WO2023176931A1 - 体細胞から多能性幹細胞を製造する方法、それを用いて製造した分化細胞、およびそれらを製造するための浮遊培養装置 - Google Patents

体細胞から多能性幹細胞を製造する方法、それを用いて製造した分化細胞、およびそれらを製造するための浮遊培養装置 Download PDF

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WO2023176931A1
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somatic cells
somatic
cell
culture
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PCT/JP2023/010357
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Inventor
優子 山本
正義 塚原
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公益財団法人京都大学ｉＰＳ細胞研究財団
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material

Definitions

  • the present invention relates to techniques for establishing and inducing pluripotent stem cells.
  • Pluripotent stem cells especially iPS cells (also called “induced pluripotent stem cells” or “induced pluripotent stem cells”), can be produced from somatic cells and are used in basic research and pharmaceutical innovation. , and is attracting attention as something that brings various benefits to regenerative medicine.
  • pluripotent stem cells have been cultured in a scaffold-dependent (2D) manner, for example on a culture dish, on a material that serves as a scaffold.
  • 2D scaffold-dependent
  • Patent Document 2 describes (a) a step of manufacturing cardiomyocytes from pluripotent stem cells, (b) a step of manufacturing endothelial cells from pluripotent stem cells, (c) a step of manufacturing parietal cells from pluripotent stem cells, (d) mixing the parietal cells produced in step (c) at a proportion of less than 30% with the cardiomyocytes produced in step (a) and the endothelial cells produced in step (b); e) A method for producing myocardial tissue is disclosed, comprising the step of culturing the cell mixture obtained in step (d) above in the presence of an extracellular matrix to form a three-dimensional structure.
  • a method using suspension culture is disclosed as an example of a process for producing cardiomyocytes from pluripotent stem cells.
  • suspension culture (dispersed culture) cannot adhere to the scaffold, making it difficult to culture cells that require attachment to the scaffold for cell proliferation. Since cells are unable to exhibit their original cell functions when colonizing a tissue or the like consisting of multiple cells, it may not be possible to culture cells that have functions.
  • the present invention was made in view of this background, and its purpose is to be able to establish and induce pluripotent stem cells without relying on scaffolding materials and without a detachment process, and to perform suspension culture.
  • a method for producing pluripotent stem cells from somatic cells which facilitates automated culture and large-scale culture, and allows for the production of pluripotent stem cells of improved quality, differentiated cells produced using the method, and
  • the object of the present invention is to provide a suspension culture device for producing them.
  • a method for producing pluripotent stem cells from somatic cells including the following steps: (1) A step of culturing somatic cells in a scaffold-independent manner, (2) aggregating two or more of the somatic cells; (3) A step of bringing the somatic cells into contact with a reprogramming factor.
  • the immunomagnetic beads have binding molecules that bind to somatic cells.
  • the binding molecule has a molecule that binds to at least one CD antigen selected from the group consisting of CD34, CD45, CD3, CD4, CD8, CD14, and CD90.
  • the somatic cells are human somatic cells.
  • the human somatic cells are blood-derived cells, skin-derived cells, dental pulp-derived cells, or urine-derived cells.
  • the human somatic cells are CD34-positive cells.
  • the method according to any one of [1] to [10], wherein the number of somatic cells aggregated in the step (2) is 100 to 10,000,000.
  • the method according to any one of [1] to [10], wherein the number of the somatic cells aggregated in the step (2) is 279,000 or more.
  • the aggregation promoting section includes a magnet, The suspension culture device according to [14], wherein the somatic cells have immunomagnetic beads that can be reversibly bound and separated, and the immunomagnetic beads are attracted to the magnet to promote aggregation of the somatic cells.
  • pluripotent stem cells can be established and induced without relying on scaffolding materials and without a detachment process.
  • culture automation and mass culture are easy, and quality can be improved.
  • a method for producing pluripotent stem cells from somatic cells that can obtain improved pluripotent stem cells, differentiated cells produced using the method, and a suspension culture device for producing them are obtained.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing an example of a process for obtaining cardiomyocytes using blood as a somatic cell sample according to an example of the present embodiment.
  • 1 is a schematic diagram showing an apparatus for producing pluripotent stem cells according to an example of the present embodiment.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing a method for producing pluripotent stem cells from somatic cells using blood collected from a subject according to an example of the present embodiment as a somatic cell sample.
  • FIG. 2 is a schematic diagram illustrating a 3D study process for manufacturing and culturing pluripotent stem cells according to an example of the present embodiment.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing a test process for establishing various conditions for the method for producing pluripotent stem cells of this example.
  • FIG. 2 is a photographic diagram showing a tube in which static culture was performed in this example. It is a photographic diagram showing the process of verifying pluripotent stem cells in this example.
  • FIG. 2 is a photographic diagram of immunostaining in Step A for tubes under condition 1 of this example. It is a photographic diagram of immunostaining in Step B for the tube under Condition 1 of this example. It is a photographic diagram of immunostaining in Step A for tubes under condition 2 of this example. It is a photographic diagram of immunostaining in Step B for tubes under condition 2 of this example. It is a photographic diagram of passage (P3) cells of this example.
  • FIG. 2 is a graph diagram showing the results of FCM analysis of the undifferentiated marker of this example.
  • FIG. 3 is a photographic diagram of immunostaining of the differentiation of three lung lobes in this example.
  • FIG. 3 is a diagram showing the expression level of myocardial differentiation in this example. It is a schematic diagram of the establishment process of 3D suspension culture of this example.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing the next step in the 3D floating culture establishment process of this example.
  • FIG. 2 is a photographic diagram showing a tube on the 11th day of static culture in this example. It is a photographic diagram showing an observation of adherent culture (control). It is a photographic diagram showing the observation of 2 ⁇ 10 4 cells seeded by aggregating floating culture cells with a magnet. It is a photographic diagram showing the observation of 1 ⁇ 10 6 cells seeded by aggregating floating culture cells with a magnet.
  • FIG. 2 is a photographic diagram of bright field microscopic observation of cells subjected to myocardial differentiation in this example.
  • FIG. 2 is a microscopic photograph of cells gathered in the magnet section of this example.
  • FIG. 3 is a photographic diagram illustrating the cell seeding conditions of this example.
  • the term “comprise” means that components other than the target component may be included.
  • the term “consist of” means that there are no components other than the component in question.
  • the term “consist essentially of” does not include components other than the target component in a manner that exerts a special function (such as a manner in which the effect of the invention is completely lost). means.
  • the term “comprise” includes both “consist of” and “essentially consist of.”
  • Proteins polypeptides
  • peptides polynucleotides (DNA, RNA), vectors, and cells can be isolated. "Isolated” means separated from its natural state.
  • the proteins (polypeptides), peptides, polynucleotides (DNA, RNA), vectors, and cells described herein include isolated proteins (isolated polypeptides), isolated peptides, isolated It can be isolated polynucleotides (isolated DNA, isolated RNA), isolated vectors, and isolated cells.
  • gene refers to a polynucleotide that contains at least one open reading frame that encodes a specific protein.
  • a gene may contain only exons, or may contain exons and any one or more of introns, 5'UTRs, and 3'UTRs.
  • the invention provides a method of producing pluripotent stem cells from somatic cells.
  • the method for producing pluripotent stem cells from somatic cells includes (1) culturing somatic cells in a scaffold-independent manner, (2) aggregating two or more somatic cells, (3) ) contacting the somatic cell with the reprogramming factor.
  • Step of culturing somatic cells in a scaffold-independent manner The step of culturing somatic cells in an anchorage-independent manner may be performed as the first step of obtaining somatic cells, or may be performed in any or all of the subsequent culturing operations performed in steps (2) and (3). This may be performed by culturing somatic cells in a scaffold-independent manner.
  • somatic cells in this embodiment are not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose.
  • somatic cells include fetal somatic cells, mature somatic cells, and the like.
  • Specific examples of mature somatic cells include tissue stem cells (somatic stem cells) such as mesenchymal stem cells, hematopoietic stem cells, adipose tissue-derived stromal cells, adipose tissue-derived stromal stem cells, neural stem cells, and sperm stem cells; tissue progenitor cells Already differentiated cells such as fibroblasts, epithelial cells, lymphocytes, and muscle cells; and the like.
  • tissue stem cells such as mesenchymal stem cells, hematopoietic stem cells, adipose tissue-derived stromal cells, adipose tissue-derived stromal stem cells, neural stem cells, and sperm stem cells
  • tissue progenitor cells already differentiated cells such as fibroblasts, epithelial cells, lymphocytes, and muscle cells;
  • the somatic cells are selected from blood-derived cells, skin-derived cells, dental pulp-derived cells, and urine-derived cells. Further, from the step of aggregating cells described below, it is more preferable that the somatic cells are CD34-positive cells.
  • the biological species from which the somatic cells are derived is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose.
  • Examples of biological species from which somatic cells are derived include any mammals such as humans, mice, rats, cows, sheep, horses, and monkeys.
  • human somatic cells can be particularly preferably used as the somatic cells.
  • the individual from which the somatic cells are derived is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose.
  • the individual to whom the regenerative medicine is applied or the MHC of the individual to whom the regenerative medicine is applied Other individuals of the same or substantially the same type are preferred.
  • the term "substantially the same MHC type" means that when cells obtained by inducing differentiation from the somatic cell-derived iPS cells are transplanted into an individual, the transplanted cells may be affected by the use of an immunosuppressant or the like. This means that the MHC types match to the extent that engraftment is possible.
  • the somatic cells may be recombinant somatic cells into which allogeneic genes have been introduced to facilitate the selection of iPS cells.
  • recombinant cells include recombinant cells that have integrated at least one of a reporter gene and a drug resistance gene into the locus of a gene specifically highly expressed in pluripotent cells.
  • genes that are highly expressed specifically in pluripotent cells include the Fbx15 gene, the Nanog gene, and the Oct3/4 gene.
  • reporter genes include green fluorescent protein (GFP) gene, luciferase gene, ⁇ -galactosidase gene, and the like.
  • the drug resistance genes include a blasticidin gene, a hygromycin gene, a puromycin resistance gene, a neomycin resistance gene, and the like.
  • Culturing somatic cells in an anchorage-independent manner broadly refers to culturing without being held by a member or material that serves as a scaffold, but particularly refers to cultures other than adherent culture, particularly dispersion culture and suspension culture.
  • Suspension culture refers to culturing cells in a culture container in a non-adherent state, and other conditions are not particularly limited. Cultivation can be carried out by leaving the culture solution still, or by stirring or the like. Specifically, the floating culture operation can be carried out using a culture container that has not been artificially treated to improve adhesion with cells.
  • Such artificial treatments include surface treatments with extracellular matrix substances (eg, collagen), but in this embodiment, for example, a culture vessel that has not been subjected to such treatments is used.
  • Other examples include culture vessels that have been artificially treated to suppress adhesion. More specific operations for suspension culture include, for example, the technique described in International Publication No. 2011/007900.
  • somatic cells are not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose.
  • the culture temperature may be approximately 37° C.
  • the CO 2 concentration may be approximately 2% to 5%
  • the O 2 concentration may be approximately 5% to 20%.
  • the medium used for culturing somatic cells is not particularly limited, and can be appropriately selected depending on the purpose. Examples include minimal essential medium (MEM), Dulbecco's modified medium (DMEM), RPMI 1640 medium, 199 medium, F12 medium, etc., containing 5% by mass to 20% by mass of serum. In this specification, when the concentration is simply expressed as "%”, it means “volume %".
  • Aggregating two or more cells refers to an operation that causes two or more cells to approach or adhere to each other to some extent.
  • the means for approaching or fixing can be selected as appropriate, and may be physical or chemical. For example, it may be an interaction with another molecule, particle, etc. attached to the cell, or an interaction with a chemical substance or other substance on the cell surface.
  • the cells may be associated with other particles that are magnetic or capable of being magnetic, and the magnetism may cause the cells to approach or stick together and aggregate.
  • the distance between aggregated somatic cells is preferably 1 ⁇ m or less.
  • the number of somatic cells aggregated in step (2) is preferably 100 to 10,000,000. Further, it is more preferable that the number is between 10,000 and 1,000,000. If the number of cells is too small, the efficiency of aggregation in one operation will be poor, and if the number of cells is too large, the aggregation means (for example, magnetic particles) will not be able to aggregate cells efficiently. More preferably, the number of somatic cells to be aggregated is 279,000 or more.
  • the step of aggregating two or more somatic cells is (A) A step of bringing the somatic cells into contact with immunomagnetic beads. (B) A step of aggregating the cells bound to the magnetic beads by magnetic force. (C) A step of aggregating the cells that have been in contact with the reprogramming factor for 5 to 30 days. It may also be a process of maintaining.
  • Immunomagnetic beads are beads (particles) that can be magnetic and immunologically bondable to other molecules.
  • immunomagnetic beads include structures that include both molecules that can be magnetic and molecules that can immunologically bind to other molecules (for example, these molecules are bound to each other).
  • the immunomagnetic beads have molecules that bind to somatic cells.
  • the molecule contained in the immunomagnetic beads is a molecule that immunologically binds to any molecule on the surface of a somatic cell.
  • the immunomagnetic beads have at least one CD antigen-binding molecule selected from the group consisting of CD34, CD45, CD3, CD4, CD8, CD14, and CD90.
  • CD34, CD45, CD3, CD4, CD8, CD14, and CD90 examples of molecules that bind to these antigens include antibodies.
  • Antibodies may be composed of polypeptides, nucleic acids or other molecules.
  • immunomagnetic beads it is preferable that particles capable of being magnetized, such as particles having a magnetic material as a component, have molecules on the surface of the particles that bind to somatic cells.
  • the type of magnetic material is not particularly limited, iron or the like can be used.
  • Immunomagnetic beads with magnetic materials and antibodies are conventionally commercially available, such as kits containing magnetic beads with CD34 antibodies, EasySep Human CD34 Pos Selection Kit II (StemCell Technologies), CliniMACS® CD34 GMP MicroBeads ( Miltenyi) etc. can be used.
  • immunomagnetic beads with a diameter smaller than that of the cells can be used, for example, but the diameter is 1 ⁇ m or less as a guide. Further, the amount added is preferably such that the number of beads is greater than the number of cells, and more preferably 10 times or more the number of cells.
  • the immunomagnetic beads may be added to a liquid containing the somatic cells, and the beads may be allowed to stand or be stirred for a certain period of time to bring them into contact.
  • the liquid containing somatic cells may be a culture solution when the somatic cells are cultured in the liquid.
  • the somatic cell sample itself is a liquid (for example, a body fluid such as blood or urine)
  • the immunomagnetic beads may be added to the liquid as a liquid containing somatic cells.
  • Step of aggregating cells bound to magnetic beads by magnetic force The step of aggregating cells bound to magnetic beads is not limited as long as they can be aggregated. For example, they may be aggregated by applying magnetic force from the outside. For example, by placing a magnet adjacent to the outside of a container containing cells and leaving the container undisturbed for a certain period of time, the cells may be aggregated at a portion of the container adjacent to the magnet. On the other hand, by simply leaving cells bound to immunomagnetic beads in a liquid such as a culture solution or a liquid sample, the somatic cells with the added mass of the immunomagnetic beads tend to precipitate, so they may be aggregated to some extent. You can also do that.
  • the cells are brought into contact with a reprogramming factor to form pluripotent stem cells.
  • a reprogramming factor those conventionally known for producing pluripotent stem cells can be used.
  • the term "reprogramming factor” refers to a substance (group) that, when introduced into a somatic cell, can induce the somatic cell to become a pluripotent stem cell, particularly an iPS cell.
  • the reprogramming factor is not particularly limited as long as it is a substance (group) that can induce pluripotent stem cells from somatic cells.
  • the reprogramming factor may be any substance such as a gene (including a form incorporated into an expression vector) or its gene product, or a low-molecular compound.
  • “Gene product” refers to mRNA transcribed from a gene and protein translated from the mRNA.
  • the gene product used as a reprogramming factor may be mRNA, protein, or both.
  • a gene that is a reprogramming factor refers to a polynucleotide that encodes a protein that is a reprogramming factor.
  • genes of the Oct gene family genes of the Sox gene family, genes of the Klf gene family, genes of the Myc gene family, genes of the Lin gene family, and Nanog genes, and their At least one selected from the group consisting of gene products.
  • the initialization factor includes at least one selected from the group consisting of Oct3/4, Sox2, Klf4, Myc, Lin28, and Nanog.
  • the reprogramming factor is an RNA virus vector. Moreover, it is also preferable that the reprogramming factor is RNA.
  • the differentiated cells of this embodiment are floating differentiated cells produced from the pluripotent stem cells described above.
  • a differentiated cell is a cell that has undergone cell differentiation (hereinafter also simply referred to as differentiation).
  • Cell differentiation refers to cells changing to have specific functions or properties.
  • a specific function or property refers in particular to a function or property of cells present in a specific tissue.
  • the differentiated cells may be of any type, but for example, cardiomyocytes can be used.
  • cardiomyocytes refer to cells expressing at least cardiac troponin (cTnT) or ⁇ MHC.
  • NCBI accession number NM_000364 is exemplified in the case of humans, and NM_001130174 is exemplified in the case of mice.
  • NM_002471 is exemplified in the case of humans, and NM_001164171 is exemplified in the case of mice.
  • the method for inducing differentiated cells from pluripotent stem cells is not particularly limited as long as it is a known method.
  • the method for inducing cardiomyocytes can be carried out in the presence or absence of feeder cells as described in Patent Document 2, and in the presence of feeder cells, pluripotent stem cells are cultured in a medium containing Activin A, Furthermore, a method of culturing in a medium containing BMP4 and bFGF can be used.
  • Figure 1 shows an example of a process for obtaining cardiomyocytes using blood as a somatic cell sample.
  • the entire culturing process is performed by (1) a step of culturing somatic cells in a scaffold-independent manner. First, peripheral blood is collected as a somatic cell sample, and (2) as a step of aggregating two or more somatic cells, (A) immunomagnetic beads containing CD34 antibody are added to the somatic cell sample, and (B) magnetic beads are added to the somatic cell sample.
  • the cells bound to the beads are aggregated by magnetic force (CD34+ cell aggregation), and (C) the reprogramming factor is introduced into the cells using a Sendai virus vector, the aggregation is maintained for 10 to 14 days, and the iPS cells are Establish. Suspension culture is continued for 14 to 28 days to expand the iPS cells, and the iPS cells are induced to differentiate into cardiomyocytes for 28 to 42 days to obtain cardiomyocytes.
  • the second embodiment is a suspension culture device for the method of manufacturing pluripotent stem cells from somatic cells according to the embodiment.
  • the suspension culture device of the present embodiment includes a culture container for aggregating somatic cells in a scaffold-independent manner and contacting the somatic cells with a resetting factor while culturing them in suspension; and an aggregation promoting part that promotes aggregation of cells.
  • FIG. 2 is a schematic diagram of the floating culture device 100 of this embodiment.
  • the floating culture device 100 includes a culture container 10 and an aggregation promoting section 20.
  • the culture vessel 10 may be any culture vessel 10 as long as it is capable of carrying out the suspension culture, culturing the somatic cells in a scaffold-independent manner, and aggregating them while culturing.
  • the culture container 10 is a test tube.
  • the culture container 10 can be made of any type of dish, plate, etc. suitable for various types of cell culture, and the material is not limited.
  • the culture container 10 has no coating or the like applied to the interior of the culture container 10 in contact with the culture medium or details to allow cells to adhere to the container.
  • the culture container 10 includes a culture solution 11, which is a liquid containing somatic cells, and aggregated somatic cells 30.
  • the somatic cells 30 have the immunomagnetic beads of the first embodiment in a state where they can be reversibly bound and separated. It is a state of being combined and possessed. As will be described later, the immunomagnetic beads are aggregated by the magnetic force of the aggregation promoting section 20, and the somatic cells 30 are aggregated on a surface adjacent to the aggregation promoting section 20 in the culture container 10.
  • the culture container 10 is configured so that the reprogramming factor can be brought into contact with the somatic cells 30.
  • the means for bringing the reprogramming factor into contact with the somatic cells 30 includes a supply means for supplying the reprogramming factor, such as a drug solution tube (not shown).
  • the aggregation promoting unit 20 is a means that can promote aggregation of the somatic cells.
  • the aggregation promoting unit 20 is a member that can promote aggregation by applying magnetic force from outside the culture container 10.
  • the aggregation promoting section 20 is made up of a plate-like member and a smaller plate-like member provided at the edge thereof, and is a magnet having an L-shaped side surface. Each of the plate-like members has a built-in magnet, and the aggregation promoting section 20 has magnetic force.
  • the aggregation promoting section 20 is placed adjacent to the culture vessel 10 to apply a magnetic force to the culture vessel 10 and the somatic cells 30 therein, and the immunomagnetic beads promote aggregation of the somatic cells 30 to the magnet of the aggregation promoting section. can do.
  • the long side of the L-shape of the aggregation promotion unit 20 is adjacent to the side surface of the culture container 10, and the short side is adjacent to the bottom surface of the culture container 10, so that the somatic cells 30 are placed on the side surface near the bottom surface of the culture container 10.
  • the aggregation promoting unit 20 may be provided so as to aggregate the somatic cells 30 to other parts of the culture container 10 by making them adjacent to other parts of the culture container 10 .
  • the suspension culture device 100 may be equipped with means suitable for suspension culture, such as stirring means such as shaking, temperature adjustment means for adjusting culture conditions, and means for supplying reagents (for example, medium).
  • stirring means such as shaking
  • temperature adjustment means for adjusting culture conditions such as temperature adjustment means for adjusting culture conditions
  • means for supplying reagents for example, medium.
  • these means may be added and provided as a part of a system for exchanging medium, manufacturing these pluripotent stem cells, or a system for manufacturing differentiated cells.
  • somatic cells 30 in a culture solution 11 are cultured in a culture container 10.
  • the somatic cells 30 are cultured in an aggregated state.
  • the somatic cells 30 can be made into pluripotent stem cells.
  • the third embodiment is an example of a method for manufacturing pluripotent stem cells from somatic cells of the first embodiment or a culture system using the suspension culture device of the second embodiment.
  • This system is an overall 3D culture system (3D-iPSCs) that obtains iPS cells derived from the subject's own somatic cells and differentiates them into cells of specific tissues.
  • a method for producing pluripotent stem cells from somatic cells is used, using blood collected from a subject (human) as a somatic cell sample (Cell separation solution).
  • a liquid containing immunomagnetic beads (Medium A) is added to the somatic cell sample in a culture container, and the cells are agglomerated by magnetic force (N, S) using an aggregation promotion unit equipped with a magnet, and the reprogramming factor (Sev vector) is added to the somatic cell sample.
  • N, S agglomerated by magnetic force
  • Sev vector the reprogramming factor
  • An operation for differentiating iPS cells for example, by adding Medium B, C (in this embodiment, a medium containing Activitin A, BMP4, and bFGF to differentiate into cardiomyocytes), suspending culture, and differentiating to obtain tissue cells (Final Product). .
  • Medium B, C in this embodiment, a medium containing Activitin A, BMP4, and bFGF to differentiate into cardiomyocytes
  • suspending culture for example, by adding Medium B, C (in this embodiment, a medium containing Activitin A, BMP4, and bFGF to differentiate into cardiomyocytes), suspending culture, and differentiating to obtain tissue cells (Final Product).
  • the present inventors cultured and induced differentiation of cells using the first embodiment as a process of 3D-iPSCs Generation and Culture.
  • We developed this system by examining cell photographs and investigating techniques for sphere disintegration and culture scale-up.
  • 3D-iPSCs have cell pluripotency and differentiation potency, can induce and confirm gene expression, and can be used to differentiate into specific tissues, such as cardiomyocyte differentiation. can be effectively induced.
  • Tissue cells can be cultured in large quantities from the subject's autologous somatic cells, and can be suitably applied to regenerative medicine and the like.
  • pluripotent stem cells can be established and induced without relying on a scaffold material and without a detachment step.
  • suspension culture automation of culture and large-scale culture is easy, and pluripotent stem cells with improved quality can be obtained.
  • pluripotent stem cells such as iPS cells
  • a platform that can provide autologous iPS-derived cell therapy at low cost.
  • it is considered essential to complete the process from somatic cells to iPS cells to differentiation induction within a closed automated device in order to stabilize quality and reduce manufacturing costs.
  • Peripheral blood mononuclear cells are floating cells and can be separated from blood using a flow path system. Further, as differentiated cells, for example, cardiomyocyte cells, which the present inventors treat, are also maintained in a suspended state.
  • 2D culture i.e., scaffolding
  • 2D culture i.e., scaffolding
  • the present inventors discovered a new method for establishing iPS cells in a 3D floating state. This method can be applied to a system that performs all steps in 3D, from the establishment of iPS cells from peripheral blood mononuclear cells to myocardial differentiation.
  • pluripotent stem cells induced in a scaffold-independent manner in terms of materials.
  • Such pluripotent stem cells can be expected to maintain high differentiation potential.
  • it can be expected to be applied to automated devices for producing differentiated cells from pluripotent stem cells induced independently of scaffolding materials.
  • various applications can be expected for the method of inducing pluripotent stem cells independent of scaffolding material, and subsequently the method of inducing differentiated cells.
  • the present invention provides a method for improving the quality of pluripotent stem cells, including the method for producing pluripotent stem cells from somatic cells according to the above embodiment.
  • the present invention provides a therapeutic method including a method for producing pluripotent stem cells from the somatic cells of the above embodiment.
  • the present invention provides pluripotent stem cells produced by the method for producing pluripotent stem cells from somatic cells according to the above embodiment.
  • the present invention provides myocardial tissue obtained from floating cardiomyocytes produced from the pluripotent stem cells of the above embodiments.
  • the present invention provides a therapeutic method using floating cardiomyocytes produced from the pluripotent stem cells of the above embodiment.
  • the present invention provides the use of a suspended differentiated cell produced from the pluripotent stem cell of the above embodiment in the production of a differentiated cell.
  • the present invention provides a kit for producing pluripotent stem cells, which includes a magnet, immunomagnetic beads, and a reprogramming factor.
  • the immunomagnetic beads and reprogramming factors may be separated into separate containers, may be combined in one container, or may be grouped into any number of containers. It may also contain a gene transfer reagent, a protein transfer reagent, packaging cells, a buffer, a diluent, and the like.
  • FIG. 5 shows a schematic diagram of the establishment process.
  • CD34-positive cells were expanded and cultured as follows. 6 ⁇ L of each cytokine adjusted to the following concentration ( ⁇ g/mL) was added to 6 mL of StemFit AK03 (w/oC) to prepare a medium for CD34-positive cells. IL-6 50 SCF50 TPO 10 Flt-3L 20 IL-3 20 G-CSF 10 Next, 1 mL of PBS for moisturizing was added to the outer wells of the 24-well plate. The PBMCs were briefly thawed in a water bath at 37°C, and about 1 mL of CD34-positive cell medium was added to completely dissolve them.
  • Centrifugation was performed at 1500 rpm for 5 minutes. The supernatant was removed, the cell walls were loosened by tapping, and then suspended in 1 mL of medium for CD34-positive cells. The suspended cells were counted, seeded in a 24-well plate at 5 ⁇ 10 5 -1 ⁇ 10 6 cells per well, and statically cultured at 37° C. in a 5% CO 2 incubator for 5 days.
  • FIG. 7 shows a schematic diagram of the operations performed.
  • the culture was carried out for 11 days with a magnet (magnetic member) installed on the side of each tube, and in Step A, the cells bound to the magnetic beads were collected in a part of the tube and made into a pellet (cell + (magnetic pellet), the supernatant was removed from each tube, leaving about 1 mL, and collected in a 24-well plate.
  • Step B each tube was removed from the magnet and left to stand at room temperature for about 10 minutes.
  • the cell pellet was suspended and transferred to a 24-well plate.
  • the medium was removed using a micropipette, leaving the medium at a height of approximately 5 mm from the bottom of the well.
  • Add 1 mL of FACS Buffer (2% FBS, 10 nM Y-27632, PBS) and remove FACS Buffer using a micropipette in the same manner. FACS Buffer addition and removal was performed again.
  • TRA-1-60 antibody Alexa Fluor(R) 647 Mouse anti-Human TRA-1-60 Antigen, BD Bioscience
  • FACS Buffer 200 ⁇ L of diluted TRA-1-60 antibody was added to each well. The mixture was protected from light with aluminum foil and incubated at room temperature for 30 minutes. 1 mL of FACS Buffer was added, and the medium was removed using a micropipette, leaving the medium at a height of approximately 5 mm from the bottom of the well. FACS Buffer addition and removal was performed again. Added 300 ⁇ L of FACS Buffer. Thereafter, it was observed using a Keyence fluorescence microscope.
  • FIG. 8 shows a photograph of Step A, that is, the supernatant portion of the culture solution, immunostained with an anti-TRA-1 antibody for the tube under Condition 1.
  • Step A shows a bright field image
  • FIG. 9 shows a photograph of the tube under Condition 1 in Step B, that is, the cell suspension, which was immunostained using an anti-TRA-1 antibody.
  • (a) shows a bright field image
  • (b) shows a TRA-1 staining (fluorescence) image.
  • the cell and TRA-1 signals matched, and the obtained cells were considered to be pluripotent stem cells.
  • FIG. 10 shows a photograph of Step A, ie, the supernatant portion of the culture solution, immunostained with anti-TRA-1 antibody for the tube under Condition 2.
  • Step A ie, the supernatant portion of the culture solution, immunostained with anti-TRA-1 antibody for the tube under Condition 2.
  • (a) shows a bright field image
  • (b) shows a TRA-1 staining (fluorescence) image.
  • FIG. 11 shows a photograph of the tube under Condition 2 in Step B, that is, the cell suspension, which was immunostained using an anti-TRA-1 antibody.
  • (a) shows a bright field image
  • (b) shows a TRA-1 staining (fluorescence) image.
  • the cell and TRA-1 signals matched, and the obtained cells were considered to be pluripotent stem cells.
  • FIG. 12 shows a bright field photograph.
  • (a) shows conditions 1, Step A,
  • (b) shows conditions 1, Step B,
  • (c) shows conditions 2, Step A, and
  • (d) shows conditions 2, Step B. Comparing conditions 1 and 2, even under condition 2, which has a large number of cells, the cell density is not high.In fact, the shape of the cells is better under condition 1, and for culture, condition 1: 2 ⁇ 10 4 cells (2E4) is better than condition 2. :1 ⁇ 10 6 cells (1E6) seemed to be better conditions.
  • the reagents used are as follows. (Product name, manufacturer name, product number, respectively) EasySep (TM) Human Whole Blood CD34 Positive Selection Kit II StemFit AK03, Ajinomoto, - IL-6 (equivalent product available), Wako, 098-06041 SCF (equivalent product available), Wako, 197-15511 TPO (equivalent product available), Wako, 207-17581 Flt-3L (equivalent product available), Wako, 061-05391 IL-3 (equivalent product available), Wako, 090-05761 G-CSF (equivalent product available), Wako, 072-06101 PBMC, PRECISION for medicine, CUSTOM/33000-10M SRV (TM) iPSC-2 Vector, Tokiwa Bio Co., Ltd., S1011694A
  • RBC Lysis buffer was prepared by diluting it 10 times with Otsuka distilled water.
  • PBS 2% FBS + 1mM EDTA
  • Blood was removed from the blood bag with a 50 mL syringe and placed in a 50 mL falcon tube.
  • 4.5 mL of blood was dispensed into two 15 mL round tubes, 4.5 mL of RBC Lysis Buffer was added to each tube and suspended, and 180 uL of Selection Cocktail was added and suspended. The tube was incubated for 15 minutes at room temperature.
  • the supernatant was removed, and 10 mL of PBS (2% FBS + 1 mM EDTA) was added and suspended. Next, it was placed on a magnet, the supernatant was removed, 1 mL of AK03 (w/o C) + 6 cytokine + Sev solution was added, and cultured at 37° C. and 5% CO 2 while being left on the magnet. On the 2nd and 4th day of culture (for each sample), 500 uL of medium for CD34-positive cells was added. Furthermore, on days 7, 9, 11, and 13 of culture, half of the medium was removed and StemFit AK03 medium was added. These were continued to be cultured until the 14th day.
  • Blood was transferred from the blood bag to a vacutainer, mixed by inversion about 10 times, and centrifuged at 1800 g for 20 minutes. The plasma layer was removed and the cell layer was transferred to a 15 mL Falcon tube. Washed with PBS, washed with AK03 (w/oC), and suspended in 1 mL of medium for CD34-positive cells. This suspension was cell counted, seeded in a 24-well plate at 5E5 cells/well, and cultured for 5 days. Then, the cells were collected, counted, and 2 ⁇ 10 4 cells were fractionated, followed by centrifugation at 300G for 5 minutes at 4°C.
  • Vector + medium was added to the cells and incubated in a 37°C incubator for 2 hours, tapping every 30 minutes. Then, 1 mL of AK03 (w/oC) was added and centrifuged at 300G for 5 min at 4°C. The supernatant was removed and tapping was performed.
  • the cell pellet was suspended in 400 uL of CD34 medium and seeded in a 24-well plate. iMatrix was added at 1.8uL/well.
  • 500 uL of AK03 (w/o C) + 6 cytokines was added. The medium was replaced with AK03 on days 7, 9, 11, and 13 of culture. These were continued to be cultured until the 14th day.
  • PBMC start 2D adhesive culture
  • 5 mL of a medium for CD34-positive cells was prepared. The total amount of PBMC after culture was collected and the cells were counted.
  • FIG. 13 shows the results of FCM analysis of undifferentiated markers.
  • the sample name on the horizontal axis is Ff-I14s04: Sample of 2D maintenance and 3D maintenance culture of established iPS cells 11/12: Sample of 3D culture (with magnet aggregation) and 2D adhesive culture using the blood start sample preparation described above 12 /07: Samples subjected to 3D culture (with agglutination by magnet) and 2D adhesive culture using the blood start sample preparation described above.
  • Trilineage differentiation was analyzed using a commercially available kit, STEMdiff (TM) Trilineage Differentiation Kit.
  • TM STEMdiff Trilineage Differentiation Kit.
  • samples adjusted under the conditions of the aforementioned blood-start 3D culture (with agglutination using a magnet) and 2D adhesive culture were used.
  • the expression of Nestin, Pax6, Brachyury, NCAM, FOXA2, and Sox17 was examined for each of Ectoderm, Mesoderm, and Endoderm.
  • FIG. 14 shows a photographic diagram of the staining.
  • three germ layer differentiation no particular difference was observed between 2D and 3D. That is, for differentiation, it seemed possible to use 3D suspension culture in the same way as conventional 2D adherent culture.
  • FIG. 15 is a diagram showing the expression rate of 3D suspension cultured cells (3D-iPSc) of clones with different establishment dates. The horizontal axis shows the date of establishment of each clone.
  • “_m” after the establishment date is a clone that was subjected to the above-mentioned 3D culture of blood start (with agglutination with a magnet)
  • “_a” is a clone that is the same as the 3D culture of blood start, but without adding immunomagnetic beads. Clones that have not been agglomerated are shown.
  • the vertical axis shows the expression rate of TnT.
  • (b) is a bright field view. The results showed that the efficiency in 3D was slightly low. However, even in the induction from 2D iPS cells, which have been established as cell lines, there is a variation of about 20-80%. In strains with good differentiation efficiency using the technique of this example, 50% or more can be guaranteed. We believe that in the 3D iPS of this example, the TnT positive rate can be increased by further examining the process, including the culture conditions before induction.
  • iPS cells cultured in 3D will be clarified by verifying gene expression analysis (microarray), karyotype, genome variation, etc. in the future.
  • the reagents used are as follows. (Product name, manufacturer name, product number, respectively) StemSpan ACF (equivalent product available), STEMCELL Technologies, ST-09855 IL-6 (equivalent product available), Wako, 098-06041 SCF (equivalent product available), Wako, 197-15511 TPO (equivalent product available), Wako, 207-17581 Flt-3L (equivalent product available), Wako, 061-05391 IL-3 (equivalent product available), Wako, 090-05761 G-CSF (equivalent product available), Wako, 072-06101 PBMC, PRECISION for medicine, CUSTOM/33000-10M SRV (TM) iPSC-2 Vector, Tokiwa Bio Co., Ltd., S1011694A D-PBS(-) without Ca and Mg, liquid (equivalent product available), Nacalai 14249-95 ViroMICST, OZ BIOSCIENCE, VMX250 EasySe
  • the equipment used is as follows. (Product name, model number, manufacturer name, respectively) CO2 incubator, 370A, ThermoFisherScientific Countess II, -, ThermoFisherScientific Inverted microscope, CKX41, Olympus fluorescence microscope, BZ-X810, Keyence multi-rack refrigerated centrifuge, AX-511, TOMY EasyEights EasySep Magnet, StemCell Technologies, ST-18103 Cell culture device, Ambr 15, SARTORIUS, -
  • the PBMC cells used were from a 23-year-old female of caucasian ethnicity.
  • the required amount of viral vector was labeled with magnetic beads. Labeling was performed in accordance with the ViroMICST INSTRUCTION MANUAL (OZ Biosciences website) in accordance with the ViroMICST kit usage manual. 53.1 ⁇ L of SRV (TM) iPSC-2 Vector was dispensed into a 1.5 mL tube. Viro-MICST was mixed well by pipetting. Add 50 ⁇ L of Viro-MICST and mix well by pipetting. It was then incubated at room temperature for 20 minutes.
  • 1.9 ⁇ L of the labeled viral vector was added to a tube containing 2 ⁇ 10 4 cells, and 95.46 ⁇ L to a tube containing 1 ⁇ 10 6 cells, and suspended.
  • a medium for CD34-positive cells was added to make the total volume 1 mL, and the mixture was placed on a magnet. Placed in 37°C 5% CO2 incubator.
  • 1 mL of AK03 medium was added to each.
  • days 8, 10, and 12 half of the AK03 medium was replaced.
  • the cells were immunostained with TRA-1-60 as described below and observed using a fluorescence microscope. Further, Fig. 18 shows photographs of visually observed 2 x 10 4 cell seeding and 1 x 10 6 cell seeding on day 13.
  • the supernatant was removed from each tube, leaving about 1 mL. Each tube was removed from the magnet and left to stand at room temperature for about 10 minutes. The cell pellet was suspended and transferred to a 24-well plate. To avoid sucking in the spheres, the medium was removed using a micropipette, leaving the medium at a height of approximately 5 mm from the bottom of the well. 1 mL of FACS Buffer was added, and FACS Buffer was removed using a micropipette in the same manner. FACS Buffer addition and removal was performed again.
  • FIG. 19 shows a photograph of the adherent culture (control).
  • (a) is a bright field observation
  • (b) is a fluorescence microscopy observation of AlexaFluor647:TRA-1-60.
  • FIG. 20 shows a photograph of 2 ⁇ 10 4 cell seeding aggregated with a magnet.
  • (a) is a bright field observation
  • (b) is a fluorescence microscopy observation of AlexaFluor647:TRA-1-60.
  • FIG. 21 shows a photograph of 1 ⁇ 10 6 cell seeding aggregated with a magnet.
  • (a) is a bright field observation
  • (b) is a fluorescence microscopy observation of AlexaFluor647:TRA-1-60.
  • FIG. 22 shows a photograph of cells aggregated with a magnet after 3rd passage (P3).
  • (a) is 2 ⁇ 10 4 cells seeded
  • (b) is 1 ⁇ 10 6 cells seeded.
  • iPS floating cells after passage three times were disrupted using a 100 ⁇ M mesh. Maintenance culture of iPS floating cells was carried out using Ambr. Cells were collected on day 15 of differentiation induction, and microscopic observation and FCM analysis were performed.
  • FIG. 23 shows a photographic diagram of bright-field microscopic observation of cells that underwent myocardial differentiation.
  • the present results showed that establishment of CD34-positive cells and viral vectors labeled with magnetic beads is possible when the number of seeded cells is between 2 ⁇ 10 4 and 1 ⁇ 10 6 cells/tube.
  • the fluorescence of TRA-1-60 was impressive. This may be because the cells are aggregated, or there is a possibility that the expression intensity of each cell is strong.
  • many beads remained, but they were washed with each passage, and it was visually confirmed that the purity of the cells had increased.
  • the 1 x 10 6 cell start had stronger adhesion between cells and beads, and more beads remained even after passage. It was predicted that if the cells were established at a high cell density, spheres would be formed with the beads incorporated, and the bead washing efficiency during passage would be impaired.
  • the reagents used are as follows. (Product name, manufacturer name, product number, respectively) StemFit AK03, Ajinomoto, - IL-6 (equivalent product available), Wako, 098-06041 SCF (equivalent product available), Wako, 197-15511 TPO (equivalent product available), Wako, 207-17581 Flt-3L (equivalent product available), Wako, 061-05391 IL-3 (equivalent product available), Wako, 090-05761 G-CSF (equivalent product available), Wako, 072-06101 PBMC, PRECISION for medicine, CUSTOM/33000-10M SRV (TM) iPS-4 Vector, Tokiwa Bio Co., Ltd., S1011694A D-PBS(-) without Ca and Mg, liquid (equivalent product available), Nacalai 14249-95 EasySep Human CD34 Pos Selection Kit II, StemCell Technologies, ST-17856 Trypan Blue Solution,
  • the equipment used is as follows. (Product name, model number, manufacturer name, respectively) CO2 incubator, 370A, ThermoFisherScientific Countess II, -, ThermoFisherScientific Inverted microscope, CKX41, Olympus fluorescence microscope, BZ-X810, Keyence multi-rack refrigerated centrifuge, AX-511, TOMY Magnet, neodymium magnet bar type (square) 5 x 5 x 10 1-405510, MAGNA EasyEights EasySep Magnet, StemCell Technologies, ST-18103
  • the derived cells used were PBMC from a 24-year-old female of Caucasian ethnicity. Expansion culture of CD34 as a somatic cell sample was performed in the same manner as in Test Example 1.
  • cells were prepared in each well of the plate using the above procedure. 2.79 ⁇ 10 3 , 2.79 ⁇ 10 4 , 2.79 ⁇ 10 5 , and 2.79 ⁇ 10 6 were sown. The medium volume was adjusted to 1.5 mL. The cells were placed in a 5% CO 2 incubator at 37°C to start culturing. On days 2 and 4, 500 ⁇ L of each medium for CD34-positive cells was added. On days 8, 10, and 12, half of the AK03 medium was replaced. It was observed under a microscope on the 14th day. In addition, for cell observation, the number of spheroids (suspended iPS cells) formed in each well was counted.
  • FIG. 24 shows a microscopic photograph of cells gathered on the magnet part.
  • (a) is a visual observation
  • (b) is an observation diagram using a phase contrast microscope.
  • FIG. 25 shows a diagram verifying cell seeding conditions.
  • (a) is a panoramic photographed image of a well in a plate with a magnet.
  • (b) is an enlarged view of spheroids on the plate with magnet, error bars are 50 ⁇ m.
  • (c) is a panoramic image of the wells of the plate without magnets.
  • the number of cells to be seeded is preferably more than 10 4 cells, and more preferably 279,000 or more cells.
  • pluripotent stem cells can be established and induced without relying on scaffolding materials and without a detachment process, and by performing suspension culture, automation of culture and mass culture are easy, A method for producing pluripotent stem cells from somatic cells that can obtain pluripotent stem cells with improved quality, and cardiomyocytes produced using the method.

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Abstract

足場材非依存で剥離の工程を経ずに多能性幹細胞の樹立及び誘導を行うことができ、浮遊培養を行うことにより、培養の自動化及び大量培養が容易であり、品質の向上した多能性幹細胞を得ることができる、体細胞から多能性幹細胞を製造する方法、それを用いて製造した心筋細胞を提供する。（１）体細胞を足場非依存的に培養する工程、（２）２つ以上の前記体細胞を凝集化させる工程、（３）前記体細胞と初期化因子を接触させる工程、を含む体細胞から多能性幹細胞を製造する方法、及びそれを用いて製造した心筋細胞、およびそれらを製造するための浮遊培養装置である。

Description

体細胞から多能性幹細胞を製造する方法、それを用いて製造した分化細胞、およびそれらを製造するための浮遊培養装置
　本発明は、多能性幹細胞の樹立および誘導を行う技術に関する。
　本願は、２０２２年３月１６日に米国に仮出願された米国特許出願番号６３／３２０，２２４号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　多能性幹細胞、特にｉＰＳ細胞（induced pluripotent stem cell;「人工多能性幹細胞」又は「誘導多能性幹細胞」とも呼ばれる。）は、体細胞から産生することができ、基礎研究、医薬の革新、及び再生医療にさまざまな利益をもたらすものとして注目されている。
　従来、多能性幹細胞は足場依存的（２Ｄ）に、例えば培養皿上において、足場材となる素材上で培養されている。このような培養方法としては、例えば特許文献１に記載された技術がある。特に、iPS細胞を体細胞から誘導する場合には、これまで２Ｄでの培養が必須と考えられてきた。そのため、浮遊条件でiPS細胞を誘導した事例は報告されていない。
　一方で、多能性幹細胞を浮遊培養し、ついで心筋細胞を誘導する技術についても開示されている。特許文献２は、（ａ）多能性幹細胞から心筋細胞を製造する工程、（ｂ）多能性幹細胞から内皮細胞を製造する工程、（ｃ）多能性幹細胞から壁細胞を製造する工程、（ｄ）前記工程（ｃ）で製造した壁細胞を３０％未満の割合にて、前記工程（ａ）で製造した心筋細胞および前記工程（ｂ）で製造した内皮細胞と混合する工程、および（ｅ）前記工程（ｄ）で得られた細胞混合物を細胞外マトリックスの存在下で培養して３次元構造体を形成させる工程を含む、心筋組織を製造する方法を開示している。この技術において、多能性幹細胞から心筋細胞を製造する工程の一例として、浮遊培養による方法が開示されている。
国際公開第２０２２／０５０４１９号 国際公開第２０１７／０７３７９４号
　従来の足場依存的な培養方法では、特許文献１のように、足場材を用いて細胞をプレート上に接着させ、また、細胞の継代のたびに剥離と接着を繰り返す操作を行っている。
　しかし、この方法では、継代における細胞の足場材からの剥離の操作を繰り返すたびに、細胞に負担がかかり、変異の増大や細胞へのストレスによって増殖率が低下する。さらに、細胞剥離や回収といった複雑な操作は、自動化することが非常に困難であり、自動化のためには複雑かつ高価な自動化システムが必要となる。そのため、前述する基礎研究、医薬の革新、及び再生医療への大規模な応用が困難であった。
　一方で、浮遊培養（分散培養）は、足場への接着ができないため、細胞増殖のために足場への接着を必須とする細胞を培養することが難しい。細胞が複数細胞からなる組織等への定着時における本来の細胞機能を発揮できないため、機能を有する細胞を培養することができない場合がある。
　本発明はこのような背景を鑑みてなされたものであり、その目的は、足場材非依存で剥離の工程を経ずに多能性幹細胞の樹立及び誘導を行うことができ、浮遊培養を行うことにより、培養の自動化及び大量培養が容易であり、品質の向上した多能性幹細胞を得ることができる、体細胞から多能性幹細胞を製造する方法、それを用いて製造した分化細胞、およびそれらを製造するための浮遊培養装置を提供することにある。
　本発明は以下の態様を含む。
［１］　次の工程を含む、体細胞から多能性幹細胞を製造する方法：
（１）体細胞を足場非依存的に培養する工程、
（２）２つ以上の前記体細胞を凝集化させる工程、
（３）前記体細胞と初期化因子を接触させる工程。
［２］　前記工程（２）が次の工程を含む、［１］の方法：
（Ａ）前記体細胞と免疫磁気ビーズとを接触させる工程、
（Ｂ）前記免疫磁気ビーズと結合した前記体細胞を磁力により凝集化させる工程、
（Ｃ）前記初期化因子と接触した前記体細胞を５～３０日間凝集化を維持する工程。
［３］　前記初期化因子が、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、およびＮａｎｏｇからなる群から選択される、少なくとも１つを含む［１］又は［２］の方法。
［４］　前記初期化因子がＲＮＡウイルスベクターである、［３］の方法。
［５］　前記初期化因子がＲＮＡである、［４］の方法。
［６］　前記免疫磁気ビーズが体細胞と結合する結合分子を有する、［２］の方法。
［７］　前記結合分子が、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１４、およびＣＤ９０からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤ抗原と結合する分子を有する［６］の方法。
［８］　前記体細胞がヒト体細胞である、請求項［１］又は［２］の方法。
［９］　前記ヒト体細胞が、血液由来細胞、皮膚由来細胞、歯髄由来細胞、又は尿由来細胞である、［８］の方法。
［１０］　前記ヒト体細胞がＣＤ３４陽性細胞である、請求項［９］に記載の方法。
［１１］　前記工程（２）で凝集化する前記体細胞の数が１００～１０，０００，０００個である、［１］～［１０］のいずれかに記載の方法。
［１２］　前記工程（２）で凝集化する前記体細胞の数が２７９，０００個以上である、［１］～［１０］のいずれかに記載の方法。
［１３］　［１］～［１２］のいずれかに記載の方法で製造された多能性幹細胞から製造された浮遊性の分化細胞。
［１４］　［１］～［１２］のいずれかの方法を実施するための浮遊培養装置であって、
　体細胞を足場非依存的に浮遊培養しながら凝集させて当該体細胞に初期化因子を接触させる培養容器と、
　前記培養容器の外部に設けられ、前記体細胞の凝集を促進する凝集促進部と、を備える、浮遊培養装置。
［１５］　前記凝集促進部は、磁石を備え、
　前記体細胞は可逆的に結合及び分離が可能な免疫磁気ビーズを有し、前記免疫磁気ビーズが前記磁石に引き寄せられて前記体細胞の凝集が促進される、［１４］の浮遊培養装置。
　本発明により、足場材非依存で剥離の工程を経ずに多能性幹細胞の樹立及び誘導を行うことができ、浮遊培養を行うことにより、培養の自動化及び大量培養が容易であり、品質の向上した多能性幹細胞を得ることができる、体細胞から多能性幹細胞を製造する方法、それを用いて製造した分化細胞、およびそれらを製造するための浮遊培養装置が得られる。
本実施態様の一例の体細胞サンプルとして血液を用い、心筋細胞を得るためのプロセスの一例を示す模式図である。 本実施態様の一例の多能性幹細胞の製造装置を示す概略図である。 本実施態様の一例の対象から採取した血液を体細胞サンプルとして、体細胞から多能性幹細胞を製造する方法を示す模式図である。 本実施態様の一例の３Ｄでの多能性幹細胞の製造および培養の検討プロセスを示す模式図である。 本実施例の多能性幹細胞を製造する方法について各種条件の樹立のための試験のプロセスを示す模式図である。 本実施例の静置培養を行ったチューブを示す写真図である。 本実施例の多能性幹細胞の検証のプロセスを示す写真図である 本実施例の条件１のチューブについてＳｔｅｐ　Ａの免疫染色の写真図である。 本実施例の条件１のチューブについてＳｔｅｐ　Ｂの免疫染色の写真図である。 本実施例の条件２のチューブについてＳｔｅｐ　Ａの免疫染色の写真図である。 本実施例の条件２のチューブについてＳｔｅｐ　Ｂの免疫染色の写真図である。 本実施例の継代（Ｐ３）細胞についての写真図である。 本実施例の未分化マーカーのFCM解析結果を示すグラフ図である。 本実施例の三肺葉分化の免疫染色の写真図である。 本実施例の心筋分化の発現量を示す図である。 本実施例の３Ｄ浮遊培養の樹立プロセスの模式図である。 本実施例の３Ｄ浮遊培養の樹立プロセスの次の工程を示す模式図である。 本実施例の静置培養を行った１１日目のチューブを示す写真図である。 接着培養(コントロール)を観察した写真図である。 浮遊培養細胞をマグネットで凝集した２×１０４細胞播種を観察した写真図である。 浮遊培養細胞をマグネットで凝集した１×１０６細胞播種を観察した写真図である。 浮遊培養細胞をマグネットで凝集した細胞の３回継代後（Ｐ３）の写真図である。 本実施例の心筋分化を実施した細胞の明視野の顕微鏡観察の写真図である。 本実施例のマグネット部に集まった細胞の顕微鏡写真図である。 本実施例の細胞播種条件について検証した写真図である。
　以下、本発明に係る体細胞から多能性幹細胞を製造する方法、及びそれを用いて製造した分化細胞について、実施形態を示して説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
　以下において、「を含む」（comprise）という用語は、対象となる構成要素以外の構成要素を含んでいてもよいことを意味する。「からなる」（consist of）という用語は、対象となる構成要素以外の構成要素を含まないことを意味する。「から本質的になる」（consist essentially of）という用語は、対象となる構成要素以外の構成要素を特別な機能を発揮する態様（発明の効果を完全に喪失させる態様など）では含まないことを意味する。本明細書において、「を含む」（comprise）と記載する場合、「からなる」（consist of）態様、及び「から本質的になる」（essentially consist of）態様を包含する。
　タンパク質（ポリペプチド）、ペプチド、ポリヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、ベクター、及び細胞は、単離されたものであり得る。「単離された」とは、天然状態から分離された状態を意味する。本明細書に記載されるタンパク質（ポリペプチド）、ペプチド、ポリヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、ベクター、及び細胞は、単離されたタンパク質（単離されたポリペプチド）、単離されたペプチド、単離されたポリヌクレオチド（単離されたＤＮＡ、単離されたＲＮＡ）、単離されたベクター、及び単離された細胞であり得る。
　「遺伝子」という用語は、特定のタンパク質をコードする少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドを意味する。遺伝子は、エクソンのみを含んでもよく、エクソン、並びにイントロン、５’ＵＴＲ、及び３’ＵＴＲのいずれか１つ以上を含んでもよい。
＜第１実施形態＞
［体細胞から多能性幹細胞を製造する方法］
　一実施形態において、本発明は、体細胞から多能性幹細胞を製造する方法を提供する。
　本実施形態において、体細胞から多能性幹細胞を製造する方法は、（１）体細胞を足場非依存的に培養する工程、（２）２つ以上の体細胞を凝集化する工程、（３）体細胞と初期化因子を接触させる工程、を含む。
　（（１）体細胞を足場非依存的に培養する工程）
　体細胞を足場非依存的に培養する工程は、最初に体細胞を得る工程として行ってもよく、また、（２）、（３）の工程で行う、以後の培養の操作のいずれか又は全てを、体細胞を足場非依存的に培養する工程によって行っても良い。
　本実施形態における体細胞は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができる。体細胞としては、例えば、胎児期の体細胞、成熟した体細胞等が挙げられる。成熟した体細胞の具体例としては、間葉系幹細胞、造血幹細胞、脂肪組織由来間質細胞、脂肪組織由来間質幹細胞、神経幹細胞、精子幹細胞などの組織幹細胞（体性幹細胞）；組織前駆細胞；線維芽細胞、上皮細胞、リンパ球、筋肉細胞等の既に分化した細胞；等が挙げられる。
　本実施形態では、体細胞が血液由来細胞、皮膚由来細胞、歯髄由来細胞、尿由来細胞から選ばれることがより好ましい。
　また、後述する細胞を凝集化する工程から、体細胞がＣＤ３４陽性細胞であることがより好ましい。
　体細胞が由来する生物種は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができる。体細胞が由来する生物種としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ヒツジ、ウマ、サルなどの任意の哺乳動物が挙げられる。
　本実施形態では、体細胞として特にヒト体細胞を好適に用いることができる。
　体細胞が由来する個体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。ただし、本実施形態の方法で製造したｉＰＳ細胞を再生医療用途に用いる場合には、拒絶反応の観点から、当該再生医療の対象となる個体自身、又は当該再生医療の対象となる個体とＭＨＣの型が同一若しくは実質的に同一の他個体が好ましい。ここで、上記ＭＨＣの型が実質的に同一とは、上記体細胞由来のｉＰＳ細胞から分化誘導して得られた細胞を個体に移植した場合に、免疫抑制剤などの使用により、移植細胞が生着可能な程度にＭＨＣの型が一致していることをいう。
　体細胞は、ｉＰＳ細胞の選択を容易にするために、他家遺伝子を導入した組換え体細胞であってもよい。組換え体細胞の具体例としては、分化多能性細胞において特異的に高発現する遺伝子の遺伝子座に、レポーター遺伝子、及び薬剤耐性遺伝子の少なくともいずれかを組み込んだ組換え体細胞が挙げられる。分化多能性細胞において特異的に高発現する遺伝子としては、例えば、Ｆｂｘ１５遺伝子、Ｎａｎｏｇ遺伝子、Ｏｃｔ３／４遺伝子、などが挙げられる。レポーター遺伝子としては、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β－ガラクトシダーゼ遺伝子などが挙げられる。上記薬剤耐性遺伝子としては、ブラストシジン遺伝子、ハイグロマイシン遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子などが挙げられる。
　体細胞を足場非依存的に培養するとは、足場材となる部材、材料に保持されることなく培養することを広く指すが、特に接着培養以外の培養、特に分散培養や浮遊培養である。浮遊培養とは、細胞を培養容器内において、培養容器へ非接着の状態で培養することであり、その他の条件は特に限定はされない。
　培養は、培養液を静置して行うこともでき、また攪拌等の操作を行うこともできる。
　具体的には、浮遊培養の操作としては、培養容器について細胞との接着性を向上させる目的の人工的な処理が行われていないものなどを用いて行うことができる。このような人工的な処理としては、細胞外マトリックス物質（例えば、コラーゲン）による表面処理などが挙げられるが、本実施形態では例えばそれらの処理を行っていない培養容器を用いる。また、培養容器について人工的に接着を抑制する処理を行っているものなどが挙げられる。
　浮遊培養のさらに具体的な操作としては、例えば国際公報第２０１１／００７９００号に記載の技術がある。
　体細胞のその他の培養条件は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、培養温度は、約３７℃、ＣＯ２濃度は約２％～５％、Ｏ２濃度は約５％～２０％などが挙げられる。体細胞の培養に用いる培地は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、５質量％～２０質量％の血清を含む、最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地、Ｆ１２培地などが挙げられる。本明細書において、濃度について単に「％」と表記するものは「容量％」を意味する。
　（（２）２つ以上の体細胞を凝集化する工程）
　２つ以上の細胞を凝集化するとは、２つ以上の細胞をある程度相互に接近、又は固着させる操作を指す。接近又は固着する手段は適宜選択でき、物理的なものでも、化学的なものでもよい。例えば、細胞に付着させた別の分子、粒子等の相互作用でも、細胞表面の化学物質その他の相互作用でもよい。一実施形態では、細胞に他の粒子である磁気を帯びた、または磁気を帯びることができる粒子を結合させ、この磁気によって細胞を相互に接近又は固着させ凝集させてもよい。また、凝集化した体細胞の細胞間の距離は、１μｍ以下であることが好ましい。
　工程（２）で凝集化する体細胞の数は１００～１０，０００，０００個であることが好ましい。また、１０，０００～１，０００，０００個の間であることがより好ましい。細胞の数が少なすぎる場合は一度の操作における凝集化の効率が悪く、細胞の数が多すぎる場合は凝集化のための手段（例えば磁気を有する粒子）が細胞を凝集する効率が悪くなる。前記凝集化する体細胞の数は、２７９，０００個以上であることがより好ましい。
　２つ以上の体細胞を凝集化する工程は、
（Ａ）前記体細胞と免疫磁気ビーズとを接触させる工程
（Ｂ）磁気ビーズと結合した細胞を磁力により凝集化させる工程
（Ｃ）前記初期化因子と接触した細胞を５～３０日間凝集化を維持する工程
　であってもよい。
（Ａ）体細胞と免疫磁気ビーズを接触させる工程
　免疫磁気ビーズは、磁気を帯びることができ、かつ、免疫的に他の分子と結合可能なビーズ（粒子）である。免疫磁気ビーズは、例えば、磁気を帯びることができる分子と、免疫的に他の分子と結合可能な分子とを両方備える（例えば、これらの分子が相互に結合した）構造のものなどが挙げられる。
　免疫磁気ビーズは、体細胞と結合する分子を有していることが好ましい。具体的には、前記免疫磁気ビーズの有する分子が、体細胞の表面のいずれかの分子と免疫的に結合する分子であることが好ましい。
　免疫磁気ビーズが、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１４、およびＣＤ９０からなる群から選択される、少なくとも１つのＣＤ抗原と結合する分子を有することも好ましい。これらの抗原と結合する分子としては、例えば抗体が挙げられる。抗体はポリペプチドからなるものでも、核酸その他の分子からなるものであってもよい。
　免疫磁気ビーズの例としては、磁気を帯びることが可能な粒子、例えば磁性体を構成要素とする粒子が、粒子の表面に体細胞と結合する分子を備えていることが好ましい。磁性体は特に種類は限られないが、鉄などを用いることができる。
　磁性体と抗体を有する免疫磁気ビーズは従来、市販されており、例えば、ＣＤ３４抗体を備えた磁気ビーズを含むキット、EasySep Human CD34 Pos Selection Kit II（StemCell Technologies）、CliniMACS (R) CD34 GMP MicroBeads（ミルテニー）などを用いることができる。
　上述の細胞に対しては、免疫磁気ビーズは、例えば細胞より径が小さいものを用いることができるが、目安として１μｍ以下である。また、添加量はビーズ数が細胞数よりも多いことが好ましく、細胞数に対して１０倍以上であることがより好ましい。
　体細胞と免疫磁気ビーズを接触させる工程は、例えば、体細胞を含む液体に免疫磁気ビーズを添加し、一定時間静置または攪拌等を行い接触させてもよい。体細胞を含む液体は、液体中で体細胞を培養した場合、培養液であってもよい。また、体細胞のサンプル自体が液体（例えば、血液などの体液や尿）である場合は、その液体を、体細胞を含む液体であるとして、免疫磁気ビーズを添加してもよい。
（Ｂ）磁気ビーズと結合した細胞を磁力により凝集化させる工程
　磁気ビーズと結合した細胞を凝集化させる工程は、これらが凝集し得るものであれば限られない。例えば、外部から磁力を印加することで凝集させてもよい。例えば、細胞を収納した容器の外部に磁石を隣接させ、一定時間静置することで、前記容器内の磁石が隣接した部位に細胞を凝集させてもよい。
　一方で、培養液や液体のサンプルなどの液体内で免疫磁気ビーズと結合した細胞を単に静置することにより、免疫磁気ビーズの質量が加わった体細胞が沈殿しやすいので、ある程度は凝集化させることもできる。
（Ｃ）初期化因子と接触した細胞を５～３０日間凝集化を維持する工程
　ついで、細胞を初期化因子と接触させて多能性幹細胞とする。初期化因子は、多能性幹細胞の製造のために従来知られたものを使用することができる。
　本明細書において、「初期化因子」とは、体細胞に導入することにより、当該体細胞を多能性幹細胞、特にｉＰＳ細胞に誘導することができる物質（群）を意味する。初期化因子は、体細胞から多能性幹細胞を誘導することができる物質（群）であれば、特に限定されない。初期化因子は、遺伝子（発現ベクターに組み込まれた形態を含む）若しくはその遺伝子産物、又は低分子化合物等のいかなる物質であってもよい。「遺伝子産物」とは、遺伝子から転写されるｍＲＮＡ、及び当該ｍＲＮＡから翻訳されるタンパク質を意味する。初期化因子として用いる遺伝子産物は、ｍＲＮＡであってもよく、タンパク質であってもよく、その両方であってもよい。初期化因子である遺伝子とは、初期化因子であるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを意味する。
　初期化因子が遺伝子又はその遺伝子産物の場合、Ｏｃｔ遺伝子ファミリーの遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子ファミリーの遺伝子、Ｋｌｆ遺伝子ファミリーの遺伝子、Ｍｙｃ遺伝子ファミリーの遺伝子、Ｌｉｎ遺伝子ファミリーの遺伝子、及びＮａｎｏｇ遺伝子、並びに、それらの遺伝子産物からなる群から選択される少なくとも１つが挙げられる。
　本実施形態では、初期化因子がＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、およびＮａｎｏｇからなる群から選択される、少なくとも１つを含むことが好ましい。
　初期化因子は、ＲＮＡウイルスベクターであることが好ましい。また、初期化因子は、ＲＮＡであることも好ましい。
　［分化細胞］
　本実施形態の分化細胞は、前記の多能性幹細胞から製造した浮遊性の分化細胞である。
　本実施形態において、分化細胞とは、細胞分化（以下、単に分化ともいう）した細胞である。細胞分化とは、細胞が特定の機能または性質を持つように変化することを指す。特定の機能または性質とは、特に、特定の組織に存在する細胞の機能または性質を指す。
　本実施形態においては、分化細胞は種類を問わないが、例えば、心筋細胞を用いることができる。
　本実施形態において心筋細胞とは、少なくとも心筋トロポニン(cTnT)またはα MHCを発現している細胞を意味する。cTnTは、ヒトの場合NCBIのaccession番号NM_000364が例示され、マウスの場合、NM_001130174が例示される。α MHCは、ヒトの場合NCBIのaccession番号NM_002471が例示され、マウスの場合、NM_001164171が例示される。
　多能性幹細胞から分化細胞を誘導する方法は、既知の方法であれば、特に限定されない。例えば、心筋細胞を誘導する方法としては、特許文献２に記載したフィーダー細胞の存在下または非存在下で行うことができ、フィーダー細胞の存在下では、多能性幹細胞をActivin Aを含む培地、さらにBMP4とbFGFとを含む培地で培養する方法などを用いることができる。
　図１に、体細胞サンプルとして血液を用い、心筋細胞を得るためのプロセスの一例を示す。培養工程は全工程を、（１）体細胞を足場非依存的に培養する工程によって行う。まず、体細胞サンプルとして末梢血を採取し、（２）２つ以上の体細胞を凝集化する工程として、（Ａ）体細胞サンプルにＣＤ３４抗体を含む免疫磁気ビーズを添加し、（Ｂ）磁気ビーズと結合した細胞を磁力により凝集化させる工程を行い（ＣＤ３４＋細胞凝集化）、（Ｃ）初期化因子をセンダイウイルスベクターにより細胞に導入し、１０～１４日間凝集化を維持して、ｉＰＳ細胞を樹立する。１４～２８日間浮遊培養を続けてｉＰＳ細胞を拡大培養し、２８～４２日間、心筋細胞へと分化誘導させる操作を行い、心筋細胞を得る。
　本実施形態では、樹立から細胞分化までの全ての培養工程を浮揚培養（３Ｄ浮揚培養条件）で実施できるプロセスを構築している。特に、これまで困難であった、iPS細胞を浮遊条件で樹立することに成功し、全ての工程を3Dで行うことにより、閉鎖型培養装置での培養が可能である。
＜第２実施形態＞
　第２実施形態は、前記実施形態における、体細胞から多能性幹細胞を製造する方法のための浮遊培養装置である。
　本実施形態の浮遊培養装置は、体細胞を足場非依存的に凝集化させて浮遊培養しながら当該体細胞に初期化因子を接触させる培養容器と、前記培養容器の外部に設けられ、前記体細胞の凝集化を促進する凝集促進部と、を備える。
　図２は、本実施形態の浮遊培養装置１００の概略図である。浮遊培養装置１００は、培養容器１０と、凝集促進部２０と、を備える。
　培養容器１０は、前記浮遊培養を行うことのできる培養容器１０で、前記体細胞を足場非依存的に培養し、また、培養しつつ凝集化させることのできるものであれば問わない。図に示した例では培養容器１０はテストチューブ（試験管）を用いている。浮遊培養を行うことが可能であれば、培養容器１０の形態は各種の細胞培養に適したディッシュ、プレートなども用いることができ、素材も問わない。前述したように、培養容器１０は培地や細部と接する内部について、細胞が接着するためのコーティング等が施されていないものが好ましい。
　培養容器１０は、該容器内部に体細胞を含む液体である培養液１１と、凝集した体細胞３０を備えている。体細胞３０は、図に示した例では、前記第１実施形態の免疫磁気ビーズを可逆的に結合及び分離が可能な状態で有しているが、図に示した例では、免疫磁気ビーズを結合し有している状態である。後述するように、凝集促進部２０の磁力により免疫磁気ビーズが凝集し、体細胞３０は培養容器１０内の凝集促進部２０に隣接した面に凝集している。
　培養容器１０は、体細胞３０に初期化因子を接触させることができるように構成されてなる。体細胞３０に初期化因子を接触させる手段は、初期化因子を供給するための供給手段、例えば薬液チューブなどが挙げられる（図示せず）。
　凝集促進部２０は、前記体細胞の凝集を促進させることができる手段である。本実施形態では、凝集促進部２０は、培養容器１０の外部から磁力を印加することにより凝集を促進することのできる部材としている。図に示した例では、凝集促進部２０は、板状部材とその縁部に設けられたより小さい板状部材からなり側面形状がＬ字型のマグネットからなる。板状部材はいずれも磁石を内蔵し、凝集促進部２０は磁力を有している。
　凝集促進部２０は、培養容器１０に隣接させることで、培養容器１０およびその内部の体細胞３０に磁力を印加し、前記免疫磁気ビーズが前記凝集促進部の磁石に体細胞３０の凝集を促進することができる。
　図に示した例では、凝集促進部２０のＬ字型の長辺が培養容器１０の側面に、短辺が底面にそれぞれ隣接することで、体細胞３０を培養容器１０の底面に近い側面に凝集させることができる。凝集促進部２０は、培養容器１０の他の部位に隣接させることで、体細胞３０を培養容器１０の他の部位に凝集するように設けられていてもよい。
　浮遊培養装置１００は、浮遊培養に適した手段、例えば、振盪などの攪拌手段や、培養条件を整えるための温度調整手段、試薬（例えば、培地）の供給手段などを備えていてもよい。また、これらの手段を加えて、培地交換やこれらの多能性幹細胞を製造するシステムや、分化細胞を製造するシステムの一部として設けられていてもよい。
　浮遊培養装置１００の使用方法としては、培養容器１０内で、培養液１１中の体細胞３０を培養する。このとき、図のように凝集促進部２０が培養容器１０に隣接した状態で行うので、体細胞３０は凝集した状態で培養されている。ついで、体細胞３０に初期化因子を接触させ、培養を継続することで、体細胞３０を多能性幹細胞とすることができる。
＜第３実施形態＞
　第３実施形態は、第１実施形態の体細胞から多能性幹細胞を製造する方法、または第２実施形態の浮遊培養装置を用いた培養システムの例である。このシステムでは、対象の自己の体細胞に由来するｉＰＳ細胞を得て、特定組織の細胞へと分化させる、一気通貫3D培養システム（Overall 3D culture system、３Ｄ－ｉＰＳＣｓ）としている。
　図３に示すように、対象（ヒト）から採取した血液(blood)を体細胞サンプル(Cell separation solution)として、体細胞から多能性幹細胞を製造する方法を用いる。培養容器内で体細胞サンプルに免疫磁気ビーズを含む液体(Medium A)を加え、細胞を磁石を備えた凝集促進部により磁力(N, S)により凝集化させ、初期化因子(Sev vector)と接触させて凝集化を維持し、iPS細胞を製造する（iPSCs generation）。iPS細胞を分化させる操作、例えばMediumB, Cを加えて（本実施形態では、心筋細胞に分化させるActivitin AやBMP4とbFGFを含む培地）浮遊培養して分化させ、組織細胞（Final Product）を得る。
　本発明者らは、図４に示すように、3D-iPSCs Generation and Cultureのプロセスとして、第１実施形態を用いた細胞の培養および分化誘導を行い、樹立直後の細胞写真、心筋細胞に分化した細胞写真を検討し、スフェア解砕、培養スケールアップの手法を検討することにより、このシステムを開発した。
　３Ｄ－ｉＰＳＣｓは、細胞の多能性（Pluripotency）、分化能（Differentation potency）、を有し、遺伝子発現（Gene expression）を誘導、確認でき、特定組織への分化、例えば心筋誘導（Cardiomyocyte differentiation）を有効に誘導することができる。対象の自家の体細胞から、組織の細胞を多量に培養することができ、再生医療等に好適に応用することができる。
［本実施形態の効果］
　本実施形態により、足場材非依存で剥離の工程を経ずに多能性幹細胞の樹立及び誘導を行うことができる。浮遊培養を行うことにより、培養の自動化及び大量培養が容易であり、品質の向上した多能性幹細胞を得ることができる。
　iPS細胞などの多能性幹細胞を上述した基礎研究、医薬の革新、及び再生医療などに応用するには、自家iPS由来細胞治療を安価に提供可能なプラットフォームの構築を行えることが望ましい。このようなプラットフォームの構築には、品質の安定化や製造コスト低減のために、体細胞～iPS細胞～分化誘導までを、閉鎖型自動化装置内で完結させることが不可欠であると考えられる。末梢血単核球は浮遊細胞であり、血液から流路系での分離が可能である。また、分化細胞として例えば本発明者らが扱っている心筋球細胞も浮遊状態で維持されるものである。
　従来の技術では、工程の中間に位置するiPS細胞樹立・維持のために、2D培養＝足場材を用いてプレート上に接着させ、継代のたびに剥離と接着を繰り返してきた。この工程を閉鎖型培養装置で実施するためには、細胞剥離・回収といった複雑な操作が可能な高価なロボットシステムの導入などが必要である。
　また、これまでの知見から、細胞剥離の影響による変異の増大や細胞ストレスによる増殖率の低下が懸念されてきた。
　本発明者らは、本実施形態の技術を用いることで、新たに3D浮遊状態でのiPS細胞樹立方法を見出した。この方法は、末梢血単核球細胞からiPS細胞の樹立、そして心筋分化までの全工程を3Dで実施するシステムに応用することができる。
　本実施形態の技術を用いることで、物質面では、足場材非依存的に誘導した多能性幹細胞を得ることができる。このような多能性幹細胞は、高分化能を維持していることが期待できる。
　用途面では、足場材非依存的に誘導した多能性幹細胞から分化細胞を作製する自動化装置に応用することが期待できる。
　工程面では、足場材非依存的に多能性幹細胞を誘導する方法、続いて、分化細胞を誘導する方法について種々の応用が期待できる。
［他の実施形態］
　本発明は、他の実施形態として、上記実施形態の体細胞から多能性幹細胞を製造する方法を含む、多能性幹細胞の品質の改善方法を提供する。
　本発明は、他の実施形態として、上記実施形態の体細胞から多能性幹細胞を製造する方法を含む治療方法を提供する。
　本発明は、他の実施形態として、上記実施形態の体細胞から多能性幹細胞を製造する方法により製造された多能性幹細胞を提供する。
　本発明は、他の実施形態として、上記実施形態の多能性幹細胞から製造した浮遊性の心筋細胞から得られた心筋組織を提供する。
　本発明は、他の実施形態として、上記実施形態の多能性幹細胞から製造した浮遊性の心筋細胞を用いた治療方法を提供する。
　本発明は、他の実施形態として、分化細胞の製造における、上記実施形態の多能性幹細胞から製造した浮遊性の分化細胞の使用を提供する。
　本発明は、他の実施形態として、磁石と、免疫磁気ビーズと、初期化因子と、を含む多能性幹細胞製造用キットを提供する。免疫磁気ビーズ、及び初期化因子は、個別の容器に分けられていてもよく、１つの容器にまとめられていてもよく、任意の数ごとに容器にまとめられていてもよい。また、遺伝子導入試薬、タンパク質導入試薬、パッケージング細胞、バッファー、希釈液等を含んでいてもよい。
　以下に実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
［試験例１］
　多能性幹細胞を製造する方法について、各種条件の樹立のための試験を行った。
　図５に、樹立プロセスの模式図を示す。
　（CD34陽性細胞の拡大培養）
　体細胞サンプルとして、以下のようにＣＤ３４陽性細胞の拡大培養を行った。
　StemFit AK03 (w/oC) 6mLに下記濃度（μｇ／ｍＬ）に調整したサイトカインをそれぞれ6μLずつ添加し、CD34陽性細胞用培地を作製した。
　IL-6　50
　SCF　50
　TPO　10
　Flt-3L　20
　IL-3 20
　G-CSF 10
　ついで、24well plateの外側のウェルに、保湿のためのPBSを1mLずつ添加した。PBMCを37℃のウォーターバスで軽く解凍し、CD34陽性細胞用培地を1mL程度入れ完全に溶かした。1500rpm 5min遠心した。上清を除去し、タッピングで細胞隗をほぐしてから、CD34陽性細胞用培地1mLで懸濁した。この懸濁細胞をセルカウントし、1wellあたり5×105-1×106細胞となるように24well plateに播種し、37℃5%CO2インキュベーターで5日間静置培養した。
　前記体細胞サンプルにCD34抗体を備えた磁気ビーズの標識キットであるEasySep Human CD34 Pos Selection Kit IIを加えた。ついで、磁性カラムを用いたウイルス導入用キットであるViroMICST (OZ BIOSCIENCE, VMX250)を用いてセンダイウイルスベクターを導入した。細胞数として、チューブ１本あたり条件１：２×１０４細胞（２Ｅ４）、条件２：１×１０６細胞（１Ｅ６）の２種の条件を試行した。これらのチューブをマグネット（EasyEights EasySep Magnet、StemCell Technologies、ST-18103）の上に静置し、０～１１日目まで培養を行った。
　図６に、前記条件１および２のマグネット上での静置培養を行ったチューブを示した。図は、目視の写真図である。
　ついで、多能性幹細胞の表面マーカーのひとつであるＴＲＡ－１の発現を検証し、培養した細胞が多能性幹細胞（ここではｉＰＳ細胞）であるかを調べた。
　図７に行った操作の概略図を示す。前記培養はそれぞれのチューブの側面にマグネット（磁石部材）を設置した状態で１１日間行い、Ｓｔｅｐ　Ａで、磁気ビーズと結合している細胞をチューブの一部に集めたペレット状にした（cell + magnet pellet）状態で、各チューブから1mL程度を残して、上清を除去し、24 well plateに回収した。
　ついで、Ｓｔｅｐ　Ｂで、各チューブをマグネットからはずし、室温で10分程度静置した。細胞ペレットを懸濁し、24well plateに移した。スフェアを吸い込まないよう、ウェルの底から5mm程度の高さ分の培地を残して、マイクロピペットで培地を除去した。FACS Buffer(2% FBS, 10nM Y-27632, PBS)を1mL添加し、同様の手法でマイクロピペットでFACS Bufferを除去した。FACS Buffer添加と除去を再度実施した。
　免疫染色の操作として、１検体あたりFACS Buffer 200μLにTRA-1-60抗体（Alexa Fluor(R) 647 Mouse anti-Human TRA-1-60 Antigen、BD Bioscience）を4μL添加し、混合した。希釈したTRA-1-60抗体を各ウェルに200μL添加した。アルミホイルで遮光し、室温で30分間インキュベートした。FACS Bufferを1mL添加し、ウェルの底から5mm程度の高さ分の培地を残して、マイクロピペットで培地を除去した。FACS Buffer添加と除去を再度実施した。FACS Bufferを300μL添加した。その後、キーエンス蛍光顕微鏡で観察した。
　図８に、条件１のチューブについて、Ｓｔｅｐ　Ａすなわち培養液の上清部分について、抗ＴＲＡ－１抗体を用いて免疫染色した写真図を示す。
　（ａ）は明視野、（ｂ）はＴＲＡ－１染色（蛍光）図を示す。細胞が染色されているという図は顕著には見られなかった。
　図９に、条件１のチューブについて、Ｓｔｅｐ　Ｂすなわち細胞懸濁液について、抗ＴＲＡ－１抗体を用いて免疫染色した写真図を示す。
　（ａ）は明視野、（ｂ）はＴＲＡ－１染色（蛍光）図を示す。細胞とＴＲＡ－１のシグナルが一致しており、得られた細胞は多能性幹細胞であると思われた。
　図１０に、条件２のチューブについて、Ｓｔｅｐ　Ａすなわち培養液の上清部分について、抗ＴＲＡ－１抗体を用いて免疫染色した写真図を示す。
　（ａ）は明視野、（ｂ）はＴＲＡ－１染色（蛍光）図を示す。
　図１１に、条件２のチューブについて、Ｓｔｅｐ　Ｂすなわち細胞懸濁液について、抗ＴＲＡ－１抗体を用いて免疫染色した写真図を示す。
　（ａ）は明視野、（ｂ）はＴＲＡ－１染色（蛍光）図を示す。細胞とＴＲＡ－１のシグナルが一致しており、得られた細胞は多能性幹細胞であると思われた。
　懸濁液から回収した細胞を再度培養する継代を行った（Ｐ１）細胞について観察を行った。
　図１２に、明視野の写真図を示す。（ａ）は条件１、Ｓｔｅｐ　Ａ、（ｂ）は条件１、Ｓｔｅｐ　Ｂ、（ｃ）は条件２、ＳｔｅｐＡ、（ｄ）は条件２、Ｓｔｅｐ　Ｂの操作を行ったものを示した。
　条件１と２を比較すると、細胞数が多い条件２でも細胞密度は多くなく、むしろ条件１の方が細胞の形状が良く、培養には条件１：２×１０４細胞（２Ｅ４）が条件２：１×１０６細胞（１Ｅ６）よりも好条件と思われた。
［試験例２］
　多能性幹細胞を製造する方法について、各種条件の樹立のためにさらに各マーカーの特性及び各種の検討を行った。特に、3D条件（浮遊培養）で樹立したiPS細胞と、従来の2D条件（接着培養）で樹立したiPS細胞を、これらの試験で比較した。
（血液スタート、３Ｄ培養）
　使用試薬は以下の通りである。（それぞれ品名、メーカー名、製品番号）
　EasySep (TM) Human Whole Blood CD34 Positive Selection Kit II
　StemFit AK03、Ajinomoto、-
　IL-6(同等品可)、Wako、098-06041
　SCF(同等品可) 、Wako、197-15511
　TPO(同等品可) 、Wako、207-17581
　Flt-3L(同等品可) 、Wako、061-05391
　IL-3(同等品可) 、Wako、090-05761
　G-CSF(同等品可) 、Wako、072-06101
　PBMC、PRECISION for medicine、CUSTOM/33000-10M
　SRV（ＴＭ） iPSC-2 Vector、ときわバイオ株式会社、S1011694A
　上述と同様の手順に従って、CD34陽性細胞用培地を1mL作製した。
　開始1時間前にRBC Lysis bufferを大塚蒸留水で10倍希釈して準備した。また、PBS(2% FBS＋1mM EDTA)を準備した。
　血液バッグから50mLシリンジで血液を取り出し、50mLファルコンチューブに血液を入れた。15mLラウンドチューブ2本に4.5mLずつ血液を分注し、各チューブに4.5mLのRBC Lysis Bufferを加えて懸濁し、180uLのSelection Cocktailを加えて懸濁した。このチューブを室温で15分インキュベートした。EasySepのRapid Sphere（免疫磁気ビーズ）を30秒間Voltexで攪拌し、チューブに180uLのRapid Sphereを加えて懸濁した。ついで、室温で10分インキュベートした後、PBS(2% FBS＋1mM EDTA)を1mL加えて懸濁した。ついで、マグネットに設置して、室温で10分インキュベートした。上清を除去し、PBS(2% FBS＋1mM EDTA)を10mL加えて懸濁した。ついで、マグネットに設置して、室温で5分インキュベートした。上清を除去し、PBS(2% FBS＋1mM EDTA)を10mL加えて懸濁した。ついで、マグネットに設置し、上清を除去し、AK03(w/o C)＋6 cytokine＋Sev溶液1mLを添加し、マグネットに静置したまま、37℃5%CO2で培養を行った。培養2,4日目（サンプルごと）にCD34陽性細胞用培地を500uL添加した。また、培養7,9,11,13日目に半量培地を除去し、StemFit AK03培地を添加した。これらを14日目まで培養を継続した。
　（血液スタート、２Ｄ接着培養）
　血液バッグからバキュテイナに血液を移し、10回程度転倒混和し、1800gで20分間遠心分離した。血漿層を除いて、細胞層を15mLのファルコンチューブに移した。PBSでWashし、AK03(w/oC)でWashし、1mLのCD34陽性細胞用培地で懸濁した。この懸濁液をセルカウントして5E5cell/wellで24well plateに播種し、5日間培養した。ついで、細胞を収集しセルカウントして2×104cellsを分取し、300G 5min 4℃で遠心分離した。MOI=3となるよう、ベクター量を計算し、上清除去、タッピングした。細胞にベクター＋培地を添加し、37℃インキュベーターで2時間インキュベートしつつ、30分ごとにタッピングした。ついで、AK03(w/oC)を1mL添加し、300G 5min 4℃で遠心分離した。上清除去してタッピングを行った。CD34用培地400uLで細胞ペレットを懸濁し、24well plateに播種した。iMatrix を1.8uL/wellで添加した。培養2,4日目にAK03(w/o C)＋6 cytokineを500uL追加した。培養7,9,11,13日目にAK03で培地交換した。これらを14日目まで培養を継続した。
　（ＰＢＭＣスタート、２Ｄ接着培養）
　試験例１と同様の手順に従って、CD34陽性細胞用培地を5mL作製した。培養後のPBMC全量を回収し、セルカウントした。
　図４に示す装置プロトコルに準じてマグネット分離を実施した（プログラム「LP34」）回収後、セルカウントし、MOI=3となるよう、ベクター量を計算し、上清除去、タッピングした。細胞にベクター＋培地を添加し、37℃インキュベーターで2時間インキュベートしつつ、30分ごとにタッピングした。
　24well plateにCD34陽性細胞用培地400μLとiMatrix 1.8μLを入れ、プレートを揺らして攪拌した。2×104cells/ wellとなるように細胞を播種した(40μL)。プレートを37℃、5%CO2インキュベーターに入れ、培養を開始した。2・4日目に、それぞれ400μLずつAK03培地を添加した。8・10・12日目にAK03培地400μLで培地交換した。
　（ＦＣＭ解析）
　未分化マーカーについては、ＴＲＡ－１－６０、ＯＣＴ４、ＳＳＥＡ４の各マーカーについてＦＣＭ解析を行った。
　図１３に、未分化マーカーのFCM解析結果を示す。図中、横軸のサンプル名は、
　Ff-I14s04：株化されたiPS細胞を2D維持、3D維持培養したサンプル
　11/12：前記の血液スタートのサンプル準備を行った３Ｄ培養（マグネットによる凝集あり）、２Ｄ接着培養を行ったサンプル
　12/07：前記の血液スタートのサンプル準備を行った３Ｄ培養（マグネットによる凝集あり）、２Ｄ接着培養を行ったサンプル 
　12/23：３Ｄは試験例１と同様にＰＢＭＣスタートで行いマグネット分離は図４の装置で実施し、２Ｄは前記ＰＢＭＣスタートの２Ｄ接着培養で行ったサンプル
　である。
　図に示すように、Tra-1-60では若干のバラつきはあるが、いずれも2D/3Dの培養で差は無かった。
　（三胚葉分化）
　三胚葉分化については、市販のキットSTEMdiff (TM) Trilineage Differentiation Kit）を用いて解析を行った。細胞のサンプルとしては、前述の血液スタートの３Ｄ培養（マグネットによる凝集あり）及び２Ｄ接着培養の条件で調整したサンプルを用いた。Ectoderm, Mesoderm, Endodermのそれぞれについて、Nestin, Pax6, Brachyury, NCAM, FOXA2, Sox17の発現を調べた。
　図１４に染色の写真図を示す。三胚葉分化については、２Ｄと３Ｄで特に差は認められなかった。すなわち、分化については従来の２Ｄの接着培養と同様に、３Ｄの浮遊培養を使用することができると思われた。
　（心筋分化）
　心筋分化について、Ｔｒｏｐｏｎｉｎ－Ｔ（ＴｎＴ）の発現について調べた。
　図１５に結果を示す。（ａ）は、樹立日の異なるクローンの３Ｄ浮揚培養した細胞（３Ｄ－ｉＰＳｃ）について、それぞれ発現率を調べた図である。横軸はクローンごとの樹立日を示す。また、樹立日の後の「＿ｍ」が前述した血液スタートの３Ｄ培養（マグネットによる凝集あり）を行ったクローン、「＿ａ」が血液スタートの３Ｄ培養と同様だが、免疫磁気ビーズを添加せずマグネットによる凝集を行っていないクローンを示す。縦軸はＴｎＴの発現率を示す。（ｂ）は明視野の図である。
　若干3Dでの効率が低いという結果が得られた。しかし、細胞株化されている2D　iPS細胞からの誘導においても、20-80%程度のばらつきがある。本実施例の技術での分化効率のよい株においては、50%以上は担保できている。本実施例の3D　iPSにおいても、誘導前の培養条件も含め、プロセスをさらに精査することで、TnT陽性率を挙げることができると考える。
　上記の他、今後、遺伝子発現解析（マイクロアレイ）、核型・ゲノム変異などについても検証することで、３Ｄで培養したｉＰＳ細胞の特性が明らかとなると思われる。
　本試験例では、完全3D（一貫して浮遊培養による操作）で、樹立から分化誘導までを行う培養方法を確立した。
　末梢血から浮遊条件でiPS細胞(3D-iPSCs)樹立を行い、心筋分化までの全工程を3Dで実施可能なことを示した。得られた3D-iPSCsは、従来法(=2D)とほぼ同等の性質を持つことが明らかとなった。
　今後は、閉鎖型装置での培養検討を実施し、再生医療に適した細胞製造を行っていくことが可能と思われる。特に自家のiPS細胞由来の分化細胞の製造＝マイiPS治療の実用化へと応用可能と思われる。
［試験例３］
　（造血幹細胞とセンダイウイルスベクターを用いたiPS細胞樹立）
　マグネットセパレーターによる細胞およびウイルスベクターの濃縮を用いたiPS細胞樹立に関する試験を行った。
　iPS細胞の樹立・維持培養・分化誘導の自動装置化・装置の小型化を推進する上で、浮遊状態での細胞のハンドリングが有用ではないかと考えた。造血幹細胞とセンダイウイルスベクターを磁気ビーズで標識し、マグネット上に濃縮することによりiPS細胞の樹立が可能であるかを検証した。造血幹細胞（ＣＤ３４陽性）およびセンダイウイルスベクターを磁気ビーズ標識した状態でのiPS細胞樹立の可否について、検証することを目的とした。
　図１６、１７に樹立プロセスの模式図を示す。
　使用試薬は以下の通りである。（それぞれ品名、メーカー名、製品番号）
　StemSpan ACF(同等品可)、STEMCELL Technologies、ST-09855
　IL-6(同等品可)、Wako、098-06041
　SCF(同等品可) 、Wako、197-15511
　TPO(同等品可) 、Wako、207-17581
　Flt-3L(同等品可) 、Wako、061-05391
　IL-3(同等品可) 、Wako、090-05761
　G-CSF(同等品可) 、Wako、072-06101
　PBMC、PRECISION for medicine、CUSTOM/33000-10M
　SRV（ＴＭ） iPSC-2 Vector、ときわバイオ株式会社、S1011694A
　D-PBS(-) without Ca and Mg, liquid(同等品可) 、ナカライ　14249-95
　ViroMICST、OZ BIOSCIENCE、VMX250
　EasySep Human CD34 Pos Selection Kit II、StemCell Technologies、ST-17856
　Trypan Blue Solution, 0.4%(同等品可)　　　、Invitrogen、15250061
　StemFit AK03、味の素、-
　FACS Buffer (2% FBS, 10nM Y-27632, PBS) 、-
　Alexa Fluor(R) 647 Mouse anti-Human TRA-1-60 Antigen、BD Bioscience、－
　使用機器は以下の通りである。（それぞれ品名、型番、メーカー名）
　CO2インキュベーター、370A、ThermoFisherScientific
　Countess II、-、ThermoFisherScientific
　倒立顕微鏡、CKX41、オリンパス
　蛍光顕微鏡、BZ-X810、キーエンス
　多本架冷却遠心機、AX-511、TOMY
　EasyEights EasySep Magnet、StemCell Technologies、ST-18103
　細胞培養装置、Ambr 15、SARTORIUS、-
　由来細胞は、ＰＢＭＣは女性２３歳、人種caucasianのものを用いた。
　（iPS細胞の樹立(接着培養、コントロール)）
　試験例１と同様の手順に従って、CD34陽性細胞用培地を5mL作製した。培養後のPBMC全量を1.5mLチューブに回収し、セルカウントした。結果はTotal 15.2、Live 10.7、Dead 4.5、(それぞれ×105cells/mL)であり、生存率Viabilityは７０．４％であった。
　2×104細胞分( 20μL)を分取し、300G, 5min, 4℃で遠心した。MOI=3となるよう、ベクター量を計算した。TITER　 6.1×107 CIU/mL　2×104 / 6.1×107 = (μL)ベクター 0.3μLとCD34陽性細胞用培地　99.7μLを混合し、合計100 μl のベクター溶液を作製した。遠心後の細胞懸濁液から上清を除去し、タッピングにて細胞隗をほぐした後、ベクター溶液100 μLで懸濁した。500 μLになるようにCD34陽性細胞用培地を追加した。37℃5%CO2インキュベーターで2時間インキュベートした。30分おきに軽くチューブをタッピングした。500 μLのStemSpanACFを添加し、300G, 5min, RTで遠心した。上清を除去し、細胞隗をタッピングしてほぐした。
　さらに上述のStemSpanACF添加、上清除去、細胞隗をほぐす操作を再度繰り返した。
　24well plateにCD34陽性細胞用培地400μLとiMatrix 1.8μLを入れ、プレートを揺らして攪拌した。2×104cells/ wellとなるように細胞を播種した(40μL)。プレートを37℃、5%CO2インキュベーターに入れ、培養を開始した。2・4日目に、それぞれ400μLずつAK03培地を添加した。8・10・12日目にAK03培地400μLで培地交換した。
　（iPS細胞の樹立(浮遊培養）
　（ウイルスの磁気ビーズ標識）
　図１７に示すように、磁性カラムを用いたウイルス導入用キットであるViroMICST (OZ BIOSCIENCE, VMX250)を用いて、初期化因子（いわゆる山中因子）を含むセンダイウイルスベクターを導入した。細胞数として、チューブ１本あたり条件１：２×１０４細胞（２Ｅ４）、条件２：１×１０６細胞（１Ｅ６）の２種の条件を試行した。
　必要量のウイルスベクターに磁気ビーズ標識をした。標識はViroMICST のキット使用マニュアルに沿ってViroMICST INSTRUCTION MANUAL （OZ Biosciencesウェブサイト)に準拠して行った。SRV（ＴＭ）iPSC-2 Vector 53.1μLを1.5mLチューブに分取した。Viro-MICSTをピペッティングでよく混合した。Viro-MICST 50μLを加え、ピペッティングでよく混合した。その後、室温で20分間インキュベートした。
　(マグネットによる細胞凝集)
　2×104細胞分(20μL)と1×106細胞分(1000μL)をそれぞれ1.5mLチューブに分取し、300G, 5min, 4℃で遠心した。それぞれのチューブに100μLのCD34陽性細胞用培地を入れ、懸濁した。5mLラウンドチューブに全量をうつした。各チューブにEasySep (TM) Human CD34 Positive Selection Cocktailを10μLずつ添加し、懸濁した。室温で10分間静置した。各チューブにEasySep (TM) Dextran Rapid Spheres (TM)を5μLずつ添加し、懸濁した。室温で5分間静置した。前記標識したウイルスベクターを、2×104細胞入りのチューブには1.9μL、1×106細胞入りのチューブには95.46μL添加し、懸濁した。全量1mLになるようCD34陽性細胞用培地を追加し、マグネットに静置した。37℃5%CO2インキュベーターに入れた。2・4日目に、それぞれ1mLずつAK03培地を添加した。8・10・12日目にAK03培地を半量ずつ培地交換した。13日目にTRA-1-60で下記のように免疫染色し、蛍光顕微鏡で観察した。
　また、１３日目の２×１０４細胞播種と、１×１０6細胞播種とを目視で観察した写真図を図１８に示した。
　（免疫染色(TRA-1-60)）
　各チューブから1mL程度を残して、上清を除去した。各チューブをマグネットからはずし、室温で10分程度静置した。細胞ペレットを懸濁し、24well plateに移した。スフェアを吸い込まないよう、ウェルの底から5mm程度の高さ分の培地を残して、マイクロピペットで培地を除去した。FACS Bufferを1mL添加し、同様の手法でマイクロピペットでFACS Bufferを除去した。FACS Buffer添加と除去を再度実施した。
　FACS Buffer 200μLにTRA-1-60抗体を4μL添加し、混合した。希釈したTRA-1-60抗体を各ウェルに200μL添加した。アルミホイルで遮光し、室温で30分間インキュベートした。FACS Bufferを1mL添加し、ウェルの底から5mm程度の高さ分の培地を残して、マイクロピペットで培地を除去した。FACS Buffer添加と除去を再度実施した。FACS Bufferを300μL添加した。その後、キーエンス蛍光顕微鏡で観察した。
　図１９に、接着培養(コントロール)を観察した写真図を示した。（ａ）は明視野、（ｂ）はAlexaFluor647：TRA-1-60の蛍光顕微鏡観察である。
　図２０に、マグネットで凝集した２×１０４細胞播種を観察した写真図を示した。（ａ）は明視野、（ｂ）はAlexaFluor647：TRA-1-60の蛍光顕微鏡観察である。
　図２１に、マグネットで凝集した１×１０６細胞播種を観察した写真図を示した。（ａ）は明視野、（ｂ）はAlexaFluor647：TRA-1-60の蛍光顕微鏡観察である。
　図２２に、マグネットで凝集した細胞の３回継代後（Ｐ３）の写真図を示した。（ａ）は２×１０４細胞播種、（ｂ）は１×１０６細胞播種である。
　（心筋分化）
　3回継代後のiPS浮遊細胞を100μMサイズのメッシュを用いて解砕した。Ambrを用いて、iPS浮遊細胞の維持培養を実施した。分化誘導15日目に細胞を回収し、顕微鏡観察およびFCM解析を実施した。
　図２３に、心筋分化を実施した細胞の明視野の顕微鏡観察の写真図を示した。
　今回の結果から、CD34陽性細胞およびウイルスベクターを磁気ビーズ標識した状態での樹立は、播種細胞数2×104～1×106cells/tubeの間で可能であることが示された。コントロールと比較して、TRA-1-60の蛍光が強い印象であった。これは細胞が凝集しているためか、又は、細胞毎の発現強度が強い可能性もある。
　樹立直後はビーズの残存が多くみられたが、継代（パッセージ）を経るごとに洗浄され、細胞の純度が高まっていることが目視で確認できた。2×104細胞スタートと比較して、1×106細胞スタートでは、細胞とビーズの接着が強く、パッセージを経てもビーズの残存が多かった。細胞密度が高い状態で樹立すると、ビーズを取り込んだ形でスフェアが形成され、継代に伴うビーズの洗浄効率が悪くなるのではないかと予想された。
　本検証では、マグネット上の樹立で磁気ビーズ標識しない条件を実施しなかったことから、標識による樹立効率への寄与は不明である。さらに4回継代後の心筋分化工程を経て、拍動する細胞が確認できた。しかし、心筋分化効率の指標としているFCM解析によるトロポニンT陽性細胞の割合は数%以下であり、誘導が十分でなかったことが示された。原因としては4回継代後の細胞には一部センダイウイルスベクターが残存しており、分化誘導できない細胞があったことやAmbrの装置条件検討が十分でなかったことが挙げられる。一方で、拍動する細胞が一部でみられたことから、分化ポテンシャルはあることが示された。
［試験例４］
　（ｉＰＳ細胞樹立時のマグネットによる細胞凝集効果の検証）
　マグネットによる細胞凝集効果について、さらなる検証を行った。
　使用試薬は以下の通りである。（それぞれ品名、メーカー名、製品番号）
　StemFit AK03、Ajinomoto、-
　IL-6(同等品可)、Wako、098-06041
　SCF(同等品可) 、Wako、197-15511
　TPO(同等品可) 、Wako、207-17581
　Flt-3L(同等品可) 、Wako、061-05391
　IL-3(同等品可) 、Wako、090-05761
　G-CSF(同等品可) 、Wako、072-06101
　PBMC、PRECISION for medicine、CUSTOM/33000-10M
　SRV（ＴＭ） iPS-4 Vector、ときわバイオ株式会社、S1011694A
　D-PBS(-) without Ca and Mg, liquid(同等品可) 、ナカライ　14249-95
　EasySep Human CD34 Pos Selection Kit II、StemCell Technologies、ST-17856
　Trypan Blue Solution, 0.4%(同等品可)　　　、Invitrogen、15250061
　Nunc (TM) Rectangular Dishes、ThermofisherScientific、267062
　使用機器は以下の通りである。（それぞれ品名、型番、メーカー名）
　CO2インキュベーター、370A、ThermoFisherScientific
　Countess II、-、ThermoFisherScientific
　倒立顕微鏡、CKX41、オリンパス
　蛍光顕微鏡、BZ-X810、キーエンス
　多本架冷却遠心機、AX-511、TOMY
　マグネット、ネオジム磁石バー型（角）　５×５×１０　1-405510、MAGNA
　EasyEights EasySep Magnet、StemCell Technologies、ST-18103
　由来細胞は、ＰＢＭＣは女性２４歳、人種Caucasianのものを用いた。体細胞サンプルとしてＣＤ３４の拡大培養は試験例１と同様に行った。
　（プレートの準備）
　Nunc (TM) Rectangular Dishesの長辺部にマグネットを固定した。コントロールプレートはマグネットなしとした。
　（iPS細胞の樹立（マグネット））
　上述と同様の手順に従って、CD34陽性細胞用培地を5mL作製した。培養後のPBMC全量を15mLチューブに回収し、セルカウントした。6×106細胞分を15mLチューブに分取し、300G, 5min, 4℃で遠心した。それぞれのチューブに100μLのCD34陽性細胞用培地を入れ、懸濁した。5mLラウンドチューブに全量をうつした。各チューブにEasySep (TM) Human CD34 Positive Selection Cocktailを10μLずつ添加し、懸濁した。ついで、室温で10分間静置した。
　各チューブにEasySep (TM) Dextran Rapid Spheres(TM)を5μLずつ添加し、懸濁した。室温で5分間静置した。SRV(TM) iPSC-4 Vectorを95.46μL添加し、懸濁した。CD34陽性細胞用培地で12mLまでメスアップし、37℃、5%CO2インキュベーターで2時間静置した。300G, 5min, 4℃で遠心した。全量3mLになるようCD34陽性細胞用培地を追加した。細胞直径を10μmと仮定し、長辺部(27.9mm/1well)に細胞が1個、10個、100個、1000個集積することを想定して、プレートの各ウェルに前記手順で準備した細胞を2.79×103, 2.79×104, 2.79×105, 2.79×106を播種した。培地量が1.5mLになるよう調整した。37℃、5%CO2インキュベーターに入れ、培養を開始した。2・4日目に、それぞれ500μLずつCD34陽性細胞用培地を添加した。8・10・12日目にAK03培地を半量ずつ培地交換した。
　14日目に顕微鏡で観察した。また、細胞観察として、各ウェルで形成されたスフェロイド（浮遊化したiPS細胞）数を計測した。
　図２４に、マグネット部に集まる細胞の顕微鏡写真図を示す。（ａ）は目視、（ｂ）は位相差顕微鏡での観察図である。細胞観察の結果、固定したマグネットによって細胞が集積する様子が観察された。
　図２５に、細胞播種条件について検証した図を示す。（ａ）は、マグネットありプレートのウェルの全景撮影像である。（ｂ）は、マグネットありのプレートのスフェロイドの拡大図であり、エラーバーは５０μｍである。（ｃ）はマグネットなしのプレートのウェルの全景撮影像である。図に示すように、2.79×105細胞を播種したプレートにおいて、マグネットなしではスフェロイドが観察されなかったが、マグネットありで2つのスフェロイド形成が確認できた。
　一方、2.79×104細胞播種では、マグネットの有無に関わらずスフェロイドの形成がみられなかった。一方、2.79×106細胞播種では、マグネットの有無に関わらず3個のスフェロイドが確認された（これらは図示せず）。結果のまとめを表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　以上の結果より、播種する細胞数は１０４個を超えることが好ましく、２７９，０００個以上であることがさらに好ましいことが示された。
　以上、本発明の好ましい実施形態を説明および図示してきたが、これらは本発明を例示するものであり、限定的なものとみなされるべきではないことを理解すべきである。本発明の精神または範囲から逸脱することなく、追加、省略、置換、およびその他の変更を行うことができる。したがって、本発明は、前述の説明によって限定されるものとはみなされず、添付の請求項の範囲によってのみ限定される。
　本発明によれば、足場材非依存で剥離の工程を経ずに多能性幹細胞の樹立及び誘導を行うことができ、浮遊培養を行うことにより、培養の自動化及び大量培養が容易であり、品質の向上した多能性幹細胞を得ることができる、体細胞から多能性幹細胞を製造する方法、それを用いて製造した心筋細胞が得られる。
　１０　培養容器
　１１　培養液
　２０　凝集促進部
　３０　体細胞
　１００　浮遊培養装置

Claims (15)

  1. 　次の工程を含む、体細胞から多能性幹細胞を製造する方法：
    （１）体細胞を足場非依存的に培養する工程、
    （２）２つ以上の前記体細胞を凝集化させる工程、
    （３）前記体細胞と初期化因子を接触させる工程。
  2. 　前記工程（２）が次の工程を含む、請求項１に記載の方法：
    （Ａ）前記体細胞と免疫磁気ビーズとを接触させる工程、
    （Ｂ）前記免疫磁気ビーズと結合した前記体細胞を磁力により凝集化させる工程、
    （Ｃ）前記初期化因子と接触した前記体細胞を５～３０日間凝集化を維持する工程。
  3. 　前記初期化因子が、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、およびＮａｎｏｇからなる群から選択される、少なくとも１つを含む請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　前記初期化因子がＲＮＡウイルスベクターである、請求項３に記載の方法。
  5. 　前記初期化因子がＲＮＡである、請求項４に記載の方法。
  6. 　前記免疫磁気ビーズが前記体細胞と結合する結合分子を有する、請求項２に記載の方法。
  7. 　前記結合分子が、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１４、およびＣＤ９０からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤ抗原と結合する請求項６に記載の方法。
  8. 　前記体細胞がヒト体細胞である、請求項１又は２に記載の方法。
  9. 　前記ヒト体細胞が、血液由来細胞、皮膚由来細胞、歯髄由来細胞、又は尿由来細胞である、請求項８に記載の方法。
  10. 　前記ヒト体細胞がＣＤ３４陽性細胞である、請求項９に記載の方法。
  11. 　前記工程（２）で凝集化する前記体細胞の数が１００～１０，０００，０００個である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 　前記工程（２）で凝集化する前記体細胞の数が２７９，０００個以上である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
  13. 　請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法で製造された多能性幹細胞から製造された浮遊性の分化細胞。
  14. 　請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法を実施するための浮遊培養装置であって、
    　体細胞を足場非依存的に浮遊培養しながら凝集させて当該体細胞に初期化因子を接触させる培養容器と、
    　前記培養容器の外部に設けられ、前記体細胞の凝集を促進する凝集促進部と、を備える、浮遊培養装置。
  15. 　前記凝集促進部は、磁石を備え、
    　前記体細胞は可逆的に結合及び分離が可能な免疫磁気ビーズを有し、前記免疫磁気ビーズが前記磁石に引き寄せられて前記体細胞の凝集が促進される、請求項１４に記載の浮遊培養装置。
PCT/JP2023/010357 2022-03-16 2023-03-16 体細胞から多能性幹細胞を製造する方法、それを用いて製造した分化細胞、およびそれらを製造するための浮遊培養装置 WO2023176931A1 (ja)

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