つのバイアル当たり３００μｌの細胞懸濁液の最終体積での、ＣＳ１０における１ｍｌ当たり１００×１０^６個の生細胞としてのＯＰＣ１ ＴＡＩ製剤の確立、３００μｌを含有するＯＰＣ１ ＴＡＩバイアルの解凍手順の確立、ＬＮ５２１増殖細胞から得られたＯＰＣ１ ＴＡＩと、ｉＭａｔｒｉｘ５１１－Ｅ８増殖細胞との比較性の評価、最適な細胞解離酵素中和溶液の評価、及び全ての受け入れ基準を満たすＯＰＣ１ ＴＡＩを生成するための最適化されたスケールアップＯＰＣ分化プロセスの能力の裏付。

以下の略語及び定義が、この実施例で使用される。ＣＦ－Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｙ）細胞培養容器）。ＣＳ１０－ＣｒｙｏＳｔｏｒ １０（細胞凍結保存剤）。ＤＭＥＭ／Ｆ１２－細胞培養培地。ＤＰ－医薬品。ＤＳ－原薬。ＧＦ－成長因子。ＨＳＡ－ヒト血清アルブミン。ＩＣＢ－中間細胞バンク。ｉＭａｔｒｉｘ５１１－Ｅ８－断片化ラミニン－５１１コーティングマトリックス。ＬＮ５２１－ラミニン－５２１コーティングマトリックス。Ｍｉｎ．－分。ＨＳＡを伴うＮＵＴＳ（－）－ヒト血清アルブミンを含有するＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（細胞培養培地）。ＯＰＣ１ ＴＡＩ－ＯＰＣ１（登録商標）「解凍及び注射」製剤。ＲＴ－室温。Ｓｅｃ．－秒。ＴＳ－ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（細胞解離酵素）。

以下の表１及び２は、この実施例で使用される材料及び機器を列挙している。

（表１）試験材料

（表２）機器

図１は、ＯＰＣ１ ＴＡＩの採取及び凍結保存のための実験手順の概要を示す。示されるように、ＯＰＣ１細胞は、２８～３５日目又は３５～４２日目まで培養される。次に、ＴＳを使用してＯＰＣ１細胞を採取し、続いて、細胞解離酵素の中和、７０ｕｍのセルストレーナーによる濾過、並びに遠心分離及び細胞再懸濁をＣＳ１０において行う。ＯＰＣ１ ＴＡＩ製剤は、ＣＳ１０において１ｍＬ当たり１００×１０^６個の生細胞で濃縮され、０．５ｍＬバイアル中、３００ｕＬ当たり３０×１０^６個の生細胞の濃度で保存される。最後に、ＯＰＣ１ ＴＡＩ凍結保存を行い、最終的に、ＯＰＣ１ ＴＡＩバイアルを解凍する。

以下の表３は、いくつかのＴＡＩ実験についての詳細及び目的を列挙する。

（表３）試験条件

^２Ｉｓｏｌｙｔｅ Ｓ中の１％ＨＳＡのＧＰＯＲ用量調製の以前の投与に基づく１％ＨＳＡ

上記の表３では、２層ＣＦがＯＰＣ１の増殖を支持しないことが判明したため、実験ＴＡＩ番号９及びＴＡＩ番号１０は含まれていない。

ＯＰＣ１培養（段階ＩＩ）
ＯＰＣ１細胞をＣＦ（ｉＭａｔｒｉｘ５１１－Ｅ８で直接コーティングしたか、又はＬＮ５２１でプレコーティングしたかのいずれか）で７日間培養した。最終ＤＰの体積及び細胞濃度の初期認定は、ＬＮ５２１でコーティングされた容器内でｍＴｅＳＲ１（ＴＡＩ番号３及び番号４）又はｍＴｅＳＲ Ｐｌｕｓ培地（ＴＡＩ番号５－１３）を使用して培養したＨ１細胞に由来するＯＰＣ１細胞を使用して実行し、培養培地としてＧＰＭ（＋）を用いて分化した。ＴＡＩ番号１１及びＴＡＩ番号１２は後に、ＬＮ５２１でコーティングされたフラスコではなくｉＭａｔｒｉｘ５１１－Ｅ８を補充した播種培地を使用して直接コーティング法を適用したときに培養した細胞からＤＰ製剤を確立した。

ＯＰＣの採取
ＴＳを使用して、細胞を３５日目又は４２日目に採取した。３つの細胞解離酵素（ＴＳ）中和溶液を試験して（ＴＡＩ番号６及び番号１２）、ＴＡＩ細胞品質属性に対するそれらの効果を評価し、原材料のＧＭＰグレードをアップグレードした。ＯＰＣ培養のために最初に確立された溶液であるＧＰＭ＋（ＧＦを伴わない）、現状のまま、又は１％ＨＳＡを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２、及びＨＳＡを伴うＮＵＴ（－）。選択された細胞解離酵素（ＴＳ）中和溶液であるＨＳＡを伴うＮＵＴ（－）を、研究ＴＡＩ番号１３及びＤＥＶＯＰＣ＿試験番号２５に適用した。

ＯＰＣ１ ＤＳの濾過及び遠心分離
ＯＰＣ１ ＴＡＩは、単一細胞懸濁液として投与されることが意図される。単一細胞ＤＳを得るには、細胞採取から得られたＤＳを７０μｍの細胞ストレーナーを介して通過させる必要があった。濾過後、細胞懸濁液を遠心分離し（上清は廃棄した）、ＤＰの最終製剤まで直ちに継続した。

ＯＰＣ１ ＴＡＩ ＤＰ製剤
ＤＳ遠心分離後に得られた細胞ペレットを、１００×１０^６個の生細胞／ｍｌの最終ＤＰ細胞濃度を生成するためにＣＳ１０中に再懸濁した。

バイアルへのＤＰ分注
最終製剤後のＤＰを、直ちにバイアルに分注し、自動ディスペンサー及びキャッパー／デキャッパーを使用して、バイアル当たり３００μｌ当たり３０×１０^６個の生細胞を次いで凍結保存し続ける。

ＯＰＣ１ ＴＡＩバイアルの解凍
細胞分析のためのこの研究の過程中に生成されたＴＡＩバイアルを解凍する必要性は、３７℃の水浴を使用する標準的な解凍方法と比較して、バイアルを収容するためのカスタマイズされた加熱ブロックを備えたＭＤ－Ｍｉｎｉ乾燥浴を使用した乾燥浴ベースの解凍方法を評価する比較可能性試験を実施することを義務付けた。

ＱＣアッセイ
解凍したＴＡＩバイアルを、３５日目又は４２日目に、バイオマーカーの発現についてアッセイした。解凍した細胞を、デコリン分泌についてアッセイした。

受け入れ基準
純度マーカー（ＰＤＧＦＲα）＞９５．００％。不純物マーカー（Ｃｌａｕｄｉｎ ６、ＥｐＣＡＭ、ＣＫ７）＜２．００％。デコリン分泌（４２日目の細胞）≧１５ｎｇ／ｍｌ。形態：小さく小型の細胞、細長い紡錘状の形態の不在。

回収計算
回収パーセンテージは、１００×１０^６個の生細胞／ｍｌの目標最終ＤＰ濃度に基づいて計算した。

結果
ＯＰＣ１ ＴＡＩバイアルについての解凍方法を確立する。ＯＰＣ１ ＴＡＩは、解凍され、臨床部位で直接適用されるように開発されたため、凍結保存され、気相ＬＮ２で保存されるバイアルを解凍するための堅牢で、運搬可能で、簡単な方法を確立する必要があった。これは、３７℃の水浴を使用する一般的な解凍方法と比較して、バイアルを収容するためのカスタマイズされた加熱ブロックを備えたＭＤ－Ｍｉｎｉ乾燥浴を使用した乾燥浴ベースの解凍方法を評価する比較可能性試験を実施することを義務付けた。臨床バイアルの実際の体積をシミュレートするために、３００μｌのＣＳ１０を充填した０．５ｍｌの凍結バイアルを使用する予備研究は、ＭＤ－Ｍｉｎｉ乾燥浴における最適な解凍持続時間を２分、及び３７℃の水浴では１分２５秒として確立した。加えて、解凍した細胞をＧＰＭ＋中で２分間インキュベートした後、ＮＣ－２００セルカウンターを使用して回収％及び生存％についてアッセイすることを確立した（ＴＡＩ番号３／４）。その後、全てのＴＡＩバイアルを、Ｒ＆Ｄ及びＱＣ分析の両方のために、前述の方法のうちの１つで解凍した。

ＯＰＣ１ ＴＡＩ ＤＰ細胞濃度及び体積の確立
ＯＰＣ１ ＴＡＩ ＤＰを、１つのバイアル当たり合計３０×１０^６個の生細胞のために、１００×１０^６個の生細胞／ｍｌの濃度を有する３００μｌのＣＳ１０細胞懸濁液として確立した。以下の表４は、関連する研究のＴＡＩバイアルの解凍後の回収％及び生存％の値を要約する。

（表４）ＴＡＩ解凍後の回収％及び生存％の結果

注記：所望のＴＡＩ ＤＰを生成するために必要な細胞量が多いため、容器のサイズに応じて、２つのＴＡＩバイアルを得ることは必ずしも達成可能ではなかった。

ＧＰＭ（＋）で中和されたＤＳから得られた解凍されたＤＰ ＴＡＩ細胞の生存％範囲は、全ての試験で８８％～９８％であり、これらの試験での回収％範囲は９０％～１１７％であった（表６）。この比較的広い範囲の回収％は、所望の濃度の最終ＤＰ製剤を生成するためにこれらの試験の各々で使用した非常に少ない作業体積のＤＰ（通常は数百μｌ）と組み合わせて高細胞濃度で処理した場合の累積誤差に起因する。ＴＡＩ番号７は、ＬＮ５２１でコーティングされたフラスコから３５日目に採取した細胞が、生存％及び回収％に関して４２日目のＴＡＩバイアルと同じくらい良好なＴＡＩバイアルを生成することを示した。しかしながら、わずかに低いＰＤＧＦＲαマーカー発現値（表６）は、ＬＮ５２１でコーティングされた１層ＣＦから採取した細胞を用いて、これらの結果がＴＡＩ番号１３で裏付けられることを必要とした。実際に、ＴＡＩ番号１３の結果は全ての受け入れ基準を満たした。ＬＮ５２１でコーティングされたフラスコ由来の細胞から３５日目にＴＡＩ ＤＰを生成する能力を実証して、ＴＡＩ番号１１、ＴＡＩ番号１２及びＤＥＶＯＰＣ－試験番号２５が、ｉＭａｔｒｉｘ５１１－Ｅ８補充培地を使用したときにＴＡＩ ＤＰを生成する実現可能性を実証し、ＬＮ５２１でコーティングされたフラスコ由来のＤＰ細胞と同じくらい良好な回収％及び生存％の結果を示した。ＴＡＩ番号６及びＴＡＩ番号１２は、酵素中和溶液を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＴＡＩ番号６のまま又はＴＡＩ番号１２に１％ＨＳＡを補充した）、又はＨＳＡを伴うＮＵＴ（－）のいずれかに置き換える実現可能性を評価することを目的とした。

結果は、ＧＰＭ（＋）及びＨＳＡを伴うＮＵＴ（－）の両方が、非常に類似した生存％及び回収％の結果を与えたことを示す。マーカー発現分析はまた、ＨＳＡを伴うＮＵＴ（－）が、現在確立されているＧＰＭ（＋）酵素中和溶液に匹敵し、全ての関連マーカーが現在の受け入れ基準を満たすことを示した（表６）。更に、酵素中和溶液が細胞の解凍後の生存％を約８％減少させるが、回収％に大きく影響しないため、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＴＡＩ番号６及びＴＡＩ番号１２のＢ群で、そのまま又は１％ＨＳＡを補充した）を使用することは明らかである。ＴＳ中和溶液としてＨＳＡを伴うＮＵＴ（－）も適用されたＤＥＶＯＰＣ－試験番号２５は、このデータを更に裏付けた。

以下の表５及び６は、マーカー発現及びデコリン分泌分析結果を示す。

（表５）マーカー発現分析結果

注記：試験ＴＡＩ番号１２及びＴＡＩ番号１３におけるＧＦＡＰ、ＣＫ７及びベータチューブリンＩＩＩマーカー発現値は、本明細書以下に詳述するように、比較的少数のＦＡＣＳ事象から導出された。
^１少ない生細胞数（＞２０００、＜５０００）；
^２少ない生細胞数（＞１０００、＜２０００）；
^３少ない生細胞数（＞４００、＜１０００）
^４Ｇ群：６０μｍフィルターキットを使用して濾過し、ＣｒｙｏＭｅｄ又はＣｏｏｌＣｅｌｌのいずれかで凍結保存した細胞。

不純物マーカーを含むマーカー発現値は、ＴＡＩ番号７でのＰＤＧＦＲα発現が９５．００％をわずかに下回ったことを除いて、全ての試験でそれらのそれぞれの受け入れ基準を満たした（表５）。これらの結果は、元のＲＤ実行と相関し、したがって、このわずかな減少は、ＯＰＣ１ ＴＡＩ凍結保存方法に起因するものではない。

ＮＧ２発現は試験間で異なるように見えたが、その発現は採取手順によって非常に影響されることが決定されているため、ＮＧ２陽性細胞の減少は必ずしもＯＰＣ同一性の潜在的な喪失を示すものではなく、特にＮＧ２発現が一晩の培養期間の後に完全に回復することが確立され、ＧＭＰバッチは、一晩の培養期間の後にＮＧ２発現についてアッセイされる。

（表６）デコリン分泌アッセイ結果

全ての試験及び条件におけるデコリン分泌は、受け入れ基準を満たしている（＞２０．００ｎｇ／ｍｌ、表８）。ＴＡＩ番号６のデコリン分泌値は、他の試験と比較して３つの条件全てにおいて比較的低く、これは、ＴＡＩ番号６と同一の試験条件を適用したＴＡＩ番号１２から更に明らかなように、試験条件の直接的な結果ではなく、細胞源に起因し得ると仮定することにつながることに留意されたい。

考察
最適化されたＯＰＣ分化プロセス段階ＩＩで生成されたＯＰＣ ＴＡＩ ＤＰの最終製剤を確立することは、ＴＡＩバイアルを解凍するための方法と同時に、この研究の焦点であった。

ＯＰＣ ＤＰを臨床試験に関与させるには、ＯＰＣ１ ＴＡＩ ＤＰを製剤化しながら、その標的生細胞濃度を１００×１０^６個の細胞／ｍｌに維持する必要があり、これにより、１００μｌの１０×１０^６個の細胞の臨床用量が可能になる。したがって、各臨床バイアルは、３００μｌのＣＳ１０細胞懸濁液中に３０×１０^６個の生細胞を含有する。

臨床研究を実施するためのＯＰＣ１ ＴＡＩバイアルを解凍するための堅牢で簡単な方法は、この研究の過程中にＯＰＣ１ ＴＡＩ細胞の更なる分析を可能にするための前提条件であった。したがって、３７℃の水浴を使用する標準的な解凍方法を、ＭＤ－Ｍｉｎｉデバイスを使用する３７℃の乾燥浴と比較した。

３００μｌのＣＳ１０を充填した０．５ｍｌのＮＵＮＣバイアルを用いて臨床ＴＡＩバイアルをシミュレートし、ＭＤ－Ｍｉｎｉ乾燥浴を使用した解凍を２分の手順として確立し、これは、３７℃の水浴での１分２５秒の解凍手順に相当することが示された（解凍時間の終了時に氷の薄片が見えるバイアルを用いて）。その後、この研究における全てのＴＡＩバイアルをＭＤ－ｍｉｎｉ乾燥浴において解凍した。加えて、ＮＣ－２００分析に必要な希釈液中の解凍細胞のインキュベーション時間は、ＧＰＭ（＋）中のＲＴで２分として確立した。

ＯＰＣ ＴＡＩ ＤＰの初期認定は、ＯＰＣ分化プロセス段階ＩＩ（試験ＴＡＩ番号３及びＴＡＩ番号４、表３）に従って、ＯＰＣ分化プロセス段階ＩにおいてｍＴｅＳＲ１を有するＬＮ５２１でコーティングされた容器及び培養培地としてＧＰＭ（＋）を使用して分化及び培養した細胞を用いて確立した。これらは、新たに最適化されたＯＰＣ分化プロセス段階ＩＩにおいて、マーカー発現及び有効性（デコリン分泌）を含む、全ての受け入れ基準を満たすＴＡＩ細胞を生成することの実現可能性を証明し、したがって、更なるプロセスのスケールアップへの道を開いた。

ＯＰＣ１ ＴＡＩ ＤＰ品質属性を維持するだけでなく、非臨床グレード及び動物由来の培地成分（Ｂ２７及びＴ３補充）を採取日に除去することを可能にする細胞解離酵素中和溶液を使用することの実現可能性を実証することが、ＴＡＩ番号６及びＴＡＩ番号１２の目的であった（表３）。３つの溶液の種類を比較すると、ＨＳＡを伴うＮＵＴ（－）を使用することは、細胞解離酵素を中和するための標準的なＧＰＭ（＋）と同じくらい良好であり、細胞品質属性は、全ての受け入れ基準（表４及び５）並びにその目的のためにＧＰＭ（＋）を使用するときに得られるものと同じくらい良好な生存％及び回収％の結果を満たすことが示された（表４）。

１４日目のＩＣＢ培養に由来し、４２日目に採取したＯＰＣ細胞から生成されたＯＰＣ１ ＴＡＩ ＤＰを製造することの実現可能性を評価することが、ＴＡＩ番号１１の目的であった。結果は、細胞品質属性が、４２日目に採取した進行中の培養物から得られた細胞のものと同等であることを示した（表４及び５）。

３５日目に採取した細胞を使用して製剤化したＴＡＩ ＤＰを評価し、それらの品質属性を、４２日目に採取した細胞を用いて製剤化したＯＰＣ１ ＴＡＩ ＤＰの品質属性と比較するための試験も実施した。ＴＡＩ番号７及びＴＡＩ番号１３の結果は、（ＴＡＩ番号７は、その起源培養物と比較してわずかに低いＰＤＧＦＲαマーカー発現を示したが）これらの細胞が全ての受け入れ基準を満たすことを示した。更に、ＴＡＩ番号１３において生成された３５日目のＴＡＩ ＤＰは、３５日目にＣｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｙ容器から得られた細胞の品質を裏付けるだけでなく、採取中に細胞解離酵素中和溶液としてＮＵＴ（－）ＨＳＡを使用することの利点も裏付けた。

最後に、この試験は、６０μｍのフィルターキットを使用した最適化されたスケールアップされた濾過手順、及びＣｒｙｏＭｅｄを使用したＯＰＣ１ ＴＡＩ ＤＰ凍結保存プロセスの両方と一緒にｉＭａｔｒｉｘ５１１－Ｅ８を使用した直接コーティング法を適用したＣＦにおける細胞増殖プロセスを包含したため、試験ＤＥＶＯＰＣ＿試験番号２５は、全体的に完全なプロセスとしてスケールアップされたＯＰＣ分化プロセス段階ＩＩの堅牢性及び再現性を実証した。ＣｒｙｏＭｅｄにおいて凍結保存された６０μｍの濾過された細胞から生成されたＯＰＣ１ ＴＡＩのマーカー発現及びデコリン分泌値の両方が受け入れ基準を満たした。

全体として、この研究で提示されたデータは、１ｍｌのＣＳ１０当たり１００×１０^６個の生細胞の細胞懸濁液としてのＯＰＣ１ ＴＡＩ ＤＰを、０．５ｍｌのＮＵＮＣバイアル当たり３００μｌの最終体積で支持し、確立する。更に、この研究は、ｉＭａｔｒｉｘ５１１－Ｅ８補充培地を使用して直接コーティングされた１層ＣＦにおいて培養し、ＴＳ及びＴＳ中和剤としてＨＳＡを伴うＮＵＴ（－）を用いて３５日目又は４２日目のいずれかに採取し、６０μｍのフィルターキットを介して濾過した後、ＣｒｙｏＭｅｄで凍結保存した細胞からＯＰＣ１ ＴＡＩ ＤＰを生成するＯＰＣのスケールアップされた製造プロセスの能力を裏付ける。この最適化されたスケールアップされた製造プロセスで得られた細胞は、ＯＰＣ１受け入れ基準を満たし、ＯＰＣ１ ＴＡＩの機能的生物学的活性を実証した。

ＯＰＣ ＴＡＩは、ＣＳ１０中の１００×１０^６個の生細胞／ｍｌの懸濁液；０．５ｍｌのバイアル中の３００μｌ当たり３０×１０^６個の生細胞を含有するＴＡＩバイアルとして確立する。ＯＰＣ ＴＡＩバイアルを３７℃のＭＤ－Ｍｉｎｉ乾燥浴中で２分間解凍することは、３７℃の水浴中で解凍するのと同じくらい良好かつ堅牢である。ｉＭａｔｒｉｘ５１１－Ｅ８補充培地を使用して直接コーティングされた１層ＣＦにおいて培養された細胞から生成されたＯＰＣ１ ＴＡＩ ＤＰは、ＬＮ５２１でプレコーティングされた容器において培養された細胞から得られたＯＰＣ１ ＴＡＩ ＤＰと同じくらい良好である。ＴＡＩ ＤＰを生成するために、ＯＰＣ分化プロセス段階ＩＩの３５日目に細胞を採取することは、前述のプロセス条件下で実行可能である。細胞解離酵素中和溶液としてのＨＳＡを伴うＮＵＴ（－）は、３５日目又は４２日目のいずれかに採取した細胞からＯＰＣ１ ＴＡＩ ＤＰを生成するためのＧＰＭ（＋）と同じくらい良好である。１４日目のＩＣＢは、進行中の細胞培養物から得られたＤＰと同等の品質属性を示すＯＰＣ１ ＴＡＩ ＤＰを生成することが示されている。６０μｍのフィルターキットを使用して最適化されたスケールアップされた製造プロセスで製造され、ＣｒｙｏＭｅｄにおいて凍結保存されたＯＰＣ１ ＴＡＩ ＤＰは、全ての受け入れ基準を満たし、機能的な生物学的活性を示す。

実施例２：亜急性脊髄損傷（ＳＣＩ）の治療のための１回投与のためのＯＰＣ１
この実施例の目的は、ＯＰＣ１（ＬＴＣＯＰＣ１とも称される）ＣＭＣプログラムの開発中に生成された科学データを提示することである。提供された情報には、改善された製造プロセスのＲ＆Ｄ実行に基づく予備的比較可能性結果、ＧＰＯＲとＬＣＴ Ｒ＆Ｄ製造材料との比較可能性、新しい提案された有効性アッセイの導入、ＧＰＯＲインビボデータに基づくＯＰＣ１安全性ステータスのレビュー、及び改善された分析方法を利用したＧＰＯＲロットの再分析に関するＬＣＴＯＰＣ１についての開発計画が含まれる。

ＧＲＮＯＰＣ１及びＡＳＴ－ＯＰＣ１と以前に称されたＬＣＴＯＰＣ１（ＯＰＣ１）は、亜急性脊髄損傷（ＳＣＩ）の治療のために１回投与することを目的としたＨ１ ｈＥＳＣ系統に由来する乏突起膠細胞前駆細胞集団である。ＯＰＣ１は、神経栄養因子を産生し、脊髄実質内を移動し、血管形成を刺激し、剥脱された軸索の再ミエリン化を誘導することが臨床前研究で示されており、これらの全ては、乏突起膠細胞前駆体の必須機能であり、軸索の生存、再成長及び機能にとって重要である。

ＬＣＴＯＰＣ１の臨床評価は、２０１０年に開始された。最初の臨床試験は、低用量の２×１０^６個のＯＰＣ１細胞を、亜急性の神経学的に完全な胸部脊髄Ｔ３－Ｔ１１損傷を有する対象の病変部位に注射した第１相安全性研究（ＮＣＴ０１２１７００８）であった。計画された８人のうち合計５人の対象が、２０１０年１０月から２０１１年１１月までの最初の第１相ＣＰ３５Ａ００７安全性研究の一部としてＯＰＣ１を投与された。この試験への登録は、２０１１年１１月に中止された。

２０１４年に、亜急性感覚運動完全（米国脊髄損傷協会障害スケールＡ（アジア障害スケールＡ））、Ｃ５からＣ７の頸髄損傷の単一神経学的レベル（ＳＮＬ）を有する対象におけるＯＰＣ１の用量漸増の第１／２ａ相試験が開始され（ＮＣＴ０２３０２１５７）、その後、上肢運動スコア（ＵＥＭＳ）≧１の場合、Ｃ４神経学的レベルの損傷（ＮＬＩ）を有する患者に研究を拡張し、脊髄損傷後１４～３０日から２１～４２日に投与ウィンドウを変更した。５つのコホートにわたる合計２５人の対象を研究に登録し、専用の外科的処置中に、注射器位置決めデバイスを使用して脊髄損傷部位内に実質内注射によって送達されたＯＰＣ１細胞の単回投与を受けた。研究への登録は２０１７年１２月に完了した。

２０１８年１１月に、無作為化、対照、単盲検第２相研究がＦＤＡに提案され、その機関は、提案された第２相臨床研究においてＯＰＣ１医薬品ロットＭ２６Ｄ１Ａを使用することに異議を唱えなかった。

簡潔に述べると、新しいマスターセルバンク（ＭＣＢ）の起源は、Ｈ１バンクロット番号ＭＣＢＨ１０１である。ＭＣＢＨ１０１は、２００９年にＨ１オリジナルセルバンク（ＯＣＢ）から直接的にＧｅｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｇｅｒｏｎ；Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）によって製造された。新しいＭＣＢは、Ｈ１バンク－ロット番号ＭＣＢＨ１０１から直接的に生じた。これは、明確に定義された原材料、新しい培養システム、及び採取手順を使用して、フィーダーフリー条件で製造され、ｈＥＳＣでカスタマイズされた凍結保存プロセスによって凍結保存された。加えて、Ｈ１ ｈＥＳＣ多能性を評価するための方法を最適化した。新しいＷＣＢは、新しいＭＣＢに由来し、ｈＥＳＣ特性を維持しながら４回の継代にわたって組織培養で増殖され、次いで凍結保存された。ＬＣＴＯＰＣ１製造のための出発材料は、ＷＣＢによって提供される。新しいマスター及びワーキングセルバンクは、事前に定義された放出基準に従って放出され、承認された研究プロトコル、一般的に広まっている業界標準（ＩＣＨ Ｑ５Ａ（Ｒ１）、Ｑ５Ｄ）、並びに現在の製造慣行（「規制」）及び随時改正されるような、実施される研究に適用可能な法律に従って、承認された試験室を使用して不定の薬剤について試験された。

ＯＰＣ１は、２００８年から２０１１年の間に製造された、Ｇｅｒｏｎによって生成されたＯＰＣ１臨床ロットを使用した第１相及び第１／２ａ相脊髄損傷臨床研究において研究された治験薬である。Ｇｅｒｏｎの製造プロセス（ＧＰＯＲ）は、最初は２０００年代初頭に開発された。当時、明確に定義された細胞療法グレードの試薬及び材料は、広く利用可能ではなかった。このように、ＧＰＯＲ製造プロセスの段階１には、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）上でのＨ１胚細胞の増殖、動物由来の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）、コラゲナーゼ、及びＨ１胚幹細胞の採取、継代、及び増殖のための培養皿表面の手動剥離が含まれた。

更に、ＧＰＯＲ製造プロセスは、自然発生的な分化に対する強い感受性を有する胚様体（０日目～２６日目、図２）の形態で、多能性Ｈ１細胞から直接始まる細胞凝集体において生じた分化プロセスに基づいていた。２７日目から、乏突起膠細胞前駆体の増殖及び成熟のために、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）でコーティングされた接着表面上で分化を完了した。したがって、ＧＰＯＲ製造プロセスは、低収率を有し、純度／不純物／非標的細胞集団マーカーによって定義される主要な品質属性は、限定的な再現性を示した。加えて、最終凍結保存製品は、投与前の解凍、洗浄、及び製剤調製時に必要であった。

本開示による改善された製造プロセスの開発は、可能であれば（図３に詳述されるように）細胞療法グレードの材料を使用して分化経路を阻害又は指示するために、成長因子及び小分子の特定の配列によって誘導された、ＯＰＣに対するＨ１のより制御された指向性分化である。更に、新しいプロセスは、Ｈ１細胞の神経外胚葉への単層指向性分化の１４日後に、自然発生的な異常分化を起こしやすい多能性細胞状態から直接２６日から、Ｇｅｒｏｎによって使用される長期間の凝集相を７日間に短縮し、凝集相における自然発生的な分化の可能性を低減する。ＧＰＯＲ対ＬＣＴＯＰＣ１の分化プロセスを図２にまとめる。改善された分化プロセスの誘導及び阻害因子のシグナル伝達配列についての生物学的根拠は、図４に記載されている。加えて、図４に詳述されるように、新しいプロセス内対照（ＩＰＣ）が追加されて、分化プロセスをより良くモニタリングし、特徴付けた。

最後に、製品を、本明細書で「解凍及び注射（ＴＡＩ）」と称される、注射準備ができたＯＰＣ１製剤として凍結保存する。ＯＰＣ１細胞（元のＧＰＯＲ及び修飾されたプロセスの両方）を製造するために使用される材料を、以下の表７にまとめる。

（表７）ＯＰＣ細胞の製造中に使用される材料（ＧＰＯＲ及びＬＣＴＯＰＣ１プロセス。

段階Ｉ－Ｈ１増殖
多能性Ｈ１細胞を解凍し、ｍＴｅＳＲプラス培地中のラミニンでコーティングされた容器上で１２～１５日間培養する。非酵素試薬ＲｅＬｅＳＲを使用して、細胞を継代及び増殖させる。増殖中に、細胞を形態学的に評価し、３回の継代の終わりに（分化プロセスの開始前に）、ｈＥＳＣ多能性をフローサイトメトリーベースの方法によって評価する。

段階ＩＩ－ＯＰＣ１へのＨ１分化
分化の０日目からプロセスの終わりまで、細胞を、Ｂ２７及びＴ３を補充したＤＭＥＭ／Ｆ－１２であるグリア前駆体培地（ＧＰＭ）中で培養する。

０～７日目－０日目に、Ｈ１培養物がラクタート濃度及び細胞形態によって定義される必要な基準に達したとき、分化プロセスは、ラミニンでコーティングされた容器上で培養された増殖多能性ｈＥＳＣについての培地を以下のように変更することによって開始される。０～３日目に、分化プロセスを神経外胚葉経路に向けるために、ＧＰＭ培地にレチノイン酸（ＲＡ）、ドルソモルフィン及びＰＤ０３２５９０１を補充する（Ｋｕｄｏｈ，Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．２００２）。ドルソモルフィンは、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達（ＳＭＡＤ経路）を阻害するので、中胚葉及びトロホブラスト分化を阻害する（Ｌｉ ａｎｄ Ｐａｒａｓｔ ２０１４）。ＰＤ０３２５９０１は、ＭＥＫ１及びＭＥＫ２における下流のｂＦＧＦシグナル伝達を阻害し、多能性及び内胚葉分化を阻害する（Ｓｕｉ，Ｂｏｕｗｅｎｓ ｅｔ ａｌ．２０１３）。要約すると、ＲＡシグナル伝達経路の活性化に加えて、多能性、内胚葉、中胚葉及びトロホブラストの形成の阻害は、神経管（神経外胚葉）の形成を促進する（Ｗａｔａｂｅ ａｎｄ Ｍｉｙａｚｏｎｏ ２００９、Ｓｕｉ，Ｂｏｕｗｅｎｓ ｅｔ ａｌ．２０１３、Ｌｉ ａｎｄ Ｐａｒａｓｔ ２０１４、Ｐａｔｔｈｅｙ ａｎｄ Ｇｕｎｈａｇａ ２０１４、Ｊａｎｅｓｉｃｋ，Ｗｕ ｅｔ ａｌ．２０１５）。４～７日目に、培養物にレチノイン酸及びアスコルビン酸を補充して、神経外胚葉分化誘導を継続する（Ｄｕｅｓｔｅｒ ２００８）。

７～１４日目－７日目に、細胞を、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを使用して酵素的に採取し、次いで７日目～１４日目までラミニンでコーティングした容器上に単層培養物として播種し、ｒｈＥＧＦ、ｈｓＦＧＦ、及びＲＯＣＫ阻害剤（ＲＯＣＫ阻害剤は最初の４８時間のみ）を補充したＧＰＭ中で培養する（Ｈｕ，Ｄｕ ｅｔ ａｌ．２００９、Ｐａｔｔｈｅｙ ａｎｄ Ｇｕｎｈａｇａ ２０１４、Ｚｈｅｎｇ，Ｌｉ ｅｔ ａｌ．２０１８）。

１４～２１日目－１４日目に、ニューロボディ（ｎｅｕｒｏｂｏｄｙ）（ＮＢ）凝集体形成を促進するために、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを使用して細胞を酵素的に採取し、ＲＯＣＫ阻害剤（最初の４８時間）、並びに全体を通じてｒｈＥＧＦ及びｈｓ－ｒｈＦＧＦを補充したＧＰＭ中で動的懸濁培養物として１週間培養する。

２１～４２日目－２１日目に、凝集体を、ｒｈＥＧＦ及びＰＤＧＦを補充したＧＰＭ中のラミニンでコーティングした容器上の接着培養物として戻してプレーティングし（Ｏｔａ ａｎｄ Ｉｔｏ ２００６、Ｋｏｃｈ，Ｌｅｈａｌ ｅｔ ａｌ．２０１３）、次いで２８日目に、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを使用して細胞を酵素的に採取し、ｒｈＥＧＦ及びＰＤＧＦを補充したＧＰＭ中のラミニンでコーティングした容器上の接着培養物として、最終的な増殖及び成熟のために３５～４２日目まで増殖させ、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを使用して約７日ごとに酵素継代を行う。

増殖プロセスの終了時に、ＯＰＣ１細胞を、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを使用して採取し、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）１０（ＣＳ１０；ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．）凍結保存溶液中で解凍及び注射（ＴＡＩ）製剤として凍結保存する。ＬＣＴＯＰＣ１製造プロセスフローを図４に示す。

プロセス内対照試験を、図４に示すように、ｈＥＳＣからＯＰＣ１への分化プロセス中の全ての主要なステップで実行する。多色フローサイトメトリー（ＦＣＭ）及びｑＰＣＲ方法（それぞれ）を使用して、バイオマーカータンパク質及びｍＲＮＡ発現を評価する。細胞を、ＯＰＣ１、上皮、中胚葉、星状膠細胞及びニューロンバイオマーカー、並びに残存ｈＥＳＣの発現について試験する。加えて、生存、細胞収率及び代謝活性（例えば、ラクタート）を、プロセス中に評価する。ラクタート濃度は、ＯＰＣ前の生成及び増殖のための凝集体プレーティングに必要な表面積を決定するために、０日目に開始し、２１日目に細胞計数の代用物として分化を開始するための指標として使用する。

解凍及び注射製剤としてのＬＣＴＯＰＣ１ ＤＰの凍結保存
改良されたＬＣＴＯＰＣ１医薬品（ＤＰ）は、解凍及び注射（ＴＡＩ）製剤として開発されており、解凍され、脊髄に注射する前に送達デバイスに直ちに装填される。この改良は、投与前の最終製剤のための洗浄及び再懸濁などの臨床現場での更なる操作と関連するリスクを大幅に低減し、製品の一貫性、安全性及び品質に対する制御を増加させる。

ＴＡＩ ＤＰ製剤の開発は、バイアル当たり３００μＬの細胞懸濁液の最終体積で１ｍＬ当たり１００×１０^６個の生存細胞を目標とする臨床用量を生成するための凍結保存媒体としてＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）１０（ＣＳ１０）を使用することを含み、凍結保存前の最適な細胞解離酵素中和溶液の評価及び濾過ステップの追加、バイアル当たり３００μＬの細胞懸濁液の最終体積でＣＳ１０中の１ｍＬ当たり１００×１０^６個の生存細胞を目標とするＯＰＣ１ ＴＡＩ製剤の確立、３００μＬを含有するＯＰＣ１ ＴＡＩバイアルについての解凍手順の確立、並びに最適化されたスケールアップされたＯＰＣ１の改良された製造プロセスが、全ての受け入れ基準を満たすＯＰＣ１ ＴＡＩを生成することの確認に焦点を当てる。

開発研究は、０．５ｍＬのＮＵＮＣバイアル中の３００μＬの最終体積で、１ｍＬのＣＳ１０当たり１００×１０^６個の生存細胞を目標とする細胞懸濁液としてＬＣＴ ＯＰＣ１ ＴＡＩ ＤＰを支持し、確立する。更に、この研究は、ＬＣＴ ＯＰＣ１のスケールアップされた製造プロセスが、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ及びＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ中和剤としてＨＳＡを伴うＮＵＴ（－）で採取され、６０μｍのフィルターキットを介して濾過された後、ＣｒｙｏＭｅｄ制御速度冷凍庫で凍結保存される、ＯＰＣ１ ＴＡＩ ＤＰを生成する能力を実証する。この最適化及びスケールアップされた製造プロセスで得られた細胞は、許容される品質属性、生存及び回収、並びに機能的な生物学的活性を示す。

材料の管理
補助材料の管理。ＬＣＴＯＰＣ１の製造に使用される各補助材料は、リスクレベル評価（ＵＳＰ ＮＦ＜１０４３＞）並びに製品用の材料及び／又はプロセス品質の重要度に基づく、プロセス開発研究及び個々の認定要件に基づいて考慮される。リスクレベル（ＲＬ）は、製造業者の品質システム、安全性リスク（材料の起源及び製造プロセス関連のリスク）、及び材料グレード（品質基準）を評価するためのリスク評価手順によって決定される。プロセス／製品の重要度は、生産手順及び／又は製品品質への材料の影響の評価によって決定される。

非細胞性の不純物。ＬＣＴＯＰＣ１ ＤＰ中の潜在的な非細胞性の不純物の推定量の計算は、最終的なＤＰ製剤の製造前に行われた手順及びＤＰ用量に基づく。リスク評価は、非細胞性の不純物レベル、材料の生体安全性、及び薬理学的リスクの理論的計算に基づいて行われる。リスク評価結果に基づいて、特定の非細胞性の不純物の検出及び測定のためのＤＰの分析試験、ＤＰからの材料の除去／低減、並びに必要に応じて拡張されたバイオセーフティ試験などの更なる緩和が実施される。

提案されたＣＭＣ比較可能性試験
ＯＰＣ１は、改良されたプロセスに従ってＧＭＰ施設において製造され、改正された放出パラメータに従って放出され、開発されたＴＡＩ製剤で凍結保存される。ＬＣＴＯＰＣ１ ＤＰは、Ｇｅｒｏｎの製造された代表的なバッチと比較され、新しいプロセスを介して製造されたＯＰＣ１の放出に使用された更新された分析方法で特徴付けられる。この計画には、ＧＰＯＲについての放出基準として使用される属性の試験に加えて、特定された追加のマーカーが含まれる。比較のための治験依頼者の提案は、表８に記載されるように、医薬品を特徴付ける品質属性に基づく。

ＬＣＴＯＰＣ１バッチとＧＰＯＲ ＯＰＣ１バッチとの間の並列比較は、統計分析に基づき、ＧＰＯＲ ＯＰＣ１バッチからの品質属性の定量的測定のための予想される範囲を計算する。ＬＣＴＯＰＣ１バッチで測定されたこれらの品質属性の値を、試験した品質属性についてのこれらの予想される範囲に関連して評価する。比較可能性データ分析は、ＬＣＴＯＰＣ１プロセスについての再現可能な放出基準を確立し、ＬＣＴＯＰＣ１がバッチ間のばらつきが低いことを実証することが予想される。

試験した品質属性は、各々３～４個の代表的なＧＰＯＲ及びＬＣＴ ＯＰＣ１バッチについての生存、同一性／純度、不純物集団、及び機能／有効性アッセイを含む。

提案される比較可能性の品質属性は次の通りである。生存－任意の生細胞医薬品の重要品質属性、同一性／純度－特徴的な乏突起膠細胞前駆細胞タンパク質マーカー：ＮＧ２、ＰＤＧＦＲα及びＰＤＧＲＦβの評価、非標的細胞集団／不純物、並びにインビトロでの細胞機能／有効性。

非標的細胞の不純物集団に関して。出発物質－多色フローサイトメトリー試験で組み合わされた催奇形性薬剤についての潜在的な供給源としてのヒト胚性幹細胞タンパク質マーカーＴＲＡ－１－６０及びＯｃｔ－４からの残留Ｈ１ ｈＥＳＣ。ＴＲＡ－１－６０及びＯｃｔ－４は、胚性幹細胞について一般的に知られ、使用されているマーカーであり、以前はＯＰＣ１放出基準として使用されていた。潜在的な異常な分化経路の評価。上皮細胞タンパク質マーカー：ケラチン７、Ｃｌａｕｄｉｎ－６、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ４９ｆが知られている上皮マーカー。既知の中胚葉及び軟骨マーカーとしての中胚葉細胞タンパク質マーカーＣＸＣＲ４及びＣＤ５６。既知の星状膠細胞マーカーとしての星状膠細胞タンパク質マーカーＧＦＡＰ。上皮－間葉移行を誘導する間葉系細胞ｍＲＮＡ ＯＬＲ１。既知の内胚葉マーカーとしてのＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７の内胚葉細胞ｍＲＮＡマーカー。ネスチンがＯＰＣに特異的ではなく、ＮＳＣ及び他の細胞型に特異的であり（ウェブサイトｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｍｃ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ＰＭＣ５９４８３０２／を参照されたい）、α－アクチニンをＣＸＣＲ４／ＣＤ５６の組み合わせによって効果的に置き換えることができることを新たなデータが示すため、現時点では、以前に使用されたネスチン及びα－アクチニン属性を含むことは計画されていない。ＣＸＣＲ４は、最終的な内胚葉及び中胚葉で発現される：ウェブサイトｐｕｂｍｅｄ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／１６２５８５１９／及びウェブサイトｐｎａｓ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／１０７／３１／１３７４２を参照されたい。

インビトロでの細胞の機能／有効性に関して。デコリン分泌－ＯＰＣ１についての有効性指標としての小さな分泌細胞マトリックスプロテオグリカン。中枢神経系におけるニューロン及び星状膠細胞によって発現されるデコリンは、瘢痕組織の形成を減弱させ、空洞形成を阻害し、創傷治癒を促進する。血小板由来成長因子－ＢＢ（ＰＤＧＦ－ＢＢ）に応答したＯＰＣ１細胞移動は、脊椎内の単一の注射部位からの最も広い解剖学的カバレッジを確保するために、損傷部位での細胞運動性にとって重要である。ＯＰＣ１の成熟及びミエリン化可能性の評価のための新しい有効性試験の開発。このアッセイは、ＯＰＣ１細胞の本質的な機能である剥離された軸索の再ミエリン化に基づく。このアッセイでは、ＯＰＣ１細胞を解凍し、ＯＰＣ１の乏突起膠細胞（ＯＬ）への成熟を誘導すべきである３Ｄ組織培養環境（例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ又はナノファイバーチューブ）内の特定の培地中に配置する。３Ｄ環境ナノチューブは、単純なインビトロ設定でＯＰＣ１細胞によるミエリン化活性を誘導するために、剥離された軸索を模倣する。アッセイは、ＭＢＰ、Ｏ４、ＭＡＧ、ＭＯＧ、ＰＬＰ、ＣＮｐａｓｅｂｙ免疫細胞化学、フローサイトメトリー、及びｑＰＣＲなどのＯＬ機能及び成熟状態と関連するタンパク質の発現を測定する。

ＬＣＴＯＰＣ１についての提案された放出基準とともに、ＧＰＯＲ ＯＰＣ１及びＬＣＴＯＰＣ１を試験するために使用される提案された試験パネルは、以下の表８に見ることができる。

（表８）提案された試験パネル、並びにプロセスの開発、放出、及び比較可能性に使用される根拠。

代表的な実行からのＲ＆Ｄ ＬＣＴＯＰＣ１バッチの予備的比較可能性が以下の表９～１３に提示される。

（表９）代表的なＧＰＯＲ ＯＰＣ１及びＬＣＴＯＰＣ１ Ｒ＆Ｄ実行からの比較可能性データ－フローサイトメトリーによるＯＰＣ１同一性プロファイル

＊ＭＧ－細胞を、ＦＣＭ分析の前に一晩Ｍａｔｒｉｇｅｌ上に播種する。ＧＰＯＲ ＯＰＣ１製剤及び凍結は、ＮＧ－２及びＰＤＧＦＲ－α発現を低下させる。以前に示されているように、かつ現在のこれらのデータによるＭａｔｒｉｇｅｌの一晩の培養。
^１臨床バッチ

（表１０）代表的なＧＰＯＲ及びＬＣＴＯＰＣ１ Ｒ＆Ｄ実行からの比較可能性データ－フローサイトメトリーによる非標的／不純物細胞集団プロファイル

^１臨床バッチ

（表１１）代表的なＧＰＯＲ ＯＰＣ１及びＬＣＴＯＰＣ１ Ｒ＆Ｄ実行からの比較可能性データ－フローサイトメトリーによるｈＥＳＣ残基

^１臨床バッチ

（表１２）代表的なＧＰＯＲ ＯＰＣ１及びＬＣＴＯＰＣ１ Ｒ＆Ｄ実行からの比較可能性データ－ｑＰＣＲによる非標的／不純物細胞集団遺伝子プロファイル（ＧＰＯＲ ＯＰＣ１ Ｍ０８に対する）

＊ＮＤ－検出されず
^１臨床バッチ

（表１３）代表的なＧＰＯＲ ＯＰＣ１及びＬＣＴ ＯＰＣ１ Ｒ＆Ｄ実行からの比較可能性データ－デコリン分泌及び移動アッセイによって決定されたインビトロでの機能

^１臨床バッチ

ＯＰＣ１医薬品についての放出基準としての異所性組織形成評価のレビュー
異所組織（嚢胞）形成リスクに対処するためのＯＰＣ１プログラムの歴史的アプローチ。最初のＯＰＣ１ ＩＮＤ提案の一部として実施及び提供された毒性研究は、特定のＯＰＣ１バッチを受けた動物における嚢胞構造及び顆粒状過形成（ＡＧＳ）の異所組織形成を明らかにした。ロット間の大幅なばらつき及び提案された放出基準が、意図された臨床ロットの安全性を予測するのに十分ではないというＦＤＡの懸念は、放出要件として各々の意図された臨床ロットについて９ヶ月間の毒性研究を実施するというＦＤＡの要求につながった。インビトロ嚢胞アッセイは、ＯＰＣ１ロットをスクリーニングするために使用された研究ツールとして提示された。この仮説は、インビトロで嚢胞を形成する強い傾向を有するロットを容易に特定することができ、インビトロ嚢胞陽性ロットの全てがインビボで嚢胞形成を示すであろうと述べた。加えて、それは、インビボ嚢胞形成についての予測因子としてのインビトロ嚢胞サイズのより一貫した染色及び評価を通じて嚢胞同定を改善することによって、アッセイを精緻化するためのステップが取られていると述べた。インビトロ嚢胞アッセイで実施された更なる研究は、以下の結論を明らかにした。数年間の開発努力にもかかわらず、嚢胞アッセイは、ＱＣ放出方法についての基本的な要件を満たしておらず、インビトロ嚢胞形成とインビボ嚢胞頻度との間に線形相関又は正確な予測は存在しない。

ＧＰＯＲデータ及び比較可能性試験からの予備的結果、合格／不合格ＧＰＯＲバッチ間の相関、及び新規／開発マーカーに基づくＯＰＣ１安全性ステータスのレビュー。本発明者らは、ＯＰＣ１製品についての新しいプロセス内制御、放出、及び有効性試験を含む、ＯＰＣ１製造プロセスの改良に継続的に取り組んできた。製造された材料についてのプロセス改良及び比較可能性計画の理論的根拠は、この実施例の前のセクションに提示された。開発努力の一環として、本発明者らは、新しく開発された方法に基づいて改良された製品特性パネルを使用して、関連するＧＰＯＲ ＯＰＣ１ ＧＭＰバッチの包括的な分析及び再試験を実施した。この分析は、Ｇｅｒｏｎ ＧＭＰバッチのＧＬＰ ｔｏｘ研究からの利用可能なデータと、純度及び不純物／非標的細胞集団特異的マーカーの発現レベルとの間の特定の相関を明らかにした。再試験結果及び分析は、不純物の有意な低レベル及び高純度プロファイルを特徴とするＬＣＴＯＰＣ１が、ＧＰＯＲ ＯＰＣ１よりもインビボで嚢胞形成の可能性を大幅に低下させることを示す、インビボでの不純物とバッチ失敗との間の相関を示す。

まとめ
代表的なＧＰＯＲ及びＬＣＴＯＰＣ１バッチの予備的比較可能性データは、以下を実証する。ＧＰＯＲ ＯＰＣ１及びＲ＆Ｄ ＬＣＴＯＰＣ１は、Ｒ＆Ｄ ＬＣＴＯＰＣ１においてより高く、改良されたＯＰＣ１製造プロセス（指向性分化）に起因し得るＰＤＧＦＲ－αバイオマーカーを除いて、同様のＯＰＣ１同一性／純度プロファイルプロファイルを実証する。Ｒ＆Ｄ ＬＣＴＯＰＣ１は、ＧＰＯＲ ＯＰＣ１と比較して、上皮細胞、星状膠細胞及び神経非標的細胞からの不純物のレベルが低い。ＬＣＴＯＰＣ１及びＧＰＯＲ ＯＰＣ１の両方は、非常にまれに検出可能な残留ｈＥＳＣ（％ＴＲＡ－１－６０＋／Ｏｃｔ４＋によって検出された）を有するが、ＧＰＯＲ ＯＰＣ１は、ＴＲＡ－１－６０＋／Ｏｃｔ４－及びＣＤ４９ｆ＋を示す細胞集団によって実証されるように、ＬＣＴＯＰＣ１と比較して、多能性細胞のパーセンテージが高い。ＬＣＴＯＰＣ１は、ＧＰＯＲ ＯＰＣ１と比較して、内胚葉及び間葉非標的細胞遺伝子発現のレベルが低い。ＬＣＴＯＰＣ１及びＧＰＯＲ ＯＰＣ１は、同様のデコリン分泌及び移動能力を実証する。

結論。これまでに蓄積されたデータは、高度に再現可能で厳密に制御された分化プロセスによって定義された細胞バンクシステムから生成され、更新された分析方法でモニタリングされた改良されたプロセスで製造されたＬＣＴＯＰＣ１医薬品が、ＧＰＯＲ ＯＰＣ１と同様の必須品質属性を提示するが、純度マーカーの全体的なより高い発現及び不純物／非標的集団マーカーのより低い発現から利益を得ることを示す。したがって、ＬＣＴＯＰＣ１医薬品についての安全性プロファイルを潜在的に増加させる。

実施例３：概念実証研究
この研究の目的は、ＯＰＣ１ミエリン化及び成熟概念実証研究のための実験データを提供することである。

ＬＣＴ ＯＰＣ１細胞を、表１４に列挙されるように、異なる培地成分中の９６個のビジョンプレート中のＭａｔｒｉｇｅｌ（ＭＧ）１：３０で培養した。各培養条件は「系」で構成される。細胞を、培養の最初の５～６日間、ＧＰＭ／Ｅ中で培養し、次いで、成熟系については、表１４に列挙されるステップに従って培地を置き換えた。系番号２は、免疫染色による乏突起膠細胞様細胞、及びＭＢＰ発現に対する形態変化を示した。

（表１４）研究設計

図６～図９は、異なる系についてのＯＰＣ形態を示す。図６は、対照系番号１、１０日目（時間＝０、７日目）のＧＰＭ／Ｅを示す。ＯＰＣ形態は、ＤＣＮ ＥＬＩＳＡ有効性アッセイに典型的である。図７は、処理後３日目の系番号２、５０％ＧＰＭ／Ｅ、及び５０％Ｎ２．１（ＩＢＭＸを伴わない）についてのＯＰＣ形態を示す。細胞は、対照と比較して形態的変化を示す。図８は、１２日目の対照系番号１、及びＤＣＮ ＥＬＩＳＡ有効性アッセイに典型的なＯＰＣ形態を示す。図９は、処理後５日目の系番号２、１００％Ｎ２．１（２日間ＩＢＭＸを伴う）を示す。細胞は形態的変化を示す。

図１０は、１３日目のＨｏｅｃｈｓｔ及びＭＢＰについての共焦点免疫染色（固定細胞）を示す。ＧＰＭ／Ｅ中の対照系番号１が左側に示され、１００％Ｎ２．１を伴う系番号２が右側に示される。

実施例４：ＯＰＣ分化プロトコル

（表１５）所望の最終濃度に達するためにＧＰＭ１ｍｌ当たり追加するストック溶液の体積

この実施例の目的は、ｈＥＳＣをＯＰＣに分化させるためのＧＭＰ条件の確立を実証することである。

０日目－培養評価。０日目 ＩＰＣ：段階ＩＩを開始する前に、ｈＥＳＣコロニー評価を行う。分化は、以下の基準が満たされている場合にのみ開始することができる。培養物中のコンフルエンシーが９５％以上である。培養物中の分化％は５％未満である。密集したコロニーの％は５０％超である。培地中のラクタート濃度は１７．４０ｍＭ超である。

培地交換、０～６日目：培地を２４時間±４時間ごとに交換する必要がある。０日目及び４日目に、５倍及び１０倍の倍率を使用して培養物を観察し、写真を撮る。３日目及び４日目に、ラクタートを測定する。表１５に従って小分子を解凍し、必要なＧＰＭ体積を温める。表１５に従って、温められたＧＰＭにＧＦ体積を加える。培地を交換する。４日目から開始して、表１５に従ってＧＦを交換する。

採取、７日目：必要に応じて、採取の１日前から１週間前までに、必要な数のフラスコを決定し、１０μｇ／ｍｌのｒｈ ＬＮ５２１でコーティングする。５倍及び１０倍の対物レンズを使用して培養物を観察し、写真を撮る。ラクタート濃度を測定する。２ｍｌのＣＭを２つの凍結バイアル（各１ｍｌ）に分け、－８０℃で保存する。表１５に従ってＧＦを解凍し、必要なＧＰＭ体積を温める（ＧＰＭ＋ＧＦ及びＧＰＭ ｗ／ｏ ＧＦの最終溶液の場合）。表１５に従って、温められたＧＰＭにＧＦ体積を加える。

採取プロトコル：培地を吸引する。３ｍｌのＰＢＳ（－）を各Ｔ２５フラスコに加える。フラスコを２～３回傾け、ＲＴで１分間インキュベートする。タイマーを使用する。吸引し、１ｍｌ／Ｔ２５ ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを添加する。注記：ＴＳの新しいボトルを開く。３７℃及び５％ＣＯ_２で６分間インキュベートする。タイマーを使用する。片側でフラスコを非常にしっかりとタップし、フラスコを傾けて細胞を洗浄し、フラスコの反対側を非常にしっかりとタップする。５ｍｌのＧＰＭ ｗ／ｏ ＧＦを添加する。培地を細胞に直接添加し、表面を１～２回軽く洗浄する。細胞をコニカルチューブに回収する。５ｍｌ／Ｔ２５のＧＰＭ ｗ／ｏ ＧＦを添加し、２～３回軽くリンスする。細胞を回収する。遠心分離：２００ｇ、５分、ＲＴ。タイマーを使用する。任意選択：クエンチ後、２．５倍の対物レンズを使用して各処理されたフラスコの画像を取り、残りの細胞の％を記録する。上清を吸引し、ペレットをしっかりとタップし、５ｍｌのピペットを使用して採取したＴ２５フラスコごとに５ｍｌのＧＰＭ＋ＧＦＳで穏やかに再懸濁させる。ピペット上で行わないように注意する。

細胞計数プロトコル：２つのマーキングされたエッペンドルフチューブを調製し、約１００μｌの細胞懸濁液を別々の各エッペンドルフチューブに移す。５倍希釈の場合：２００μｌのＧＰＭ＋ＧＦを含む２つの追加のエッペンドルフチューブを調製し、セクション０で調製した５０μｌの細胞懸濁液のチューブを含有する各培地に移し、２５０μｌの最終体積にする。十分に混合する。ＮＣ－２００セルカウンターを使用して、各希釈したエッペンドルフチューブを計数する。

細胞の播種プロトコル：表１６に従って、播種に必要な培地の体積及び細胞の数（２．６７×１０^４個の生細胞／ｃｍ^２の密度）を計算する。

（表１６）播種のための体積及び細胞の数

該当する場合、冷蔵庫からＬＮ５２１でコーティングされたフラスコを回収する。ＬＮ５２１でコーティングされたフラスコの場合：各Ｔ２２５ ＬＮ５２１でコーティングされたフラスコに６ｍｌのＧＰＭ＋ＧＦを添加する。フラスコをＲＴで１分間インキュベートする。タイマーを使用する。コーティング溶液及びＧＰＭ＋ＧＦ培地をフラスコから吸引する。２４ｍｌのＰＢＳ（＋）／Ｔ２２５で洗浄する。計算したＧＰＭ＋ＧＦをフラスコに添加する。計算した細胞体積に細胞懸濁液及び播種を混合するために、穏やかにピペットする。容器をインキュベーターに移し、容器を穏やかに撹拌して、細胞を容器の表面上に均一に分散させる。ＩＰＣ ７日目：試料のための凍結保存細胞。

培地交換、９～１３日目：９、１１、及び１３日目に、培養物を観察し、２．５倍、５倍、及び１０倍の対物レンズを使用して写真を撮り、ラクタートを測定する。表１５に従ってＧＦを解凍する。必要なＧＰＭ体積を決定し、３７℃の水浴で加温する。表１５に従ってＧＦをＧＰＭに添加する。培地を吸引し、各Ｔ２２５フラスコに９０ｍｌのＧＰＭ＋ＧＦ培地を添加する。

採取、１４日目：ＰＢＳホイールの調製：１３日目に、７０ｍｌのＧＰＭ培地をＰＢＳホイールにラベル付けし、事前に充填し、ＰＢＳを傾け、ホイールの壁を洗浄する。加湿ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃及び５％ＣＯ_２で３５ＲＰＭで一晩インキュベートする。１４日目に培養物を観察し、２．５倍、５倍、１０倍の対物レンズを使用して写真を撮る。ラクタートを測定する。２ｍｌのＣＭを２つの凍結バイアル（各１ｍｌ）に分け、－８０℃で保存する。表１５に従ってＧＦを解凍し、必要なＧＰＭ体積を温める（ＧＰＭ＋ＧＦ及びＧＰＭ ｗ／ｏ ＧＦの最終溶液の場合）。表１５に従って、温められたＧＰＭにＧＦ体積を加える。

採取：培地を吸引する。２４ｍｌのＰＢＳ（－）を各Ｔ２２５フラスコに添加する。フラスコを２～３回傾け、ＲＴで１分間インキュベートする。吸引し、９ｍｌ／Ｔ２２５ ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを添加する。３７℃及び５％ＣＯ_２で８分間インキュベートする。片側でフラスコをしっかりとタップし、フラスコを傾けて細胞を洗浄し、フラスコの反対側をしっかりとタップする。１８ｍｌのＧＰＭ ｗ／ｏ ＧＦを添加する。培地を細胞に直接添加する。細胞をコニカルチューブに回収する。１８ｍｌ／Ｔ２２５のＧＰＭ ｗ／ｏ ＧＦを添加し、２～３回軽くリンスする。細胞を回収する。遠心分離：１７０～１８０ｇ、５分、ＲＴ。任意選択：クエンチ後、２．５倍の対物レンズを使用して各処理されたフラスコの画像を取り、残りの細胞の％を記録する。上清を吸引し、ペレットをしっかりとタップし、Ｔ２２５フラスコごとに３０ｍｌ（最初に５ｍｌのピペットで５ｍｌで再懸濁し、次に２５ｍｌを添加する）のＧＰＭ＋ＧＦＳで再懸濁し、採取した。ピペット上で行わないように注意する。

細胞計数：２つのマーキングされたエッペンドルフチューブを調製し、約１００μｌの細胞懸濁液を別々の各エッペンドルフチューブに移す。４倍希釈の場合：１５０μｌのＧＰＭ＋ＧＦを含む２つの追加のエッペンドルフチューブを調製し、５０μｌの細胞懸濁液のチューブを含有する各培地に移し、２００μｌの最終体積にする。十分に混合する。ＮＣ－２００セルカウンターを使用して、各希釈したエッペンドルフチューブを計数する。

細胞播種：表１７に従って、播種に必要な培地の体積及び細胞の数（１２８×１０^６個の生細胞／０．１ＰＢＳホイール）を計算する。

（表１７）播種のための体積及び細胞の数

予め充填された培地をホイールから吸引する。計算したＧＰＭ＋ＧＦをフラスコに添加する。計算した細胞体積に細胞懸濁液及び播種を混合するために、穏やかにピペットする。ＰＢＳホイール容器を、３７℃及び５％の加湿ＣＯ_２インキュベーター内のＰＢＳｍｉｎｉ上に置く。２４±４時間の間、ＰＢＳｍｉｎｉの速度を３５ＲＰＭに設定する。ＩＰＣ １４日目：細胞を凍結保存する。

１５日目：ＰＢＳｍｉｎｉの速度を４５ＲＰＭに増加させる。ＰＢＳｍｉｎｉのライトを点灯し、ＰＢＳホイールが依然として回転している間に塊が見られないことを注意深く確認する。塊が観察された場合にのみ、沈殿を避けるためにそれらを迅速に除去する。必要でない場合、ＰＢＳｍｉｎｉからＰＢＳホイールを除去しない。

培地交換：１６、１８、２０日目：１６、１８、２０日目に、培養物を観察し、２．５倍及び５倍の対物レンズを使用して写真を撮り、ラクタートを測定する。表１５に従ってＧＦを解凍する。必要なＧＰＭ体積を決定し、３７℃の水浴で加温する。表１５に従ってＧＦをＧＰＭに添加する。ＰＢＳｍｉｎｉからＰＢＳホイールを除去し、表１８のように、１日当たり示される沈降時間の間、インキュベーター内のラック上にそれを置く。

（表１８）１日当たりの沈降時間

培地交換前に沈降を検査する。凝集体が沈降していない場合、沈降時間を更に５分間延長する。１０ｍｌのピペットを使用して、ＰＢＳホイール内の体積の８０％（５６ｍｌ）を除去し、ラクタート測定のためにそれを維持する。５６ｍｌ（上記のセクションで除去したものと同じ体積のＧＰＭ＋ＧＦ）をＰＢＳホイールの側面に加える。塊の形成についてＰＢＳホイールを検査し、塊が観察された場合、塊の調査及び除去がプロセスにとって重要であるため、それらを除去する。３７℃及び５％ＣＯ_２、４５ＲＰＭの加湿ＣＯ_２インキュベーター内で、ＰＢＳホイールをＰＢＳｍｉｎｉに戻す。ラクタートを測定する。

凝集体の平滑化、２１日目：採取の１日前から１週間前までに、Ｔ７５／Ｔ１５０フラスコの数を決定し、適切なコーティング溶液（１０μｇ／ｍｌのｒｈＬＮ５２１又はｉＭａｔｒｉｘ－５１１－Ｅ８）でコーティングする。播種するための容器を決定するために、培地交換の約２４時間後にラクタートを測定する。ラクタート濃度が１５．００ｍＭ以下である場合、凝集体を１つのＴ７５に播種する。そうでなければ、凝集体を１つのＴ１５０に播種する。２ｍｌのＣＭを２つの凍結バイアル（各１ｍｌ）に分け、－８０℃で保存する。培養物を観察し、凝集体を撮影する。表１５に従ってＧＦを解凍し、必要なＧＰＭ体積を加温する（ＧＰＭ＋ＧＦの最終溶液の場合）。表１５に従って、温められたＧＰＭにＧＦ体積を加える。

播種のためのコーティングされた容器の調製：冷蔵庫からコーティングされたフラスコを回収する。各フラスコにラベルを付ける。各々のＴ７５／Ｔ１５０でコーティングされたフラスコに２／４ｍｌのＧＰＭ＋ＧＦを添加する。フラスコをＲＴで１分間インキュベートする。タイマーを使用する。コーティング溶液及びＧＰＭ＋ＧＦ培地をフラスコから吸引する。ＬＮ５２１でコーティングされたフラスコの場合のみ、各Ｔ７５／Ｔ１５０でコーティングされた容器について１０／２０ｍｌのＰＢＳ（＋）で洗浄する。Ｔ７５／Ｔ１５０に２０／４０ｍｌのＧＰＭ＋ＧＦを添加する。プレーティングするまで、３７℃及び５％ＣＯ_２の加湿ＣＯ_２インキュベーターに容器を移す。２５ｍｌのピペットを使用して、３５ｍｌのＰＢＳ－ホイール含有量を５０ｍｌのコニカルチューブに移す。凝集体を４分間沈降させる。２５ｍｌのピペットを使用して手動で吸引し、３０ｍｌのＧＰＭを別の５０ｍｌのチューブに取り出す。ステップを繰り返し（２５ｍｌピペットは、３５ｍｌのＰＢＳ－ホイール含有量を５０ｍｌのコニカルチューブに移し、凝集体を４分間沈降させる）、凝集体の残りをＰＢＳ－ホイールから「播種凝集体」とラベル付けされた同じ５０ｍｌのコニカルチューブに移す。凝集体の沈降中に、２ｍｌのピペットを使用して、ＰＢＳ－ホイールに残った凝集体の残りを収集し、「播種凝集体」チューブの底部にゆっくりと移す。凝集体が５０ｍｌのチューブに沈降している間に、２０ｍｌのＧＰＭ＋ＧＦをＰＢＳ－ホイールに添加する。ステップをもう１回繰り返す（２５ｍｌのピペットは、３５ｍｌのＰＢＳ－ホイール含有量を５０ｍｌのコニカルチューブに移し、凝集体を４分間沈降させ、凝集体の残りをＰＢＳ－ホイールから「播種凝集体」とラベル付けされた同じ５０ｍｌのコニカルチューブに移し、凝集体沈降中に、２ｍｌのピペットを使用して、ＰＢＳ－ホイールに残っている凝集体の残りを収集し、凝集体が５０ｍｌのチューブに沈降している間、ゆっくりと「播種凝集体」チューブの底部に移し、２０ｍｌのＧＰＭ＋ＧＦをＰＢＳ－ホイールに添加する）。洗浄液をＰＢＳ－ホイールから５０ｍｌチューブに回収する。ＰＢＳ－ホイールを傾け、２ｍｌのピペットを用いてＰＢＳ－ホイールから残りの培地を採取する。５０ｍｌのコニカルチューブを遠心分離する：１４０Ｇ、３分、ＲＴ。調製した容器をＢＳＣの中に移す。フラスコの上面が透明であることを検証する。必要に応じて、播種前に培地で表面を洗浄する。上清を穏やかに吸引する。２５ｍｌのピペットを使用して、Ｔ７５／Ｔ１５０の播種ごとに５／１０ｍｌのＧＰＭ＋ＧＦを用いて、ペレットを再懸濁する（再懸濁前にタップしない）。懸濁液の体積を測定する。総体積を指定された容器にすばやく播種する（凝集体の非均質な付着を避けるためにフラスコを垂直に保つ）。２５ｍｌのピペットを使用して、余分な体積でチューブを洗浄し（それぞれ、７５／１５０ｃｍ^２の播種当たり３０／６０ｍｌを完了する）、容器に添加する。３７℃及び５％ＣＯ_２の加湿インキュベーター内でフラスコをインキュベートする。インキュベーター内では、凝集体がフラスコ内に均一に分布していることを確認する。

培地交換 ２３、２５、２７日目：２３、２５、及び２７日目に、培養物を観察し、５倍、及び１０倍の対物レンズを使用して写真を撮り、ラクタートを測定する。表１５に従ってＧＦを解凍する。必要なＧＰＭ体積を決定し、３７℃の水浴で加温する。表１５に従ってＧＦをＧＰＭに添加する。培地を吸引し、各Ｔ７５／Ｔ１５０フラスコに３０／６０ｍｌのＧＰＭ＋ＧＦ培地を添加する。

２８日目：必要に応じて、採取の１日前から１週間前までに、必要な数のフラスコを決定し、１０μｇ／ｍｌのｒｈＬＮ５２１でコーティングする。５倍及び１０倍の対物レンズを使用して培養物を観察し、写真を撮る。ラクタート濃度を測定する。２ｍｌのＣＭを２つの凍結バイアル（各１ｍｌ）に分け、－８０℃で保存する。表１５に従ってＧＦを解凍し、必要なＧＰＭ体積を温める（ＧＰＭ＋ＧＦ及びＧＰＭ ｗ／ｏ ＧＦの最終溶液の場合）。表１５に従って、温められたＧＰＭにＧＦ体積を加える。採取：培地を吸引する。８／１６ｍｌのＰＢＳ（－）を各Ｔ７５／Ｔ１５０フラスコに添加する。フラスコを２～３回傾け、ＲＴで１分間インキュベートする。Ｔ７５／Ｔ１５０ ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔごとに３／６ｍｌを吸引し、添加する。７分間、３７℃及び５％ＣＯ_２でインキュベートする。片側でフラスコを軽くタップし、フラスコを傾けて細胞を洗浄し、フラスコの反対側を軽くタップする。２５ｍｌのピペットを使用して、細胞の表面上に６／１２ｍｌのＧＰＭ ｗ／ｏ ＧＦを穏やかに添加する。細胞をコニカルチューブに回収する。細胞の表面を洗浄しない。遠心分離：２６０～２７０ｇ、１０分、ＲＴ。上清を吸引し、ペレットがチューブから解離されるまでペレットを軽くタップし、採取したＴ７５／Ｔ１５０フラスコごとに１５／３０ｍｌのＧＰＭ＋ＧＦＳで再懸濁する。まず、２５ｍｌのピペットを用いて、５ｍｌで再懸濁し、上下に２～３回ピペット操作し、次いで２５ｍｌのピペットを使用して残りの体積を添加する。ピペット上で行わないように注意する。

細胞計数：２つのマーキングされたエッペンドルフチューブを調製し、約１５０μｌの細胞懸濁液を別々の各エッペンドルフチューブに移し、計数試料のための凝集体を移さないようにする。２倍希釈の場合：１００μｌのＧＰＭ＋ＧＦを含む２つの追加のエッペンドルフチューブを調製し、１００μｌの細胞懸濁液のチューブを含有する各培地に移し、２００μｌの最終体積にする。十分に混合する。ＮＣ－２００セルカウンターを使用して、各希釈したエッペンドルフチューブを計数する。

細胞播種：表１６に従って、播種に必要な培地の体積及び細胞の数（４．０×１０^４個の生細胞／ｃｍ^２の密度）を計算する。

（表１９）播種のための体積及び細胞の数

該当する場合、冷蔵庫からＬＮ５２１でコーティングされたフラスコを回収する。各フラスコにラベルを付ける。ＬＮ５２１でコーティングされたフラスコの場合：各Ｔ２２５ ＬＮ５２１でコーティングされたフラスコに６ｍｌのＧＰＭ＋ＧＦを添加する。フラスコをＲＴで１分間インキュベートする。タイマーを使用する。コーティング溶液及びＧＰＭ＋ＧＦ培地をフラスコから吸引する。２４ｍｌのＰＢＳ（＋）／Ｔ２２５で洗浄する。計算したＧＰＭ＋ＧＦをフラスコに添加する。該当する場合、培地＋Ｅ８プールを調製する。計算した細胞体積に細胞懸濁液及び播種を混合するために、穏やかにピペットする。フラスコをインキュベーターに移し、フラスコを穏やかに撹拌して、細胞を容器の表面上に均一に分散させる。

ＩＰＣ ２８日目：細胞を凍結保存する。培地交換 ３０、３２、３４日目：３０、３２、及び３４日目に、培養物を観察し、５倍、及び１０倍の対物レンズを使用して写真を撮り、ラクタートを測定する。表１５に従ってＧＦを解凍する。必要なＧＰＭ体積を決定し、３７℃の水浴で加温する。表１５に従ってＧＦをＧＰＭに添加する。培地を吸引し、各Ｔ２２５フラスコに９０ｍｌのＧＰＭ＋ＧＦ培地を添加する。

３５日目：３５日目に、培養を観察し、５倍、及び１０倍の対物レンズを使用して写真を撮る。ラクタートを測定する。２ｍｌのＣＭを２つの凍結バイアル（各１ｍｌ）に分け、－８０℃で保存する。表１５に従ってＧＦを解凍し、必要なＧＰＭ体積を温める（ＧＰＭ＋ＧＦ及びＧＰＭ ｗ／ｏ ＧＦの最終溶液の場合）。更なる培養のために細胞を播種しない場合、ＧＦを解凍せず、ＧＰＭ＋ＧＦを調製しないで、ＧＰＭ ｗ／ｏ ＧＦのみが必要である。表１５に従って、温められたＧＰＭにＧＦ体積を加える。

採取：培地を吸引する。２４ｍｌのＰＢＳ（－）を各Ｔ２２５フラスコに添加する。容器を２～３回傾け、ＲＴで１分間インキュベートする。吸引し、９ｍｌ／Ｔ２２５ ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを添加する。３７℃及び５％ＣＯ_２で７分間インキュベートする。片側で容器を軽くタップし、フラスコを傾けて細胞を洗浄し、容器の反対側を軽くタップする。１８ｍｌのＧＰＭ ｗ／ｏ ＧＦを添加する。培地を細胞に直接添加する。細胞をコニカルチューブに回収する。１８ｍｌ／Ｔ２２５のＧＰＭ ｗ／ｏ ＧＦを添加し、２～３回軽くリンスする。細胞を回収する。播種せずに細胞を採取だけする場合、細胞計数に進む。更なる培養のために細胞を播種する場合、遠心分離：２６０～２７０ｇ、１０分、ＲＴ。上清を吸引し、ペレットをしっかりとタップし、採取したＴ２２５容器ごとに３０ｍｌのＧＰＭ＋ＧＦで再懸濁する。まず、５ｍｌで再懸濁し、上下に２～３回ピペット操作し、次いで２５ｍｌのピペットを使用して残りの体積を添加する。ピペット上で行わないように注意する。

細胞計数：２００μｌの細胞懸濁液とともに２つの追加のエッペンドルフチューブを調製し、各チューブに移す。ＮＣ－２００セルカウンターを使用して各チューブを計数する。

細胞播種（該当する場合）：表１６に従って、播種に必要な培地の体積及び細胞の数（４．０×１０^４個の生細胞／ｃｍ^２の密度）を計算する。

（表２０）播種のための体積及び細胞の数

該当する場合、冷蔵庫からＬＮ５２１でコーティングされたフラスコを回収する。各フラスコにラベルを付ける。ＬＮ５２１でコーティングされたフラスコの場合：各Ｔ２２５ ＬＮ５２１でコーティングされたフラスコに６ｍｌのＧＰＭ＋ＧＦを添加する。フラスコをＲＴで１分間インキュベートする。タイマーを使用する。コーティング溶液及びＧＰＭ＋ＧＦ培地をフラスコから吸引する。計算したＧＰＭ＋ＧＦをフラスコに添加する。該当する場合、培地＋Ｅ８プールを調製する。計算した細胞体積に細胞懸濁液及び播種を混合するために、穏やかにピペットする。フラスコをインキュベーターに移し、フラスコを穏やかに撹拌して、細胞をフラスコの表面上に均一に分散させる。ＩＰＣ ３５日目：細胞を凍結保存する。

培地交換 ３７、３９、４１日目：３７、３９、及び４１日目に、培養物を観察し、５倍、及び１０倍の対物レンズを使用して写真を撮り、ラクタートを測定する。表１５に従ってＧＦを解凍する。必要なＧＰＭ体積を決定し、３７℃の水浴で加温する。表１５に従ってＧＦをＧＰＭに添加する。培地を吸引し、各Ｔ２２５フラスコに９０ｍｌのＧＰＭ＋ＧＦ培地を添加する。

４２日目：４２日目に、培養を観察し、５倍、及び１０倍の対物レンズを使用して写真を撮る。ラクタートを測定する。２ｍｌのＣＭを２つの凍結バイアル（各１ｍｌ）に分け、－８０℃で保存する。必要なＧＰＭ量を加温する。

採取：培地を吸引する。２４ｍｌのＰＢＳ（－）を各Ｔ２２５フラスコに添加する。フラスコを２～３回傾け、ＲＴで１分間インキュベートする。吸引し、９ｍｌ／Ｔ２２５ ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを添加する。３７℃及び５％ＣＯ_２で７分間インキュベートする。片側でフラスコを軽くタップし、フラスコを傾けて細胞を洗浄し、フラスコの反対側を軽くタップする。１８ｍｌのＧＰＭ ｗ／ｏ ＧＦを添加する。注記：培地を細胞に直接添加する。細胞をコニカルチューブに回収する。１８ｍｌ／Ｔ２２５のＧＰＭ ｗ／ｏ ＧＦを添加し、２～３回軽くリンスする。細胞計数：２００μｌの細胞懸濁液とともに２つの追加のエッペンドルフチューブを調製し、各チューブに移す。ＮＣ－２００セルカウンターを使用して各チューブを計数する。ＩＰＣ ４２日目：細胞を凍結保存する。

実施例５：大規模ＯＰＣバッチの製造：
この実施例の目的は、ＯＰＣの生成のための大規模な条件の確立を実証することである。

実験手順：図１３は、ＯＰＣ分化プロトコルのステップを示す。

ｈＥＳＣの培養（段階１）－Ｈ１ ｈＥＳＣ（ＰＩＬＯＴ－ＬＣＴ－Ｈ１－００２）を、ＬＮ５２１でコーティングされた容器上で、ＥＲＩ番号ＥＲＩ－Ｈ１－０１及び番号ＥＲＩ－Ｈ１－０２に従って３回の継代で培養した。ｐ３０＋６＋４＋２の終わりに、ＯＰＣ分化開始のために細胞を４日間播種した。

ＯＰＣ分化－段階１のｐ３０＋６＋４＋３の４日目に、図１３に従って、６つのＴ２５容器内でＯＰＣ分化を開始した。（０日目から分化プロトコル）。

０～３日目－上記のように培養する。２μＭのドルソモルフィン、１０μＭのＰＤ０３２５９０１、及び１μＭのＲＡで補充したＧＰＭ培地を毎日交換した。

４～６日目－実施例５のプロトコルに従って培養する。１５０μＭのＡＡ、及び１μＭのＲＡを補充したＧＰＭ培地を毎日交換した。

７日目－ＴＳを用いて実施例５のプロトコルに従って細胞を採取した。１１個のＴ２２５容器を、１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌのｈｓ－ＦＧＦ、及び１０μＭのＲＩを補充したＧＰＭ中に、２６，６６７個の生細胞／ｃｍ^２で、ＬＮ５２１でコーティングした容器に播種した。

９～１３日目－実施例５のプロトコルに従って培養する。１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、及び１０ｎｇ／ｍｌのｈｓ－ＦＧＦを補充したＧＰＭ培地を２日ごとに交換した。

１４日目－１２８×１０^６個の生細胞／ＰＢＳホイールで、１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌのｈｓ－ＦＧＦ、及び１０μＭのＲＩを補充したＧＰＭ中の凝集体形成のために、ＴＳ及び１２個のＰＢＳホイールを播種した（番号２０－ＥＲＯＰＣＲＤ－０２の進行中の実行のため）実施例５のプロトコルに従って細胞を採取した。加えて、他の全ての細胞をＣＳ１０中でＩＣＢとして凍結保存した。

１４日目の解凍－ＩＣＢ解凍のために、凍結保存された細胞を解凍させ、計数し、番号ＥＲ－ＩＣＢＲＤ－０２研究設計に従ってＰＢＳホイール中に播種した。１２８×１０^６個の生細胞／ＰＢＳホイールを実施例５のプロトコルに従って６つの容器内に播種し、１０５×１０^６個の生細胞／ＰＢＳホイールを１つの容器内に播種した。

１６～２０日目－実施例５のプロトコルに従って培養する。１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、及び１０ｎｇ／ｍｌのｈｓ－ＦＧＦを補充したＧＰＭ培地の８０％を２日ごとに交換した。

２１日目－凝集体を２１日目に平滑化し、７つのＴ７５ ＬＮ５２１でコーティングされた容器で、２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、及び１０ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ－ＡＡを補充したＧＰＭ中に播種した。

２３～２７日目－上記のように培養する。２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、及び１０ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ－ＡＡを補充したＧＰＭ培地を２日ごとに交換した。

２８日目－細胞をＴＳで採取し、１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、及び１０ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ－ＡＡを補充したＧＰＭ中で、３６個のＴ２２５ Ｅ８で直接コーティングされた容器で、４０，０００個の生細胞／ｃｍ^２で播種した。

２９～３４日目－上記のように培養する。２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、及び１０ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ－ＡＡを補充したＧＰＭ培地を２日ごとに交換した。

３５日目－細胞をＴＳで採取し、１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、及び１０ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ－ＡＡを補充したＧＰＭ中で、４５個のＣｅｌｌ－ｆａｃｔｏｒｉｅｓ Ｅ８で直接コーティングされた容器で、４０，０００個の生細胞／ｃｍ^２で播種した。３５日目のインキュベーター内のＣＯ_２レベルの逸脱を報告した。逸脱の影響を受けた容器と他の全ての容器との間に差は見られなかったため、形態学的及びラクタートレベルの評価により、逸脱は細胞にとってわずかなリスクを伴うため、全ての容器で進めることが決定された。

３５～４１日目－上記のように培養する。２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、及び１０ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ－ＡＡを補充したＧＰＭ培地を２日ごとに交換した。

４２日目－番号ＥＲＩ－ＯＰＣ－０７に従って、ＴＡＩ製剤中のＴＳによる細胞の採取及び凍結保存。

ＱＣ試験－フローサイトメトリー－ＦＡＣＳによるマーカーの分析を、表２１に従って、７日目、１４日目、２８日目、３５日目、及び４２日目に凍結保存された細胞上で実施した。

（表２１）ＦＡＣＳ染色

バッチ放出受け入れ基準－４２日目の細胞のバッチ放出試験のための提案された受け入れ基準は、表２２に提示される。

（表２２）バッチ放出提案受け入れ基準。

結果：継代パラメータ番号２０－ＥＲＯＰＣＲＤ－０２及び番号ＥＲ－ＩＣＢＲＤ－０２に関する全ての継代パラメータは、表２３及び表２４に提示されている。各継代において、収量及びＰＤＬ値は、以下の式に従って計算した：

（表２３）継代パラメータ ０～２８日目

（表２４）継代パラメータ ３５～４２日目

１４日目まで、全ての継代パラメータは、以前の成功した実行の範囲であった（報告番号ＯＰＣ－ＲＥＰ－０３）。一方、１４～２１日目の間に、進行中の実行において大規模な塊形成が観察され、したがって、２１日目の凝集塊及びラクタートの数を平均６．５７ｍＭに減少させた。結果として、進行中の実行を中止し、凍結保存された細胞を解凍し、上記のように播種した。ＩＣＢ解凍細胞では、塊の形成は観察されず、結果として、２１日目のラクタートがより高かった（平均７．５８ｍＭ）。２８～４２日目の継代パラメータは、予想される許容範囲内であった。

マーカー発現－番号２０－ＥＲＯＰＣＲＤ－０２及び番号ＥＲ－ＩＣＢＲＤ－０２のマーカー発現は、表２５に提示される。

（表２５）７～２８日目のマーカー発現

（表２６）３５日目のマーカー発現

継代パラメータに記載されているように、３５日目までのマーカー発現は、以前の成功した実行からの任意の大きな矛盾を指摘しなかった。

形態－３５日目から開始して、成功した群及び失敗した群の培養は、異なる形態によって異なる。図１２では、番号ＥＲ－ＩＣＢＲＤ－０２の写真は、細胞が小型で高密度な細胞として組織化されており、紡錘状の「失敗した」形態を取得しなかったことを示している。

バッチ放出－表２３に従った番号ＥＲ－ＩＣＢＲＤ－０２バッチ放出試験の要約であり、表２７に提示される。

（表２７）番号ＥＲ－ＩＣＢＲＤ－０２のバッチ放出試験

バッチＥＲ－ＩＣＢＲＤ－０２細胞は、バッチ放出のために提案された全ての受け入れ基準を満たした。

考察：バッチ番号２０－ＥＲＯＰＣＲＤ－０２の進行中の実行及びＩＣＢ１４日目の操作実行から解凍された番号ＥＲ－ＩＣＢＲＤ－０２の実行は、フルスケールのＬＣＴＯＰＣ１バッチ生産の実現可能性の証明の一環としてＲ＆Ｄ実験室で製造され、それらの生成物は比較可能性及び動物研究目的のために指定されている。

番号２０－ＥＲＯＰＣＲＤ－０２の進行中の実行では、複数の容器を同時に処理することにより、全てのＰＢＳホイールで異常に高い数の塊が形成され、この実行が終了したことが明らかになった。１４～２１日目の間のＰＢＳホイールにおける塊形成は、２１日目の凝集体喪失及び非指標性ラクタート読み取りによる分化プロセスを損なう。加えて、１４日目に採取した細胞（ＬＣＴＯＰＣ１ ＩＣＢ）の凍結保存及び解凍は、同じ細胞の継続的な実行と比較して、１４～２１日目に形成される塊の数を減少させることができる。実際に、番号２０－ＥＲＯＰＣＲＤ－０２の間に生成されたＩＣＢから開始された番号ＥＲ－ＩＣＢＲＤ－０２の実行では、ＰＢＳホイールに塊は観察されなかった。進行中の実行とＩＣＢ実行との間のこれらの差は、１４日目のＩＣＢの凍結保存及び解凍は、ＧＭＰ施設におけるＯＰＣ１プロセスに有益であり、必要であると結論付けた。

バッチ番号ＥＲ－ＩＣＢＲＤ－０２は、試験されたアッセイで提案された全てのＩＰＣ及びバッチ放出基準を合格し、１４日目のＩＣＢの凍結保存を伴うフルスケールのＬＣＴＯＰＣ１バッチの製造が実行可能であることを承認した。このバッチである番号ＥＲ－ＩＣＢＲＤ－０２は、ＬＣＴＯＰＣ１ ＧＭＰプロセス及び放出細胞を代表する。

結論：番号ＥＲ－ＩＣＢＲＤ－０２は、ＧＭＰプロセスの代表的なバッチであり、ＬＣＴＯＰＣ１の細胞を放出し、バッチ放出のために提案された全ての基準に合格した。バッチ放出のための提案された基準を満たすフルスケールのＯＰＣ１細胞の製造は実行可能である。１４日目にＩＣＢを凍結保存し、凝集体形成のために播種前に解凍することは、細胞に有益であり、塊形成を防止する。

実施例６：ＯＰＣを産生するための１４日目の解凍細胞の分化。
この実施例の目的は、解凍細胞のＯＰＣへの分化条件の確立を実証することである。

実験手順：図１３は、ＯＰＣ分化プロトコルのステップを示す。

（表２８）試験条件

＊＊接着防止液で予備洗浄する－接着防止液は、１４～１６日目に凝集体がホイールの底に付着するのを防ぐと考えられた。後に、凝集体の損失の主な理由は、互いに付着する傾向があり、大きな塊が形成されたことが判明した。

ＨＥＳＣ培養（段階１）－Ｈ１ ｈＥＳＣ（ＰＩＬＯＴ－ＬＣＴ－Ｈ１－００２）を、ＬＮ５２１でコーティングされた容器上で３回の継代で培養した。ｐ３０＋６＋４＋２の終わりに、ＯＰＣ分化開始のために細胞を４日間播種した。

ＯＰＣ分化－段階１のｐ３０＋６＋４＋３の４日目に、ＯＰＣ分化が開始された。試験したあらゆる変化を表２８に詳細に示す。

０～３日目－細胞を、２μＭのドルソモルフィン、１０μＭのＰＤ０３２５９０１、及び１μＭのＲＡを補充したＧＰＭ培地中で培養し、毎日交換した。

４～６日目－１５０μＭのＡＡ、及び１μＭのＲＡを補充したＧＰＭ培地での培養を、毎日交換した。

７日目－細胞をＴＳで採取し、１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌのｈｓ－ＦＧＦ、及び１０μＭのＲＩを補充したＧＰＭ中で、ＬＮ５２１でコーティングされた容器に、２６，６６７個の生細胞／ｃｍ^２で播種した。

９～１３日目－１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、及び１０ｎｇ／ｍｌのｈｓ－ＦＧＦを補充したＧＰＭ培地中での培養を、２日ごとに交換した。

１４日目－細胞をＴＳで採取した。進行中の培養では、播種していない細胞をＣＳ１０で凍結保存した。

ＩＣＢ１４日目の解凍－細胞を解凍し、再懸濁し、計数し、１２８×１０^６個の生細胞を、１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌのｈｓ－ＦＧＦ、及び１０μＭのＲＩを補充した７０ｍｌのＧＰＭ培地に播種した。

１６～２０日目－１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、及び１０ｎｇ／ｍｌのｈｓ－ＦＧＦを補充したＧＰＭ培地の８０％で培養し、２日ごとに交換した。

２１日目－凝集体を、ＬＮ５２１でコーティングされた容器上で、２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、及び１０ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ－ＡＡを補充したＧＰＭ中の２１日目のラクタート測定（ラクタート濃度が１５．００ｍＭ未満の場合は７５ｃｍ^２で平滑化、又はラクタート濃度が１５．００ｍＭ以上の場合は１５０ｃｍ^２で平滑化）に従って平滑化した。

２３～２７日目－２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、及び１０ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ－ＡＡを補充したＧＰＭ培地中での培養を、２日ごとに交換した。

２８日目－細胞をＴＳで採取し、ＬＮ５２１でコーティングされた容器上で、４０，０００個の生細胞／ｃｍ^２で１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、及び１０ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ－ＡＡを補充したＧＰＭ中に播種した。

２９～３４日目－２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、及び１０ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ－ＡＡを補充したＧＰＭ培地中での培養を、２日ごとに交換した。

３５日目－細胞をＴＳで採取し、ＬＮ５２１でコーティングされた容器上で、４０，０００個の生細胞／ｃｍ^２で１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、及び１０ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ－ＡＡを補充したＧＰＭ中に播種した。

３６～４１日目－上記のように培養する。２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、及び１０ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ－ＡＡを補充したＧＰＭ培地を２日ごとに交換した。

４２日目－ＴＳによる細胞の採取及び凍結保存。

ＱＣ試験－フローサイトメトリー－ＦＡＣＳによるマーカーの分析を、表２９に従って、７日目、１４日目、２８日目、３５日目、及び４２日目に凍結保存された細胞上で実施した。

（表２９）ＦＡＣＳ染色

デコリン分泌－３５日目及び４２日目から凍結保存された細胞を、デコリン分泌について試験した。

受け入れ基準－ＯＰＣバッチを評価するためのアッセイが、プロセスとともに開発されたため、成功したバッチは、以下の基準に従って定義された：純度マーカー（ＰＤＧＦＲα）＞９５．００％、不純物マーカー（Ｃｌａｕｄｉｎ、ＥｐＣＡＭ、ＣＫ７）＜２．００％、デコリン分泌（４２日目の細胞）＞２５．００ｎｇ／ｍｌ、形態－小細胞及び小型細胞、細長い紡錘状の形態の不在。

結果：継代パラメータ各継代において、収量及びＰＤＬ値は、以下の式に従って計算した：

（表３０）継代パラメータ ２１～３５日目。全てのＩＣＢ１４の実行は以下になる。

（表３１）継代パラメータ ４２日目。全てのＩＣＢ１４の実行は以下になる。

いくつかの類似性は、主に２１日目及び２８日目のラクタート濃度で、ＲＤ実行の継代パラメータと、それらの誘導体、ＩＣＢ実行との間に見出すことができ、他の全てのパラメータは、許容値を示した。２８日目の実行番号１０．１群での生存の低さは、手作業での操作に関連している。

マーカー発現－各継代において、収量及びＰＤＬ値は、以下の式に従って計算した：

（表３２）２８日目のマーカー発現。全てのＩＣＢ１４の実行は以下になる。

（表３３）３５日目のマーカー発現。全てのＩＣＢ１４の実行は以下になる。

（表３４）４２日目のマーカー発現。全てのＩＣＢ１４の実行は以下になる。

＊失敗した実行のマーカー発現は、受け入れ基準の範囲外である。

実行１０．１のＢ群以外の全てのＩＣＢ群は、４２日目にマーカー発現についての提案された受け入れ基準を満たし、１４日目の凍結保存及び解凍手順が、細胞又はＯＰＣ１分化プロセスに害を及ぼさないことを示した。実行１０．１のＢ群については、接着防止液を用いたＰＢＳホイール処理はプロセスを改善せず、ＧＭＰ施設における最終ＯＰＣ１プロセスに適格ではない。

有効性アッセイ－３５日目及び４２日目のデコリン分泌が表３５に提示される。

（表３５）デコリン分泌。全てのＩＣＢ１４の実行は以下になる。

全ての群のデコリン分泌は、４２日目に２５ｎｇ／ｍｌを超え、予想される基準を満たした。

形態－３５日目から開始して、成功した群及び失敗した群の培養は、異なる形態によって異なる。図１４及び図１５では、進行中の実行の形態の写真が、ＩＣＢ解凍細胞と比較して提示されている。３５日目及び４２日目に、細胞は、小型で高密度な細胞として組織化され、紡錘状の「失敗した」形態を取得しなかった。

起源の実行と、それらの誘導されたＩＣＢとの間の明確な２１日目の凝集体の形態的類似性が、図１４に提示される。

考察：ＯＰＣ１分化プロセス中の１４日目のＩＣＢの凍結保存は、実行の失敗をもたらしたＰＢＳホイール内の塊形成の低減、同じＩＣＢからの複数のバッチの製造などの大きな潜在的利点を保持し、９週間の長いプロセスの柔軟性を可能にする。結果は、進行中の完全な実行及びそれらの１４日目のＩＣＢ由来の実行の両方から産生されたＯＰＣ１細胞が、ＯＰＣ集団についての予想される基準を取得したことを示した。

この報告では、１４日目の解凍された細胞の分化の結果を、起源の進行中の群と比較して要約する。継代パラメータ、マーカー発現及び有効性アッセイ（デコリン分泌）は、実行１０．１のＢ群以外で、１４日目に解凍された全ての細胞が、ＯＰＣ１細胞について提案された受け入れ基準を満たすことを示した。実行１０．１のＢ群については、１４日目に細胞を播種する前に、ＰＢＳホイールを接着防止溶液で前処理した。この処理は、ＧＰＭでの事前充填と比較してプロセスに明確な利点を示さなかったため、プロセスでこの材料を使用しないことが決定された。加えて、本明細書に記載されるＩＣＢ凍結保存手順を実施すると、回収％が７５％～９２％に改善されたことが見出された（表２８を参照されたい）。手順はＣＣＮ ＯＰＣ１プロセスで実施されるであろう。

結論：１４日目は、ＯＰＣ１分化プロトコルについてのブレイクポイントであり得る。１４日目のＩＣＢ細胞は、ＰＢＳホイールに直接解凍させ、進行中のプロトコルの確立されたプロセスを継続することができる。１４日目のＩＣＢは、１４～２１日目の凝集ステップにおける沈着物の減少において明らかな利点を示す。凍結保存が本明細書に記載の方法に従って行われた場合、解凍１４日目での解凍後の回収がより良好に得られた。

参考文献
Ｄｕｅｓｔｅｒ，Ｇ．（２００８）．”Ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｕｒｉｎｇ ｅａｒｌｙ ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．”Ｃｅｌｌ １３４（６）：９２１－９３１．
Ｈｕ，Ｂ．Ｙ．，Ｚ．Ｗ．Ｄｕ，Ｘ．Ｊ．Ｌｉ，Ｍ．Ａｙａｌａ ａｎｄ Ｓ．Ｃ．Ｚｈａｎｇ（２００９）．”Ｈｕｍａｎ ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅｓ ｆｒｏｍ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ＳＨＨ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｎｅｔｗｏｒｋｓ ａｎｄ ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ ＦＧＦ ｅｆｆｅｃｔｓ．”Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３６（９）：１４４３－１４５２．
Ｊａｎｅｓｉｃｋ，Ａ．，Ｓ．Ｃ．Ｗｕ ａｎｄ Ｂ．Ｂｌｕｍｂｅｒｇ（２０１５）．”Ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．”Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ７２（８）：１５５９－１５７６．
Ｋｏｃｈ，Ｕ．，Ｒ．Ｌｅｈａｌ ａｎｄ Ｆ．Ｒａｄｔｋｅ（２０１３）．”Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｌｉｖｉｎｇ ｗｉｔｈ ａ Ｎｏｔｃｈ．”Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １４０（４）：６８９－７０４．
Ｋｕｄｏｈ，Ｔ．，Ｓ．Ｗ．Ｗｉｌｓｏｎ ａｎｄ Ｉ．Ｂ．Ｄａｗｉｄ（２００２）．”Ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｒｏｌｅｓ ｆｏｒ Ｆｇｆ，Ｗｎｔ ａｎｄ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ｐｏｓｔｅｒｉｏｒｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｎｅｕｒａｌ ｅｃｔｏｄｅｒｍ．”Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２９（１８）：４３３５－４３４６．
Ｌｉ，Ｙ．ａｎｄ Ｍ．Ｍ．Ｐａｒａｓｔ（２０１４）．”ＢＭＰ４ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．”Ｉｎｔ Ｊ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ５８（２－４）：２３９－２４６．
Ｏｔａ，Ｍ．ａｎｄ Ｋ．Ｉｔｏ（２００６）．”ＢＭＰ ａｎｄ ＦＧＦ－２ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ－２ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｎｓｏｒｙ ｎｅｕｒｏｎｓ ａｎｄ ｇｌｉａ．”Ｄｅｖ Ｄｙｎ ２３５（３）：６４６－６５５．
Ｐａｔｔｈｅｙ，Ｃ．ａｎｄ Ｌ．Ｇｕｎｈａｇａ（２０１４）．”Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｅｃｔｏｄｅｒｍａｌ ｃｅｌｌ ｆａｔｅ ｃｈｏｉｃｅｓ．”Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ３２１（１）：１１－１６．
Ｓｕｉ，Ｌ．，Ｌ．Ｂｏｕｗｅｎｓ ａｎｄ Ｊ．Ｋ．Ｍｆｏｐｏｕ（２０１３）．”Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ ｄｕｒｉｎｇ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ａｎｄ ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ ｅｎｄｏｄｅｒｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．”Ｉｎｔ Ｊ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ５７（１）：１－１２．
Ｗａｔａｂｅ，Ｔ． ａｎｄＫ．Ｍｉｙａｚｏｎｏ（２００９）．”Ｒｏｌｅｓ ｏｆ ＴＧＦ－ｂｅｔａ ｆａｍｉｌｙ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｒｅｎｅｗａｌ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．”Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ １９（１）：１０３－１１５．
Ｚｈｅｎｇ，Ｗ．，Ｑ．Ｌｉ，Ｃ．Ｚｈａｏ，Ｙ．Ｄａ，Ｈ．Ｌ．Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｚ．Ｃｈｅｎ（２０１８）．”Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ Ｆｒｏｍ ｈｉＰＳＣｓ：Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ｔｈｅｒａｐｙ．”Ｆｒｏｎｔ Ｃｅｌｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １２：２３９．

本明細書に提供される全ての参考文献（全ての非特許文献、特許、及び特許刊行物を含む）は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (38)

1. 未分化多能性幹細胞から乏突起膠細胞前駆細胞（ＯＰＣ）の集団を得るための方法であって、
   ａ）未分化多能性ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）の培養物を得ることと、
   ｂ）前記ｈＥＳＣの神経外胚葉細胞及び神経前駆細胞への分化を誘導するのに十分な培養条件下で、前記未分化多能性ｈＥＳＣを第１の期間培養することと、
   ｃ）前記神経前駆細胞をＯＰＣに分化させるのに十分な培養条件下で、ステップｂ）からの前記神経前駆細胞を第２の期間培養することと
   を含む、方法。
2. ステップｂ）における前記多能性細胞が、接着組織培養容器中、若しくは懸濁複合体中、又は両方において、ラミニン上で培養される、請求項１に記載の方法。
3. 前記多能性幹細胞が、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）である、請求項１に記載の方法。
4. 前記多能性幹細胞が、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）である、請求項１に記載の方法。
5. ステップｂ）の前記未分化ｈＥＳＣが、ドルソモルフィン、ＰＤ０３２５９０１、及びＲＡの存在下で培養される、請求項１に記載の方法。
6. ＡＡ及びＲＡの存在下で培養するステップを更に含む、請求項５に記載の方法。
7. ステップｂ）からの前記神経外胚葉細胞が、ＥＧＦ及びｈｓｂＦＧＦの存在下で培養される、請求項１に記載の方法。
8. ＥＧＦ及びＰＤＧＦ－ＡＡの存在下で培養するステップを更に含む、請求項７に記載の方法。
9. 前記第１の期間が、約３日～約６０日である、請求項１に記載の方法。
10. 前記第１の期間が、約１０日～約１５日である、請求項９に記載の方法。
11. 前記第１の期間が、約１４日である、請求項９に記載の方法。
12. 前記第２の期間が、約１０日～約６０日である、請求項１に記載の方法。
13. 前記第２の期間が、約２０日～約４０日である、請求項１２に記載の方法。
14. 前記第２の期間が、約２８日である、請求項１２に記載の方法。
15. ステップｂ）における分化ｈＥＳＣが、約１４日目に凍結保存される、請求項１に記載の方法。
16. 凍結保存された細胞が、解凍され、続いて解凍された細胞が、前記方法の任意の残りのステップで培養される、請求項１５に記載の方法。
17. 前記第１の期間の完了時、又は前記第１の期間のほぼ完了時に、ステップｂ）からの前記神経前駆細胞を凍結保存するステップを含む、請求項１５に記載の方法。
18. 凍結保存された神経外胚葉細胞が、解凍され、ステップｃ）に従って培養される、請求項１６に記載の方法。
19. ステップｃ）の前記ＯＰＣが、凍結保存される、請求項１４に記載の方法。
20. 凍結保存されたＯＰＣが、解凍される、請求項１９に記載の方法。
21. 前記ＯＰＣが、神経／グリア抗原２（ＮＧ２）、血小板由来成長因子受容体Ａ（ＰＤＧＦＲα）、及び血小板由来成長因子受容体Ｂ（ＰＤＧＦＲβ）から選択される１つ以上のマーカーを発現する、請求項１に記載の方法。
22. 解凍直後に対象へ投与するための乏突起膠細胞前駆細胞（ＯＰＣ）組成物を製剤化する方法であって、
    （ａ）凍結保存培地中に請求項１に記載のＯＰＣを懸濁して、細胞懸濁液を形成することと、
    （ｂ）前記細胞懸濁液を凍結保存温度で保存することと、
    （ｃ）前記凍結保存された懸濁液を解凍することと
    を含む、方法。
23. 前記凍結保存培地が、アデノシン、デキストラン－４０、ラクトビオン酸、ＨＥＰＥＳ（Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－Ｎ’－（２－エタンスルホン酸））、水酸化ナトリウム、Ｌ－グルタチオン、塩化カリウム、重炭酸カリウム、リン酸カリウム、デキストロース、スクロース、マンニトール、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、及び水のうちの１つ以上を含む、請求項２２に記載の方法。
24. 対象に投与するための医薬組成物であって、請求項１に記載のＯＰＣ及び凍結保存培地を含む、医薬組成物。
25. 前記凍結保存培地が、アデノシン、デキストラン－４０、ラクトビオン酸、ＨＥＰＥＳ（Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－Ｎ’－（２－エタンスルホン酸））、水酸化ナトリウム、Ｌ－グルタチオン、塩化カリウム、重炭酸カリウム、リン酸カリウム、デキストロース、スクロース、マンニトール、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、及び水のうちの１つ以上を含む、請求項２４に記載の医薬組成物。
26. 対象における脊髄損傷を治療するための方法であって、治療有効量の請求項２２に記載の組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
27. 前記投与することが、前記組成物を、脊髄損傷部位内に、又は脊髄損傷部位に隣接して、投与することを含む、請求項２６に記載の方法。
28. 投与することが、注射による、請求項２６に記載の方法。
29. 前記投与することが、埋め込みによる、請求項２６に記載の方法。
30. 前記投与することが、移植による、請求項２６に記載の方法。
31. 細胞の濃度が、１ｍＬ当たり約１×１０^６個の細胞～１ｍＬ当たり約１００×１０^６個の細胞である、請求項２６に記載の医薬組成物。
32. 約１００マイクロリットル～約１ミリリットルの体積で保存される、請求項２６に記載の医薬組成物。
33. 細胞の濃度が、１ｍＬ当たり１００×１０^６個の細胞である、請求項２６に記載の医薬組成物。
34. ２５０マイクロリットルの体積で保存される、請求項２６に記載の医薬組成物。
35. ３００マイクロリットルの体積で保存される、請求項２６に記載の医薬組成物。
36. 前記凍結保存培地が、凍結溶液である、請求項２６に記載の医薬組成物。
37. 凍結溶液が、ＣｒｙｏＳｔｏｒ１０（ＣＳ１０）である、請求項２６に記載の医薬組成物。
38. 前記ＯＰＣが、神経／グリア抗原２（ＮＧ２）、血小板由来成長因子受容体Ａ（ＰＤＧＦＲα）、及び血小板由来成長因子受容体Ｂ（ＰＤＧＦＲβ）から選択される１つ以上のマーカーを発現する、請求項２６に記載の医薬組成物。

Images