附图简述
图1:RT4细胞的3D球体的形成导致干细胞标记物的表达:
A.在单层(左图)和球体培养物(右图)中RT4细胞的相差图像。比例尺=200μm。
B.在单层和球体培养物中的RT4细胞干细胞标记基因的定量PCR(Q-PCR)分析结果。
C.在单层和7天球体培养物中的RT4细胞NANOG和SOX2表达情况的Western印迹结果。使用畸胎瘤细胞系PA-1作为阳性对照。
图2:RT4细胞的3D球体的形成产生具有癌干细胞特征的细胞。
A.在单层(左图)和7天球体培养物(右图)中迁移细胞的定量分析结果。
B在单层和7天球体培养物中的RT4细胞上皮间质转化(EMT)相关基因的Q-PCR分析结果。
C.RT4细胞的裸鼠肿瘤形成试验结果汇总表。单层表示单层培养物经胰酶消化的RT4细胞;球体表示球体经胰酶消化的RT4细胞。
图3:在3D球体中培养的人胚肾(HEK293)细胞部分获得了胚胎干细胞的表型。
A.在单层(左图)和球体培养物(右图)中HEK293细胞的相差图像。比例尺=200μm。
B.在单层和球体培养物中的HEK293细胞干细胞标记基因的Q-PCR分析结果。
C.在单层和10天球体培养物中的HEK293细胞NANOG和SOX2表达情况的Western印迹结果。
D.表示在单层HEK293和球体HEK293细胞中的OCT4、NANOG和SOX2/OCT4转录活性的荧光素酶试验(n=3)。载体表示对照荧光素酶报告子。(M)表示单层HEK293细胞并且(S)表示10天球体HEK293细胞。
E.在单层(图中的上部分)和10天球体培养物(图中的下部分)中的HEK293细胞的OCT4、NANOG和SOX2的转录调控区的亚硫酸氢盐基因组测序。将起始位点设定为+1。空心圆表示未被甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(CpG),而实心圆表示甲基化的CpG。
F.在单层和球体培养物中的HEK293细胞胚胎干(ES)细胞标记基因的Q-PCR分析结果。
G.在单层和10天球体培养物中的HEK293细胞内胚层、中胚层和外胚层标记基因的Q-PCR分析结果。
H.在单层(左图)和10天球体培养物(右图)中的HEK293细胞的碱性磷酸酶(AP)染色结果。
I.HEK293细胞的裸鼠肿瘤形成试验结果汇总表。“A”表示胰酶消化的在单层培养物中的HEK293细胞;“B”表示胰酶消化的HEK293细胞球;“C”表示未经胰酶消化的HEK293球。
图4:在后肾间质和完全分化的肾单位中表达的基因的Q-PCR分析结果。
A.肾单位的示意图。
B-F.在单层、5天球体培养物和10天球体培养物中的在后肾间质(B)、肾小球(足细胞)(C)、近曲小管(D)、亨勒襻(Henle’s loop)(E)、远曲小管和集合管(F)中表达的基因的Q-PCR分析结果。
图5:小鼠胚胎成纤维(MEF)细胞的3D球体的形成导致部分胚胎干细胞表型。
A.在单层(左图)和球体培养物(右图)中MEF细胞的相差图像。比例尺=200μm。
B.在单层和7天球体培养物中的MEF细胞干细胞标记基因的Q-PCR分析结果。
C.在单层和12天球体培养物中的MEF细胞干细胞标记基因的Q-PCR分析结果。
D.在单层和7天球体培养物中的MEF细胞Sox2表达情况的Western印迹分析结果。
E.在单层(左图)和7天球体培养物(右图)中的MEF细胞的碱性磷酸酶染色结果。
图6:MEF细胞的3D球体形成导致神经球的表型。
A.在单层和7天球体培养物中的MEF细胞标记基因的Q-PCR分析结果。
B.在单层和12天球体培养物中的MEF细胞标记基因的Q-PCR分析结果。
C.在单层和球体培养物中的MEF细胞Tuj1和Gfap表达情况的Western印迹。使用小鼠神经球作为阳性对照。
D-H.在单层MEF和来源于7天球体的粘附MEF中Tuj1(D)、神经丝蛋白(E)、S100(F)、Gfap(G)和GABA(H)阳性的细胞百分率。
I.由丁基化的羟基苯甲醚(BHA)进行神经源性分化后的MEF标记基因的Q-PCR分析结果。
图7:GFP和神经元标记物在体内均为阳性的移植MEF的百分率。
A-E.GFP和神经元标记物在体内均为阳性的移植MEF的百分率,神经元标记物包括Tuj1(A)、GFAP(B)、S100(C)、NeuN(D)或MAP2(E)。
图8:小鼠尾尖成纤维(TTF)细胞的3D球体的形成导致出现神经细胞。
A.在单层(左图)和球体培养物(右图)中的TTF的相差图像。比例尺=200μm。
B.在单层和7天球体培养物中的TTF Sox2表达情况的Western印迹分析结果。
C.在单层和7天球体培养物中的TTF标记基因的Q-PCR分析结果。
D-E.单层TTF和来源于7天球体的粘附TTF中Tuj1(D)和S100(E)阳性的细胞百分率。
图9:MCF-7细胞的3D球体的形成导致干细胞标记物的上调。
A.在单层(左图)和球体培养物(右图)中的MCF-7细胞的相差图像。
B.在单层和球体培养物中的MCF-7细胞标记基因的Q-PCR分析结果。
图10:大鼠成骨细胞的3D球体的形成导致一些干细胞标记物的上调。
A.在单层(左图)和球体培养物(右图)中的大鼠成骨细胞的相差图像。
B.在单层和球体培养物中的大鼠成骨细胞标记基因的Q-PCR分析结果。
图11:鼠神经元干细胞的3D球体的形成导致干细胞标记物的上调。
A.在单层(左图)和球体培养基(右图)中的大鼠神经元干细胞的相差图像。
B.在单层和球体培养物中的大鼠神经元干细胞标记基因的Q-PCR分析结果。
图12A-J:一些干细胞标记物的示例性蛋白序列。
图13A-R:一些转分化标记物的示例性蛋白序列。
发明详述
本申请提供了在允许形成三维细胞聚集体和诱导所述细胞进行重新编程的条件下重新编程细胞的方法。本申请还提供了使用本申请所述的方法重新编程的细胞。本申请还提供了用于使用本申请所述的方法重新编程细胞的组合物和试剂盒。
本申请的一个方面涉及重新编程细胞的方法,所述方法包括在允许形成三维细胞聚集体的条件下培养所述细胞,其中所述细胞被诱导进行重新编程。
在本申请中使用的术语“重新编程(reprogram)”或“重新编程(reprogramming)”指诱导分化细胞以产生一个或多个干细胞特征的过程。
分化细胞是一种细胞,其致力于成为或已经成为特化细胞,并显示出这种特化细胞的一种或多种生物学或功能特征。分化细胞可以部分分化,其中所述细胞没有完成成为特化细胞的过程并且不含有所述特化细胞的全部特征。部分分化细胞还可以包括在还原至非特化细胞过程中的并且已经丧失了所述特化细胞的某些特征的特化细胞。分化细胞可以是终末分化的,其中所述细胞已完成成为特化细胞的过程并且含有所述特化细胞的全部特征。本申请所使用的术语“分化细胞”包括部分分化细胞和/或终末分化细胞。
干细胞是具有能分化成各种特化细胞类型潜能的细胞。干细胞可以是万能性的(pluripotent),即能够分化成大多数类型的特化细胞,如胚胎干细胞。干细胞可以是多能性的(multipotent),即能够分化成某些类型的特化细胞,如骨髓干细胞或造血干细胞。干细胞可以是单能性的(unipotent),即能够分化成特定类型的特化细胞。干细胞可以是全能性的(totipotent),即受精卵。本申请所使用的术语“干细胞”包括具有上述各种潜能水平的任意和全部类型的干细胞。
本申请的方法可以用于重新编程任意细胞,所述细胞在允许形成三维细胞聚集体的培养条件下能够被诱导以显示出一种或多种干细胞的生物学和/或功能性特征。在某些实施方式中,本申请的待重新编程的细胞为贴壁细胞。贴壁细胞是为了在体外生长需要粘附于固体基质的细胞(参见John M.Davis,Animal Cell Culture:Essential Methods.(动物细胞培养:基本方法),John Wiley&Sons 2011年出版,4.2章;Jennie P.Mather等,Introduction to Cell and Tissue Culture:Theory and Technique(细胞和组织培养介绍:理论和技术),Springer出版,1998,p.64-65)。在悬浮培养基中,贴壁细胞不能生长或存活,或者生长或存活较差。贴壁细胞通常来源于实体组织和器官。贴壁细胞的例子包括但不限于:内皮细胞、平滑肌细胞、上皮细胞和成纤维细胞。
在某些实施方式中,贴壁细胞在悬浮培养基中的存活率低于15%。在某些实施方式中,贴壁细胞在悬浮培养基中的存活率低于10%。在某些实施方式中,贴壁细胞在悬浮培养基中的存活率低于5%。在某些实施方式中,贴壁细胞在悬浮培养基中的存活率低于1%。细胞存活率根据在细胞培养基中的活细胞数占细胞总数的百分率计算。可以采用公知的方法测量细胞活力,如碘化丙啶染色。
在某些实施方式中,待通过本申请的方法进行重新编程的本申请的细胞是体细胞。体细胞的例子包括但不限于成纤维细胞(例如小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)、小鼠尾尖成纤维(TTF)细胞和人成纤维细胞样滑膜细胞(HFL))、膀胱细胞(例如人膀胱乳头状瘤(RT4)细胞)、幼仓鼠肾(BHK21)细胞、卵巢细胞(例如中国仓鼠卵巢(CHO-K1)细胞)、宫颈细胞(例如HeLa细胞)、肌细胞、胚胎细胞(例如人胚胎肾(HEK)293细胞、NIH3T3细胞)、肺细胞(例如人胎肺成纤维(MRC-5)细胞、MRC-9细胞)、肝细胞(例如Hep G2细胞)、上皮细胞(例如WPE干细胞)、内皮细胞(例如HUV-EC-C细胞)、脑细胞(例如T98G细胞)、骨细胞(例如KHOS-240S细胞)。在某些实施方式中,所述体细胞是非癌细胞。
在某些实施方式中,所述体细胞是癌细胞如乳腺癌细胞(例如MCF-7细胞、MDA-MB-231细胞、MDA-MB-435细胞或SK-BR-3细胞)、结肠癌细胞(例如DLD-1细胞、HCT-15细胞、T84细胞、HCT-8细胞)、肾癌细胞(例如A-498细胞、769-P细胞、G401细胞)、肺癌细胞(例如NCI-H2126细胞、DMS 79细胞、A549细胞)、肝癌细胞(例如Hep G2细胞)、宫颈癌细胞(例如HeLa细胞)、神经胶质瘤细胞(例如M059K细胞、LN-18细胞)、神经元细胞(例如大鼠嗜铬细胞瘤(PC12)细胞、人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞、前列腺癌细胞(例如DU145细胞、LNCaP细胞)和骨肉瘤细胞(例如KHOS/NP细胞)。
在某些实施方式中,通过本申请所述的方法将部分分化的所述细胞诱导进行重新编程。在某些实施方式中,通过本申请所述的方法将干细胞诱导进行重新编程。
在某些实施方式中,本申请提供了一种重新编程细胞的方法,所述方法包括在允许形成三维细胞聚集体的条件下在体外培养所述细胞,其中所述细胞被诱导进行重新编程。在某些实施方式中,所述培养条件是低粘附条件。低粘附条件指所述细胞不粘附于固体基质或者所述细胞在所述固体基质上的粘附降低或被抑制的培养环境。在某些实施方式中,当与常规粘附条件相比时,在低粘附条件下,细胞在基质上的粘附降低至少30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。可以由市售的细胞培养瓶提供常规粘附条件,例如康宁细胞培养皿(例如目录号430589未经处理的细胞培养皿(纽约,US)或目录号3353002猎鹰TM细胞培养皿(纽约,美国)或目录号715001 NEST细胞培养皿(无锡,中国))。
在某些实施方式中,所述低粘附条件由低粘附基质提供,所述低粘附基质减少或抑制细胞粘附于其表面(参见John M.Davis,同上)。在某些实施方式中,所述低粘附基质包括使用减少或抑制细胞粘附的材料包被的细胞培养容器(例如皿、板、圆底管或瓶)。在某些实施方式中,这种材料含有亲水性的和电中性的水凝胶层。本申请所使用的“水凝胶”指由一定量的水构成的半固体组合物,并且其中溶解或分散有聚合物或混合物。在某些实施方式中,所述水凝胶由聚苯乙烯制成。在某些实施方式中,所述聚苯乙烯选自以下组:聚苯乙烯-嵌段-聚(N-异丙基丙烯酰胺)-嵌段-聚苯乙烯、聚(苯乙烯-共-马来酸酐)(SMA)、聚(苯乙烯-二乙烯基苯)(P(ST-DVB))、聚(苯乙烯磺酸)(PSSA)、聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-共-α-甲基苯乙烯)、聚苯胺-聚(苯乙烯磺酸酯)(Pan-PSS)、聚(苯乙烯-嵌段-(甲氧基二甘醇丙烯酸酯)-嵌段-苯乙烯)和聚(4-苯乙烯磺酸酯钠)。
在某些实施方式中,所述水凝胶由琼脂、琼脂糖制成。在某些实施方式中,所述低粘附基质包被浓度范围为0.2至5.0%的琼脂糖。在某些实施方式中,所述低粘附基质包被浓度范围为1-5%的琼脂。
在某些实施方式中,所述水凝胶由聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)制成。在某些实施方式中,所述低粘附基质使用浓度范围为40-50%的聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)包被。
在某些实施方式中,所述低粘附基质上包被有水凝胶与培养基的混合物(例如杜尔贝科改良的伊格尔培养基(DMEM)或McCoy’5A培养基)。
在某些实施方式中,减少或抑制细胞粘附的所述材料能够调节靶细胞的细胞外蛋白的功能,从而减少所述细胞与所述基质的粘附。所述细胞外蛋白抑制剂的例子包括但不限于蛋白聚糖(参见例如Yamagata,M.等,Journal of Biological Chemistry,264(14):8012-8018,1989),氢化可的松或放线菌酮结合的肝素、L-氮杂环丁烷-2-羧酸、胰酶和乙二胺四乙酸(EDTA)、分散酶、葡聚糖、聚环氧乙烷、合成肽如甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸-脯氨酸,甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸(参见例如Whalen,G.F.等,Ann.Surg.,210(6):758-764,1989)。
在某些实施方式中,将减少或抑制细胞粘附的材料包被于所述低粘附基质的表面上作为层或薄膜或膜。在某些实施方式中,将减少或抑制细胞粘附的材料包埋于所述基质中。
在某些实施方式中,所述低粘附基质包含疏水性表面。在某些实施方式中,疏水性表面由具有疏水性组分的聚合物和共聚物薄膜形成。在某些实施方式中,所述疏水性表面由聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚(环氧乙烷)-聚(甲基丙烯酸甲酯)(PEO-PMMA)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、全氟聚醚(PFPE)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚苯乙烯(PS)形成。
任意适宜的培养基均可以用于本申请的方法中。常用培养基的例子包括但不限于DMEM()、RPMI 1640()、McCoy's 5A(Hyclone,Thermo Scientific)和DMEM/营养混合物F-12(DMEM/F12,)。
在另一个方面,在悬挂在支持材料如皮氏培养皿(petri dish)底部和滚瓶壁上的培养基液滴中悬浮培养所述细胞。在某些实施方式中,所述培养基液滴的体积不超过1ml、2ml、3ml、4ml或5ml。在某些实施方式中,所述培养基的液滴悬挂于倒置的培养容器如皮氏培养皿的底部。
在某些实施方式中,所述细胞在旋转或振荡或静止状态下培养。
在某些实施方式中,所述重新编程细胞的方法包括在缺乏以悬浮、飘浮或其他方式处于培养基中的任何支持基质或结构的条件下培养所述细胞。
本申请所使用的术语“三维细胞聚集体”指生长成三维(3D)形状而不是细胞单层的细胞。三维细胞聚集体可以在二维、三维或多维基质中生长。在某些实施方式中,本发明的三维细胞聚集体是多细胞和多层细胞聚集体。在某些实施方式中,本发明的三维细胞聚集体是球样形状的。在某些实施方式中,本发明球样形状的细胞聚集体能够维持稳定的形态若干周。在某些实施方式中,所述三维细胞聚集体的直径为至少10μm、15μm或20μm。
在某些实施方式中,重新编程所述细胞以上调一种或多种干细胞标记物。所述干细胞标记物是干细胞特有的基因和蛋白。在本申请所述的方法中使用的干细胞标记物的例子包括但不限于Oct4、Nanog、Sox2、Klf4、c-Myc、Lin28、Rex1、Tdgf1、Leftb、Ebaf、Grb7、Podxl、Nodal、Fgf4、Nestin、Gdf3、Dax1、Nat1、Esg1、S1c2a3、Sox1、Olig2和Pax6。这些干细胞标记物(核苷酸和蛋白)的NCBI(美国国家生物技术信息中心)参考编号如下表1所示。示例性的蛋白序列也在图12A-J中显示。
表1
在某些实施方式中,所述干细胞标记物可以是胚胎干细胞标记物如Oct4、Nanog、Sox2、Rex1、Gdf3、Dax1、Nat1、Esg1、S1c2a3、Tdgf1、Leftb、Ebaf、Grb7、Podxl和Fgf4。
在某些实施方式中,所述干细胞标记物可以是肾干细胞标记物如Pax2、Wt1、整合素α8、Sall1、Lim1、Ncam1、Six2、Frizzled 2、Frizzled 7、Acvr2b和Ntrk2。
在某些实施方式中,所述干细胞标记物可以是神经干细胞标记物如Sox2(Episkopou,2005;Reynolds和Weiss,1992)。
可以通过干细胞标记物的存在或缺乏,或通过干细胞标记物在基因水平或蛋白水平的增加或减少,来鉴定利用本申请方法的细胞的重新编程。在某些实施方式中,通过本申请的方法诱导不表达干细胞标记物的所述细胞进行重新编程以表达一种或多种干细胞标记物。在某些实施方式中,通过本申请的方法诱导表达一种或多种干细胞标记物的所述细胞进行重新编程以表达额外的一种或多种干细胞标记物。在某些实施方式中,本申请所述的重新编程细胞在基因水平和/或蛋白水平表达至少二、三、四或五种干细胞标记物。
在某些实施方式中,本申请所述的经重新编程的细胞所表达的至少一、二、三、四、五或六种干细胞标记物的基因和/或蛋白水平增加,所述干细胞标记物选自以下组:Oct4、Nanog、Sox2、Klf4、c-Myc和Lin 28。在某些实施方式中,本申请所述的经重新编程的细胞所表达的至少一、二、三、四或五种干细胞标记物的基因和/或蛋白水平增加,所述干细胞标记物选自以下组:Oct4、Nanog、Sox2、Klf4和c-Myc。
在某些实施方式中,使用本申请所述方法对细胞进行的重新编程导致细胞在基因水平上调干细胞标记物Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4,而在蛋白水平上调干细胞标记物Nanog和Sox2。
在另一个方面,本申请的方法还能够转分化细胞,其中将部分或终末分化的细胞转化成不同类型的分化细胞,或将诱导后的干细胞转化成特化细胞,所述特化细胞与诱导前的特化细胞的类型不同。
在某些实施方式中,所述转分化细胞通过一个或多个转分化标记物表征。本申请所使用的术语“转分化标记物”指能够用于鉴定细胞转分化的特征性基因和/或蛋白。
转分化标记物的例子可以包括例如内胚层标记物如Foxa2、Afp、Sox17和Pdx-1,中胚层标记物如Branchyury和Msx1,外胚层标记物如巢蛋白、Otx2和Tp63,肾小球标记物如Nphs1、Actn4、Cd2ap、Cdh3、Pdpn和Podxl,肾近曲小管标记物如Aqp1、Clcn5、Cubn、Lrp2和Slc5a1,肾亨勒襻标记物如Umod和Pkd2以及肾远曲小管和集合管标记物如Scnn1a和Pkd1,神经元标记物如Map2、NeuN、Tuj1、NF-L、NF-M和NF-H,星形胶质细胞标记物如Gfap、S100A和S100B以及寡突胶质细胞标记物如Mbp和Ng2,以及神经元特异性转录因子如Pax6、Sox1、Otx2、Zic1、NeuroD1和Olig2。上文所述的转分化作用标记物的NCBI参考编号如下表2所示。示例性的蛋白序列如图13 A-R所示。
表2
在某些实施方式中,使用本申请所述的方法重新编程的细胞既显示出干细胞标记物又显示出转分化标记物。例如,本申请的所述方法能够诱导胚胎细胞HEK293上调某些干细胞标记物(例如Six2、Frizzled2、Frizzled7、Acvr2b和Ntrk2)以及某些转分化标记物(例如Nphs1、Actn4、Cd2ap、Cdh3、Aqp1、Clcn5、Cubn、Umod、Pkd2、Scnn1a、Pkd1),其表明所述HEK293细胞已被转分化为成熟的肾细胞。
在另一个方面,本申请所述的方法还包括向所述培养物中引入诱导剂,所述诱导剂能够诱导分化细胞转化成干细胞。诱导剂可以是任意化学或生化物质,包括但不限于小分子化合物、核苷酸、肽或其任意组合。
在某些实施方式中,所述诱导剂是能够诱导细胞重新编程的蛋白。此种蛋白的例子包括但不限于Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4、Nanog和Lin28。所述蛋白能够在适宜的宿主细胞中重组表达并且使用本领域公知的方法(例如亲和层析)纯化。能够使用本领域公知的方法将所述蛋白递送至所述细胞。例如,可以由链球菌溶血素O介导的可逆性渗透将蛋白递送至细胞质,链球菌溶血素O在质膜上形成孔从而使得蛋白能够递送(参见例如Walev,I.等,PNAS,98(6):3185-3190,2001;Cho,H.J.等,Blood,116:386-395,2010)。另一个例子,可以将所述蛋白与转导结构域如HIV tat和聚精氨酸融合,其能够介导所述蛋白向细胞质的跨膜递送(参见例如Zhou,H.等,Cell stem cell,4:381-384,2009)。
在某些实施方式中,所述诱导剂是编码蛋白的多核苷酸,所述蛋白能够诱导细胞重新编程。这种多核苷酸的例子包括但不限于编码Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4、Nanog和Lin28的多核苷酸。当将所述多核苷酸引入将进行重新编程的细胞时,其能够被表达以产生能够刺激所述重新编程的基因产物。所述多核苷酸可以是含有编码序列和启动子的表达盒或表达载体,其易于使用分子克隆技术(例如制备cDNA随后插入质粒载体)构建并且能够通过转染的方法(例如使用脂质体转染试剂或磷酸钙)引入细胞。
在某些实施方式中,所述诱导剂是能够诱导细胞重新编程的化合物。此种化合物的例子包括但不限于BIX-01294和BayK8644(参见例如Shi等,cell stem cell,3:568–574,2008)、丙戊酸和5’氮杂胞苷。
在另一个方面,本申请提供了一种使用本申请所述的方法获得的重新编程的细胞。在某些实施方式中,此种重新编程细胞显示出至少一、二、三、四、五或六种干细胞标记物的上调。在某些实施方式中,这种重新编程的细胞在基因和/或蛋白水平显示出至少一、二、三、四、五或六种选自以下组的干细胞标记物的上调:Oct4、Nanog、Sox2、Klf4、c-Myc和Lin28。在某些实施方式中,这种重新编程的细胞显示出至少一、二、三、四、五或六种干细胞标记物的上调和至少一、二、三、四、五或六种转分化标记物的上调。
在另一个方面,本申请提供了使用本申请所述的方法获得的重新编程的三维的细胞聚集体。在某些实施方式中,所述重新编程的细胞聚集体具有球样形状。在某些实施方式中,所述重新编程的细胞聚集体的直径为至少10μm、15μm或20μm。
在另一个方面,本申请提供了一种用于重新编程细胞的试剂盒,所述试剂盒含有低粘附基质和培养基。在某些实施方式中,所述试剂盒还含有说明书。在某些实施方式中,所述低粘附基质含有琼脂糖或聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)。
本申请的重新编程方法和重新编程的细胞或细胞聚集体可用于在体外或体内产生所需的细胞或组织。此种细胞或组织能够用于创伤愈合、神经再生、组织再生、药物筛选等。
在本说明书中引用的所有出版物和专利均通过引用整体并入本申请。
实施例9:大鼠神经元干细胞的重新编程
在DMEM/F12(HYCLONE)中培养大鼠神经元干细胞。大鼠神经元干细胞从1日龄大鼠的脑中原代分离得到。
对于3D培养而言,使用软凝胶包被细胞培养皿制备低粘附培养皿,所述软凝胶通过将1%熔化的琼脂糖凝胶与等量的2×DMEM培养基混合制备。将3×106个大鼠神经元干细胞转移至60mm低粘附培养皿中。
几天后,在3D培养物中培养的大鼠神经元干细胞生长为球体(见图11A右图),而在常规2D细胞培养皿中培养的大鼠神经元干细胞形成单层(见图11A左图)。
对在2D培养物中形成的单层和在3D培养物中形成的球体通过检测Q-PCR若干干细胞标记基因的表达情况。如图11B所示,在大鼠神经元干细胞球中一些检测的干细胞标记物上调,包括Nanog、Klf4、Fgf4和Nodal。一些标记基因如Sox2、c-Myc、Lin28和Ga1下调。这些数据表明球体培养诱导大鼠神经元干细胞进入重新编程过程,其结果使得一些干细胞标记基因上调。
表3:引物序列
参考文献
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