CN111971392A - 细胞的制造方法 - Google Patents

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三木健嗣
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Takeda Pharmaceutical Co Ltd
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Abstract

作为用于以商业水平大规模制造导入了所需物质的细胞的技术,提供一种制造方法,所述制造方法包括:在细胞非粘附性容器内,在能够将物质转染至细胞内的条件下,形成细胞聚集体的工序。

Description

细胞的制造方法
技术领域
本发明涉及一种细胞的制造方法。更具体而言,涉及一种导入了所需物质的细胞的制造方法。
背景技术
以往,粘附性细胞中核酸(例如,DNA、或者mRNA及siRNA等RNA)等物质的导入,是通过将细胞接种于培养皿和培养钵等容器之后,对在该容器表面的处于粘附状态的细胞,应用物质和转染试剂(例如,脂质体或多元胺)而进行的。因此,用于细胞粘附的容器的表面面积成为制约,难以以商业水平大规模制造导入了所需物质的细胞。
还已知一种通过将物质和转染试剂粘附或涂布于培养皿和培养钵等容器表面之后,将粘附性细胞接种于容器,从而进行细胞中物质的导入的方法(所谓的反向转染法)(专利文献1)。在该方法中,认为是在接种的细胞逐渐粘附于容器表面的过程中将物质导入细胞内。因此,用于细胞粘附的容器的表面面积仍然成为制约,难以以商业水平大规模制造导入了所需物质的细胞。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特表第2008-532480号公报
专利文献2:国际公开第2015/141827号
非专利文献
非专利文献1:Miki等人,“Efficient Detection and Purification of CellPopulations Using Synthetic MicroRNA Switches”,Cell Stem Cell,16,1-13,2015
发明内容
发明要解决的问题
本发明的主要目的是提供一种用于以商业水平大规模制造导入了所需物质的细胞的技术。
用于解决问题的手段
为了解决上述问题,本发明提供以下[1]至[35]。
[1]一种导入了所需物质(desired substance)的细胞的制造方法,所述制造方法包括:在细胞非粘附性容器内,在能够将所述物质转染至细胞内的条件下,形成细胞聚集体的工序(工序1)。
[2]根据[1]所述的制造方法,其中,所述细胞为粘附性细胞。
[3]根据[2]所述的制造方法,其中,所述工序1为:在细胞非粘附性容器内,在转染试剂和所述物质以及微载体的存在下培养细胞,形成由导入了所述物质的细胞和所述微载体构成的聚集体。
[4]根据[3]所述的制造方法,其中,所述工序1在所述细胞的静置培养下进行。
[5]根据[2]所述的制造方法,其中,所述工序1为:在细胞非粘附性容器内,在转染试剂和所述物质的存在下培养细胞,形成由导入了所述物质的细胞构成的聚集体。
[6]根据[5]所述的制造方法,其中,所述工序1在所述细胞的静置培养下进行。
[7]根据[1]至[6]中任一项所述的制造方法,其中,所述物质为核酸或蛋白质。
[8]根据[7]所述的制造方法,其中,所述核酸为miRNA响应性RNA,所述miRNA响应性RNA包括(i)对在特定的细胞内表达的微小RNA(miRNA)进行特异性识别的核酸序列、以及(ii)与所需蛋白质的遗传密码区域对应的核酸序列(这里,(ii)的核酸序列至蛋白质的翻译由(i)的核酸序列控制)。
[9]根据[1]至[8]中任一项所述的制造方法,其中,所述细胞为心肌细胞。
[10]一种通过[9]所述的制造方法获得的心肌细胞。
[11]一种目的细胞(cell of interest)的制造方法,所述制造方法包括:在细胞非粘附性容器内,在能够将所需物质转染至细胞内的条件下,形成细胞聚集体的工序(工序1);以及基于所述物质在细胞内的功能,从导入了该物质的细胞中筛选目的细胞的工序(工序2)。
[12]根据[11]所述的制造方法,其中,所述细胞为粘附性细胞。
[13]根据[12]所述的制造方法,其中,所述工序1为:在细胞非粘附性容器内,在转染试剂和所述物质以及微载体的存在下培养细胞,形成由导入了所述物质的细胞和所述微载体构成的聚集体。
[14]根据[13]所述的制造方法,其中,所述工序1在所述细胞的静置培养下进行。
[15]根据[12]所述的制造方法,其中,所述工序1为:在细胞非粘附性容器内,在转染试剂和所述物质的存在下培养细胞,形成由导入了所述物质的细胞构成的聚集体。
[16]根据[15]所述的制造方法,其中,所述工序1在所述细胞的静置培养下进行。
[17]根据[11]至[16]中任一项所述的制造方法,其中,所述物质为核酸或蛋白质。
[18]根据[17]所述的制造方法,其中,所述核酸为miRNA响应性RNA,所述miRNA响应性RNA包括(i)对在特定的细胞内表达的微小RNA进行特异性识别的核酸序列、以及(ii)与所需蛋白质的遗传密码区域对应的核酸序列(这里,(ii)的核酸序列至蛋白质的翻译由(i)的核酸序列控制)。
[19]根据[18]所述的制造方法,其中,所述细胞包括心肌细胞和非心肌细胞,所述目的细胞为心肌细胞,在所述工序2中,基于有无所述蛋白质的翻译,从导入了miRNA响应性RNA的细胞中筛选心肌细胞。
[20]根据[18]所述的制造方法,其中,所述细胞为包括心室肌细胞的心肌细胞,且所述目的细胞为心室肌细胞,在所述工序2中,基于有无所述蛋白质的翻译,从导入了miRNA响应性RNA的心肌细胞中筛选心室肌细胞。[21]一种通过[19]所述的制造方法获得的心肌细胞。
[22]一种通过[20]所述的制造方法获得的心室肌细胞。
[23]一种将所需物质导入细胞内的方法,所述方法包括:在细胞非粘附性容器内,在能够将所述物质转染至细胞内的条件下,形成细胞聚集体的工序。
[24]一种由多能干细胞制造目的细胞的方法,所述制造方法包括:诱导多能干细胞分化为目的细胞的工序(工序A);使分化诱导后的细胞分散的工序(工序B);将分散后的细胞导入细胞非粘附性容器内,在能够将所需物质转染至细胞内的条件下,形成细胞聚集体的工序(工序C);以及基于所述物质在细胞内的功能,从导入了该物质的细胞中筛选所述目的细胞的工序(工序D)。
[25]根据[24]所述的制造方法,其中,所述细胞为粘附性细胞。
[26]根据[25]所述的制造方法,其中,所述工序C为:在细胞非粘附性容器内,在转染试剂和所述物质以及微载体的存在下培养细胞,形成由导入了所述物质的细胞和所述微载体构成的聚集体。
[27]根据[26]所述的制造方法,其中,所述工序C在所述细胞的静置培养下进行。
[28]根据[27]所述的制造方法,其中,所述工序C为:在细胞非粘附性容器内,在转染试剂和所述物质的存在下培养细胞,形成由导入了所述物质的细胞构成的聚集体。
[29]根据[28]所述的制造方法,其中,所述工序C在所述细胞的静置培养下进行。
[30]根据[24]至[29]中任一项所述的制造方法,其中,所述物质为核酸或蛋白质。
[31]根据[30]所述的制造方法,其中,所述核酸为miRNA响应性RNA,所述miRNA响应性RNA包括(i)对在特定的细胞内表达的微小RNA进行特异性识别的核酸序列、以及(ii)与所需蛋白质的遗传密码区域对应的核酸序列(这里,(ii)的核酸序列至蛋白质的翻译由(i)的核酸序列控制)。
[32]根据[31]所述的制造方法,其中,所述目的细胞为心肌细胞,在所述工序D中,基于有无所述蛋白质的翻译,从导入了miRNA响应性RNA的细胞中筛选心肌细胞。
[33]根据[31]所述的制造方法,其中,所述目的细胞为心室肌细胞,在所述工序D中,基于有无所述蛋白质的翻译,从导入了miRNA响应性RNA的心肌细胞中筛选心室肌细胞。
[34]一种通过[32]所述的制造方法获得的心肌细胞。
[35]一种通过[33]所述的制造方法获得的心室肌细胞。
发明的效果
通过本发明,提供一种用于以商业水平大规模制造导入了所需物质的细胞的技术。
附图说明
图1为实施例1中确认到导入了EmGFP的细胞的起因于EmGFP的荧光的照片。白色部分实际上表示起因于EmGFP的绿色荧光。
图2为实施例2中确认到导入了EmGFP的细胞的起因于EmGFP的荧光的照片。白色部分实际上表示起因于EmGFP的绿色荧光。
具体实施方式
下面,对用于实施本发明的适宜的方式进行说明。另外,以下说明的实施方式用于示出本发明的代表性的实施方式的一个例子,本发明的范围不因此而被狭义地解释。
在本说明书中,“转染”是指将任意物质导入细胞内部。细胞内部至少包括细胞质内和细胞核内。
在本说明书中,“所需物质”是指通过转染而导入细胞内部的任选的物质。所需物质若能够导入细胞内部则没有特别限定,可以举出例如核酸、蛋白质、颗粒等,优选为核酸,更优选为RNA。
所需物质的使用量可根据物质的种类、导入的细胞的种类以及转染条件等而改变,例如,RNA的使用量相对于1×106个细胞为1ng至100μg,优选为100ng至5000ng。
“能够将物质转染至细胞内的条件”是指可诱发转染的条件。在本发明中,“能够将物质转染至细胞内的条件”尤其具体指“在细胞非粘附性容器内,在转染试剂和物质以及微载体的存在下培养细胞,形成由导入了所述物质的细胞和所述微载体构成的聚集体”或者“在细胞非粘附性容器内,在转染试剂和物质的存在下培养细胞,形成由导入了所述物质的细胞构成的聚集体”。
“培养(Culture)”或者“进行培养”是指在组织外或体外,例如,在培养钵、培养皿、烧瓶或者培养槽(罐)中维持细胞,使其增殖、且/或分化。
“粘附性细胞”是指在粘附于成为支架的固体层表面的状态下最佳地维持或增殖的细胞。粘附性细胞可以是从动物或人的组织中直接获得的细胞(原代细胞)或者对它们进行继代而获得的细胞,也可以是作为株而确立的细胞。
可以举出例如包括心肌细胞的肌细胞、或包括胰细胞和肝细胞的上皮细胞等,作为从动物或人的组织中获得的细胞。
可以举出:小鼠的细胞株,如3T3、NTCT或WEHI株;仓鼠的细胞株,如BHK株(尤其是BHK21株)或CHO株;狗的细胞株,如MDCK株;猪的细胞株,如PK15株;牛的细胞株,如MDBK株;猴的细胞株,如Vero、LLC-MK2、FRHL2或MA104株;以及人的细胞株,如MRC5、HEK293、PER.C6、Hela、ECV或A431株,作为株化后的细胞。
“多能(pluripotency)”是指能够分化为各种具有不同形态或功能的组织或细胞,且能够分化为三胚层的任一层的细胞的能力。“多能(pluripotency)”不能够分化为胚盘,因此从不具有形成个体的能力的角度来看,区别于包括胚盘且能够分化为生物体的所有组织的“全能(totipotency)”。
“多潜能(multipotency)”是指能够分化为多个有限数量的层的细胞的能力。例如,间充质干细胞、造血干细胞、神经干细胞为多潜能的(multipotent),而非多能的(pluripotent)。
可以举出例如多能干细胞(pluripotent stem cell),作为“干细胞(stemcell)”。
本发明中能够使用的“多能干细胞(pluripotent stem cell)”是指具有如下能力的干细胞:能够分化为生物体的各种具有不同形态或功能的组织或细胞,且能够分化为三胚层(内胚层、中胚层、外胚层)的任一层的细胞。对其没有特别限定,可以举出例如胚胎干细胞(ESC)、经由核移植获得的胚胎克隆衍生的胚胎干细胞、精子干细胞、胚胎生殖细胞、诱导性多能干细胞(本说明书中,有时也称为“iPSC”)等。
此外,本发明中能够使用的“多潜能干细胞(multipotent stem cell)”是指具有能够分化为多个有限数量的层的细胞的能力的干细胞。可以举出例如牙髓干细胞、口腔粘膜衍生的干细胞、毛囊干细胞、衍生自培养成纤维细胞或骨髓干细胞的成体干细胞等,作为本发明中可使用的“多潜能干细胞(multipotent stem cell)”。优选的多能干细胞(pluripotent stem cell)为ESC和iPSC。
“诱导性多能干细胞(iPSC)”是指通过将特定的因子(核重编程因子)导入哺乳动物体细胞或未分化干细胞内进行重编程而获得的细胞。目前,“诱导性多能干细胞”有许多种类,除了山中等通过将Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc四种因子导入小鼠成纤维细胞内,从而建立的iPSC(Takahashi K,Yamanaka S.,Cell,(2006)126:663-676)之外,还可以使用将同样的四种因子导入人成纤维细胞内而建立的人细胞衍生的iPSC(Takahashi K,YamanakaS.,等人,Cell,(2007)131:861-872.)、在导入上述四种因子后,以Nanog的表达作为指标进行筛选而建立的Nanog-iPS细胞(Okita,K.,Ichisaka,T.,以及Yamanaka,S.(2007).Nature448,313-317.)、通过不包括c-Myc的方法制作的iPS细胞(Nakagawa M,Yamanaka S.,等人,Nature Biotechnology,(2008)26,101-106)、通过无病毒法导入了六种因子而建立的iPS细胞(Okita K等人,Nat.Methods 2011May;8(5):409-12,Okita K等人,Stem Cells.31(3):458-66.)。此外,还可以使用Thomson等制作的、导入了OCT3/4、SOX2、NANOG、LIN28四种因子而建立的诱导性多能干细胞(Yu J.,Thomson JA.等人,Science(2007)318:1917-1920.)、Daley等制作的诱导性多能干细胞(Park IH,Daley GQ.等人,Nature(2007)451:141-146)、樱田等制作的诱导性多能干细胞(日本特开第2008-307007号)等。
此外,还可以使用已公开的所有论文(例如,Shi Y.,Ding S.,等人,Cell Stem Cell,(2008)Vol3,Issue 5,568-574;Kim JB.,Scholer HR.,等人,Nature,(2008)454,646-650;Huangfu D.,Melton,DA.,等人,Nature Biotechnology,(2008)26,No 7,795-797)、或者日本专利(例如日本特开第2008-307007号、日本特开第2008-283972号、US 2008-2336610、US2009-047263、WO 2007-069666、WO 2008-118220、WO 2008-124133、WO 2008-151058、WO2009-006930、WO 2009-006997、WO 2009-007852)中记载的该领域公知的诱导性多能干细胞中的任一种。
可以使用NIH、理研(理化学研究所)、京都大学等建立的各种iPSC株,作为“诱导性多能干细胞”。例如,若是人iPSC株,可以举出理研的HiPS-RIKEN-1A株、HiPS-RIKEN-2A株、HiPS-RIKEN-12A株、Nips-B2株、京都大学的253G1株、201B7株、409B2株、454E2株、606A1株、610B1株、648A1株等。或者,京都大学或Cellular Dynamics International等提供的临床级的细胞株以及使用这些细胞株制作的研究用和临床用的细胞株等。
若是小鼠ESC作为“胚胎干细胞(ESC)”,可以使用inGenious targetinglaboratory公司、理研(理化学研究所)等建立的各种小鼠ESC株,若是人ESC作为“胚胎干细胞(ESC)”,可以使用NIH、理研、京都大学、Cellartis公司建立的各种人ESC株。例如,可以使用NIH的CHB-1-CHB-12株、RUES1株、RUES2株、HUES1-HUES28株等;WisCell Research的H1株、H9株;理研的KhES-1株、KhES-2株、KhES-3株、KhES-4株、KhES-5株、SSES1株、SSES2株、SSES3株等,作为人ESC株。或者,也可以使用临床级的细胞株以及使用这些细胞株制作的研究用和临床用的细胞株等。
“包括(comprise(s)或comprising)……”是指表示包含但不限于该语句之后的要素。因此,暗示了包含该语句之后的要素,但并非暗示排除其它任意要素。
“由……构成(consist(s)of或consisting of)”是指包含且限于该语句之后的所有要素。因此,“由……构成”这一语句表示所列举的要素是必要或必需的,实质上不存在其它要素。“基本上由……构成”是指包含该语句之后的任意要素,且对于该要素,限定为不影响本公开中确定的活性或作用的其它要素。因此,“基本上由……构成”这一语句表示所列举的要素为必要或必需的,但其它要素为任意选择,并根据它们是否会影响所例举的要素的活性或作用,有时可以使其存在,有时也可以使其不存在。
本发明涉及的细胞的制造方法为导入了所需物质的细胞的制造方法,其包括以下工序1。
工序1:在细胞非粘附性容器内,在能够将所述物质转染至细胞内的条件下,形成细胞聚集体的工序。
此外,本发明的另一方面涉及的细胞的制造方法为目的细胞的制造方法,除了工序1之外,还包括以下工序2。
工序2:基于所述物质在细胞内的功能,从导入了该物质的细胞中筛选目的细胞的工序。
另外,工序1与将本发明涉及的所需物质导入细胞内的方法相应。
更具体而言,工序1包括以下工序1-1和工序1-2中的任一个。
工序1-1:在细胞非粘附性容器内,在转染试剂和所述物质以及微载体的存在下培养细胞,形成由导入了所述物质的细胞和所述微载体构成的聚集体的工序。
工序1-2:在细胞非粘附性容器内,在转染试剂和所述物质的存在下培养细胞,形成由导入了所述物质的细胞构成的聚集体的工序。
在本说明书中,目的细胞可以是例如包括多种亚型的成熟细胞群。作为包括多种亚型的成熟细胞群,例如,成熟心肌细胞群包括心室肌细胞、心房肌细胞和起搏细胞等亚型。
在本发明涉及的细胞的制造方法中,细胞若是真核细胞则没有特别限定,可以是例如酵母、真菌、原生生物、植物细胞、昆虫细胞、两栖类细胞、爬虫类细胞、鸟类细胞、非人哺乳类细胞、人细胞。例示小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、狗、猫、猪、牛、马、羊以及猴,作为非人哺乳动物。细胞可以是培养细胞(体外和离体)。
细胞优选设为粘附性细胞。细胞尤其设为具有粘附于微载体的能力,且在细胞非粘附性容器内与微载体一起培养时能够粘附于微载体的细胞。或者,细胞设为具有聚集能力,且在细胞非粘附性容器内培养时能够形成聚集体的细胞。
细胞可以是一种或两种以上。
对于被导入细胞内的物质没有特别限定,可以是例如核酸、蛋白质以及颗粒等。
可以举出DNA、RNA以及质粒等,作为核酸。这些核酸也可以包括非天然型的核苷酸。
尤其可以举出miRNA响应性RNA作为RNA,该miRNA响应性RNA包括(i)对在特定的细胞内表达的微小RNA(miRNA)进行特异性识别的核酸序列以及(ii)与所需蛋白质的遗传密码区域对应的核酸序列。在miRNA响应性RNA中,通过对成为(i)的核酸序列的靶的miRNA进行识别,从而对(ii)的核酸序列至蛋白质的翻译进行控制。具体来说,通过将在特定的细胞内表达的miRNA与(i)的核酸序列结合形成双链,从而进行控制以抑制(即,关闭)来自(ii)的核酸序列的遗传密码区域的转录和翻译(详见后述)。
质粒可以是并入了在细胞内进行表达的基因和用于基因表达的启动子等的质粒。
可以举出抗体、酶以及荧光蛋白质等,作为蛋白质。
可以举出树脂制或金属制的微珠、金胶体或银胶体等胶体颗粒等,作为颗粒。微珠也可以是修饰或含有化合物或高分子的微珠,可以是结合了抗体或抗生物素蛋白/生物素等的亲和珠、或荧光珠、药剂缓释珠等。可以举出感应器、细胞内反应的活化剂或抑制剂、酸或碱等,作为化合物或者药剂。此外,微珠也可以是铁素体磁珠等具有磁性的微珠。聚合物可以是感应于温度或pH而发生结构变化的功能性聚合物。
工序1:聚集体形成工序
在工序1-1中,在细胞非粘附性容器内,在转染试剂和物质以及微载体的存在下培养细胞。细胞优选在分散的状态下供培养,按照需要在工序1的前段工序中从微载体上剥离、分散。剥离处理可以采用利用酶和螯合剂等的化学处理、利用移液等的物理处理、以及它们的组合。化学处理中可以使用市售的试剂(例如Roche公司的Liberase TM Research Grade;Gibco公司的StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent;Gibco公司的TrypLESelect CTS等)。分散处理也可以通过公知的方法进行,例如,可以采用利用酶和螯合剂等的化学处理、利用移液等的物理处理、以及它们的组合。化学处理中可以使用市售的试剂(例如Roche公司的Liberase TM Research Grade;Gibco公司的StemPro Accutase CellDissociation Reagent;Gibco公司的TrypLE Select CTS等)。
在培养中,为了形成由细胞和所述微载体构成的聚集体或仅由细胞构成的聚集体,使用细胞非粘附性容器。细胞非粘附性容器可以使用以提高容器表面与细胞之间的粘附性为目的而未进行人工处理(例如,利用细胞外基质等的包覆处理)的容器。或者,也可以使用以降低容器表面与细胞之间的粘附性为目的而进行了人工处理(例如,利用疏水性分子的包覆处理)的容器。另外,“细胞非粘附性”是指不粘附或者难以粘附粘附性细胞(例如,相对于接种于容器的细胞的总数,小于20%,优选为小于10%、进一步优选为小于1%的细胞粘附于容器)。
作为这样的容器,可以举出以例如聚碳酸酯、聚乙烯、聚丙烯、特氟龙(注册商标)、聚对苯二甲酸乙二酯、聚甲基丙烯酸甲酯、尼龙6,6、聚乙烯醇、纤维素、硅、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、以及不锈钢等为材料的容器。
容器可以是微量培养板、培养皿(培养钵)、细胞培养烧瓶(旋转烧瓶、摇瓶等)、细胞培养袋、转瓶、生物反应器以及培养槽(罐)等,按照制造规模(例如,1mL至2000L)适当地选择。在本发明中可适宜使用尤其大容量(例如,100mL至2000L)的容器。
转染试剂可以是以往公知的试剂,可以使用例如阳离子性脂质体(LipofectamineMessengerMAX(Thermo Fisher Scientific公司)、mRNAIn stem(LIFE GENE公司)等)、脂质(HiPerFect Transfection Reagent(Qiagen公司)、TransMessenger TransfectionReagent(Qiagen公司)、Lipofectamine Stem reagents(Qiagen公司)、LipofectamineStem reagents(Thermo Fisher Scientific公司)、RiboJuice mRNA Transfection Kit(Merck公司)等)、磷酸钙(ProFection(注册商标)Mammalian Transfection System(Promega公司)等)、聚合物(jetPEI(Polyplus transfection公司)、DEAE Dextran(GEHealthcare Bio-Sciences AB公司)等)等。此外,也可以使用包括阳离子性脂质等脂质分子的脂质纳米颗粒(Lipid nanoparticle,LNP),作为转染试剂。转染试剂可以根据细胞的种类或导入细胞内的物质的种类适当地选择。
转染试剂的使用量可以根据试剂、细胞以及转染条件等而改变,代表性地,在相对于2×106个细胞而导入600ng的mRNA情况下,使用7.5μL的Lipofectamine MessengerMAX。
除了转染试剂之外,也可以通过以往公知的方法(例如,电穿孔、脂质转染)进行转染。例如,若使用电穿孔,则通过向包括适用了物质的细胞的缓冲液施加适当的电压,从而使物质通过细胞膜,导入细胞内。作为其他例子,若使用脂质转染,则通过将脂质和物质的混配物适用于细胞,从而使该混配物通过细胞膜,将物质导入细胞内。如上所述,对于本发明中的转染方法没有特别限定,可以采用例如Nature Protocols(K.Yusa等人,vol.8,No.10,2013,2061-2078)、Nature Protocols(T.Sakuma等人,vol.11,No.1,2016,118-133)、Nature Protocols(B.Wefers等人,vol.8,No.12,2013,2355-2379)等中记载的方法。
微载体是指细胞能够粘附于其表面,且通过使粘附了细胞的微载体悬浮于液体培养基中,从而能够供细胞培养的载体。微载体只要是在其表面附着有细胞的状态下悬浮于液体培养基中且能够进行细胞培养的载体即可,对于其材质、形状以及尺寸等没有特别限制。
可以举出葡聚糖、明胶、胶原蛋白、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯酰胺、玻璃、纤维素等,作为微载体的材质。
可以举出球状(珠)、圆盘状等,作为微载体的形状。
球状的微载体的尺寸为例如直径2μm至1000μm,优选为100μm至300μm。
微载体也可以为多孔性。
对于细胞培养中使用的微载体的数量没有特别限定,例如每10个细胞为1个微载体。
对于细胞培养中使用的微载体的量没有特别限定,例如相对于1×106个至5×107个细胞,微载体为0.1g,优选为相对于2×107个至3×107个细胞,微载体为0.1g。
微载体也可以是市售的微载体,例如可以使用高浓度Synthemax II微载体(Corning公司)。
通过在细胞非粘附性容器内添加转染试剂和所需物质以及微载体,对粘附性细胞进行静置培养,从而使细胞粘附于微载体而形成聚集体,在该过程中物质被导入细胞内。
这里的“聚集体”是指包括至少一个细胞和一个微载体的集合体。
聚集体的尺寸取决于所使用的微载体的尺寸,对此没有特别限定。
对于粘附于一个微载体的细胞的数量没有特别限定,例如为2个至500个,优选为50个至300个。
此外,对于培养细胞之中,聚集体形成细胞相对于形成聚集体的细胞和未形成聚集体的细胞的总数的比例没有特别限定,例如为10%以上、20%以上、30%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上或者100%。
在工序1-2中,不使用微载体,而是在转染试剂和物质的存在下培养细胞。
通过在细胞非粘附性容器内添加转染试剂和物质,对粘附性细胞进行静置培养,从而在没有微载体的情况下细胞彼此也能够形成聚集体,在该过程中物质被导入细胞内。
这里的“聚集体”是指包括至少两个细胞的集合体。聚集体大多为粘附了多个细胞的聚集体。
对于形成一个聚集体的细胞数没有特别限定,例如为2个至500个,优选为50个至300个。
此外,对于培养细胞之中,聚集体形成细胞相对于形成聚集体的细胞和未形成聚集体的细胞的总数的比例没有特别限定,例如为10%以上、20%以上、30%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上或者100%。
在工序1(工序1-1和工序1-2)中,也可以不使用转染试剂,而是通过在存在下或者不存在微载体的情况下,将细胞与物质一起培养从而进行转染(例如,电穿孔)。
为了形成聚集体,以完成转染所需的适当的期时间段对细胞进行静置培养。对于静置培养时间段没有特别限定,例如可以设为2小时至10小时左右,优选为3小时至6小时左右,特别优选为4小时至5小时。对于培养条件没有特别限定,可以设为约37℃、5%CO2存在下。
静置培养后,为了维持所形成的聚集体,也可以进行搅拌培养。对于静置培养时间段没有特别限定,例如可以设为12小时至48小时左右,优选为24小时左右。对于培养条件没有特别限定,可以设为约37℃、5%CO2存在下。
搅拌速度和时间按照细胞密度和培养容器的尺寸而适当地设定,代表性地为在4小时至6小时静置后,以25rpm搅拌12小时以上。过度的搅拌或者振荡会给细胞带来物理性应激,进而抑制聚集体的维持。因此,期望使培养基成分和培养基内氧浓度均匀,且控制搅拌速度使得聚集体的维持不被抑制。
对于培养基没有特别限定,可以使用以往公知的培养基。例如,可以使用BME培养基、BGJb培养基、CMRL 1066培养基、Glasgow MEM培养基、Improved MEM(IMEM)培养基、Improved MDM(IMDM)培养基、Medium 199培养基、Eagle MEM培养基、αMEM培养基、DMEM培养基(高浓度葡萄糖、低浓度葡萄糖)、DMEM/F12培养基、Ham培养基、RPMI 1640培养基、Fischer's培养基、以及它们的混合培养基等。
培养基的使用量可根据细胞或培养条件而改变,可由本领域技术人员适当地决定。
培养基中,也可以按照细胞或培养条件,根据需要添加氨基酸、L-谷氨酰胺、GlutaMAX(产品名称)、非必需氨基酸、维生素、抗生物质(例如,青霉素、链霉素或它们的混合物)、抗菌剂(例如,两性霉素B)、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂、无机盐类等的添加物。
添加物的使用量可根据细胞或培养条件而改变,可由本领域技术人员适当地决定。
根据本发明涉及的细胞的制造方法,能够形成聚集体并将所需物质导入细胞内。因此,不会像以往的使用培养皿或培养钵的方法那样受到用于细胞粘附的容器的表面面积制约,能够以商业水平大规模地获得导入了所需物质的细胞。
工序2:筛选工序
在工序2中,基于该物质在细胞内的功能,从导入了所需物质的细胞中,筛选目的细胞。
目的细胞的筛选例如可以通过对利用所需物质的转染而被导入细胞内部的标记蛋白质或标记基因进行检测来进行。标记可以是阳性选择标记或者阴性选择标记。优选的是标记为细胞表面标记,尤其若利用细胞表面阳性选择标记,则能够实施生存细胞的浓缩、分离、和/或检测。标记蛋白质的检测可以利用使用了针对该标记蛋白质的特异性抗体的免疫测定,例如ELISA、免疫染色、流式细胞术等来进行。可以使用与标记蛋白质中的特定氨基酸序列或结合了标记蛋白质的特定糖链等结合的抗体,作为针对标记蛋白质的特异性抗体。标记基因的检测可以利用该领域公知的核酸扩增方法和/或核酸检测方法,例如RT-PCR、微阵列、生物芯片以及RNAseq等来进行。
此外,目的细胞的筛选也可以利用例如被导入的荧光珠或磁性珠来进行。通过利用了荧光珠或磁性珠的流式细胞术进行细胞筛选在本技术领域中是公知的。
在所需物质为RNA的情况下,工序2也可以通过微小RNA(miRNA)开关法进行。miRNA开关法可以使用上述miRNA响应性RNA,按照例如WO 2015/105172、专利文献2以及非专利文献1中记载的方法来实施。专利文献2以及非专利文献1中记载的方法是从心肌细胞和心肌细胞以外的细胞混合在一起的细胞群中筛选心肌细胞的方法(详见后述)。
在本发明的一个实施方式中,“目的细胞”是心室肌细胞。
在该实施方式中,在所述工序2中,基于有无所需蛋白质的翻译,从导入了miRNA响应性RNA的心肌细胞中筛选心室肌细胞。
本说明书中,“存在所需蛋白质的翻译”是指能够通过荧光检测、吸光度、蛋白质印迹、ELISA等该领域公知的方法检测出该蛋白质。
此外,本发明还提供一种由多能干细胞制造目的细胞的方法,该方法包括以下工序A至工序D。
工序A:诱导多能干细胞分化为目的细胞的工序。
工序B:使分化诱导后的细胞分散的工序。
工序C:将分散后的细胞导入细胞非粘附性容器内,在能够将所需物质转染至细胞内的条件下,形成细胞聚集体的工序。
工序D:基于所述物质在细胞内的功能,从导入了该物质的细胞中筛选所述目的细胞的工序。
对于由诱导多能干细胞分化而得的目的细胞没有特别限定,可以举出心肌细胞(包括心室肌细胞、心房肌细胞以及起搏细胞等)、胰腺前体细胞、神经前体细胞、肝细胞以及血管内皮细胞等。这些细胞的分化诱导可以应用以往公知的条件来进行。
从本发明涉及的多能干细胞制造目的细胞的方法可以应用于例如用于从非心肌细胞(包括未分化的多能干细胞)中分离由诱导多能干细胞分化而得的心肌细胞、用于从非胰腺前体细胞中分离由诱导多能干细胞分化而得的胰腺前体细胞、用于从非神经前体细胞中分离由诱导多能干细胞分化而得的神经前体细胞、用于从非肝细胞中分离由诱导多能干细胞分化而得的肝细胞、或者用于从非血管内皮细胞中分离由诱导多能干细胞分化而得的血管内皮细胞。
下面,使用由诱导多能干细胞而得的心肌细胞,并使用miRNA开关法从心肌细胞中筛选尤其是心室肌细胞的例子,对从本发明涉及的多能干细胞中筛选目的细胞的方法进行具体说明。
工序A:分化诱导工序
在工序A中,诱导多能干细胞分化为心肌细胞。
在本发明中,“心肌细胞”是指至少表达心肌肌钙蛋白(cTnT)或αMHC的细胞。对于cTnT,人的情况,例示NCBI的登记号NM_000364,小鼠的情况,例示NM_001130174。对于αMHC,人的情况,例示NCBI的登记号NM_002471,小鼠的情况,例示NM_001164171。
向心肌细胞的分化诱导可以采用例如专利文献2和非专利文献1中记载的方法。或者,可以通过例如Laflamme MA等报告的方法,由多能干细胞制造心肌细胞(Laflamme MA&Murry CE,Nature 2011,Review)。除此之外没有特别限定,可以例示例如通过对诱导性多能干细胞进行悬浮培养使其形成细胞块(拟胚体)从而制造心肌细胞的方法、在抑制BMP信号传送的物质的存在下制造心肌细胞的方法(WO 2005/033298)、依次添加Activin A和BMP从而制造心肌细胞的方法(WO 2007/002136)、在促进激活Wnt信号传导途径的活性化的物质的存在下制造心肌细胞的方法(WO 2007/126077)、以及从诱导性多能干细胞中分离Flk/KDR阳性细胞并在环孢菌素A的存在下制造心肌细胞的方法(WO 2009/118928)等。
工序B:分散工序
在工序B中,使分化诱导后的心肌细胞分散。
分散处理可以采用公知的方法进行,例如,可以采用利用了酶和螯合剂等的化学处理、利用了移液等的物理处理、以及它们的组合。化学处理中可以使用市售的试剂(例如Roche公司的Liberase TM Research Grade;Gibco公司的StemPro Accutase CellDissociation Reagent;Gibco公司的TrypLE Select CTS等)。
工序C:聚集体形成工序
在工序C中,在细胞非粘附性容器内,在能够将微小RNA(miRNA)响应性RNA转染至心肌细胞内的条件下,形成细胞聚集体。工序C的具体顺序与工序1相同。
miRNA响应性RNA包括(i)对在心室肌细胞内特异性表达的miRNA进行特异性识别的核酸序列、以及与(i)功能性连结的(ii)与所需蛋白质的遗传密码区域对应的核酸序列。(ii)的核酸序列至蛋白质的翻译由(i)的核酸序列控制。
与(ii)的遗传密码区域对应的核酸至蛋白质的翻译由(i)的核酸序列控制是指在心室肌细胞内存在特异性表达的miRNA的情况下,按照其存在量对与遗传密码区域对应的核酸至蛋白质的翻译进行控制。更优选为通过使在心室肌细胞内特异性表达的miRNA与(i)的核酸序列结合形成双链,从而抑制来自(ii)的核酸序列的遗传密码区域的转录和翻译(关闭开关型miRNA响应性RNA)。
(i)的核酸序列和(ii)的核酸序列功能性连结是指(ii)的遗传密码区域的5'UTR内、3’UTR内、和/或该开放读框内具有至少一个(i)核酸序列。
“在心室肌细胞内特异性表达的微小RNA(miRNA)”若是与心室肌细胞以外的细胞相比在心室肌细胞内更高地表达的miRNA则没有特别限定。例如,可以是与心室肌细胞以外的细胞相比在心肌细胞内以10%以上、20%以上、30%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上或者其以上的比例更高地表达的miRNA,不限于此。这样的miRNA可以从数据库的信息(例如,http://www.mirbase.org/或http://www.microrna.org/)中登记的miRNA、和/或该数据库中记载的文献信息所记载的miRNA中适当地选择。
关于(i)的核酸序列,“对在心室肌细胞内特异性表达的miRNA进行特异性识别”是指该miRNA在与规定的多个蛋白质相互作用而形成了RNA诱导沉默复合物(RNA-inducedsilencing complex)(RISC)的状态下存在于(i)的核酸序列上。
关于(ii)的核酸序列,“蛋白质的遗传密码区域”是在细胞内被翻译,并对能够进行心室肌细胞筛选的任意的蛋白质进行编码的核酸基因。
作为一个例子,“基因”可以是标记基因。“标记基因”是在细胞内被翻译,且作为标记发挥功能,并对能够进行心室肌细胞筛选的任意的蛋白质进行编码的基因。
可以例示荧光蛋白质或细胞凋亡诱导蛋白质,作为在细胞内被翻译且能够作为标记发挥功能的蛋白质。荧光蛋白质可以使用公知的各种分子。可以举出例如IκB、Smac/DIABLO、ICE、HtrA2/OMI、AIF、endonuclease G、Bax、Bak、Noxa、Hrk(harakiri)、Mtd、Bim、Bad、Bid、PUMA、activated caspase-3、Fas、Tk等,但不限于这些,作为细胞凋亡诱导蛋白质。
可以使用将心室肌细胞与对特异性miRNA(例如miR-208b-3p(序列号1))进行识别的序列(miRNA靶点)和荧光蛋白质的基因的序列组合而得的开启开关型人工RNA(miRNA开关:合成mRNA),作为miRNA响应性RNA。若将该人工RNA导入心肌细胞,则在存在miRNA的心室肌细胞内人工RNA与miRNA结合,从而表达荧光蛋白质(开启开关)。另一方面,在不存在所述miRNA的、心室肌细胞以外的细胞内人工RNA不与miRNA结合,因此不表达荧光蛋白质。
或者,也可以使用将心室肌细胞与对特异性miRNA进行识别的序列和细胞凋亡诱导基因(例如Bim)的序列组合而得的关闭开关型人工RNA,作为miRNA响应性RNA。若将该人工RNA导入细胞内,则在存在miRNA的心肌细胞内人工RNA与miRNA结合,抑制引起细胞凋亡的基因的表达(关闭开关)。另一方面,在不存在所述miRNA的、心室肌细胞以外的细胞内人工RNA不与miRNA结合,因此引起细胞凋亡的基因表达并引起细胞凋亡。
工序D:筛选工序
在工序D中,基于miRNA响应性RNA在心肌细胞内的功能,从导入了miRNA响应性RNA的心肌细胞中筛选并获取心室肌细胞。
在使用将上述心室肌细胞与对特异性miRNA进行识别的序列和荧光蛋白质的基因的序列组合而得的开启开关型人工RNA的情况下,利用细胞分选仪等,将荧光蛋白质的表达为阳性或者表达量为规定值以上的心室肌细胞从心室肌以外的荧光蛋白质的表达为阴性或者表达量小于规定值的细胞中分离。
此外,在使用将上述心室肌细胞与对特异性miRNA进行识别的序列和细胞凋亡诱导基因的序列组合而得的关闭开关型人工RNA的情况下,由于心室肌以外的细胞会引起细胞凋亡,因此能够在不利用设备筛选心室肌细胞的情况下自动进行提纯。
根据本发明涉及的细胞的制造方法,在工序C中,能够使细胞形成聚集体并将物质导入细胞内。因此,用于细胞粘附的容器的表面面积不会成为制约,能够以商业水平大规模地获得导入了所需物质的细胞,在工序D中以商业水平大规模地获得目的分化细胞。
实施例
实施例1:来自iPSC的心肌细胞的制造1
在本实施例中,通过在转染试剂和表达荧光蛋白质的RNA(EmGFP mRNA)的存在下对由诱导iPSC而得的心肌细胞进行搅拌培养,形成聚集体,从而将RNA导入心肌细胞。
(1)心肌细胞的诱导
使用包覆了Synthemax II(Corning公司)的10cm培养钵,以1.5×106个细胞/mL将在Essential 8培养基(Gibco公司)中维持、培养而得的iPSC(Ff-I14s04,购自京都大学iPS细胞研究所)接种于30mL生物反应器内的RPMI-1640培养基(Gibco公司)。RPMI-1640培养基中添加有10μmol/L的Y-27632(Wako公司),包括0.55g(以表面积换算则为198cm2)的微载体(高浓度Synthemax II微载体、Corning公司)。
在细胞培养箱中,在低氧浓度(5%)、37℃下培养2天后,使用RPMI-1640培养基作为Basal培养基进行21天的分化诱导。
(2)RNA转染
(RNA的制作)
通过以下方法,基于与各自的mRNA对应的DNA序列(序列号2和序列号3)制作了由EmGFPmRNA以及miR-208a-3p和tagBFP构成的miRNA响应性关闭开关mRNA。
使用Warren L,等人,Cell Stem Cell.7(5):618-30(2010)中记载的规程,通过MEGAscriptΤ7kit(Thermo Fisher Scientific)制作了mRNA。在该反应中,分别使用假尿苷-5'-三磷酸和甲基胞苷-5'-三磷酸(TriLink BioTechnologies),代替尿苷三磷酸和胞苷三磷酸。在IVT(mRNA合成)反应之前,用Anti Reverse cap Analog(TrilinkBiotechnologies)将鸟苷-5'-三磷酸稀释5倍。将反应混合液在37℃下温育5小时,添加TURBO DNase(Thermo Fisher Scientific)后,在37℃下进一步温育30分钟。对于所获得的mRNA,利用FavorPrep Blood/Cultured Cells total RNA extraction column(FavorgenBiotech)进行提纯,并使用Antarctic phosphatase(New England BioLabs)在37℃下温育30分钟。然后,通过RNeasy Mini Elute Cleanup Kit(QIAGEN)进行进一步提纯。
(mRNA的转染)
对分化诱导后的细胞(包括微载体上的细胞和从微载体上脱离的细胞)进行回收后,通过以下顺序,进行从微载体上的细胞的剥离和细胞的分散。
利用包括胶原酶(Liberase)(Roche公司的Liberase TM Research Grade)的IMDM(Iscove改良的DMEM培养基,添加1%DNase)处理40分钟。
接着,使用细胞消化液(Accutase)(Gibco公司的StemPro Accutase CellDissociation Reagent)处理10分钟。
最后,进行移液。
使移液后的细胞溶液通过细胞滤网(Fisher Scientific公司的Sterile CellStrainer 40μm),回收单细胞。
进行离心分离并去除上清液后,在RPMI-1640培养基(添加了1/50(vol/vol)的B27添加剂(B27 Supplement),添加了10μmol/L的Y-27632)中悬浮2×106个细胞/mL。每2×106个细胞/mL,使125μL的Opti-MEM培养基(Gibco公司)与7.5μL的Lipofectamine MessengerMAX(Invitrogen公司)、3μL的100ng/μL EmGFP mRNA、以及3μL的由miR-208a-3p和tagBFP构成的100ng/μL miRNA响应性关闭开关mRNA混合,进而混合细胞悬浮液之后,立即转移至30mL生物反应器(30mL一次性生物反应器,Biott公司)。
在细胞培养箱内,在普通氧浓度(21%)、37℃下静置培养4小时。然后,向30mL生物反应器中添加RPMI-1640培养基(添加了1/50(vol/vol)的B27添加剂,添加了10μmol/L的Y-27632)直到培养液量达到30mL,并以25rpm开始搅拌培养。
次日,通过对培养液进行离心分离从而回收细胞聚集体,使用细胞消化液(Accutase)(gibco公司的StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent)处理20分钟后进行移液,添加RPMI-1640培养基(添加了10μg/mL的DNase,牛胰腺(Bovine Pancreas))。进而,通过离心分离回收细胞,使其悬浮于D-PBS(-)溶液(Wako公司),然后,再次通过离心分离回收细胞。向回收得到的细胞中添加0.5%的BSA/PBS溶液(向PBS中添加了1/60(vol/vol)的BSA(Wako公司的30w/v%白蛋白溶液,来自牛血清,无脂肪酸)),进行移液,制得单一的细胞,并使用流式细胞术(FACS Aria Fusion),确认到发出起因于EmGFP的荧光的细胞(图1)。
进而,对于tag-BFP也能够通过使用流式细胞术求出起因于EmGFP和tag-BFP的荧光表达比,从而筛选出tag-BFP/EmGFP降低的细胞作为心肌细胞。
实施例2:来自iPSC的心肌细胞的制造2
在本实施例中,通过在转染试剂和表达荧光蛋白质的RNA(EmGFP mRNA)以及微载体的存在下对由诱导iPSC而得的心肌细胞进行搅拌培养,形成聚集体,从而将RNA导入心肌细胞。
(1)心肌细胞的诱导
使用包覆了Synthemax II(Corning公司)的10cm培养钵,以4×105个细胞/mL将在Essential 8培养基(Gibco公司)中维持、培养而得的iPSC(Ff-I14s04,购自京都大学iPS细胞研究所)接种于30mL生物反应器内的RPMI-1640培养基(Gibco公司)。RPMI-1640培养基中添加有10μmol/L的Y-27632(Wako公司),包括0.55g(以表面积换算则为198cm2)的微载体(高浓度Synthemax II微载体,Corning公司)。
在细胞培养箱中,在低氧浓度(5%)、37℃下培养4天后,使用RPMI-1640培养基作为Basal培养基进行35天的分化诱导。
(2)RNA转染
(RNA的制作)
通过与实施例1相同的方法制作了100ng/μL EmGFP mRNA、以及由miR-208a-3p和tagBFP构成的100ng/μL miRNA响应性关闭开关mRNA。
(mRNA的转染)
在对分化诱导后的细胞(微载体上的细胞和从微载体上脱离的细胞)进行回收后,通过以下顺序,进行从微载体上的细胞的剥离和细胞的分散。
利用包括胶原酶(Liberase)(Roche公司的Liberase TM Research Grade)的IMDM(Iscove改良的DMEM培养基,添加1%DNase)处理40分钟。
接着,通过TrypLE select(Gibco公司的TrypLE Select CTS)处理10分钟。
最后,进行移液。
使移液后的细胞溶液通过细胞滤网(Fisher Scientific公司的Sterile CellStrainer 40μm),回收单细胞。
进行离心分离并去除上清液后,在RPMI-1640培养基(添加了1/50(vol/vol)的B27添加剂,添加了10μmol/L的Y-27632)中悬浮。向细胞悬浮液(细胞数18.2×106)中混合18μL的mRNAIn stem(LIFE GENE公司)、27μL的100ng/μL EmGFP mRNA、以及27μL的由miR-208a-3p和tagBFP构成的100ng/μL miRNA响应性关闭开关mRNA),并立即转移至包括0.1g的微载体(高浓度Synthemax II微载体)的30mL生物反应器(30mL一次性生物反应器,Biott公司)。
在细胞培养箱内,在普通氧浓度(21%)、37℃下静置培养5小时。
然后,向30mL生物反应器中添加RPMI-1640培养基(添加了1/50(vol/vol)的B27添加剂,添加了10μmol/L的Y-27632)直到培养液量达到30mL,并以25rpm开始搅拌培养。
次日,依照实施例1,使用细胞消化液(Accutase)(Gibco公司的StemPro AccutaseCell Dissociation Reagent)对所获得的细胞聚集体进行处理后,进行移液,通过细胞滤网(Fisher Scientific公司的Sterile Cell Strainer 40μm)回收单一的细胞,使用流式细胞术(FACS Aria Fusion),确认到发出起因于EmGFP的荧光的细胞(图2)。
进而,对于tag-BFP也能够通过使用流式细胞术求出起因于EmGFP和tag-BFP的荧光表达比,从而筛选出tag-BFP/EmGFP降低的细胞作为心肌细胞。
产业上的可利用性
本发明适用于以商业水平大规模制造导入了所需物质的细胞。
序列表自由文本
序列号1:与人miR-208b-3p对应的RNA序列
序列号2:与EmGFP mRNA对应的DNA序列
序列号3:与由miR-208a-3p和tagBFP构成的miRNA响应性关闭开关mRNA对应的DNA序列
序列表
<110> 国立大学法人京都大学
武田药品工业株式会社
<120> 细胞的制造方法
<130> PT38-9031WO
<150> JP2018-069241
<151> 2018-03-30
<160> 3
<170> PatentIn 3.5 版本
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
auaagacgaa caaaagguuu gu 22
<210> 2
<211> 1016
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EmGFP序列
<400> 2
cagtgaattg taatacgact cactataggg cgaattaaga gagaaaagaa gagtaagaag 60
aaatataaga caccggtcgc caccatggtg agcaagggcg aggagctgtt caccggggtg 120
gtgcccatcc tggtcgagct ggacggcgac gtaaacggcc acaagttcag cgtgtccggc 180
gagggcgagg gcgatgccac ctacggcaag ctgaccctga agttcatctg caccaccggc 240
aagctgcccg tgccctggcc caccctcgtg accaccttca cctacggcgt gcagtgcttc 300
gcccgctacc ccgaccacat gaagcagcac gacttcttca agtccgccat gcccgaaggc 360
tacgtccagg agcgcaccat cttcttcaag gacgacggca actacaagac ccgcgccgag 420
gtgaagttcg agggcgacac cctggtgaac cgcatcgagc tgaagggcat cgacttcaag 480
gaggacggca acatcctggg gcacaagctg gagtacaact acaacagcca caaggtctat 540
atcaccgccg acaagcagaa gaacggcatc aaggtgaact tcaagacccg ccacaacatc 600
gaggacggca gcgtgcagct cgccgaccac taccagcaga acacccccat cggcgacggc 660
cccgtgctgc tgcccgacaa ccactacctg agcacccagt ccgccctgag caaagacccc 720
aacgagaagc gcgatcacat ggtcctgctg gagttcgtga ccgccgccgg gatcactctc 780
ggcatggacg agctgtacaa gtaatctaga ccttctgcgg ggcttgcctt ctggccatgc 840
ccttcttctc tcccttgcac ctgtacctct tggtctttga ataaagcctg agtaggaaaa 900
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 1016
<210> 3
<211> 991
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 关闭开关mRNA序列
<400> 3
gctaatacga ctcactatag gttccttaat cgcggatcca caagcttttt gctcgtctta 60
tagatcacac cggtcgccac catgagcgag ctgattaagg agaacatgca catgaagctg 120
tacatggagg gcaccgtgga caaccatcac ttcaagtgca catccgaggg cgaaggcaag 180
ccctacgagg gcacccagac catgagaatc aaggtggtcg agggcggccc tctccccttc 240
gccttcgaca tcctggctac tagcttcctc tacggcagca agaccttcat caaccacacc 300
cagggcatcc ccgacttctt caagcagtcc ttccctgagg gcttcacatg ggagagagtc 360
accacatacg aagacggggg cgtgctgacc gctacccagg acaccagcct ccaggacggc 420
tgcctcatct acaacgtcaa gatcagaggg gtgaacttca catccaacgg ccctgtgatg 480
cagaagaaaa cactcggctg ggaggccttc accgagacgc tgtaccccgc tgacggcggc 540
ctggaaggca gaaacgacat ggccctgaag ctcgtgggcg ggagccatct gatcgcaaac 600
atcaagacca catatagatc caagaaaccc gctaagaacc tcaagatgcc tggcgtctac 660
tatgtggact acagactgga aagaatcaag gaggccaaca acgagaccta cgtcgagcag 720
cacgaggtgg cagtggccag atactgcgac ctccctagca aactggggca caagcttaat 780
ctagaccttc tgcggggctt gccttctggc catgcccttc ttctctccct tgcacctgta 840
cctcttggtc tttgaataaa gcctgagtag gaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 900
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 991

Claims (9)

1.一种导入了所需物质的细胞的制造方法,所述制造方法包括:
在细胞非粘附性容器内,在能够将所述物质转染至细胞内的条件下,形成细胞聚集体的工序。
2.根据权利要求1所述的制造方法,其中,
所述细胞为粘附性细胞。
3.根据权利要求2所述的制造方法,其中,所述工序为:
在细胞非粘附性容器内,在转染试剂和所述物质以及微载体的存在下培养细胞,形成由导入了所述物质的细胞和所述微载体构成的聚集体。
4.根据权利要求2所述的制造方法,其中,所述工序为:
在细胞非粘附性容器内,在转染试剂和所述物质的存在下培养细胞,形成由导入了所述物质的细胞构成的聚集体。
5.根据权利要求3或4所述的制造方法,其中,
所述工序在所述细胞的静置培养下进行。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的制造方法,其中,
所述物质为核酸或蛋白质。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的制造方法,其中,
所述细胞为心肌细胞。
8.一种目的细胞的制造方法,
所述制造方法包括:
在细胞非粘附性容器内,在能够将所需物质转染至细胞内的条件下,形成细胞聚集体的工序;以及
基于所述物质在细胞内的功能,从导入了该物质的细胞中筛选目的细胞的工序。
9.一种通过权利要求8所述的制造方法获得的心室肌细胞。
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