CN111187750B - 生物胺诱导多功能干细胞向心肌细胞分化的方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用生物胺促进诱导多功能干细胞向心肌细胞分化和成熟的方法与应用。本发明在固定的时间点向多能干细胞向心肌细胞诱导分化的体外培养物中加入组胺，诱导多功能干细胞向心肌细胞分化和成熟。并提供了检测组胺促进ips分化成心肌细胞的时间和浓度的方法。本方法成熟，操作简单，环境友好；此方法获得的细胞具有心肌细胞的特征性细胞表面标志和形态标志，能够自发性地周期性收缩，适用于心脏病的研究、药物筛选和细胞治疗等多种应用。

Description

生物胺诱导多功能干细胞向心肌细胞分化的方法与应用

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体涉及获得人心肌前体细胞和成熟心肌细胞系的方法与应用。

背景技术

目前，诱导心肌分化的方法主要有两种，一种是诱导性多能干细胞(inducedpluripotent stem cells，iPSCs)单层细胞培养法，即iPSCs在铺有基质胶的培养皿内培养，通过添加某些小分子化合物来调控心肌分化关键信号通路，以获得跳动的心肌细胞。另一种是形成类似胚胎结构的含有多种类型细胞的结构，即拟胚体法(EBs),EBs法诱导心肌分化过程是iPSCs纯化后经过数天的悬浮培养以诱导EBs形成，随后转移到明胶包被的培养皿中进行贴壁培养。EBs中细胞种类多，包括内、中、外三个胚层的细胞。目前从技术上可以使iPSCs分化为搏动心肌细胞，EBs方法模拟体内心肌分化的过程，更符合体内心肌分化的过程，但这种方法获得心肌细胞的分化效率和细胞纯度较低。iPSCs单层细胞培养法通过程序性调控Wnt,BMP等信号通路，在分化时间上更具有可操控性，可以具体到分化的各个主要阶段。随着研究的深入及技术的发展，细胞培养的方式得到改良和优化，如联合使用激活素A(activin A)、骨形态生成蛋白4(BMP4)、成纤维细胞生长因子2(FGF2)或血管细胞生长因子(VEGF)等多种药物或生长因子可一定程度提高iPSCs源心肌的诱导分化效率，此外通过共培养的技术也能实现分化效率的一定提高。但总体来说，单层细胞方法分化培养时间长，培养基(生长因子)价格昂贵，一定程度地限制了多能干细胞向心肌细胞分化技术的应用。

目前研究认为，iPSCs来源的心肌细胞类似于胎儿或胚胎期CMs,结构及功能上具有不成熟性，是制约其基础研究及临床应用的重要原因之一。大量的研究致力于探索促进分化心肌成熟的方法，例如通过延长体外培养的时间，机械和电刺激培养，添加化学因子等，但都有各自比较严重的缺陷。如体外延长培养时间不仅耗时耗力，而且细胞容易污染；给与机械和电刺激模拟在体心肌的微环境，具有一定的可行性，但效率不高；研究模拟体内心肌的生长环境给予不同的基质，发现能促进心肌的成熟及心肌线粒体的稳态，但这些基质价格贵且操作不够便捷。通过添加某些关键的化学因子促进心肌成熟，不仅简单易操作，而且可以通过高通量筛选具有明显促成熟的一些化学因子，特别是天然存在的，生物体内源性的一些小分子物质，更加符合心肌自然分化与成熟的过程。目前有研究报导维甲酸能显著促进iPSCs向心肌细胞分化，激素类如甲状腺素和G-CSF等可以促进分化心肌成熟。

组胺(histamine)是由组氨酸脱羧酶(histidine decarboxylase HDC)催化组氨酸(histidine)脱羧生成的小分子生物胺。组胺通过作用于细胞表面的组胺受体，激活相应的细胞内信号通路进而发挥生物学效应，广泛参与生物体病理生理过程。除了在免疫调节及神经信号传递，胃酸分泌和免疫细胞分化等过程中发挥重要作用。本专利申请人前期研究中首先发现HDC在CD11b+不成熟髓系细胞高表达，而且内源性组胺缺失能够促进炎症相关肠癌的发生、发展，首先提出“内源性组胺是一种抑瘤因子”的科学假说。近期研究又发现内源性组胺缺乏HDC基因敲除小鼠心梗后心脏功能损害加重，早期外源性补充适当浓度的组胺能有效保护心肌损伤和心室重构。机制研究发现组胺受体H1R和H2R信号参与了组胺在调控免疫细胞功能和保护缺血性心血管疾病的作用。组胺参与造血细胞生成和神经细胞分化等过程，但组胺在心肌干细胞分化及心脏发育中的作用及机制，目前还没有相关研究报道。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种可丰富和改善现有的多能干细胞向心肌细胞分化成熟的方法，以达到缩短获得心肌细胞所需时间，提高获得的心肌细胞成熟度，增强移植的心肌细胞抗低氧、炎症损伤的能力，并可显著降低获得较大数量心肌细胞的成本的方法。

本发明提供的能更高效地诱导多能干细胞分化成为心肌前体细胞和成熟心肌细胞的方法，具体为一种用生物胺促进诱导多功能干细胞向心肌细胞分化和成熟的方法，即通过在固定的时间点向常用的多能干细胞向心肌细胞诱导分化的体外培养物中加入适量浓度的组胺，诱导多功能干细胞向心肌细胞分化和成熟。

进一步的，本发明采用的组胺优选为二盐酸组胺。

进一步的，本发明采用的组胺的浓度范围为10^-7～10^-5M，优先浓度为10^-5M。

进一步的，本发明的分化时间优选为3-5天。

下面对本发明做进一步的详细说明。

本发明采用分化效率高的化学成分既定法即通过调控Wnt信号通路来调控心肌分化的方法诱导心肌分化，首先我们在心肌分化的全程中给与不同浓度的组胺，通过检测多个心肌分化标志NKX2.5、a-actinin、cTnI、cTnT、MYH6和MYH7基因及蛋白表达，发现组胺在一定浓度范围内(10^-7～10^-5M)可以促进iPSC向心肌分化，并且在10^-5M浓度下这种促分化效果更明显。进一步探究组胺发挥促进心肌分化的具体时间阶段，在iPSC诱导分化的不同时间加入10^-5M浓度的组胺，通过检测心肌分化不同阶段标志基因BRACHYURY、MESP1、NKX2.5、GATA4、MEF2C及蛋白表达，发现在化学成分既定法的第3到5天给予10^-5M组胺可以明显促进心肌前体细胞的得率，随后分化得来的心肌细胞结构及功能更加成熟。

检测组胺促进ips分化成心肌细胞的关键时间窗和浓度，具体方法如下：

a)在包被matigel胶的培养皿加入适量mTESR培养基，按1/1000比例加入Y试剂，即Y27632 s1049 selleck,ROCK inhibitor10uM，将消化好或复苏好的ips细胞加入其中，轻轻混匀，镜下观察，放入37℃细胞培养箱内；

b)2小时后去掉培养液，加入不含Y试剂的mTESR培养基即可；

c)每4天传代一次，具体根据细胞状态；细胞密度达到80-90％时开始分化；去除培养皿内的培养基，D-PBS洗一遍；加入8umol/L CHIR(GSK3β抑制剂s2924selleck)的RPMI1640+B27minus insulin(GIBCO,A18956-01)的培养基，分化48小时；

d)去除培养基，加入新鲜B27minusinsulin培养基24小时；去掉培养液，加入新的含5umol/L IWR-1抑制剂的RPMI1640+B27minus insulin培养基；分化48小时，之后换RPMI1640+B27minus insulin培养基两天，期间不用换液；7天后，分化好之后，换RPMI1640+B27with insulin的培养基；以后每3天换一次液体；

e)按上述方法分别在分化开始的不同天数的培养基中分别加入不同浓度组胺；

f)分析心肌细胞跳动面积、频率、心肌细胞标志物a-MHC和cTNT表达量，检测不同浓度的组胺对iPSC向心肌分化的促进效应。

按上述方法分别在分化开始至第七天的培养基中分别加入10^-4M、10^-5M、10^-6M组胺，第十天分析心肌细胞跳动面积、频率、心肌细胞标志物a-MHC和cTNT表达量，检测到10^-5M浓度的组胺对iPSC向心肌分化有最大最经济的促进效应。

按上述方法分别在分化开始至第七天、分化开始至第三天、分化第三天至第五天、分化第五天至第七天的培养基中分别加入10^-5M组胺，第十天分析心肌细胞跳动面积、频率、心肌细胞标志物a-MHC和cTNT表达量，检测到在分化第三天至第五天加入10^-5M组胺对iPSC向心肌分化有最大最经济的促进效应。

此外，组胺发挥胞内作用是通过相应的组胺受体，组胺1型受体拮抗剂pyrilamine降低心肌分化效率，还可以明显逆转组胺促心肌前体细胞产生及心肌细胞成熟的作用。进一步，我们将用组胺预处理的iPSC源心肌细胞多点注射到心梗小鼠心脏中，发现组胺预处理iPSC源心肌细胞组小鼠心肌细胞驻留及存活率更高，心功能改善明显。。在研究组胺促进多能干细胞向心肌分化分子通路的过程中，本发明还发现ERK1/2和STAT3信号激动剂具有促进多功能干细胞向心肌前体细胞分化的功能。

本发明方法获得的iPSC源心肌细胞，可应用于：(1)进行心肌细胞功能、特性、通路检测研究；(2)应用于药物毒理学和新药研发分子；(3)高效获得高分化成熟度的心肌细胞，未来可能应用于临床上心肌梗死相关疾病治疗。

本发明的优益效果在于：

本发明通过在固定的时间点向常用的多能干细胞向心肌细胞诱导分化的体外培养物中加入适量浓度的组胺，可显著促进多能干细胞向心肌细胞分化和成熟，缩短体外诱导心肌细胞(iPS-CM)分化的时间，提高成熟心肌细胞的产率，并增强移植到缺血心肌组织内的iPS-CM的存活率。

本发明所使用的组胺为小分子生物活性分子，我们的前期研究证明合成内源性组胺的关键酶——组氨酸脱羧酶(Hisitidine decarboxylase,HDC)在造血干细胞、髓系干细胞和不成熟髓系前体细胞有时空特异的表达，组胺在免疫细胞的增殖与分化中发挥了关键的作用。本发明提供了一种更高效、更便捷、更经济的获得大量心肌细胞的方法。组胺是体内天然存在的小分子物质，其诸多特性已被研究发现，化学合成技术成熟，可获得高纯度的固态组胺，便于保存，这些更增添了本发明使用的安全性、可靠性，以及本发明实现工业化应用的可行性。

本发明优选应用的二盐酸组胺(Histamine Dihydrochloride)目前合成工艺成熟，操作简单，环境友好，相比前述研究使用的各种生长因子，不仅经济实惠，而且作用机制较为清楚，特异性更好。

此方法获得的细胞具有心肌细胞的特征性细胞表面标志和形态标志，能够自发性地周期性收缩，适用于心脏病的研究、药物筛选和细胞治疗等多种应用。

本发明将极大地丰富和优化目前的干细胞向心肌细胞诱导分化的技术，促进干细胞向心肌细胞诱导分化技术在相关领域的应用，在心肌疾病诊断、药物筛选和治疗应用方面具有相当好的前景。

附图说明

图1为实施例1的实验结果图，其中：

A--将人源iPSCs诱导为心肌细胞的方案操作时间点的示意图；

B--在第10天，不同浓度组胺处理下，人源iPSCs分化为跳动心肌细胞的百分比；

C--在第10天，不同浓度组胺处理下，心肌分化标志基因NKX2.5、cTnT、MYH6和MYH7的表达水平；

D--不同时间段组胺处理的分化方案示意图(左图)；相应的人源ipsc心脏分化效率统计结果(右图)；

E--分化后第3、5、7天心肌细胞的代表性明场图；

F--组胺处理后心肌标志物nkx2.5和cTnI免疫荧光共染代表图。

图2为实施例2的实验结果图，其中：

A--免疫印迹检测心肌分化过程中组胺受体H1R和H2R蛋白水平的动态变化；

B—流式分析检测组胺受体1拮抗剂吡拉明对人源iPSC向心肌分化的影响；

C—免疫印迹检测组胺对心肌分化标记物及ERK1/2表达和磷酸化的影响；

D--免疫印迹检测组胺受体1拮抗剂吡拉明对心肌分化标记物及ERK1/2表达和磷酸化的影响；

E--免疫印迹检测ERK1/2磷酸化抑制剂AS703026对心肌分化标记物表达的影响；

F--流式分析检测ERK1/2磷酸化抑制剂AS703026对人源iPSC向心肌分化的影响；

G--免疫印迹检测组胺对心肌分化标记物及STAT3表达和磷酸化的影响；

H--流式分析检测STAT3磷酸化抑制剂c188-9对人源iPSC向心肌分化的影响；

图3为实施例3的实验结果图，其中：

A--PBS或组胺干预处理的人源iPSC分化而来的心肌细胞植入心梗小鼠或假手术组小鼠2周后小鼠的代表性M型超声心动图；

B--PBS或组胺干预处理的人源iPSC分化而来的心肌细胞植入心梗小鼠或假手术组小鼠2周后小鼠心功能指标。EF，射血分数；FS，分数缩短；

C--给PBS或组胺干预处理的hiPSC分化而来的心肌细胞植入心梗小鼠或假手术组小鼠2周后小鼠心脏组织的代表性Masson三色染色及心肌梗死面积的定量结果；

D--PBS或组胺干预处理的人源iPSC分化而来的心肌细胞经染料CM-Dil(红色)标记后，植入心梗小鼠或假手术组小鼠2周后，心脏冰冻切片检测统计细胞存留率。

图4为实施例4的实验结果图，其中：

A--组胺(his)、H1R拮抗剂(吡拉明)和H2R拮抗剂(西咪替)处理斑马鱼卵孵化后斑马鱼的Kaplan-Meier生存分析；

B--组胺(his)、H1R拮抗剂(吡拉明)和H2R拮抗剂(西咪替)处理斑马鱼卵96小时后胚胎心脏形态的代表性图；

C--组胺(his)、H1R拮抗剂(吡拉明)和H2R拮抗剂(西咪替)处理斑马鱼卵后不同时间点的斑马鱼心率统计图；

D--组胺(his)、H1R拮抗剂(吡拉明)和H2R拮抗剂(西咪替)处理cmlc2-mCherry转基因斑马鱼，斑马鱼心脏冰冻切片代表性心脏图像。

具体实施方式

以下结合附图对本发明作进一步的描述。根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施案例所描述的内容仅用于说明和解释本发明，并不用于限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1

检测组胺促进ips分化成心肌细胞的关键时间窗和浓度。

组胺为二盐酸组胺。

在包被matigel胶的培养皿加入适量mTESR培养基，按1/1000比例加入Y试剂(Y27632 s1049 selleck,ROCK inhibitor10uM)，将消化好或复苏好的ips细胞加入其中，轻轻混匀，镜下观察(细胞团块不可太小，也不可太大)放入37℃细胞培养箱内。2小时后去掉培养液，加入不含Y试剂的mTESR培养基即可，以后每4天传代一次即可，具体根据细胞状态。细胞密度达到80-90％时开始分化。去除培养皿内的培养基，D-PBS洗一遍。加入8umol/LCHIR(GSK3β抑制剂s2924selleck)的RPMI1640+B27minus insulin(GIBCO,A18956-01)的培养基，分化48小时。之后去除培养基，加入新鲜B27minusinsulin培养基24小时；去掉培养液，加入新的含5umol/L IWR-1抑制剂的RPMI1640+B27minus insulin培养基。分化48小时，之后换RPMI1640+B27minus insulin培养基两天，期间不用换液。7天后，分化好之后，换RPMI1640+B27with insulin的培养基。以后每3天换一次液体。

按上述方法分别在分化开始至第七天的培养基中分别加入10^-4M、10^-5M、10^-6M组胺，第十天分析心肌细胞跳动面积、频率、心肌细胞标志物a-MHC和cTNT表达量，检测到10^-5M浓度的组胺对ips向心肌分化有最大最经济的促进效应见图1中A、B、C。其中：A为将人源iPSCs诱导为心肌细胞的方案操作时间点的示意图；B为在第10天，不同浓度组胺处理下，人源iPSCs分化为跳动心肌细胞的百分比图；C为在第10天，不同浓度组胺处理下，心肌分化标志基因NKX2.5、cTnT、MYH6和MYH7的表达水平。

按上述方法分别在分化开始至第七天、分化开始至第三天、分化第三天至第五天、分化第五天至第七天的培养基中分别加入10^-5M组胺，第十天分析心肌细胞跳动面积、频率、心肌细胞标志物a-MHC和cTNT表达量，检测到在分化第三天至第五天加入10^-5M组胺对ips向心肌分化有最大最经济的促进效应见图1中D、E、F。其中：D为不同时间段组胺处理的分化方案示意图(左图)；相应的人源ipsc心脏分化效率统计结果(右图)；E为分化后第3、5、7天心肌细胞的代表性明场图；比例尺100μM；F为组胺处理后心肌标志物nkx2.5和cTnI免疫荧光共染代表图，比例尺100μM。

实施例2

检测组胺促进ips分化成心肌细胞的下游通路。

按上述方法，在ips向心肌分化第十天，收集细胞提取蛋白和RNA，检测组胺受体1和2的表达，检测组胺经典下游通路ERK1/2表达及磷酸化变化，检测了ERK1/2经典下游靶分子STAT3的表达及磷酸化。

按上述方法，在ips向心肌分化第三天至第五天，在加入组胺的同时分别加入组胺受体抑制剂1、ERK1/2磷酸化抑制剂、STAT3磷酸化抑制剂，第十天分析心肌细胞跳动面积、频率、心肌细胞标志物a-MHC和cTNT表达量，同时流式检测a-MHC和cTNT双阳性心肌细胞比例。

实验结果见图2。其中：A为免疫印迹检测心肌分化过程中组胺受体H1R和H2R蛋白水平的动态变化；B为流式分析检测组胺受体1拮抗剂吡拉明对人源iPSC向心肌分化的影响；C为免疫印迹检测组胺对心肌分化标记物及ERK1/2表达和磷酸化的影响；D为免疫印迹检测组胺受体1拮抗剂吡拉明对心肌分化标记物及ERK1/2表达和磷酸化的影响；E为免疫印迹检测ERK1/2磷酸化抑制剂AS703026对心肌分化标记物表达的影响；F为流式分析检测ERK1/2磷酸化抑制剂AS703026对人源iPSC向心肌分化的影响；G为免疫印迹检测组胺对心肌分化标记物及STAT3表达和磷酸化的影响；H为流式分析检测STAT3磷酸化抑制剂c188-9对人源iPSC向心肌分化的影响。

实施例3

检测组胺诱导分化的心肌细胞对心梗的修复效应。

BALB/C雄性小鼠吸入异氟醚麻醉，用22g静脉导管插管，然后用1-2％异氟醚气体完全麻醉，同时用正压呼吸机机械通气。左胸小切口暴露心脏，用8-0丝线结扎LAD冠状动脉；在ips向心肌分化第三天至第五天加入组胺或PBS，细胞分化至第十天后，消化离心收集细胞用红色染料(Dil，激发/发射＝644/665nm，Sigma–Aldrich)进行标记。随后将30μL的细胞悬液(2x10⁵)注入梗死心肌的边缘区，分三个位点注射每只小鼠。为减少MI小鼠的免疫排斥反应，在给MI小鼠注射细胞后提供Cyspin。两周后，超声心动检测小鼠心功能见图3中A、B，其中：A为PBS或组胺干预处理的人源iPSC分化而来的心肌细胞植入心梗小鼠或假手术组小鼠2周后小鼠的代表性M型超声心动图；B为PBS或组胺干预处理的人源iPSC分化而来的心肌细胞植入心梗小鼠或假手术组小鼠2周后小鼠心功能指标：EF，射血分数；FS，分数缩短；后摘取心脏，石蜡包埋切片，荧光拍照检测细胞滞留情况见图3中D：D为PBS或组胺干预处理的人源iPSC分化而来的心肌细胞经染料CM-Dil(红色)标记后，植入心梗小鼠或假手术组小鼠2周后，心脏冰冻切片检测统计细胞存留率。比例尺100μM。数据表示为平均值±扫描电镜。*与对照组相比，p<0.05，**p<0.01(每组n＝7)，以及马松染色检测心肌纤维化情况见图3中C：C为给PBS或组胺干预处理的hiPSC分化而来的心肌细胞植入心梗小鼠或假手术组小鼠2周后小鼠心脏组织的代表性Masson三色染色及心肌梗死面积的定量结果。

实施例4

检测组胺及其受体拮抗剂对斑马鱼心脏发育影响。

选择发育正常的心脏特异红光(cmlc2:mCherry)标记的6hpf(hours postfertlization)斑马鱼胚胎暴露于组胺、组胺受体拮抗剂1和组胺受体拮抗剂2中48小时。显微镜观察72hpf斑马鱼心血管系统的形态学改变。通过DVC摄像系统测定心率；,HE染色观察斑马鱼心肌结构。结果显示组胺和组胺受体拮抗剂2处理组斑马鱼心血管系统形态无改变；组胺受体拮抗剂1可引起斑马鱼出现心包水肿,心脏畸形,心率减低，生存率下降见图4中A、B和C，其中：A为组胺(his)、H1R拮抗剂(吡拉明)和H2R拮抗剂(西咪替)处理斑马鱼卵孵化后斑马鱼的Kaplan-Meier生存分析；B为组胺(his)、H1R拮抗剂(吡拉明)和H2R拮抗剂(西咪替)处理斑马鱼卵96小时后胚胎心脏形态的代表性图；红点圆圈显示心脏形态；C为组胺(his)、H1R拮抗剂(吡拉明)和H2R拮抗剂(西咪替)处理斑马鱼卵后不同时间点的斑马鱼心率统计图(每组n＝15)。心脏组织切片显示，组胺受体拮抗剂1处理可引起斑马鱼心房腔变大、房室间隔缺损见图4中D，D为组胺(his)、H1R拮抗剂(吡拉明)和H2R拮抗剂(西咪替)处理cmlc2-mCherry转基因斑马鱼，斑马鱼心脏冰冻切片代表性心脏图像；白色虚线圆圈显示心房扩大，白色箭头显示房间隔缺损(上图)。下图为斑马鱼心脏H&E染色图像，蓝色圆圈显示心脏形态(n＝10)。比例尺100mM。

实施例5：

组胺诱导的心肌细胞的药理学反应。

使用实施例1的方法，在ips向心肌分化的第三到第五天加入10^-5M组胺，诱导分化至第20天，加入异丙肾上腺素处理，检测心肌细胞对异丙肾上腺素的应激反应，组胺诱导分化的心肌细胞对异丙肾上腺素有更灵敏的反应，更适合用于药物毒性筛选。

实施例6：

组胺、ERK1/2磷酸化激动剂、STAT3磷酸化激动剂均可作为分化因子。

按实施例2，组胺促进ips向心肌细胞分化，是通过促进ERK1/2磷酸化和STAT3磷酸化达到的；由此ERK1/2磷酸化激动剂、STAT3磷酸化激动剂均可在分化第三至第五天加入，成为促进心肌分化的可选因子。

Claims (6)

1.生物胺诱导多功能干细胞向心肌细胞分化的方法，其特征在于，在固定的时间点向多能干细胞向心肌细胞诱导分化的体外培养物中加入组胺，诱导多功能干细胞向心肌细胞分化和成熟；所述组胺的浓度范围为10^-7~10^-5M；所述的加入组胺的时间点为分化的第3-5天。

2.如权利要求1所述的生物胺诱导多功能干细胞向心肌细胞分化的方法，其特征在于其中的组胺为二盐酸组胺。

3.如权利要求1所述的生物胺诱导多功能干细胞向心肌细胞分化的方法，其特征在于其中的组胺的浓度为10^-5M。

4.如权利要求1所述的生物胺诱导多功能干细胞向心肌细胞分化的方法，其特征在于检测其中的组胺促进 ips分化成心肌细胞的时间和浓度的方法为：

a)在包被matigel胶的培养皿加入适量mTESR培养基，按1/1000比例加入Y试剂，即Y27632 s1049 selleck, ROCK inhibitor10uM，将消化好或复苏好的ips细胞加入其中，轻轻混匀，镜下观察，放入37℃细胞培养箱内；

b)2小时后去掉培养液，加入不含Y试剂的mTESR培养基即可;

c)每4天传代一次，具体根据细胞状态；细胞密度达到80-90%时开始分化；去除培养皿内的培养基，D-PBS洗一遍；加入8umol/L CHIR的RPMI1640 +B27 minus insulin的培养基，分化48小时；

d)去除培养基，加入新鲜B27minusinsulin培养基24小时；去掉培养液，加入新的含5umol/L IWR-1抑制剂的RPMI1640 +B27 minus insulin培养基；分化48小时，之后换RPMI1640 +B27 minus insulin培养基两天，期间不用换液；7天后，分化好之后，换RPMI1640+B27with insulin 的培养基；以后每3天换一次液体；

e)按上述方法分别在分化开始的不同天数的培养基中分别加入不同浓度组胺；

f)分析心肌细胞跳动面积、频率、心肌细胞标志物a-MHC和cTNT表达量，检测不同浓度的组胺对ips向心肌分化的促进效应。

5.如权利要求4所述生物胺诱导多功能干细胞向心肌细胞分化的方法，其特征在于：步骤e中的分化开始的不同天数为分化开始至第七天、分化开始至第三天、分化第三天至第五天、或分化第五天至第七天。

6.如权利要求4所述生物胺诱导多功能干细胞向心肌细胞分化的方法，其特征在于：步骤e中的不同浓度组胺为10^-4M、10^-5M、或10^-6M。

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