CN104334718A - 通过三维培养重新编程细胞 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了在允许形成三维细胞聚集体的条件下通过培养细胞使所述细胞重新编程的方法。本申请还涉及使用所述方法获得的细胞和细胞聚集体。

Description

通过三维培养重新编程细胞
发明背景
干细胞的特征在于其具有增殖能力，同时保持形成特定细胞类型的潜能和分化能力。这种特征也被称为干性，其赋予了干细胞在科研和治疗应用方面广阔的前景。细胞干性受到了广泛关注，特别是如何重新编程体细胞以获得干性。Yamanaka等此前的工作表明，通过强制过表达关键转录因子，能够由体细胞产生万能干细胞(pluripotent stem cells)，从而建立了一种操纵干性的新方法(Takahashi和Yamanaka,2006)。从那时起，已大力致力于设计更加安全和更加有效的用于诱导性万能干细胞(iPS)的方法，如利用蛋白(Kim等，2009；Zhou等，2009)、RNA(Warren等)、microRNA(Anokye-Danso等)或特定的化学品(Shi等，2008；Zhu等)。尽管已证实这些方法在操纵所述细胞的干性方面是有效的，但是其效率和风险控制仍有待改进。因此，仍需寻找重新编程细胞的替代方法。
发明概述
本申请的一个方面涉及将细胞重新编程的方法，所述方法包括在允许形成三维(3D)细胞聚集体的条件下培养所述细胞，其中所述细胞被诱导进行重新编程。
在某些实施方式中，在低粘附基质上培养所述细胞，以形成三维细胞聚集体。在某些实施方式中，所述低粘附基质包括亲水性的和电中性的水凝胶层。在某些实施方式中，所述低粘附基质包括疏水性表面。
在某些实施方式中，在悬挂在支持材料上的培养基液滴中悬浮培养所述细胞，以使得形成三维细胞聚集体。
在某些实施方式中，所述三维细胞聚集体是多细胞和多层细胞聚集体。在某些实施方式中，所述三维细胞聚集体具有球样形状。
在某些实施方式中，所述细胞被重新编程以上调一种或多种干细胞标记物。在某些实施方式中，所述细胞被重新编程以上调一种或多种转分化标记物。
在某些实施方式中，所述方法还包括向所述培养物中引入诱导剂。在某些实施方式中，所述诱导剂是能够诱导细胞重新编程的蛋白。在某些实施方式中，所述诱导剂是编码蛋白的核酸，所述蛋白能够诱导细胞重新编程。在某些实施方式中，所述诱导剂是能够诱导细胞重新编程的化合物。
本申请的另一个方面涉及使用本申请中提供的任意方法获得的重新编程细胞。
本申请的另一个方面涉及使用本申请中提供的任意方法获得的重新编程三维细胞聚集体。
本申请的另一个方面涉及用于将细胞重新编程的试剂盒，所述试剂盒含有低粘附基质和，任选地，培养基。
附图简述
图1：RT4细胞的3D球体的形成导致干细胞标记物的表达：
A.在单层(左图)和球体培养物(右图)中RT4细胞的相差图像。比例尺＝200μm。
B.在单层和球体培养物中的RT4细胞干细胞标记基因的定量PCR(Q-PCR)分析结果。
C.在单层和7天球体培养物中的RT4细胞NANOG和SOX2表达情况的Western印迹结果。使用畸胎瘤细胞系PA-1作为阳性对照。
图2：RT4细胞的3D球体的形成产生具有癌干细胞特征的细胞。
A.在单层(左图)和7天球体培养物(右图)中迁移细胞的定量分析结果。
B在单层和7天球体培养物中的RT4细胞上皮间质转化(EMT)相关基因的Q-PCR分析结果。
C.RT4细胞的裸鼠肿瘤形成试验结果汇总表。单层表示单层培养物经胰酶消化的RT4细胞；球体表示球体经胰酶消化的RT4细胞。
图3：在3D球体中培养的人胚肾(HEK293)细胞部分获得了胚胎干细胞的表型。
A.在单层(左图)和球体培养物(右图)中HEK293细胞的相差图像。比例尺＝200μm。
B.在单层和球体培养物中的HEK293细胞干细胞标记基因的Q-PCR分析结果。
C.在单层和10天球体培养物中的HEK293细胞NANOG和SOX2表达情况的Western印迹结果。
D.表示在单层HEK293和球体HEK293细胞中的OCT4、NANOG和SOX2/OCT4转录活性的荧光素酶试验(n＝3)。载体表示对照荧光素酶报告子。(M)表示单层HEK293细胞并且(S)表示10天球体HEK293细胞。
E.在单层(图中的上部分)和10天球体培养物(图中的下部分)中的HEK293细胞的OCT4、NANOG和SOX2的转录调控区的亚硫酸氢盐基因组测序。将起始位点设定为+1。空心圆表示未被甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(CpG)，而实心圆表示甲基化的CpG。
F.在单层和球体培养物中的HEK293细胞胚胎干(ES)细胞标记基因的Q-PCR分析结果。
G.在单层和10天球体培养物中的HEK293细胞内胚层、中胚层和外胚层标记基因的Q-PCR分析结果。
H.在单层(左图)和10天球体培养物(右图)中的HEK293细胞的碱性磷酸酶(AP)染色结果。
I.HEK293细胞的裸鼠肿瘤形成试验结果汇总表。“A”表示胰酶消化的在单层培养物中的HEK293细胞；“B”表示胰酶消化的HEK293细胞球；“C”表示未经胰酶消化的HEK293球。
图4：在后肾间质和完全分化的肾单位中表达的基因的Q-PCR分析结果。
A.肾单位的示意图。
B-F.在单层、5天球体培养物和10天球体培养物中的在后肾间质(B)、肾小球(足细胞)(C)、近曲小管(D)、亨勒襻(Henle’s loop)(E)、远曲小管和集合管(F)中表达的基因的Q-PCR分析结果。
图5：小鼠胚胎成纤维(MEF)细胞的3D球体的形成导致部分胚胎干细胞表型。
A.在单层(左图)和球体培养物(右图)中MEF细胞的相差图像。比例尺＝200μm。
B.在单层和7天球体培养物中的MEF细胞干细胞标记基因的Q-PCR分析结果。
C.在单层和12天球体培养物中的MEF细胞干细胞标记基因的Q-PCR分析结果。
D.在单层和7天球体培养物中的MEF细胞Sox2表达情况的Western印迹分析结果。
E.在单层(左图)和7天球体培养物(右图)中的MEF细胞的碱性磷酸酶染色结果。
图6：MEF细胞的3D球体形成导致神经球的表型。
A.在单层和7天球体培养物中的MEF细胞标记基因的Q-PCR分析结果。
B.在单层和12天球体培养物中的MEF细胞标记基因的Q-PCR分析结果。
C.在单层和球体培养物中的MEF细胞Tuj1和Gfap表达情况的Western印迹。使用小鼠神经球作为阳性对照。
D-H.在单层MEF和来源于7天球体的粘附MEF中Tuj1(D)、神经丝蛋白(E)、S100(F)、Gfap(G)和GABA(H)阳性的细胞百分率。
I.由丁基化的羟基苯甲醚(BHA)进行神经源性分化后的MEF标记基因的Q-PCR分析结果。
图7：GFP和神经元标记物在体内均为阳性的移植MEF的百分率。
A-E.GFP和神经元标记物在体内均为阳性的移植MEF的百分率，神经元标记物包括Tuj1(A)、GFAP(B)、S100(C)、NeuN(D)或MAP2(E)。
图8：小鼠尾尖成纤维(TTF)细胞的3D球体的形成导致出现神经细胞。
A.在单层(左图)和球体培养物(右图)中的TTF的相差图像。比例尺＝200μm。
B.在单层和7天球体培养物中的TTF Sox2表达情况的Western印迹分析结果。
C.在单层和7天球体培养物中的TTF标记基因的Q-PCR分析结果。
D-E.单层TTF和来源于7天球体的粘附TTF中Tuj1(D)和S100(E)阳性的细胞百分率。
图9：MCF-7细胞的3D球体的形成导致干细胞标记物的上调。
A.在单层(左图)和球体培养物(右图)中的MCF-7细胞的相差图像。
B.在单层和球体培养物中的MCF-7细胞标记基因的Q-PCR分析结果。
图10：大鼠成骨细胞的3D球体的形成导致一些干细胞标记物的上调。
A.在单层(左图)和球体培养物(右图)中的大鼠成骨细胞的相差图像。
B.在单层和球体培养物中的大鼠成骨细胞标记基因的Q-PCR分析结果。
图11：鼠神经元干细胞的3D球体的形成导致干细胞标记物的上调。
A.在单层(左图)和球体培养基(右图)中的大鼠神经元干细胞的相差图像。
B.在单层和球体培养物中的大鼠神经元干细胞标记基因的Q-PCR分析结果。
图12A-J：一些干细胞标记物的示例性蛋白序列。
图13A-R：一些转分化标记物的示例性蛋白序列。
发明详述
本申请提供了在允许形成三维细胞聚集体和诱导所述细胞进行重新编程的条件下重新编程细胞的方法。本申请还提供了使用本申请所述的方法重新编程的细胞。本申请还提供了用于使用本申请所述的方法重新编程细胞的组合物和试剂盒。
本申请的一个方面涉及重新编程细胞的方法，所述方法包括在允许形成三维细胞聚集体的条件下培养所述细胞，其中所述细胞被诱导进行重新编程。
在本申请中使用的术语“重新编程(reprogram)”或“重新编程(reprogramming)”指诱导分化细胞以产生一个或多个干细胞特征的过程。
分化细胞是一种细胞，其致力于成为或已经成为特化细胞，并显示出这种特化细胞的一种或多种生物学或功能特征。分化细胞可以部分分化，其中所述细胞没有完成成为特化细胞的过程并且不含有所述特化细胞的全部特征。部分分化细胞还可以包括在还原至非特化细胞过程中的并且已经丧失了所述特化细胞的某些特征的特化细胞。分化细胞可以是终末分化的，其中所述细胞已完成成为特化细胞的过程并且含有所述特化细胞的全部特征。本申请所使用的术语“分化细胞”包括部分分化细胞和/或终末分化细胞。
干细胞是具有能分化成各种特化细胞类型潜能的细胞。干细胞可以是万能性的(pluripotent)，即能够分化成大多数类型的特化细胞，如胚胎干细胞。干细胞可以是多能性的(multipotent)，即能够分化成某些类型的特化细胞，如骨髓干细胞或造血干细胞。干细胞可以是单能性的(unipotent)，即能够分化成特定类型的特化细胞。干细胞可以是全能性的(totipotent)，即受精卵。本申请所使用的术语“干细胞”包括具有上述各种潜能水平的任意和全部类型的干细胞。
本申请的方法可以用于重新编程任意细胞，所述细胞在允许形成三维细胞聚集体的培养条件下能够被诱导以显示出一种或多种干细胞的生物学和/或功能性特征。在某些实施方式中，本申请的待重新编程的细胞为贴壁细胞。贴壁细胞是为了在体外生长需要粘附于固体基质的细胞(参见John M.Davis,Animal Cell Culture:Essential Methods.(动物细胞培养：基本方法)，John Wiley&Sons 2011年出版，4.2章；Jennie P.Mather等，Introduction to Cell and Tissue Culture:Theory and Technique(细胞和组织培养介绍：理论和技术)，Springer出版,1998,p.64-65)。在悬浮培养基中，贴壁细胞不能生长或存活，或者生长或存活较差。贴壁细胞通常来源于实体组织和器官。贴壁细胞的例子包括但不限于：内皮细胞、平滑肌细胞、上皮细胞和成纤维细胞。
在某些实施方式中，贴壁细胞在悬浮培养基中的存活率低于15％。在某些实施方式中，贴壁细胞在悬浮培养基中的存活率低于10％。在某些实施方式中，贴壁细胞在悬浮培养基中的存活率低于5％。在某些实施方式中，贴壁细胞在悬浮培养基中的存活率低于1％。细胞存活率根据在细胞培养基中的活细胞数占细胞总数的百分率计算。可以采用公知的方法测量细胞活力，如碘化丙啶染色。
在某些实施方式中，待通过本申请的方法进行重新编程的本申请的细胞是体细胞。体细胞的例子包括但不限于成纤维细胞(例如小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)、小鼠尾尖成纤维(TTF)细胞和人成纤维细胞样滑膜细胞(HFL))、膀胱细胞(例如人膀胱乳头状瘤(RT4)细胞)、幼仓鼠肾(BHK21)细胞、卵巢细胞(例如中国仓鼠卵巢(CHO-K1)细胞)、宫颈细胞(例如HeLa细胞)、肌细胞、胚胎细胞(例如人胚胎肾(HEK)293细胞、NIH3T3细胞)、肺细胞(例如人胎肺成纤维(MRC-5)细胞、MRC-9细胞)、肝细胞(例如Hep G2细胞)、上皮细胞(例如WPE干细胞)、内皮细胞(例如HUV-EC-C细胞)、脑细胞(例如T98G细胞)、骨细胞(例如KHOS-240S细胞)。在某些实施方式中，所述体细胞是非癌细胞。
在某些实施方式中，所述体细胞是癌细胞如乳腺癌细胞(例如MCF-7细胞、MDA-MB-231细胞、MDA-MB-435细胞或SK-BR-3细胞)、结肠癌细胞(例如DLD-1细胞、HCT-15细胞、T84细胞、HCT-8细胞)、肾癌细胞(例如A-498细胞、769-P细胞、G401细胞)、肺癌细胞(例如NCI-H2126细胞、DMS 79细胞、A549细胞)、肝癌细胞(例如Hep G2细胞)、宫颈癌细胞(例如HeLa细胞)、神经胶质瘤细胞(例如M059K细胞、LN-18细胞)、神经元细胞(例如大鼠嗜铬细胞瘤(PC12)细胞、人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞、前列腺癌细胞(例如DU145细胞、LNCaP细胞)和骨肉瘤细胞(例如KHOS/NP细胞)。
在某些实施方式中，通过本申请所述的方法将部分分化的所述细胞诱导进行重新编程。在某些实施方式中，通过本申请所述的方法将干细胞诱导进行重新编程。
在某些实施方式中，本申请提供了一种重新编程细胞的方法，所述方法包括在允许形成三维细胞聚集体的条件下在体外培养所述细胞，其中所述细胞被诱导进行重新编程。在某些实施方式中，所述培养条件是低粘附条件。低粘附条件指所述细胞不粘附于固体基质或者所述细胞在所述固体基质上的粘附降低或被抑制的培养环境。在某些实施方式中，当与常规粘附条件相比时，在低粘附条件下，细胞在基质上的粘附降低至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。可以由市售的细胞培养瓶提供常规粘附条件，例如康宁细胞培养皿(例如目录号430589未经处理的细胞培养皿(纽约，US)或目录号3353002猎鹰TM细胞培养皿(纽约，美国)或目录号715001 NEST细胞培养皿(无锡，中国))。
在某些实施方式中，所述低粘附条件由低粘附基质提供，所述低粘附基质减少或抑制细胞粘附于其表面(参见John M.Davis，同上)。在某些实施方式中，所述低粘附基质包括使用减少或抑制细胞粘附的材料包被的细胞培养容器(例如皿、板、圆底管或瓶)。在某些实施方式中，这种材料含有亲水性的和电中性的水凝胶层。本申请所使用的“水凝胶”指由一定量的水构成的半固体组合物，并且其中溶解或分散有聚合物或混合物。在某些实施方式中，所述水凝胶由聚苯乙烯制成。在某些实施方式中，所述聚苯乙烯选自以下组：聚苯乙烯-嵌段-聚(N-异丙基丙烯酰胺)-嵌段-聚苯乙烯、聚(苯乙烯-共-马来酸酐)(SMA)、聚(苯乙烯-二乙烯基苯)(P(ST-DVB))、聚(苯乙烯磺酸)(PSSA)、聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-共-α-甲基苯乙烯)、聚苯胺-聚(苯乙烯磺酸酯)(Pan-PSS)、聚(苯乙烯-嵌段-(甲氧基二甘醇丙烯酸酯)-嵌段-苯乙烯)和聚(4-苯乙烯磺酸酯钠)。
在某些实施方式中，所述水凝胶由琼脂、琼脂糖制成。在某些实施方式中，所述低粘附基质包被浓度范围为0.2至5.0％的琼脂糖。在某些实施方式中，所述低粘附基质包被浓度范围为1-5％的琼脂。
在某些实施方式中，所述水凝胶由聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)制成。在某些实施方式中，所述低粘附基质使用浓度范围为40-50％的聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)包被。
在某些实施方式中，所述低粘附基质上包被有水凝胶与培养基的混合物(例如杜尔贝科改良的伊格尔培养基(DMEM)或McCoy’5A培养基)。
在某些实施方式中，减少或抑制细胞粘附的所述材料能够调节靶细胞的细胞外蛋白的功能，从而减少所述细胞与所述基质的粘附。所述细胞外蛋白抑制剂的例子包括但不限于蛋白聚糖(参见例如Yamagata,M.等，Journal of Biological Chemistry,264(14):8012-8018,1989)，氢化可的松或放线菌酮结合的肝素、L-氮杂环丁烷-2-羧酸、胰酶和乙二胺四乙酸(EDTA)、分散酶、葡聚糖、聚环氧乙烷、合成肽如甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸-脯氨酸，甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸(参见例如Whalen,G.F.等，Ann.Surg.,210(6):758-764,1989)。
在某些实施方式中，将减少或抑制细胞粘附的材料包被于所述低粘附基质的表面上作为层或薄膜或膜。在某些实施方式中，将减少或抑制细胞粘附的材料包埋于所述基质中。
在某些实施方式中，所述低粘附基质包含疏水性表面。在某些实施方式中，疏水性表面由具有疏水性组分的聚合物和共聚物薄膜形成。在某些实施方式中，所述疏水性表面由聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚(环氧乙烷)-聚(甲基丙烯酸甲酯)(PEO-PMMA)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、全氟聚醚(PFPE)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚苯乙烯(PS)形成。
任意适宜的培养基均可以用于本申请的方法中。常用培养基的例子包括但不限于DMEM()、RPMI 1640()、McCoy's 5A(Hyclone,Thermo Scientific)和DMEM/营养混合物F-12(DMEM/F12,)。
在另一个方面，在悬挂在支持材料如皮氏培养皿(petri dish)底部和滚瓶壁上的培养基液滴中悬浮培养所述细胞。在某些实施方式中，所述培养基液滴的体积不超过1ml、2ml、3ml、4ml或5ml。在某些实施方式中，所述培养基的液滴悬挂于倒置的培养容器如皮氏培养皿的底部。
在某些实施方式中，所述细胞在旋转或振荡或静止状态下培养。
在某些实施方式中，所述重新编程细胞的方法包括在缺乏以悬浮、飘浮或其他方式处于培养基中的任何支持基质或结构的条件下培养所述细胞。
本申请所使用的术语“三维细胞聚集体”指生长成三维(3D)形状而不是细胞单层的细胞。三维细胞聚集体可以在二维、三维或多维基质中生长。在某些实施方式中，本发明的三维细胞聚集体是多细胞和多层细胞聚集体。在某些实施方式中，本发明的三维细胞聚集体是球样形状的。在某些实施方式中，本发明球样形状的细胞聚集体能够维持稳定的形态若干周。在某些实施方式中，所述三维细胞聚集体的直径为至少10μm、15μm或20μm。
在某些实施方式中，重新编程所述细胞以上调一种或多种干细胞标记物。所述干细胞标记物是干细胞特有的基因和蛋白。在本申请所述的方法中使用的干细胞标记物的例子包括但不限于Oct4、Nanog、Sox2、Klf4、c-Myc、Lin28、Rex1、Tdgf1、Leftb、Ebaf、Grb7、Podxl、Nodal、Fgf4、Nestin、Gdf3、Dax1、Nat1、Esg1、S1c2a3、Sox1、Olig2和Pax6。这些干细胞标记物(核苷酸和蛋白)的NCBI(美国国家生物技术信息中心)参考编号如下表1所示。示例性的蛋白序列也在图12A-J中显示。
表1
在某些实施方式中，所述干细胞标记物可以是胚胎干细胞标记物如Oct4、Nanog、Sox2、Rex1、Gdf3、Dax1、Nat1、Esg1、S1c2a3、Tdgf1、Leftb、Ebaf、Grb7、Podxl和Fgf4。
在某些实施方式中，所述干细胞标记物可以是肾干细胞标记物如Pax2、Wt1、整合素α8、Sall1、Lim1、Ncam1、Six2、Frizzled 2、Frizzled 7、Acvr2b和Ntrk2。
在某些实施方式中，所述干细胞标记物可以是神经干细胞标记物如Sox2(Episkopou,2005；Reynolds和Weiss,1992)。
可以通过干细胞标记物的存在或缺乏，或通过干细胞标记物在基因水平或蛋白水平的增加或减少，来鉴定利用本申请方法的细胞的重新编程。在某些实施方式中，通过本申请的方法诱导不表达干细胞标记物的所述细胞进行重新编程以表达一种或多种干细胞标记物。在某些实施方式中，通过本申请的方法诱导表达一种或多种干细胞标记物的所述细胞进行重新编程以表达额外的一种或多种干细胞标记物。在某些实施方式中，本申请所述的重新编程细胞在基因水平和/或蛋白水平表达至少二、三、四或五种干细胞标记物。
在某些实施方式中，本申请所述的经重新编程的细胞所表达的至少一、二、三、四、五或六种干细胞标记物的基因和/或蛋白水平增加，所述干细胞标记物选自以下组：Oct4、Nanog、Sox2、Klf4、c-Myc和Lin 28。在某些实施方式中，本申请所述的经重新编程的细胞所表达的至少一、二、三、四或五种干细胞标记物的基因和/或蛋白水平增加，所述干细胞标记物选自以下组：Oct4、Nanog、Sox2、Klf4和c-Myc。
在某些实施方式中，使用本申请所述方法对细胞进行的重新编程导致细胞在基因水平上调干细胞标记物Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4，而在蛋白水平上调干细胞标记物Nanog和Sox2。
在另一个方面，本申请的方法还能够转分化细胞，其中将部分或终末分化的细胞转化成不同类型的分化细胞，或将诱导后的干细胞转化成特化细胞，所述特化细胞与诱导前的特化细胞的类型不同。
在某些实施方式中，所述转分化细胞通过一个或多个转分化标记物表征。本申请所使用的术语“转分化标记物”指能够用于鉴定细胞转分化的特征性基因和/或蛋白。
转分化标记物的例子可以包括例如内胚层标记物如Foxa2、Afp、Sox17和Pdx-1，中胚层标记物如Branchyury和Msx1，外胚层标记物如巢蛋白、Otx2和Tp63，肾小球标记物如Nphs1、Actn4、Cd2ap、Cdh3、Pdpn和Podxl，肾近曲小管标记物如Aqp1、Clcn5、Cubn、Lrp2和Slc5a1，肾亨勒襻标记物如Umod和Pkd2以及肾远曲小管和集合管标记物如Scnn1a和Pkd1，神经元标记物如Map2、NeuN、Tuj1、NF-L、NF-M和NF-H，星形胶质细胞标记物如Gfap、S100A和S100B以及寡突胶质细胞标记物如Mbp和Ng2，以及神经元特异性转录因子如Pax6、Sox1、Otx2、Zic1、NeuroD1和Olig2。上文所述的转分化作用标记物的NCBI参考编号如下表2所示。示例性的蛋白序列如图13 A-R所示。
表2
在某些实施方式中，使用本申请所述的方法重新编程的细胞既显示出干细胞标记物又显示出转分化标记物。例如，本申请的所述方法能够诱导胚胎细胞HEK293上调某些干细胞标记物(例如Six2、Frizzled2、Frizzled7、Acvr2b和Ntrk2)以及某些转分化标记物(例如Nphs1、Actn4、Cd2ap、Cdh3、Aqp1、Clcn5、Cubn、Umod、Pkd2、Scnn1a、Pkd1)，其表明所述HEK293细胞已被转分化为成熟的肾细胞。
在另一个方面，本申请所述的方法还包括向所述培养物中引入诱导剂，所述诱导剂能够诱导分化细胞转化成干细胞。诱导剂可以是任意化学或生化物质，包括但不限于小分子化合物、核苷酸、肽或其任意组合。
在某些实施方式中，所述诱导剂是能够诱导细胞重新编程的蛋白。此种蛋白的例子包括但不限于Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4、Nanog和Lin28。所述蛋白能够在适宜的宿主细胞中重组表达并且使用本领域公知的方法(例如亲和层析)纯化。能够使用本领域公知的方法将所述蛋白递送至所述细胞。例如，可以由链球菌溶血素O介导的可逆性渗透将蛋白递送至细胞质，链球菌溶血素O在质膜上形成孔从而使得蛋白能够递送(参见例如Walev,I.等，PNAS,98(6):3185-3190,2001；Cho,H.J.等，Blood,116:386-395,2010)。另一个例子，可以将所述蛋白与转导结构域如HIV tat和聚精氨酸融合，其能够介导所述蛋白向细胞质的跨膜递送(参见例如Zhou,H.等，Cell stem cell,4:381-384,2009)。
在某些实施方式中，所述诱导剂是编码蛋白的多核苷酸，所述蛋白能够诱导细胞重新编程。这种多核苷酸的例子包括但不限于编码Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4、Nanog和Lin28的多核苷酸。当将所述多核苷酸引入将进行重新编程的细胞时，其能够被表达以产生能够刺激所述重新编程的基因产物。所述多核苷酸可以是含有编码序列和启动子的表达盒或表达载体，其易于使用分子克隆技术(例如制备cDNA随后插入质粒载体)构建并且能够通过转染的方法(例如使用脂质体转染试剂或磷酸钙)引入细胞。
在某些实施方式中，所述诱导剂是能够诱导细胞重新编程的化合物。此种化合物的例子包括但不限于BIX-01294和BayK8644(参见例如Shi等，cell stem cell,3:568–574,2008)、丙戊酸和5’氮杂胞苷。
在另一个方面，本申请提供了一种使用本申请所述的方法获得的重新编程的细胞。在某些实施方式中，此种重新编程细胞显示出至少一、二、三、四、五或六种干细胞标记物的上调。在某些实施方式中，这种重新编程的细胞在基因和/或蛋白水平显示出至少一、二、三、四、五或六种选自以下组的干细胞标记物的上调：Oct4、Nanog、Sox2、Klf4、c-Myc和Lin28。在某些实施方式中，这种重新编程的细胞显示出至少一、二、三、四、五或六种干细胞标记物的上调和至少一、二、三、四、五或六种转分化标记物的上调。
在另一个方面，本申请提供了使用本申请所述的方法获得的重新编程的三维的细胞聚集体。在某些实施方式中，所述重新编程的细胞聚集体具有球样形状。在某些实施方式中，所述重新编程的细胞聚集体的直径为至少10μm、15μm或20μm。
在另一个方面，本申请提供了一种用于重新编程细胞的试剂盒，所述试剂盒含有低粘附基质和培养基。在某些实施方式中，所述试剂盒还含有说明书。在某些实施方式中，所述低粘附基质含有琼脂糖或聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)。
本申请的重新编程方法和重新编程的细胞或细胞聚集体可用于在体外或体内产生所需的细胞或组织。此种细胞或组织能够用于创伤愈合、神经再生、组织再生、药物筛选等。
在本说明书中引用的所有出版物和专利均通过引用整体并入本申请。
实施例
参照下述的实施例将更加易于理解本发明，但是实施例并非旨在以任何方式限制本发明的范围。下文所描述的所有特定的组合物、材料和方法均全部或部分落入本发明的范围。这些特定的组合物、材料和方法均并非旨在限制本发明，而仅是解释落入本发明范围的特定实施方式。在无需进行创造性的劳动并且不脱离本发明的范围的情况下，本领域的技术人员可以开发出等效的组合物、材料和方法。应当理解的是，可以在本申请所述的程序中进行多种改变，但其仍在本发明的范围内。发明人认为这种改变均包括在本发明的范围内。
实施例1：细胞培养
分别在McCOY’5A(HYCLONE)和DMEM(HYCLONE)中培养RT4和人胚肾(HEK)293细胞。
小鼠胚胎成纤维(MEF)细胞来源于E13.5天的ICR小鼠胚胎。对于海马移植实验，使用绿色荧光蛋白(GFP)转基因小鼠。简言之，除去头、四肢、内脏组织和脊柱后，将所分离胚胎的剩余部分切成小块，随后进行胰酶消化。通过离心从胰酶消化组织的上清液中收集细胞，然后重悬于新鲜培养基中。将P0 MEF细胞生长至融合，随后进行传代。将P2 MEF细胞进一步用于2D和3D培养。
从24小时ICR小鼠分离小鼠尾尖成纤维(TTF)细胞。简言之，将尾部的前1/4-1/5部分切成小块，然后接种在细胞培养皿上并培养2-3天。在约72小时后细胞开始从小块中迁移出来。再培养2-3天后，将迁移出来的所述细胞传代。将P3 TTF细胞进一步用于2D和3D培养。
对于3D培养而言，通过使用软凝胶包被细胞培养皿制备低粘附培养皿，所述软凝胶通过将1％熔化的琼脂糖凝胶与等量的2×DMEM培养基混合制备。将3×106个RT4或HEK293细胞转移至60mm低粘附培养皿。将6×106个MEF细胞或TTF细胞转移至60 mm低粘附培养皿。
对于2D培养而言，使用常规的细胞培养皿，不使用任何软凝胶包被所述培养皿。
实施例2：RT4细胞的重新编程
分别通过单层贴壁培养(2D)和球体培养(3D)培养人膀胱乳头状瘤细胞系RT4细胞。我们使用的是含10％胎牛血清的完全生长培养基，而不是补充了含生长因子的无血清培养基。
2.a.RT4细胞的细胞形态
如图1A(左图)所示，通过单层贴壁培养在常规粘附培养皿上培养人膀胱乳头状瘤细胞系RT4细胞，并且RT4细胞显示出上皮细胞的形态。相反，在图1A(右图)中，在低粘附培养皿上培养的RT4细胞从所述培养板上脱离并且形成维持若干周的悬浮的3D球体。
2.b.RT4球体的干细胞特征
使用定量PCR(Q-PCR)确定干细胞标记物的表达水平。简言之，使用Trizol LS试剂(英骏公司)从所述细胞中分离总RNA，然后与逆转录酶反应混合物(SuperScriptIII第一链合成系统，英骏公司)和寡-dT引物(英骏公司)混合。使用Power SYBR GreenRT-PCR试剂盒(应用生物系统公司)进行Q-PCR。使用GADPH作为对照以归一化cDNA输入。结果表示为在待测培养物中待测标记物的表达水平与在2D培养物中的相比的变化倍数。数据以平均值±标准偏差表示，N＝3。使用Student’s T检验确定是否所述3D培养细胞的结果与所述2D培养细胞的结果具有统计学差异。在图中使用1个星号(*,P<0.05)或两个星号(**,P<0.01)表示统计学差异的显著性。除非另有明示，在实施例和图中的所有Q-PCR研究均使用类似的方法。
对所述基因表达进行定量PCR分析的结果表明，与单层培养物组相比，在球体培养物组中OCT4、NANOG、SOX2、KLF4和c-MYC均上调(图1B，在Q-PCR分析中使用的引物列于下表3)。分别使用针对NANOG(1:5000稀释，艾碧康公司)和SOX2(1:200稀释，英骏公司)的一抗和与辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗进行western印迹，结果(图1C)表明在RT4球体中NANOG和SOX2的蛋白水平均显著上调。
2.c.RT4细胞的癌干细胞特征
通过“侧群”(SP)鉴别实验检测干细胞的百分率，该方法是一种利用干细胞的染料外排性质检测干细胞百分率的流式细胞术方法。简言之，将细胞使用胰酶消化并单独使用5ug/ml Hoechst 33342(西格玛公司)或使用5ug/ml Hoechst 33342(西格玛公司)和50ug/ml维拉帕米(西格玛公司)在37℃下孵育90分钟。将所述细胞旋转沉淀并在去除死细胞后，使用FACSVantage SE(BD生物科学公司)进行流式细胞术细胞分选(FACS)分析。在球体培养物组中SP细胞的百分率为0.83±0.32％，相比之下在单层培养物组中为0.37±0.12％。
通过transwell实验检测RT4细胞的迁移能力，并使用结晶紫对迁移细胞进行染色。简言之，将使用2D或3D方法培养的细胞血清饥饿24小时，随后进行胰酶消化并重悬于无血清培养基中。将细胞悬液接种在24孔transwell板(康宁公司)的含8um小孔的上室，并且在下室中填入补充了10％FBS的培养基。24小时后，将响应FBS向下室迁移的细胞用0.1％的结晶紫染色，并且在显微镜下计数染色的细胞。对所述迁移的RT4细胞的定量分析表明，球体培养物促进了细胞的迁移能力(图2A)。各实验组计数4个随机视野，并且所述结果以平均值±标准偏差表示。
通过Q-PCR检查与上皮间质转化(EMT)相关的基因表达。结果显示与单层相比在RT4球体中FOXC2、SNAIL和ZEB2上调(图2B，在Q-PCR分析中使用的引物列于下表3)。
我们进行了体内裸鼠肿瘤形成实验。将细胞皮下注射至4-5周龄裸鼠(8BALB/c-nu)的背部侧面。如图2C所示，在14只小鼠中有11只出现了1×106个单层RT4细胞形成的肿瘤，而在14只小鼠中有14只出现了1×106个球体来源的RT4细胞形成的肿瘤。而且，1×104个单层RT4细胞不能形成任何肿瘤，而1×104个球体来源的细胞在14只小鼠中的4只形成了肿瘤(图2C)。所述数据表明RT4肿瘤细胞的3D球体培养物促进了癌干细胞的性质。
实施例3：HEK293细胞的重新编程
3.a.HEK293细胞的细胞形态
HEK293细胞是原始来源于人胚胎肾细胞的非癌细胞系。粘附于细胞培养皿的HEK293细胞显示出了单层上皮细胞的形态(图3A左)，而培养在低粘附培养皿上的HEK293形成悬浮的3D球体(图3A右)。
3.b.HEK293细胞的干细胞特征
将2D培养的和3D培养的HEK293细胞通过Q-PCR和Western印迹的方法确定某些干细胞标记物的表达情况。对已知的iPS诱导因子进行Q-PCR分析，显示与单层培养物相比，在5和10天时在球体培养物中OCT4、NANOG、SOX2、KLF4和LIN28均上调(图3B，在Q-PCR分析中使用的引物列于下表3)。Western印迹分析也显示在球体培养物组中NANOG和SOX2的蛋白水平与单层组相比更高(图3C)。一抗和二抗与实施例2中的相同。
还使用报告基因检测和亚硫酸氢盐基因组测序，对2D培养的和3D培养的HEK293细胞的干细胞标记物的转录活性进行了比较。
对于报告基因检测而言，使用OCT4、NANOG或SOX2/OCT4结合序列(即Oct4-Luc载体(通过将6W增强子插入具有tk启动子的PGL3载体构建而成)、Nanog-Luc载体(通过将Nanog结合位点P5N与p37tk荧光素酶载体的SalI位点连接构建而成，亦参见：Pan,G.等,Journal of Biological Chemistry,280:1401-1407(2005))和Sox2/Oct4-Luc载体(通过将含有6个拷贝的Oct4/Sox2结合寡核苷酸的序列克隆至PGL3载体FGF-4启动子的上游构建而成))的荧光素酶报告构建体转染来自2D或3D培养物的HEK293细胞。根据标准方案(普洛麦格公司)进行荧光素酶检测。我们发现在3D培养的细胞中的OCT4、NANOG和SOX2/OCT4蛋白具有更高的转录活性(图3D)。
对于亚硫酸氢盐基因座测序而言，使用Epi-Tect亚硫酸氢盐试剂盒(凯杰公司)进行亚硫酸氢盐处理，并分别使用下表3所示引物，通过PCR(Hotstar HiFidelity DNA聚合酶)扩增OCT4、NANOG和SOX2的转录调控区。将PCR产物亚克隆至pMD18-T载体中，各样品随机挑出20个克隆并测序。亚硫酸氢盐基因组测序分析评估了在OCT4、NANOG和SOX2转录调控区胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(CpG)的甲基化状况，其结果表明，在HEK293球体中的甲基化状况比在单层HEK293细胞中的低(图3E)。
对2D和3D培养的HEK293细胞进行进一步检测，以确定其是否显示出任何未分化的ES细胞的特征。对若干未分化ES细胞标记基因mRNA表达情况的Q-PCR分析显示，在HEK2933D细胞中REX1、TDGF1、LEFTB、EBAF、GRB7、PODXl和FGF4上调(图3F，在Q-PCR分析中使用的引物列于下表3)。对HEK293球向内胚层、中胚层和外胚层分化能力的Q-PCR分析表明，在球中内胚层标记物(FOXA2、AFP、SOX17和PDX-1)、中胚层标记物(BRANCHYURY和MSX1)和外胚层标记物(NESTIN、OTX2和TP63)均上调(图3G，在Q-PCR分析中使用的引物列于下表3)。利用碱性磷酸酶(AP)染色对碱性磷酸酶的表达进行检测。如图3H所示，在HEK293球细胞中AP染色为阳性，而在单层细胞中为阴性。
通过体内裸鼠肿瘤形成实验检测了HEK293球的致肿瘤性。将3×106个HEK293单层细胞和在球体培养物中的3×106个HEK293细胞分别皮下注射至4-5周龄裸鼠的背部侧面。如图3I所示，我们发现HEK293单层细胞不能形成任何肿瘤，而HEK293球体在7只小鼠中3只的皮下组织中形成了肿瘤，胰酶消化的球体细胞在7只小鼠的1只中形成了肿瘤。未检测到明确的内胚层、中胚层和外胚层结构，表明这些肿瘤与由ESC形成的畸胎瘤之间可能存在某些差异。这些结果表明以3D球体式培养的HEK293细胞能够部分地产生胚胎干细胞表型。
实施例4：HEK293细胞的转分化
在这个实施例中，检测了HEK293细胞向肾干细胞表型的重新编程活性，还检测了其向肾脏中不同类型的终末分化细胞的转分化重新编程活性。
肾祖细胞位于后肾间充质中，其进一步分化为肾单位，所述肾单位由肾小球(足细胞)、近曲小管、享勒襻、远曲小管和集合管组成(图4A)。
对2D培养和3D培养的HEK293细胞中的后肾间充质特异性基因和肾祖细胞细胞标记物的表达情况进行了检测。对后肾间充质特异性基因表达情况的Q-PCR分析表明，在HEK293球中PAX2、WT1、INTEGRIN a8、SALL1、LIM1和NCAM1均上调。在HEK293球中，肾祖细胞细胞标记物SIX2、FRIZZLED 2、FRIZZLED 7、ACVR2b和NTRK2也上调(图4B，在Q-PCR分析中使用的引物列于下表3)。这些结果表明HEK293形成球体能够促进肾干细胞的表型。
针对肾单位分化标记物对2D培养和3D培养的HEK293细胞进行进一步检测。对肾小球、近曲小管、享勒襻、远曲小管和集合管分化标记物的Q-PCR检测表明，当以3D细胞的形式培养5和10天后，HEK2931球的肾小球标记物(NPHS1、ACTN4、CD2AP、CDH3、PDPN和PODXl)、近曲小管标记物(AQP1、CLCN5、CUBN、LRP2和SLC5A1)、享勒襻标记物(UMOD和PKD2)以及远曲小管和集合管标记物(SCNN1a和PKD1)均显著上调(图4C-F，在Q-PCR分析中使用的引物列于下表3)。数据表明，球体培养能够促进肾组织的特异性去分化，其伴随向成熟的肾单位的重分化。
实施例5：MEF细胞的重新编程
为进一步评估球体培养对原代细胞的影响，将MEF培养成球体。当粘附于细胞培养皿时，MEF显示出分枝状的细胞质包绕椭圆形细胞核的典型形态，而在低粘附培养板培养时其形成3D球体(图5A)。通过Q-PCR检测了iPS诱导因子和若干未分化的ES细胞标记物的表达情况。在培养7和12天后，与单层EMF相比，在MEF球体中Sox2、Gdf3、Dax1和Slc2a3的表达增加(图5B，在Q-PCR分析中使用的引物列于下表3)。虽然在MEF球中Oct4、Nanog和Klf4没有上调(图5B和5C)，但通过Western印迹确证了在MEF球中Sox2蛋白具有较高的水平，这与在畸胎瘤细胞系PA-1中的相当。相反，通过Western印迹在单层MEF中未检测到Sox2的表达(图5D)。进行AP染色以确定碱性磷酸酶的表达情况。如图5E所示，在MEF球中可见阳性AP染色，但是在单层MEF中却不存在。这些数据表明MEF的球体培养能够促进一些胚胎干细胞基因的表达。
实施例6：MEF和TTF细胞转分化成神经元细胞
鉴于在MEF球体中Sox2具有较高的表达，我们检测了MEF球体是否获得了神经球的性质。如图6A-B所示，MEF球体在培养7和12天后Nestin上调。我们还分析了在MEF球体中与分化的神经元、星形细胞和寡突胶质细胞相关基因的表达情况。在MEF球体中神经元标记物(Map2、NeuN、Tuj1、NF-L、NF-M和NF-H)、星形细胞标记物(Gfap、S100A和S100B)和寡突胶质细胞标记物(Mbp和Ng2)均上调(图6A-B，数据以平均值±标准偏差表示，N＝4)。在MEF球中若干神经特异性转录因子(Pax6、Sox1、Otx2、Zic1、NeuroD1和Olig2)的表达也升高(图6A-B)。在培养1、3、5和7天后在MEF球体中检测到了Tuj1和Gfap蛋白，并且其随着时间的推移而增加，但是其在单层MEF中不表达(图6C)。
当MEF球体再粘附于细胞培养皿时，在球体中的细胞回迁到皿上形成单层。我们将这些回迁的细胞称为球来源的贴壁细胞。进行免疫细胞化学染色，并获得了单层细胞和球体培养细胞的免疫荧光图像。对于各细胞培养物而言，取四个典型的图像，通过使用图中的阳性细胞数除以细胞总数计算针对特性标记物的阳性细胞百分率。结果显示，在球来源贴壁细胞中，一些细胞的Tuj1(图6D)、神经丝(图6E)、S-100(图6F)和Gfap(图6G)为阳性，而在单层MEF中为阴性(图6D-G)。此外，我们发现在MEF球来源细胞中，一些细胞被针对GABA的抗体所标记，GABA是脑中主要的神经元抑制性神经递质(图6H)。所述数据表明3D球体培养能够重新编程MEF以获得神经球性质。使用包括抗-Tuj1(1:500稀释，密理博公司)、抗-GFAP(1:500稀释，密理博公司)、抗-神经丝(1:1000稀释，艾碧康公司)、抗-S100(1:100稀释，西格玛公司)、抗-GABA(1:3000稀释，西格玛公司)的一抗以及包括Dylight 488偶联的亲和纯化的驴抗小鼠IgG(1:400稀释，杰克逊免疫研究所)和Alexa Fluor 488驴抗家兔IgG(1:1000稀释，英骏公司)的二抗进行免疫细胞化学染色。
接下来我们检测了是否MEF球在神经诱导培养基中能够获得神经细胞的表型。尝试了若干方法，包括RA、SHH、N2(数据未列出)和BHA，仅BHA是有效的。诱导10天后，单层MEF未显示出明显的形态改变，而来源于MEF球的细胞显示出具有大量分枝的长神经突样形态。Q-PCR结果显示与对照相比BHA诱导的单层MEF的大多数神经标记物保持不变或下调。相反，在MEF球体组中，BHA诱导后，大多数神经标记物进一步上调，包括Sox2、Nestin、Map2、Gfap、Tuj1、Nf-L、S100B、Ng2、NeuN、NeuroD1和Pax6(图6I，在Q-PCR分析中使用的引物列于下表3)。这些数据表明BHA能够促进球体MEF向神经细胞的转化。
海马是脑内的一种特殊结构，整个成年期的神经形成发生在其中。为进一步评估MEF球体在体内的神经球特征，将GFP标记的单层MEF和球体MEF移植入大鼠的海马中，并在2和4周时分析其存活和分化的能力。与2周时相比，在4周时在单层组中GFP阳性细胞的数量显著降低，而球体MEF的数量未显示出明显的降低，这表明球体MEF具有更高的生存能力。如图7A-E所示，移植2周和4周后，GFP阳性的球体MEF能够被针对Tuj1、GFAP、S100、NeuN和MAP2的抗体检测，而在单层MEF中的GFP阳性细胞不表达这些神经标记物(数据以平均值±标准偏差表示，N＝4)。这些结果表明球体MEF能够在体内产生活的神经细胞。而且，在球体MEF中存在NeuN和MAP2阳性的细胞，这表明在植入后能够产生成熟的神经元。
单层TTF显示出典型的成纤维细胞形态，而在低粘附培养板上培养的TTF形成了悬浮的3D球体(图8A)。尽管在TTF球体中一些胚胎干细胞特异性基因(Nanog、Gdf3、Dax1、Nat1和Esg1)未出现上调，但是western印迹和Q-PCR分析显示，与单层TTF相比，在TTF球体中sox2的mRNA和蛋白表达均显著上调(图8B和8C)。Q-PCR分析也显示，与单层TTF相比，在TTF球中神经元标记物Nf-L、星形细胞标记物Gfap和S100B、寡突胶质细胞标记物Ng2以及若干神经特异性转录因子Pax6、Sox1和Zic1均具有较高的表达(图8C)。进行免疫细胞化学染色并使用与[0099]段中提供的类似的方法计算染色阳性细胞的百分率。所述结果表明，在衍生自TTF球体单层细胞中，有一些细胞针对神经元标记物Tuj1和星形细胞标记物S100为阳性，而这些标记物在单层TTF中为阴性(图8D-E，数据以平均值±标准偏差表示，N＝4)。这些数据表明小鼠出生后的成纤维细胞的3D球体能够促进重新编程并且还显示出了神经球的性质。
实施例7：MCF-7细胞的重新编程
在高DMEM葡萄糖培养基(HYCLONE)中培养人乳腺癌细胞系MCF-7细胞系。
对于3D培养而言，使用软凝胶包被细胞培养皿来制备低粘附培养皿，所述软凝胶通过将1％熔化的琼脂糖凝胶与等量的2×DMEM培养基混合制备。将3×106个MCF-7细胞转移至60mm低粘附培养皿中。
几天后，在3D培养物中的MCF-7细胞生长为球体(见图9A右图)，而在常规2D细胞培养皿中培养的MCF-7细胞形成单层(见图9A左图)。
对在2D培养物中形成的MCF-7单层和在3D培养物中形成的MCF-7球体通过Q-PCR检测若干干细胞标记基因的表达情况。如图9B所示，在MCF-7球体中，所有检测的干细胞标记物均上调，包括Oct4、Nanog、Sox2、c-Myc、Klf4、Lin 28、Rex1、Fgf4、Esg1、Tdgf1、Leftb、Ebaf、Grb7、Podx1和Nestin。这些数据表明MCF-7细胞的球体培养促进了一些干细胞标记基因的表达，包括一些胚胎干细胞标记基因。
实施例8：大鼠成骨细胞的重新编程
在高DMEM葡萄糖培养基(HYCLONE)中培养大鼠成骨细胞。大鼠成骨细胞从1日龄大鼠的颅骨中原代分离得到。
对于3D培养而言，使用软凝胶包被细胞培养皿制备低粘附培养皿，所述软凝胶通过将1％熔化的琼脂糖凝胶与等量的2×DMEM培养基混合制备。将3×106个大鼠成骨细胞转移至60mm低粘附培养皿中。
几天后，在3D培养物中的大鼠成骨细胞生长为球体(见图10A右图)，而在常规2D细胞培养皿中培养的大鼠成骨细胞形成单层(见图10A左图)。
对在2D培养物中形成的单层和在3D培养物中形成的球体通过Q-PCR检测若干干细胞标记基因的表达情况。如图10B所示，在大鼠成骨细胞球中一些检测的干细胞标记物上调，包括Oct4、Nanog、Sox2、Lin 28、Fgf4、Nodal和Gal。一些标记基因如c-Myc、Klf4和Rex1下调。这些数据表明，球体培养诱导大鼠成骨细胞进入重新编程过程，其结果为使得一些干细胞标记基因上调，包括一些胚胎干细胞标记基因。
实施例9：大鼠神经元干细胞的重新编程
在DMEM/F12(HYCLONE)中培养大鼠神经元干细胞。大鼠神经元干细胞从1日龄大鼠的脑中原代分离得到。
对于3D培养而言，使用软凝胶包被细胞培养皿制备低粘附培养皿，所述软凝胶通过将1％熔化的琼脂糖凝胶与等量的2×DMEM培养基混合制备。将3×106个大鼠神经元干细胞转移至60mm低粘附培养皿中。
几天后，在3D培养物中培养的大鼠神经元干细胞生长为球体(见图11A右图)，而在常规2D细胞培养皿中培养的大鼠神经元干细胞形成单层(见图11A左图)。
对在2D培养物中形成的单层和在3D培养物中形成的球体通过检测Q-PCR若干干细胞标记基因的表达情况。如图11B所示，在大鼠神经元干细胞球中一些检测的干细胞标记物上调，包括Nanog、Klf4、Fgf4和Nodal。一些标记基因如Sox2、c-Myc、Lin28和Ga1下调。这些数据表明球体培养诱导大鼠神经元干细胞进入重新编程过程，其结果使得一些干细胞标记基因上调。
表3：引物序列
参考文献
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Claims (34)

1.一种将细胞重新编程的方法，所述方法包括：
在允许形成三维细胞聚集体的条件下培养所述细胞，其中所述细胞被诱导进行重新编程。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在低粘附基质上培养所述细胞。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述低粘附基质包括可降低细胞粘附的材料。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述材料包括亲水性的和电中性的水凝胶层。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述材料选自以下组：琼脂、琼脂糖和聚(甲基丙烯酸-2-羟基乙酯)。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述琼脂糖的浓度范围为0.2至5.0％。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述琼脂糖与培养基混合。
8.根据权利要求3所述的方法，其中所述材料包被于所述低粘附基质的表面上。
9.根据权利要求3所述的方法，其中所述材料包括聚苯乙烯。
10.根据权利要求2所述的方法，其中所述低粘附基质包括疏水性表面。
11.根据权利要求1所述的方法，其中在悬挂于支持材料上的培养基液滴中悬浮培养所述细胞。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述液滴的体积不超过1ml。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述培养基液滴悬挂于倒置的培养容器的底部。
14.根据权利要求1-13任意一项所述的方法，其中在旋转、振荡或静止状态下培养所述细胞。
15.根据权利要求1-14任意一项所述的方法，其中在缺乏任何支持材料的培养基中培养所述细胞。
16.根据权利要求1-15任意一项所述的方法，其中所述细胞是体细胞。
17.根据权利要求1-15任意一项所述的方法，其中所述细胞是干细胞。
18.根据权利要求1-15任意一项所述的方法，其中所述细胞选自以下组：HEK293细胞、成纤维细胞和癌细胞。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述成纤维细胞是小鼠胚胎成纤维细胞或尾尖成纤维细胞。
20.根据权利要求1-19任意一项所述的方法，其中所述三维细胞聚集体是多细胞和多层细胞聚集体。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述三维细胞聚集体具有球样形状。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述三维细胞聚集体的直径至少为10um。
23.根据权利要求1-22任意一项所述的方法，其中所述细胞被重新编程以上调一种或多种干细胞标记物。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述干细胞标记物选自以下组：Oct4、Nanog、Sox2、Klf4、c-Myc、Lin28、Rex1、Tdgf1、Leftb、Ebaf、Grb7、Podxl、Nodal、Fgf4、Nestin、Gdf3、Dax1、Slc2a3、Sox1、Olig2和Pax6。
25.根据权利要求1-22任意一项所述的方法，其中所述细胞被重新编程以上调一种或多种转分化标记物。
26.根据权利要求1-25任意一项所述的方法，所述方法还包括向所述培养物中引入诱导剂。
27.根据权利要求23所述的方法，其中所述诱导剂是能够诱导细胞重新编程的蛋白。
28.根据权利要求23所述的方法，其中所述诱导剂是编码蛋白的核酸，所述蛋白能够诱导细胞重新编程。
29.根据权利要求23所述的方法，其中所述诱导剂是能够诱导细胞重新编程的化合物。
30.根据权利要求1所述的方法，其中在体外培养所述细胞。
31.一种使用权利要求1-30任意一项所述的方法获得的重新编程的细胞。
32.一种使用权利要求1-30任意一项所述的方法获得的重新编程的三维细胞聚集体。
33.一种用于将细胞重新编程的试剂盒，所述试剂盒包括低粘附基质和培养基。
34.根据权利要求33所述的试剂盒，其中所述材料是琼脂、琼脂糖或聚(甲基丙烯酸-2-羟基乙酯)。
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