ES2967788T3 - Expresión especifica de célula de Arnmond - Google Patents

Abstract

Se divulga un sistema regulador de la expresión para la transcripción (expresión) específica de una célula de una proteína de interés, por ejemplo, un inductor del ciclo celular que reactiva la proliferación en cardiomiocitos adultos o neonatales o células beta productoras de insulina. El sistema regulador de la expresión comprende un primer ácido nucleico que codifica un elemento de reconocimiento de microARN que se une específicamente a un miR de célula diana y una proteína supresora de la traducción; y un segundo ácido nucleico que comprende un motivo de interacción de proteína supresora que se une a la proteína supresora de la traducción y un gen que codifica una proteína de interés. Cuando una célula de interés se cotransfecta con el primer y segundo ácido nucleico del sistema, la proteína de interés se expresa de una manera específica de la célula. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Expresión específica de célula de Arnmod

REMISIÓN A SOLICITUDES RELACIONADAS

Esta solicitud reivindica prioridad de la solicitud provisional de Estados Unidos número 62/395,701 presentada el 16 de septiembre de 2016.

LISTA DE SECUENCIAS

La presente solicitud contiene una lista de secuencias, creada el 7 de septiembre de 2016; el archivo, en formato ASCII, se denomina 3710029P_SequenceListing_ST25.txt y es de 11278bytesde tamaño.

CAMPO TÉCNICO

La presente divulgación se refiere en general a una plataforma para la expresión específica de célula de proteínas terapéuticasin vitro, ex vivoein vivo,usando un sistema regulador transcripcional específico de célula basado en anulación por miR específico de célula de la supresión de la expresión génica.

ANTECEDENTES DE LA DIVULGACIÓN

El ARN mensajero modificado químicamente (ARNmod) es una estrategia terapéutica que posibilita que la maquinaria celular produzca genes de interés sin modificar el genoma. Por tanto, el ARNmod evita varios de los problemas que han surgido con la genoterapia convencional, incluyendo la ausencia de integración genómica, la persistencia de expresión, inmunogenia, dificultad en la capacidad de cambio de escala y producción, necesidad de supervisión de por vida para tumorigénesis y otros desenlaces clínicos adversos, y el potencial de escape del vector en la circulación sistémica y expresión a largo plazo en otra parte del organismo.

El ARNmod tiene un considerable potencial como tratamiento para enfermedades. La administración de un inductor del ciclo celular mediante ARNmod, por ejemplo, activaría el crecimiento de células beta en individuos con diabetes o restablecería la proliferación de cardiomiocitos después de infarto de miocardio o insuficiencia cardiaca. La neuropatía diabética puede reducirse mediante la capacidad de administrar genes que codifiquen el factor de crecimiento nervioso. Además, con la llegada de la tecnología de edición génica, CRISPR/Cas9 o la transfección de nucleasa efectora similar a activado de la transcripción serán más seguros si se administran de una manera transitoria o específica de célula.

Sin embargo, ninguno de los reactivos de transfección disponible para ARNmod ofrece tanto un alto nivel de expresión génica como la capacidad de abordar cualquier célula de interés. Por ejemplo, un reactivo de transfecciónin vivocomún esinvivo-jetPEI® (Polyplus-transfection® SA, lllkirch, Francia), que es un reactivo a base de polímero que forma complejos con ARNmod para formar nanopartículas. Sin embargo,invivo-jetPEI se dirige principalmente a tejido pulmonarin vivoy reduce significativamente la eficacia de transfección en comparación con ARNmod desnudo.

Por lo tanto, lo que se necesita es un sistema de administración génica basado en ARNmod que consiga un alto nivel de expresión génica exclusivamente en una célula de interés.

SUMARIO DE LA DIVULGACIÓN

La presente divulgación proporciona una plataforma reguladora de la expresión para transcripción específica de célula basada en la explotación de una interacción de proteína de unión a ARN represor /motivo k acoplada con la anulación por miR específica de célula de la función represora para controlar la expresión de un ARNmod administrado de un modo específico de célula. Las proteínas de unión a ARN, tales como la proteína arqueobacteriana L7Ae y homólogos eucariotas de la misma tales como L30e, reconocen un motivo de ARN distintivo, el giro retorcido(kinkturn)(giro k o motivo k como se menciona en este documento). Al incorporar el motivo k en una primera construcción que codifica un gen de interés (GOI) y que incluye un elemento de reconocimiento para un miR específico de célula en una segunda construcción que codifica la proteína de unión a ARN, la supresión de la expresión del GOI se anula cuando las dos construcciones se cotransfectan en el tipo celular apropiado. La plataforma incorpora ARNm modificado.

La presente divulgación, por lo tanto, se refiere a un método para conseguir la expresión específica de célula de un ARNmod de un gen de interés (GOI), cuya expresión se desea solamente en la célula de interés. En un aspecto, la divulgación describe un sistema regulador de la expresión para transcripción específica de célula, comprendiendo el sistema un primer ácido nucleico que codifica (1) un elemento de reconocimiento de microARN (miR) específico de célula, y (2) una proteína supresora de la traducción; y un segundo ácido nucleico que codifica (1) un motivo de interacción proteínica supresora, por ejemplo, un motivo K, en dirección 3' de su 5'UTR que se une a la proteína supresora de la traducción, y (2) un gen que codifica una proteína de interés. Los ácidos nucleicos son ARNmod.

Al intercambiar el elemento de reconocimiento de miR, puede modularse la especificidad celular, haciendo que el sistema sea adaptable a otros tipos celulares.

También se describe una expresión a corto plazo de ARNmod específico de cardiomiocitos (CM) de genes candidatos, tales como genes inductores del ciclo celular, cuya expresión reactiva la regeneración de CM, lo que es importante después de infarto de miocardio o en escenarios de insuficiencia cardiaca. El método se basa en la observación de que los genes inductores del ciclo celular, por ejemplo, Lin28 y Pkm2, administrados como ARNmod usando el sistema de administración específico de célula of la divulgación después de Ml induce significativamente la proliferación de CM y células no CM. Como la proliferación aumentada de células no CM puede dar lugar a fibrosis cardiaca, fue necesario desarrollar un ARNmod específico de CM que permita la expresión de genes solamente en cardiomiocitos.

La presente divulgación describes ARNmod específico de CM que permite la traducción del ARNmod exclusivamente en los CM. En una realización, la expresión de ARNmod de Lin28 o Pkm2 específico de CM provoca<proliferación significativa de CM sin cambiar significativamente la proliferación de células no>C<m>.<En otra realización,>basándose en el ARNmod específico de CM, se desarrolló un modelo novedoso de ratón adulto de rastreo de linaje que se basa en la coexpresión de Cre recombinase desestabilizada y genes candidatos en Rosa26tdTomato usando<ARNmod específico de>C<m>.

De acuerdo con la invención, se proporciona un sistema regulador de la expresión para la expresión específica de célula de un gen de interés, (GOI), que comprende

un primer ácido nucleico que codifica un elemento de reconocimiento de microARN (miR) cerca de su 3'UTR que se une específicamente a un miR específico de célula diana, y codifica una proteína supresora de la traducción; y

un segundo ácido nucleico que comprende un motivo de interacción proteínica supresora que se une a la proteína supresora de la traducción, y un gen que codifica una proteína de interés, en donde la célula diana es un cardiomiocito y el miR de célula diana se selecciona del grupo que consiste en miR1, miR208 y miR1 más miR208, en donde el ARNmod comprende una modificación y la modificación se selecciona de uno o más de una sustitución de uridina con seudouridina, una sustitución de citidina con 5-metilcitidina y un capuchón de 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G sustituido en un extremo 5'.

En una realización del sistema regulador de la expresión, la proteína supresora es L7Ae y el motivo de interacción proteínica es el motivo K. L7Ae es una proteína de unión a ARN que reprime la traducción del transcrito abordado. L7Ae se dirige a una secuencia específica denominada el motivo k o giro k. Por consiguiente, el motivo k se crea en el ácido nucleico del par que codifica el GOI. Normalmente, cuando el otro ácido nucleico del par que codifica L7Ae se expresa de forma normal, L7Ae puede unirse al motivo k, reprimiendo de ese modo la expresión del GOI codificado por ese ácido nucleico.

En una realización del presente sistema, el ácido nucleico que codifica L7Ae también contiene un elemento de reconocimiento de miR específico de célula. Cuando se expresa en la célula apropiada, el miR específico de célula se une al elemento de reconocimiento de miR que detiene la expresión de L7Ae, eliminando la supresión del GOI en el otro ácido nucleico.

En una realización del sistema regulador de la traducción, la proteína de interés es una proteína indicadora u otro gen de interés. En una realización del sistema regulador de la traducción, la proteína indicadora o marcador de selección es una proteína fluorescente, un marcador de resistencia a antibióticos u otro gen de interés. En una realización del sistema regulador de la traducción, la proteína indicadora o marcador de selección se selecciona del grupo que consiste en proteína fluorescente verde (GFP), CD25 humano inactivo (ihCD25). En una realización del sistema regulador de la transcripción/traducción de la divulgación, la proteína de interés es una proteína inductora del ciclo celular. En una realización del sistema regulador de la traducción, la proteína inductora del ciclo celular se selecciona del grupo que consiste en Lin28, Pkm2 y ciclina D2. En una realización del sistema regulador de la transcripción, dicho primer ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4. En una realización del sistema regulador de la transcripción, dicho segundo ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8.

En un aspecto, la divulgación se refiere a una composición que comprende un primer y segundo ARN modificado (ARNmod), en donde dicho primer ARNmod es un producto de expresión del primer ácido nucleico de la reivindicación 1, 2 o 3 y el segundo ARNmod es un producto de expresión del segundo ácido nucleico.

En un aspecto, la divulgación se refiere a un método para expresar una proteína en cardiomiocitos (CM), comprendiendo el método poner en contacto dichos CM con un ARNmod que codifica un elemento de reconocimiento de miR específico para una diana de miR de cardiomiocito, en donde el ARNmod comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 3.

En un aspecto, la divulgación se refiere a un vector que comprende un primer y segundo ácido nucleico como se describe en este documento.

En un aspecto, la divulgación se refiere a un kit regulador de la transcripción/traducción que comprende el primer y segundo ácido nucleico como se describe en este documento o un vector que comprende el primer y segundo ácido nucleico como se describe en este documento.

En un aspecto, la divulgación se refiere a un método para inducir/reactivar la proliferación de cardiomiocitos después de infarto de miocardio (Ml), comprendiendo el método poner en contacto dichos cardiomiocitos o una parte de dichos miocitos con un primer ARNmod que codifica un miR específico de cardiomiocitos y un segundo ARNmod que codifica un gen inductor del ciclo celular.

En un aspecto, la divulgación se refiere al método divulgado, en donde el gen inductor del ciclo celular se selecciona del grupo que consiste en Lin28, Pkm2 y ciclina D2.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS DIBUJOS

La figura 1 muestra un mapa plasmídico de pTEMPLZ usado en la generación del ARNmod de la divulgación.

La figura 2 muestra forma de gráfico (panel superior) y de tabla (panel inferior) las configuraciones de PCR para sintetizar un molde con cola de ADN. En el recuadro se muestra la etapa de elongación que debe establecerse en función del tamaño del inserto de secuencia. La etapa de elongación requiere 30 segundos por kb de inserto de ORF. La configuración de PCR se basa en las instrucciones del fabricante del kit KAPA HiFi HotStart ReadyMix 2X.

Las figuras 3A-3C muestran los resultados del análisis de control de calidad para la síntesis de ARNmod. A Gel de agarosa al 1 % que determina el tamaño correcto del plásmido pTEMPLZ con el inserto de ORF y el molde de ADN con cola para IVT. B Resultado ideal de NanoDrop del producto de ARNmod final. La concentración ideal es entre 15-20 ug/ul. Los valores de 260/280 más cercanos a 2 indican pureza. C Resultado del Bioanalyzer para el control de la calidad del ARNmod sintetizado.

Las figuras 4A-4C A Vista de todo el corazón de corazón de ratón al que se ha inyectadoin vivoARNmod codificado con gen LacZ. 24 horas de la inyección, el ratón se sacrificó, el corazón se fijó con PFA al 4 %, y se tiñó con x-gal. B Inmunotinción de corazón de ratón al que se ha inyectoin vivoARNmod codificado con GFP nuclear. (izquierda) Cardiomiocitos (TropT: rojo), células endoteliales (Pecam1: rojo) y células de músculo liso (smMHC: rojo) positivas para GFP nuclear (verde). (DAPI: azul). C Sección transversal de corazón de ratón Rosa26 LacZ al que se ha inyectado ARNmod codificado con Cre recombinasa. Las células transfectadas con Cre recombinasa pueden teñirse con x-gal produciendo color azul oscuro.

La figura 5A y 5B muestran modelos de infarto de miocardio de ratón adulto e insuficiencia cardiaca. El modelo de infarto de miocardio de ratón adulto (modelo Ml) se realiza usando un ligamiento permanente de la arteria coronaria descendente anterior izquierda (LAD) después de inyección intramuscular directa de ARNmod. Uno o más días después de Ml, se recogen los corazones y se usan para inmunotinción. B El corazón de ratón adulto después de Ml está muy transfectado con ARNmod de Luc; LacZ y nGFP. A Se transfectan varios tipos celulares con ARNmod, incluyendo cardiomiocitos (CM), fibroblastos cardiacos (CF) y células endoteliales (EC).

Las figuras 6A-6H muestran que la expresión de Pkm2 en CM adultos induce la proliferación después de Ml. A. Expresión relativa de Pkm2 medida por qRT-PCR en corazones de ratones 1 o 10 días después del nacimiento. B. Plan experimental para inmunotinción de Pkm2 o a-actinina (marcador de CM) en diferentes fases de desarrollo del corazón de ratón. C. Imágenes representativas de la expresión de Pkm2 en diferentes fases de desarrollo del corazón de ratón. D. Farmacocinética de la expresión de Pkm2 después de la administración de ARNmodin vivo.E. Cronología experimental para medir el efecto de Pkm2 sobre la proliferación de CM. F. Una imagen representativa de la síntesis de ADN (BrdU<+>) en CM (a-actinina<+>) y células no CM (a-actinina<'>) 7 días después de MI. G. y H. Cuantificación de marcadores de proliferación distinticos en CM (F) o células no CM (G) en ratones adultos 7 días después de MI. Los resultados representan 2 experimentos independientes (n = 4); las puntas de flecha blancas indican CM; las puntas de flecha amarillas indican células no CM, ***, P <0,001, **, P <0,01, ensayo de latde Student bilateral, barra de escala de 10 pm.

Las figuras 7A-7K muestran el diseño y función de ARNmod<cms>in vivo.A. Diseño de la construcción y cronología experimental usada para identificar miR<cms>. B. Imágenes de inmunotinción de expresión de ARNmod ihCD25 (rojo) con o sin elementos de reconocimiento para diferentes miR después de la transfección. C. Cuantificación del experimento en c. D. Diseño de construcciones de ARNmod usadas para administración de ARNmod<cms>Cre o<cm s>nGFPin vivo.E-F. ARNmod nGFP-K (verde) transfectado en solitario o cotransfectado con miR1-208, 4 días después de MI. (E) Imágenes representativas de corazones 7 días después de MI. (F) Eficacia de transfección con diferentes relaciones de nGFP-K y miR1-208, g. Ratones Rosa26<mTmG>cotransfectados con Cre-K+miR1-208. G. Cotransfección de Cre-K+miR1-208. Rojo: Troponina I. H. Cuantificación del experimento en g. I. Cronología experimental para la evaluación del efecto de ARNmod<cms>Pkm2 sobre la proliferación. Cuantificación de marcadores de proliferación distintivos en CM (J) o células no CM (K) 7 días después de MI. Los resultados representan 2 experimentos independientes (n = 3 ratones); ****, P <0,0001, ***, P <0,001, **, P<0,01, N.S. no significativo, ensayo de latde Student bilateral (f) o ANOVA unidireccional, ensayoa posterioride Bonferroni (j,c,k). Barra de escala de 10 |jm o 50 |jm en c y f o h, respectivamente.

Las figuras 8A-8N muestran que ARNmod<cm s>Pkm2 mejora la función cardiaca y el desenlace después de Ml. A. Cronología experimental para evaluar la función cardiaca y el desenlace. B. Evaluaciones por MRI de la función sistólica ventricular izquierda 1 mes después de MI. Las imágenes representan la cámara ventricular izquierda (subrayada en rojo) en diástole y sístole. C. Porcentaje de fracción de expulsión para los experimentos en b. D. Evaluación ecocardiográfica de delta en el porcentaje de diferencias de acortamiento fraccionario entre el día 2 (referencia) y el día 28 después de MI. E. Imágenes representativas de tinción tricrómica de Masson para evaluar el tamaño de fibrosis 28 días después de MI. F-l. Cuantificación del tamaño de fibrosis (F), relación del peso de corazón al peso corporal (G), tamaño de los CM (H) y densidad capilar (I) medida 28 días después de MI. J-M. Número de CM con diferentes tratamientos 28 días después de MI. J. Imagen representativa del número de CM en cada grupo. D. Cuantificación del experimento en j. L. Imágenes representativas de núcleos de CM aislados (mono, bi o multi). M. Cuantificación del experimento en l. N. Curva de supervivencia después de MI a largo plazo para ratones a los que se ha inyectado ARNmod Pkm2-K o luc-K y cotransfectados con miR1-208. Los resultados representan 2 experimentos independientes (n = 5 ratones); ***, P <0,001, **, P <0,01, *, P <0,05, ANOVA unidireccional, ensayoa posterioride Bonferroni. Los valores de P para supervivencia a largo plazo se calcularon usando el ensayo del orden logarítmico de Mantel-Cox. Barra de escala de l0 jm .

Las figuras 9A-9M muestran un rastreo de linaje de CM que expresan<cms>Pkm2 después de MI y muestran número aumentado de CM transfectados e inducción de mediadores clave posteriores de las funciones de Pkm2. A. Cronología experimental usada para rastreo de linaje cardiaco en ratones R26<mTmG>. B. Eficacia de transfección (% GFP<+>) de CM o células no CM 28 días después de MI. C. Imágenes representativas de CM y su descendencia (GFP<+>) 28 días después de MI. D. Cuantificación de CM GFP<+>3 o 28 días después de MI. Relación de peso del corazón a peso corporal (E), tamaño relativo de CM GFP<+>(F), y número de núcleos en CM GFP<+>(G) en corazones, 28 días después de MI. H. Imagen representativa de CM GFP<+>, pH3<+>o Ki67<+>28 días después de MI. Cuantificación de CM GFP<+>pH3<+>(I) o CM GFP<+>Ki67<+>(J) 28 días después de transfección con<cms>Luc o<cm s>Pkm2 con ARNmod<cms>Cre en modelo de Ml. k-m. 2 días después de MI y administración de<cms>ihCD25 con ARNmod<cms>Luc o<cms>Pkm2, los CM adultos se aislaron usando microesferas magnéticas. K. Análisis de qRT-PCR para validar la pureza de los CM aislados. L. Comparaciones de expresión génica de genes clave tanto para PPP (G6PD) como dianas transcripcionales indirectas posteriores clave de Pkm2 en CM adultos. M. Expresión de genes promotores del ciclo celular o inhibidores del ciclo celular. Los resultados representan 2 experimentos independientes (n = 3 ratones); ***, P <0,001, **, P <0,01, *, P<0,05, N.S. no significativo, ensayo de latde Student bilateral (b-j) o ANOVA con ensayoa posterioride Bonferroni (k-m). Barra de escala de 50 o 10 jm en c o h, respectivamente.

La figura 10 (S1) muestra que CM adultos se transfectan sucesivamente con ARNmodin vitro.CM adultos aislados se transfectaron con GFP nuclear (nGFP) y se tomaron imágenes 20 horas después de la transfección (barra = 10 jm .)

La figura 11 (S2) es un gráfico de barras que muestra que la activación de la proliferación de CM adultosin vivousando ARNmod inductores del ciclo celular no compromete la integridad de los CM. El tamaño de los CM se midió usando tinción de aglutinina de germen de trigo (WGA) para la evaluación del área de sección transversa de los CM en corazones 7 días después de Ml con diferentes tratamientos de ARNmod. Los resultados indican ausencia de diferencias significativas en la integridad y tamaño de los CM cuando se administraban los ARNmod inductores del ciclo celular Lin28 o Pkm2 en moldeo de Ml de ratón adulto. Los resultados representan dos experimentos independientes con n = 3 ratones, N.S. no significativo, ensayo de latde Student bilateral.

Las figuras 12A-12C (S3) muestran que la activación de la proliferación de CM adultosin vivousando ARNmod inductores del ciclo celular reduce la apoptosis de CM y aumenta la densidad capilar. La proliferación de CM (Ki67+), la apoptosis (TUNEL+) y la densidad capilar (estructuras luminales Cd31+) se midieron en el ventrículo izquierdo de corazones 7 días después de Ml y diferentes tratamientos de ARNmod. A. Datos representativos que muestran que el tratamiento con ARNmod inductor del ciclo celular Lin28 7 días después de Ml induce proliferación de CM, reduce la apoptosis y aumenta la densidad capilar. Resultados cuantificables para el nivel de apoptosis (B) o densidad capilar (C) con los diferentes tratamientos. Los resultados indican reducción significativa en la apoptosis de CM y la elevación en la densidad capilar usando genes inductores del ciclo celular tales como Lin28 (rojo), y PKM2. Los resultados representan dos experimentos independientes con n = 3 ratones, ***, P <0,001, ensayo de latde Student bilateral.

Las figuras 13A-13C (S4) muestran que miR-1 y miR-208 se expresan exclusivamente en CM neonatales de ratain vitro.A. ARNmod de CD25 humano inactivo (ihCD25) con o sin elemento de reconocimiento de miR para miR-208, miR1, miR133a, miR126, miR199, miR378 y miR29a se transfectaron en CM neonatalesin vitro.20 horas después de la transfección las células se fijaron y tiñeron con anti CD25 (rojo) y troponina I (marcador de CM, verde). B. Imágenes tomadas para diferentes tratamientos que muestran que, cuando el ARNmod ihCD25 tenía elementos de reconocimiento de miR-1 o miR-208, los CM (células troponina l+) no podían traducir el ARNmod ihCD25 (CM troponina l+ e ihCD25+), otros tratamientos provocaron traducción de ihCD25 en los CM. Esto indica que solamente miR-1 o miR-208 son específicos de CM. C. Cuantificación de los experimentos. Los resultados representan dos experimentos independientes con n = 3 pocilios, barra = 10 mm.

Las figuras 14A-14C (S5) muestran que miR-1 y miR-208 se expresan exclusivamente en CM neonatales de ratain vitro.Un ARNmod ihCD25 con o sin elemento de reconocimiento de miR para miR-208 o miR1 se cotransfectó con nGFP en CM neonatalesin vitro.20 horas después de la transfección, las células se fijaron y se tiñeron con anti CD25 (rojo) y troponina I (marcador de CM, verde nuclear). nGFP se usó como control de transfección. B. Imágenes tomadas para diferentes tratamientos que muestran que, cuando ARNmod ihCD25 tenía elementos de reconocimiento de miR-1 o miR-208, los CM (células troponina l+) no podían traducir el ARNmod ihCD25 (células troponina l+ e ihCD25+), sin embargo, el ARNmod ihCD25 sin elementos de reconocimiento de miR pudo traducirse en CM. Todas las células se transfectaron con nGFP, lo que indica que ARNmod se administraba satisfactoriamente. C. Cuantificación de los experimentos. Los resultados representan dos experimentos independientes con n = 3 pocillos, barra = 10 mm.

Las figuras 15A-15C (S6) muestran que miR-1 y miR-208 se expresan exclusivamente en corazón de ratón adultoin vivo.A. ARNmod ihCD25 con o sin elemento de reconocimiento de miR para miR-208 o miR1 se contransfectó con nGFP en corazón de ratón adulto en modelo de Ml. 20 horas después de Ml y administración de ARNmod, los corazones se recogieron, se fijaron y se tiñeron con anti CD25 (rojo), troponina I (marcador de CM, blanco) y nGFP (verde). nGFP se usó como control de transfección. B. Imágenes tomadas para diferentes tratamientos, que muestran que, cuando ARNmod ihCD25 tenía elementos de reconocimiento de miR-1 o miR-208, los CM (células troponina l+) no podían traducir el ARNmod ihCD25 (células troponina l+ e ihCD25+), transfectar ihCD25 sin sitio de reconocimiento de miR provocó traducción de ihCD25 en los CM. Todas las células se transfectaron con nGFP, lo que indica que ARNmod se administraba satisfactoriamente. C. Cuantificación de los experimentos. Los resultados representan dos experimentos independientes con un total de n = 5 ratones, barra = 10 mm.

Las figuras 16A-16C (S7) muestran que ARNmod específico de CM nGFP que portan elemento de reconocimiento para miR-208, miR-1 o ambos, en una relación de 1:1, muestra traducción de nGFP principalmente en CMin vitro. A.Diseño de ARNmod específico de CM. B. ARNmod específico de CM nGFP que porta elemento de reconocimiento para miR-208, miR-1 o ambos, en una relación de 1:1, se transfectó en CM neonatales de ratain vitro.

20 horas después de la transfección las células se fijaron y tiñeron para nGFP (nuclear verde) y troponina I (marcador de CM, rojo). C. Cuantificación del experimento descrito en B. Los resultados representan dos experimentos independientes con n = 3 pocillos, barra = 10 mm.

Las figuras 17A-17C (S8) muestran ARNmod específico de CM nGFP que porta elemento de reconocimiento para miR-208, miR-1 o ambos, en una relación de 1:2,5 o mayor, muestra traducción de nGFP exclusivamente en CMin vitro. A.Diseño de ARNmod específico de CM. B. ARNmod específico de CM nGFP que porta elemento de reconocimiento para miR-208, miR-1 o ambos, en diferentes relaciones, se transfectó en CM neonatales de ratain vitro.20 horas después de la transfección, las células se fijaron y tiñeron para nGFP (verde nuclear) y troponina I (marcador de CM, rojo). C. Cuantificación del experimento descrito en B. Los resultados representan dos experimentos independientes con n = 3 pocillos, barra = 10 mm.

Figura 18 (S9) ARNmod específico de CM nGFP que porta elemento de reconocimiento tanto para miR-1 como miR-208, en una relación de 1:0,5 o mayor, muestra traducción de nGFP exclusivamente en CMin vivo.Los resultados representan dos experimentos independientes con n = 3 ratones, barra = 10 mm.

Figuras 19A-19D (S10) ARNmod específico de CM Pkm2 promueve la proliferación exclusivamente en CM. A. Cronología experimental. B. Diseño de ARNmod usado en los experimentos. C. ARNmod específico de CM Lin28/PKM2 promueve la proliferación exclusivamente en CM. D. ARNmod PKM2 que porta un motivo k cotransfectado con L7AE-miR1 y miR208 se ensayó para la reactivación de la proliferación de cardiomiocitos de ratón 7 días después de la administración en un modelo de infarto de miocardio de ratón. La línea discontinua roja representa la tasa de proliferación de control. Los resultados representan 2 experimentos independientes con n = 2 ratones (total n = 4 ratones), *** P <0,001, N.S., no significativo; ensayo de latde Student bilateral.

Figura 20 (S11) El ARNmod L7AE no elevaba la respuesta inmunitaria en modelo de infarto de miocardio de ratón adulto. Imágenes de calidad que muestran que no puede observarse elevación en la respuesta inmunitaria (células CD45+, rojo) después de haber administrado L7AE con o sin elementos de reconocimiento de diferentes miR. Barra de escala = 10 pm.

Figuras 21A-21C (S12) Evaluación de ARNmod L7AE con o sin elemento de reconocimiento de miR para miR-208 o miR1 o ambos sobre la proliferación y tamaño de CM,in vivo.A un corazón adulto de ratón después de Ml se le inyectó Luc, L7AE sin elemento de reconocimiento de miR o con elemento de reconocimiento para miR-1 o miR-208 o ambos. 7 días después de Ml, se recogieron los corazones, se fijaron y se tiñeron para diferentes marcadores de proliferación tales como Ki67, BrdU, H3P y Aurora B (B) y WGA para medir el tamaño de los CM en los corazones tratados (C). Los resultados indican que L7AE con elemento de reconocimiento de miR para miR-208 o miR-1 o ambos induce proliferación de CM sin comprometer el tamaño de los CM. Los resultados representan dos experimentos independientes con n = 3 ratones, N.S., no significativo, ***, P <0,001, ensayo de latde Student bilateral.

Las figuras 22A-22C (S13) muestran el sistema regulador de la transcripción/traducción usado para expresar nGFP.

La figura 23 muestra los resultados del aislamiento de CM adultos transfectados de corazón después de Ml usando una estrategia de ARNmod específico de CM y clasificación de microesferas magnéticas. A. El aislamiento de CM adultos se realizó 2 días después de Ml y administración de ARNmod. Se usaron microesferas magnéticas antihCD25 para aislar células CD25-positivas. B. Ratones CFW se transfectaron con ihCD25 y nGFP que porta el motivo k. Todas las células positivas aisladas con esta estrategia son GFP+ ihCD25+. C. Cuando se transfectaron junto con L7AE que porta elementos de reconocimiento de miR1 y miR208 (ARNmod específico de CM) se produce una mezcla de CM transfectados (nGFP+ e ihCD25+) y CM no transfectados y células no CM. D. Usar microesferas magnéticas hCD25 permite aislar solamente CM transfectados. Ratones = 3.

La figura 24 muestra que ARNmod específico de CM Lin28 o Pkm2 mejora la función cardiaca 28 días después de Ml e inyección en modelo de infarto de miocardio de ratón. La función cardiaca se midió para diferentes grupos tratados en el día 2 y día 28 después de Ml usando ecocardiografía. Los resultados muestran mejora de la función cardiaca en grupos tratados con Lin28 o Pkm2 con efecto sinérgico cuando se administraba Lin28 o Pkm2 de manera específica de CM (+L7Ae miR1 miR208). n = 3 ratones, ***, P <0,001, ensayo detde Student bilateral.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA DIVULGACIÓN

Las metodologías usadas en el desarrollo de la presente invención son bien conocidas por los expertos en la materia salvo que se indique de otro modo.

En la descripción que sigue, se seguirán determinadas convenciones en cuanto al uso de terminología. En general, los términos usados en este documento están destinados a interpretarse de forma coherente con el significado de esos términos como se conocen por los expertos en la materia. Se proporcionan algunas definiciones simplemente por conveniencia del lector.

La expresión "elemento de reconocimiento para miARN" o "elemento de reconocimiento de miARN" se refiere a oligonucleótidos basados en ARN monocatenario que se diseñan para que se unan a miARN endógeno e inhiban la expresión de una construcción que contiene el elemento de reconocimiento cuando se introduce en células.

El término "miARN" se refiere a secuencias que son complementarias a ARNm que están implicadas en la escisión del ARN o la supresión de la traducción. Los miARN maduros endógenos funcionan como parte del complejo inducido por ARN, que tiene la capacidad de regular postranscripcionalmente los ARNm que tienen secuencias con complementariedad parcial al miARN unido. A través de la hibridación de la secuencia anti-miARN con la secuencia de miARN, se neutraliza la función de la secuencia de miARN evitando su unión selectiva a la diana.

El término "ARNmod" se refiere a un ARN modificado sintético que puede usarse para la expresión de un gen de interés. Las modificaciones químicas hechas en el ARNmod, por ejemplo, sustitución de seudouridina en el lugar de uridina, estabilizan la molécula y potencian la transcripción. Además, a diferencia de la administración de agentes proteínicos directamente a una célula, que puede activar el sistema inmunitario, la administración de ARNmod puede conseguirse sin impacto inmunitario. El uso de ARNmod para expresiónin vivoein vitrose describe en más detalle en, por ejemplo, el documento WO 2012/138453.

La expresión "CD25 humano inactivo" (ihCD25) se refiere a un receptor de interleucina-2 truncado que tiene solamente el dominio extracelular y no puede enviar señales al interior de la célula. Otra especie, por ejemplo, CD25 de ratón inactivo también puede usarse en el método divulgado.

La presente divulgación se refiere a metodología para conseguir expresión específica de célula de un ARNmod que codifica un gen de interés (GOI), cuya expresión se desea en una célula de interés. En un aspecto, la divulgación describes un sistema regulador de la expresión para la transcripción específica de célula, comprendiendo el sistema un primer ácido nucleico que tiene una región no traducida (UTR) 5' y una 3'UTR, donde el ácido nucleico codifica (1) un elemento de reconocimiento de microARN (miR) específico de célula en dirección 5' de su 3'UTR, y (2) una proteína supresora de la traducción; y un segundo ácido nucleico que tiene una 5'UTR y un 3'UTR que codifica (1) un motivo de interacción proteínica supresora, por ejemplo, un motivo K, en dirección 3' de su 5'UTR que se une a la proteína supresora de la traducción, y (2) un gen que codifica una proteína de interés.

Los tratamientos actuales para Ml abordan las consecuencias de la pérdida de miocitos, pero no son eficaces en potenciar la reparación del miocardio de músculo cardiaco perdido (3, 5). Recientemente, se demostró que las células de corazón de mamífero adulto de un día (ratones) pueden regenerarse a sí mismas mediante proliferación de CM (7). Al examinar las diferencias genéticas entre las fases regenerativa y no regenerativa se descubrió que el gen expresado de forma más diferencial entre estas fases pertenece a las categorías de mitosis y ciclo celular (7).

El ARNm modificado (ARNmod) ha surgido como una herramienta eficaz y segura para transferencia de genes somáticos, y se ha usado satisfactoriamente por nosotros y otros para administración génica al corazón.1012-15 Aquí mostramos que la isozima muscular de piruvato cinasa M2 (Pkm2), un factor proproliferativo, frecuentemente desregulado en cáncer,1617 se expresa elevadamente en CM regenerativos fetales y neonatales iniciales, pero no en CM adultos. El restablecimiento de los niveles de Pkm2 usando la administración de ARNmod de la divulgación exclusivamente en CM adultos (cmsPkm2) después de MI indujo significativa y exclusivamente la proliferación de CM, y se asoció con función cardiaca mejorada, tamaño de fibrosis reducido, relación aumentada de peso del corazón a peso corporal, tamaño reducido de CM, apoptosis reducida y densidad capilar aumentada. Esos procesos regenerativos se tradujeron en supervivencia a largo plazo aumentada después de MI. Usando rastreo de linaje y aislamiento de CM transfectados con Pkm2 seguido de análisis de expresión génica después de MI, mostramos un aumento en el número de colonias de CM transfectados con Pkm2 y la implicación potencial de efectores posteriores clave de las funciones citoplásmicas proproliferativas (mediante la ruta de pentosa fosfato (PPP)1819) y nucleares (mediante transactivación de p-catenina y Hif1a2021) de Pkm2. Nuestros resultados muestran que un corto estímulo de un gen proproliferativo, usando una plataforma clínicamente adaptable, muy traducible es suficiente para inducir la proliferación de CM y la regeneración cardiaca. Esos hallazgos subrayan el potencial terapéutico de ARNmod cmsPkm2 en enfermedades cardiacas.

La reactivación de la proliferación de CM ha sido un elemento clave en estrategias de regeneración cardiaca. La regeneración cardiaca en pez cebra y tritón está principalmente mediada por la proliferación de CM3578. En desarrollo fetal de mamíferos, la proliferación de CM es una ruta distinta para el crecimiento y regeneración del corazón922. Se ha mostrado que, después de lesión, los CM adultos regulan por aumento un subconjunto de genes fetales, lo que sugiere que los CM adultos no están diferenciados de forma terminal y poseen algún grado de plasticidad celular49. Los CM de mamífero adultos pueden dividirsein vitroein vivoy esta capacidad puede estimularse regulando por aumento los genes proproliferativos922-33. Durante años, varias publicaciones han mostrado que la reactivación de la reentrada en el ciclo celular de CM adultos es posible mediante proteínas23,2426,3034, virus26303135 o modelo de ratón transgénicos de genes de proliferación252833. La administración de proteína con el propósito de inducción del ciclo celular es dificultosa debido a la semivida muy corta, la dificultad de administración local, la ausencia de especificidad de los CM y la incapacidad de administrar genes intracelulares, tales como factores de transcripción. El vector de virus adenoasociado específico cardiaco (AAV<cms>) no es inmunógeno y se usa en muchos estudios del corazón, pero tiene un tiempo de expresión muy largo y mantenido que puede dar lugar a tamaño aumentado de CM incontrolado e hipertrofia cardiaca y arritmia. Aunque los ratones transgénicos pueden usarse de manera específica de CM y transitoria, no son clínicamente relevadas para administración génica. Los retos con las estrategias actuales poner de relieve la necesidad de una estrategia de administración génica eficaz que pueda administrar de forma segura y local genes inductores del ciclo celular a los CM, de una manera transitoria, eficaz y controlada. La isozima muscular de piruvato cinasa M2 (Pkm2) es un inductor del ciclo celular. Durante el desarrollo, Pkm2 es expresa en muchos tejidos adultos, incluyendo el bazo y el pulmón, sin embargo, durante la adultez, Pkm2 se expresa estrictamente en células proliferantes con alta actividad anabólica1617. Se descubrió que Pkm2 aumenta la proliferación de células adultas y células cancerosas, la angiogénesis y evita la apoptosis provocada por agresión oxidativa182036-42. Pkm2 ejerce sus funciones mediante sus dos funciones distintas: En el citoplasma, Pkm2 desplaza el destino metabólico de glucólisis a la ruta de pentosa fosfato (PPP) al reducir la conversión de fosfoenolpiruvato en piruvato1819. Esto da lugar a la acumulación de galactosa, un intermedio de glucólisis, y activación de PPP mediante glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6pd)43-45. La activación de la ruta de PPP da lugar a la síntesis de nucleótidos, aminoácidos y lípidos y a la producción de NADPH reducido, aumento de óxido nítrico sintasa y reparación de ADN38394146'48. Además, Pkm2 tiene una función también en el núcleo. Pkm2 interactúa directamente con los factores de transcripción pcatenina y Hif1a. Esta interacción promueve la expresión de genes tal como en Ccdn1, c-Myc y Vegfa, y Bcl22021. Véase el resumen de la función de Pkm2 en células proliferativas o cancerosas en la figura 5 (S1).

Varios estudios indican que los genes inductores del ciclo celular pueden inducir la proliferación de CM (8 22). Sin embargo, la activación de estos genes durante periodos largos en C<m>puede dar lugar a hipertrofia de CM y, en algunos casos, cardiomiopatía hipertrófica y HF (14). Además, la administración sistémica de genes inductores del ciclo celular puede dar lugar a crecimiento celular incontrolado de células no CM en el corazón y en todo el organismo, y puede dar lugar a problemas de seguridad.

La expresión diferencial de diferentes genes inductores del ciclo celular en el corazón cambiar durante el desarrollo del corazón. Otros y nosotros nos centramos en dos puntos temporales diferentes después del nacimiento (día 1 y día 10) ya que representan las fases del desarrollo en que el corazón tiene capacidad regenerativa mediante proliferación de CM (día 1) y ausencia de esta capacidad (día 10). Como puede observarse en la figura 1a, varios inductores del ciclo celular cambian significativamente entre las dos fases del desarrollo. Sin embargo, los niveles de Pkm2 en corazones de ratones son altos durante el desarrollo fetal49 y disminuyen muy significativamente en el día 10 después del nacimiento. Como Pkm2 está muy significativamente anterior a varios genes inductores del ciclo celular y sus cambios en la coinmunotinción de Pkm2 y el marcador de CM a-actinina reveló que Pkm2 se expresa elevadamente en CM durante el desarrollo y un día después del nacimiento, sin embargo, su expresión fue indetectable 8 semanas después del nacimiento (figura 1b y c). La expresión de Pkm2 en el corazón después de Ml estaba restringida a inmunocitos (CD45+) y células no CM, pero no estaba regulado por aumento en CM (figura complementaria 2a y b). Hemos restablecido los niveles de Pkm2 por inyección directa de ARNmod Pkm2 en el miocardio (figura 1c). El estudio farmacocinético de los niveles de Pkm2 después de inyección en el miocardio indicó que la expresión de la proteína Pkm2 se producía unas pocas horas después de la inyección, y duraba al menos 8 días, pero no más de 12 días (figura 1d). Para ensayar el efecto de la expresión de Pkm2 en la proliferación de CM, se aislaron CM de rata neonatales de 4 días de edad y se transfectaron con ARNmod Luc de control o Pkm2 (figura complementaria 3a y b). El ARNmod Pkm2 se tradujo 12 horas después de la transfección y los niveles permanecieron hasta 10 días después de la transfección (figura complementaria 3c). Tres días después de la transfección con ARNmod Pkm2 o Luc, hubo un aumento significativo en la proliferación de CM transfectados con Pkm2 (figura complementaria 3d y e). Para ensayar los efectos de Pkm2 en el escenario de Ml, se inyectaron directamente ARNmod Pkm2 o Luc en el miocardio inmediatamente después de ligamiento LAD.13-15 Una semana después de MI e inyección, Pkm2 indujo significativamente la proliferación de CM y células no CM (figura 1e-h). Proponemos la hipótesis de que la mejora observada en la capacidad proliferativa puede traducirse en una mejor regeneración, y producir un desenlace mejorado después de MI. Sin embargo, inducir la proliferación de células no CM en el corazón frecuentemente provoca efectos indeseados, principalmente al promover la fibrosis y la respuesta inmunitaria. Por tanto, desarrollamos un sistema de ARNmod único específico de CM (ARNmodcms) que se basa en dos ARNmod distintos (figura 2 y figuras complementarias 4 y 5). La primera construcción contiene L7AE, una proteína ribosómica arqueobacteriana que regula la traducción de genes que contienen un motivo de giro retorcido (motivo K), un sitio de unión específico para L7AE.5051 La traducción del ARNmod L7AE suprime la traducción del ARNmod del gen de interés diseñado cuando los dos se cotransfectan en la célula. Al añadir un elemento de reconocimiento de microARN específico de CM (miRcms) a la 3'UTR del gen L7AE, fuimos capaces de evitar la traducción de L7AE en CM que expresan abundantemente y muy exclusivamente esos miR, permitiendo la traducción del ARNmod del gen de interés estrictamente en CM (figura complementaria 4). Se informa que el miR1-1 (miR-1), miR-208a (miR-208) y miR-199a (miR-199) se expresan principalmente en CM.52-54 Se ensayó la expresión de esos miR en muestro modelo generando un CD25 humano inactivo (ihCD25) - gen trucando que contiene solamente el dominio extracelular de hCD25 - como gen indicador que puede inmunoteñirse cuando se expresa en la superficie de células/tejidos. Hemos diseñado dos versiones de la construcción de ihCD25, con o sin elementos de reconocimiento para miR-1, miR-208 o miR-199. Los ARNmod se transfectaron en CM neonatales (figura complementaria 5a-f), o se inyectaron usando el modelo de Ml (figura 2ga-c y figura complementaria 5g y h). Se descubrió que miR-1 y miR-208 son específicos de CM, como se indica por la tinción positiva de ihCD25 en células no CM, pero no en CM. Diseñamos un ARNmod L7AE que contiene ambos elementos de reconocimiento de miR-1 y miR-208 (miR-1-208) (figura 2d-k), y se usó un ARNmod GFP nuclear (nGFP-K) y un ARNmod de Cre recombinasa (Cre-K) que contiene un motivo K. En nuestro modelo de Ml, la transfección de nGFP-K provocó la traducción de nGFP tanto en CM y como en células no CM. Sin embargo, cuando nGFP-K se cotransfectaba con miR-1-208, nGFP se traducía exclusivamente en CM (figura 2e y f). La cotransfección de Cre-K con miR-1-208 en nuestro modelo de Ml usando ratones indicadores Rosa26 (Rosa26mTmG) provocó loa expresión de GFP estrictamente en CM (figura 2g). La inyección de Cre-K en solitario provocó una eficacia de transfección de ~24,8 % de sección cardiaca/~2600 células en el ventrículo izquierdo (tanto CM como células no CM). Sin embargo, la combinación de Cre-K+miR1-208 provocó una eficacia de transfección de un 7,7 %/~800 células de exclusivamente CM (figura 2h). También mostramos que la proteína no mamífera L7AE no exacerba la respuesta inmunitaria después de Ml (figura complementaria 6). Formulamos la hipótesis de que esto se debe a la respuesta inmunitaria ya activa en el corazón inmediatamente después de Ml. Concluimos que el uso de L7AE en modelo de ratones es inmunológicamente seguro. Para ensayar la funcionalidad de nuestra plataforma de administración de ARNmodcms en nuestro modelo de Ml, inyectamos directamente Luc-K, miR1-208, Luc K+miR1-208, Pkm2-K, Pkm2+miR1-208 o Pkm2-K+miR1-208 (cmsPkm2). Siete días después de la transfección, medimos la tasa de proliferación en el corazón (figura 2i). El ARNmod Pkm2-K en solitario o Pkm2+miR1-208 aumentó significativamente la proliferación tanto de CM como de células no CM (P <0,001) en comparación con ARNmod Luc (figura 2j y k). Sin embargo, el ARNmod cmsPkm2 reactivó significativamente la proliferación de solamente CM (P <0,001), sin influencia significativa sobre la proliferación de células no CM. Usando imágenes en vivo de CM neonatales de rata durante 24 horas, descubrimos que la cotransfección de ARNmod cmsPkm2 con ARNmod cmsnGFP aumentó la proliferación de CM en comparación con la transfección de ARNmod cmsnGFP en solitario (vídeo complementario 1). Además, el ARNmod cmsPkm2 redujo significativamente la apoptosis y aumentó la densidad capilar en el miocardio 2 o 7 días después de MI (figura complementaria 7a-e). La m R i o ecocardiograma mostró que cmsPkm2 aumentaba significativamente el porcentaje de fracción de expulsión (figura 3a-d y vídeos complementarios 2 y 3) y el delta de porcentaje de acortamiento fraccionario desde el día 2 (referencia) hasta el día 28 después de MI (figura 3d). El diámetro interno ventricular izquierdo en sístole final se aumentó, mientras el diámetro interno ventricular izquierdo en diástole final se aumentó significativamente en ratones cmsPkm2 en comparación con el control 28 días después de MI (figura complementaria 7f-h). 28 días después de MI, la expresión de Pkm2 o cmsPkm2 redujo significativamente la formación de fibrosis cardiaca. Además, no se observaron anomalías en el tejido cardiaco (por ejemplo, angioma, edema) después de la inyección de cmsPkm2 (figura 3e y f), la relación de peso del corazón al peso corporal se aumentó significativamente (figura 3g) mientras que el tamaño de los CM se disminuyó significativamente, lo que indica la proliferación de CM (figura 3h y figura complementaria 7i), y la densidad capilar se aumentó significativamente (figura 3i) en transfecciones de ARNmod Pkm2 o cmsPkm2 en comparación con los controles. Finalmente, cmsPkm2 aumentó significativamente el número de CM en el corazón sin elevar el número de núcleos por CM, mientras aumentaba la fracción mononuclear en comparación con el control (figura 3j-m). De forma importante, la curva de supervivencia a largo plazo para ratones tratados inmediatamente después de Ml con ARNmod cmsLuc o cmsPkm2 mostró mejora significativa en la supervivencia de los ratones después de MI y la transfección de cmsPkm2 (figura 3n). Para comprender el mecanismo por el que cmsPkm2 mejora la función cardiaca después de MI, usamos un modelo de rastreo de linaje que combina ARNmodcms y R26mTmG (figura 4a-j) para expresar exclusivamente Pkm2/Luc en CM (al mezclar cmsPkm2/cmsLuc + ARNmod cmsCre; CM marcados con GFP, figura 4a y b), y rastrear el destino y las propiedades de los CM transfectados a lo largo del tiempo, después de que el ARNmodcms ya no se expresara. El número de CM transfectados con ARNmod cmsPkm2+Cre fue mayor 3 días después de MI y significativamente mayor 28 días después de MI en comparación con el control (figura 4c y d). La relación de peso del coral al peso corporal se aumentó significativamente (figura 4e), mientras que el tamaño de CM GFP+ (figura 4f) y el número de núcleos/célula (figura 4g) se disminuyó significativamente en ratones tratados con ARNmod cmsPkm2+Cre en comparación con el control. De forma importante, 28 días después del tratamiento con ARNmod cmsPkm2+Cre, los CM GFP+ mostraron expresión elevada de marcadores proliferativos tales como pH3 y Ki67 (figura 4h-j), mucho después de que Pkm2 no se expresara. Se midieron los cambios en la expresión génica después de la administración de cmsPkm2 o cmsLuc junto con ARNmod cmsihCD25 en un escenario de Ml 2 días después de la inyección. Las células aisladas se enriquecieron para marcadores de CM con expresión significativamente menor de troponina T (figura 4k). Las células que expresaban Pkm2 regularon por aumento significativamente los efectores posteriores de sus funciones citoplásmicas (G6pd) y nucleares (c-Myc, ciclina D1, Bcl2, VEGF-A y Pdk1) (figura 4I). De acuerdo con la proliferación aumentada, observamos una regulación por aumento de los genes promotores del ciclo celular (Cdc20, Cdk1 y Ccnd2, Ccnb1), y regulación por disminución de los inhibidores del ciclo celular (p21 y p27) en CM Pkm2+ ihCD25+ en comparación con CM Luc+ ihCD25+ (figura 4m).

La rápida regulación por disminución de Pkm2 después del nacimiento, que coincide con la pérdida de la capacidad de regeneración cardiaca,<55>apunta a su implicación en la regeneración cardiaca fetal y neonatal. Además, sus funciones previamente descritas proproliferativas y prosupervivencia en el cáncer, hace que sea un candidato ideal para promover la función/regeneración cardiaca. Nuestro descubrimiento de que<cm s>Pkm2 mejora el desenlace después de Ml, muy probablemente al mejorar la función cardiaca, tiene implicaciones fisiológicas y clínicas, ya que subrayan el potencial valor terapéutico de la expresión de<cm s>Pkm2 inmediatamente después de MI. Nuestros resultados están en consonancia con una publicación reciente que muestra que una corta expresión de miR sintéticos es suficiente para la inducción de la proliferación de CM y la regeneración cardiaca<56>. Además, la especificidad cardiaca de nuestro ARNmod junto con su corto tiempo de expresión hace que sea una estrategia segura y traducible para regeneración cardiaca. Nuestros datos apuntan a la alta potencia de Pkm2 y su capacidad de inducir reprogramación metabólica que respalda mejor la homeostasis de los CM con efectos beneficiosos a largo plazo, que duran semanas después de que la proteína ya no se exprese. Nuestra estrategia experimental y herramientas nos permitirán investigar más otros genes de reprogramación proproliferativos y metabólicos relevantes y su potencial terapéutico en diferentes modelos de enfermedad, y para estudiar de forma eficaz y precisa el destino celular de los CM. De forma destacable, nuestra estrategia de aislamiento usando<cms>ihCD25 (figura complementaria 8) supera el reto de clasificación por FACS de CM transfectados adultos.<31>Este estudio es pionero en el uso de ARNmodcms para manipular el comportamiento celular y alberga un gran potencial terapéutico para enfermedades cardiacas, ya que el ARNmod es una plataforma segura, transitoria, local y no inmunógena para transferencia génica.

El campo de la genoterapia cardiaca se está expandiendo, aunque si uso en el entorno clínico es limitado. Actualmente el método más ampliamente usado para dirigir la expresión génica al corazón es a través de vectores víricos, particularmente el vector de virus adenoasociado (AAV) (1-3). Durante las últimas décadas se han hecho varios intentos por insertar genes de interés en los CM usando adenovirus, virus adenoasociado (AAV), lentivirus y plásmido de ADN. Mientras el AAV y el adenovirus tienen altos niveles de transfección de CM, la eficacia de transfección de<lentivirus y plásmido de a>D<n es baja. Los adenovirus pueden provocar una respuesta inmunitaria robusta, dejando>solamente el AAV como opción adecuada para sistema de administración génica al corazón. Usar promotores específicos de CM en AAV puede permitir la expresión de genes inductores del ciclo celular estrictamente en CM, sin embargo, su farmacocinética en el corazón (la expresión empieza en el día 4 y permanece al menos 11 meses) puede dar lugar a crecimiento incontrolado y cardiomiopatía hipertrófica y HF (3, 5). Además, más de un 60 % de los individuos humanos sanos poseen anticuerpos neutralizantes dirigidos contra la cápside de AAV que pueden neutralizar de forma eficaz la expresión génica aportada por este método (21). La genoterapia vírica se muestra prometedora aunque sus aplicaciones son limitadas debido a su longitud de expresión e incapacidad de regular la expresión génica de una manera cuantificable de la dosis (1-3).

Aunque el uso de ARN exógeno sin modificar como método de administración génica es atractivo porque puede ser más seguro que el ADN plasmídico debido a un riesgo reducido de integración genómica, es eficaz debido a su inestabilidad fuera de la célula y la fuerte respuesta inmunitaria innata que provoca cuando se transfecta en las células (10, 11).

Karikoet al.descubrieron que la sustitución de uridina y citidina con seudouridina y 5-metilcitidina, respectivamente, reducía drásticamente la respuesta inmunitaria provocada por ARN exógeno (11, 12). Para aumentar la estabilidad y la eficacia traduccional, se sustituye un capuchón análogo anticapuchón inverso (ARCA) de 3'-O-Me-<m7G(5')ppp(5')G en el extremo 5' de la molécula de>A<r>N<(4, 5, 10). Por lo tanto, el ARNm modificado (ARNmod)>proporciona un método novedoso y eficaz de administración génica que proporciona expresión génica a corto plazo (1-2 semanas), valorable para su uso tantoin vitrooin vivo(4-9).

El ARNm modificado (ARNmod) ha surgido como una herramienta eficaz y segura para transferencia génica somática, y lo hemos usado satisfactoriamente nosotros y otros para administración génica al corazón.<101215>Aquí mostramos que la isozima muscular de piruvato cinasa M2 (Pkm2), un factor proproliferativo, frecuentemente desregulado en cáncer,1617 se expresa elevadamente en CM regenerativos fetal y neonatales iniciales, pero no en CM adulticos. El restablecimiento de los niveles de Pkm2 usando administración de ARNmod exclusivamente en CM adultos (cmsPkm2) después de MI indujo significativa y exclusivamente la proliferación de CM, y estaba asociado con función cardiaca mejorada, tamaño de fibrosis reducido, relación aumentada de peso del corazón al peso corporal, tamaño reducido de los CM, apoptosis reducida y densidad capilar aumentada. Estos procesos regenerativos se tradujeron en supervivencia a largo plazo aumentada después de MI. Usando rastreo de linaje y aislamiento de CM transfectados con Pkm2 seguido de análisis de expresión génica después de MI, mostramos un aumento en el número de colonias de CM transfectados con Pkm2 y la potencial implicación de efectores posteriores clave de las funciones proproliferativas citoplásmicas (mediante la ruta de pentosa fosfato (PPP)1819) y nucleares (mediante transactivación de p-catenina y Hif1a2021) de Pkm2. Nuestros resultados muestran que un estímulo de un gen proproliferativo, usando una plataforma muy traducible, clínicamente adaptable es suficiente para inducir la proliferación de CM y la regeneración cardiaca. Esos hallazgos subrayan el potencial terapéutico de ARNmod cmsPkm2 en enfermedades cardiacas.

Recientemente se ha mostrado (1) que usando tecnología de ARNm modificado (ARNmod), el ARNmod puede dirigir una expresión génica transitoria, segura en el corazón con altos niveles de transfección sin provocar respuesta inmunitaria o comprometer el genoma (5, 22). El ARNm no modificado que entra en la célula mediante la membrana celular se reconoce por receptores endosómicos de tipo Toll 7/8 y 3 (23, 24). Este proceso inhibe la traducción de proteínas y activa la respuesta inmunitaria innata, dando lugar finalmente a apoptosis de la célula hospedadora. El ARNmod se sintetiza al sustituir ribonucleótidos con ribonucleótidos modificados de forma natural. El uso de estos ribonucleótidos modificados provoca un cambio en la estructura secundaria del ARNm sintetizado, lo que evita que los receptores de tipo Toll reconozcan el ARNmod y, por lo tanto, permitan su traducción en una proteína funcional por la maquinaria ribosómica sin provocar una respuesta inmunitaria o comprometer el genoma (5, 22).

Los solicitantes mostraron previamente que el ARNmod transfecta diferentes tipos celulares en el corazón, incluyendo CM con alta eficacia, lo que da lugar a niveles inmediatos y altos de expresión proteínica en una cinética transitoria similar a estímulo (duración de 3-5 díasin vitroy 7-10 díasin vivo).La cotransfección de dos ARNmod individuales provocó la cotraducción de ambos. Usando el modelo de Ml (5) y la administración de ARNmod Luc LacZ y nGFP en miocardio, los solicitantes muestran que el tejido cardiaco después de Ml está bien transfectado con ARNmod y varios tipos celulares tales como CM y células no CM están muy transfectadas en el ventrículo izquierdo. Los solicitantes entonces seleccionaron varios genes inductores del ciclo celular candidatos que habían mostrado previamente tener la capacidad de inducir CM neonatales durante el desarrollo cardiaco (CDK2, p catenina) (16) o reactivación de la proliferación de CM adultos en modelos de ratón transgénico (ciclina D2, cMYC) (12, 14) y otros que habían mostrado fuerte potencial proliferativo en diferentes órganos y tipos celulares, pero que nunca se habían ensayado en cardiomiocitos y corazón (Lin28, PKM2) (24, 25).

En general, una plataforma para preparar ARNm modificado (ARNmod) específico de célula es como sigue.

En primer lugar, se elige un tipo celular para preparar el ARNmod específico de célula. Se identifica un microARN (miR) candidato que se ha informado que se expresa en la célula de interés y preferiblemente solamente en la célula de interés (por ejemplo, en el caso de cardiomiocitos, miR1, miR29, miR126, miR133, miR199, miR208, miR378). Se identifican secuencias complementarias inversas para cada secuencia de miR que permitan el reconocimiento del miR específico para esta secuencia. Se añade a la 3'UTR cada una de las secuencias complementarias inversas de miR calculadas previamente para el motivo k de ihCD25, un receptor truncado para hCD25 que porta un motivo k. Esto permite que ihCD25 se exprese solamente en aquellas células que carecen del miR específico al que la secuencia complementaria inversa está dirigida.

Se cotransfecta una mezcla de células que contiene la célula de interés y otro tipo celular (por ejemplo, fibroblastos), así como con ARNmod nGFP y con diferentes ARNmod miR-ihCD25. Después de aproximadamente 18 horas, se fijan las células y se tiñen las células para GFP (muestra las células transfectadas con ARNmod) y para el gen indicador (con anti hCD25, muestra las células que carecen del miR que era la diana) y marcadores específicos de célula (por ejemplo, para cardiomiocitos troponina I, para células endoteliales, Pecam1, etc.).

Se identifican las células GFP-positivas que también son positivas para marcador específico de célula (por ejemplo, troponina I para cardiomiocitos), pero negativas para el gen indicador (hCD25). Esto significa que este miR-ihCD25 específico no se traducía, aunque el ARNmod se administrara a este tipo celular. Esto indicará que este miR se expresa específicamente en el tipo celular de interés y puede usarse para crear ARNmod específico de célula. Se crea el ARNmod específico de célula añadiendo a la 3'UTR de L7AE la secuencia que inhibe ihCD25 en la célula de interés. Se contransfecta con mir-L7AE y el gen de interés que porta en su 5' UTR el motivo k. Estos dos ARNmod permitirán administrar específicamente un gen de interés a un tipo celular específico.

En una realización, el solicitante diseñó y generó ARNmod para cada uno de los genes anteriores. Usando CM neonatal de rata, el solicitante ensayó la traducción de cada ARNmod. Además, se ensayó la funcionalidad de la proteína midiendo la tasa de proliferación de los CM neonatales de rata con el control y el ARNmod inductor celular candidato. Todos los ARNmod inductores del ciclo celular candidatos aumentan la proliferación de CM neonatal de rata y la proliferación de CM adultos después de Ml hasta diversos grados. Tanto Lin28 como PKM2 aumentaron significativamente la capacidad proliferativa de los CM. Por lo tanto, esos genes se seleccionaron para mayor investigación.

Lin28 es un supresor conocido de Let7 que controla estrechamente los reguladores del ciclo celular (25-29). Para ensayar si Lin28 induce los reguladores del ciclo celular, se inyectó ARNmod nGFP (ARNmod de control) o Lin28 inmediatamente después de ligamiento LAD y se descubrió un aumento significativo en la expresión de los genes del ciclo celular Ccnb1, Ccnb2, Cdc20, Cdk1 y Aurka después de 3 días usando RT-PCR. El uso de ARNmod inductores del ciclo celular tales como ARNmod Lin28 de una manera no específica aumenta la proliferación, no solamente en los CM, sino también células no CM que representan un reto empírico ya que el modelo y la hipótesis tenían como objetivo ensayar la proliferación de CM como un medio para conseguir regeneración cardiaca aumentada.

Para abordar este reto los solicitantes diseñaron un sistema de ARNmod específico de CM que se basa en dos ARNmod distintos (figura 5). La primera construcción es un ARNmod supresor que porta L7AE, una proteína ribosómica arqueobacteriana que regula la traducción de un ARNmod de gen de interés diseñado con motivo de giro retorcido - un sitio de unión específico para L7AE (30, 31). La traducción de ARNmod L7AE suprimirá la traducción del ARNmod de gen de interés diseñado cuando los dos se cotransfectan en la célula. Al añadir un elemento de reconocimiento de microARN (miR) específico de CM al gen L7AE, fuimos capaces de evitar la traducción de L7AE en CM que expresan de forma abundante y muy exclusivamente el miR (estrategia de "suprimir el supresor"), lo que permite la traducción del ARNmod del gen de interés estrictamente en los CM. Se mostró previamente que usar un elemento de reconocimiento de miR provoca una reducción del número de copias del miR diana (32, 33). La reducción en el número de miR en el corazón puede ser perjudicial o beneficioso para el corazón (33-42). En nuestra estrategia, necesitamos garantizar que no reducimos la expresión de miR que es beneficiosa para la regeneración cardiaca, sino que en su ligar se reduce la expresión de miR que es perjudicial para la regeneración cardiaca. miR1-2 (miR1), miR208a (miR208) y miR199a (miR199) se expresan principalmente en CM (33, 39, 41). Se descubrió que miR1 y miR208 se regulan por aumento después de Ml en estudio de animales adultos y en seres humanos (33, 38, 41, 43). La regulación por aumento de miR1 y miR208 tiene efectos perjudiciales, mientras que su regulación por disminución tiene efectos beneficiosos después de Ml y enfermedades cardiacas (32-42).

Para ensayar la expresión de estos miR en CM, hemos creado un gen de CD25 humano inactivo (ihCD25), un gen truncado que contiene solamente el dominio extracelular (ECD) de hCD25 - como gen indicador. Hemos diseñado dos versiones de la construcción de ihCD25, con o sin los elementos de reconocimiento de miR para miR-1, miR-208 o miR-199. Entonces transfectamos los ARNmod en CM neonatalesin vitroein vivousando el modelo de Ml (figura 2). Como puede observarse en la figura 6, se descubrió que tanto miR-1 como miR-208 son específicos de CM, ya que se observó traducción de ihCD25 en células no CM, pero no en CM. En contraste, se descubrió que los ARNmod con o sin elemento de reconocimiento de miR-199 no eran específicos de CM,in vitroein vivo.Después, diseñamos un ARNmod L7AE que portan ambos elementos de reconocimiento de miR-1 y miR-208 (L7AE miR-1 miR-208). También generamos un ARNmod de GFP nuclear (nGFP - motivo k) y un ARNmod de Cre recombinase desestabilizada (DD-Cre - motivo k) que incluye el motivo k (sitio de reconocimiento de L7AE). Usando nuestro modelo de Ml de ratón adulto, mostramos que la transfección de nGFP - motivo k provocaba la traducción de nGFP tanto en CM como en células no CM (figura 7). Sin embargo, cuando se cotransfectaba nGFP - motivo k con L7AE miR-1 miR-208, solamente los CM traducían nGFP. Además, la cotransfección de L7AE miR-1 miR-208 con un DD-Cre -motivo k en un modelo de Ml usando Rosa26Tdtomato provocó activación génica (fluorescencia de Tomato) estrictamente en CM. La combinación de estos dos métodos nos permite expresar de forma elegante nuestros genes/genes de interés exclusivamente en CM, y nos permite un rastreo de linaje sobre periodos de tiempo más largos después de que ya no se exprese el ARNmod del gen de interés.

Para ensayar la funcionalidad de nuestro ARNmod específico de CM, inyectamos directamente ARNmod de control de Luc o ARNmod Lin28 - K y PKM2-motivo k en solitario o junto con L7AE miR-1 miR-208 (ARNmod específico de CM de Lin28/PKM2) usando nuestro modelo de Ml. Siete días después de la transfección, medimos la proliferación (usando marcadores de proliferación distintivos, BrdU, Ki67, H3P y Aurora B) tanto de CM como de células no CM. Como se representa en la figura 8, el ARNmod Lin28-k o PKM2-motivo k en solitario aumentó significativamente la proliferación tanto de CM como de células no CM (P <0,001) en comparación con ARNmod Luc. Sin embargo, el ARNmod específico de CM de Lin28 y PKM2 reactivó significativamente la proliferación de solamente CM (P <0,001), sin influencia significativa sobre la proliferación de células no CM. De forma importante, como L7AE no es una proteína de mamífero, para ensayar la inmunogenia de L7AE después de Ml, inyectamos ARNmod de control de Luc o ARNmod L7AE con o sin miR-1, miR-208 o ambos en modelo de Ml de ratón adulto. Como puede observarse en la figura 8, no presenciamos elevaciones significativas en la respuesta inmunitaria y apoptosis aumentada con todos los ARNmod L7AE después de 7 días después de Ml. Concluimos que el uso de L7A<e>en ratones es inmunológicamente seguro.

Plásmidos

pTEMPLZ es un vector de clonación en que puede insertarse una ORF de interés entre las UTR. En una realización, los plásmidos para su uso en el método divulgado incluyen los mostrados en la tabla 1.

Tabla 1

ctctggaggctgttcgcatgcagcacctgattgcccgagaggcagaggctgccatctaccacttgcagctattcgaggaa ctccgccgcctggcgcccattaccagcgaccccacagaagctgccgccgtgggtgccgtggaggcctccttcaagtgct gcagtggggccattatcgtgctcaccaagtctggcaggagtgctcaccaagtggccaggtaccgccctcgggctcctatc attgccgtgactcgaaatccccagactgctcgccaggcccatctgtaccgtggcatcttccctgtgctgtgtaaggatgccgt gctgaatgcctgggctgaggatgtcgaccttcgtgtaaacttggccatggatgttggcaaggcccgaggcttcttcaagaa gggagatgtggtcattgtgctgaccgggtggcgccctggctctggattcaccaacaccatgcgtgtagtgcctgtaccttga GCTGGCTTCTGCGGGGCTTGCCTTGTGGGCATGGCCTTCTTCTCTCCCTTGCAGCT

GTACGT CTT GGTCTTTG A ATA AAGCCT G AGTAGGA A (SEQ ID NO: 6)

7 nucGFP - motivo K TTGGACCCTCGTACAGAAGCTAATACGACTCACTATAGGGAAAGGTGGGCGTGAT CCGAAAGGTGACCCGGATCTGGGGCGTGATCCGAAAGGTGACCCGGAAAGCCAC

Catggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggcc acaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccg gcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgacca catgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgac ggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcg acttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccg acaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccga ccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccg ccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcg gcatggacgagctgtacaagggagatccaaaaaagaagagaaaggtaggcgatccaaaaaagaagagaaaggta ggtgatccaaaaaagaagagaaaggtataaGCTGCCTTCTGCGGGGCTTGCCTTCTGGCCATG CCCTTCTTCTCTCCCTTGCACCTGTÁCCTCTTGGTCTTTGAATAAAGCCTGAGTAG GAA (SEQ ID NO: 7)

8 ihCD25 motivo K - sin modificar TTGGACCCTCGTACAGAAGCTAATACGACTCACTATAGGGAAAGGTGGGCGTGAT CCGAAAGGTGACCCGGATCTGGGGCGTGATCCGAAAGGTGACCCGGAAAGCCAC

Cafggattcatacctgctgatgtggggactgctcacgttcatcatggtgcctggctgccaggcagagctctgtgacgatgac ccgccagagatcccacacgccacattcaaagccatggcctacaaggaaggaaccatgttgaactgtgaatgcaagag aggtttccgcagaataaaaagcgggtcactctatatgctctgtacaggaaactctagccactcgtcctgggacaaccaatg tcaatgcacaagctctgccactcggaacacaacgaaacaagtgacacctcaacctgaagaacagaaagaaaggaa aaccacagaaatgcaaagtccaatgcagccagtggaccaagcgagccttccaggtcactgcagggaacctccaccat gggaaaatgaagccacagagagaatttatcatttcgtggtggggcagatggtttattatcagtgcgtccagggatacaggg ctctacacagaggtcctgctgagagcgtctgcaaaatgacccacgggaagacaaggtggacccagccccagctcatat gcacaggtgaaatggagaccagtcagtttccaggtgaagagaagcctcaggcaagccccgaaggccgtcctgagagt gagacttcctgcctcgtcacaacaacagattttcaaatacagacagaaatggctgcaaccatggagacgtccatatttaca acagatctccaggtagcagtggccggctgtgttttcctgctgatcagcgtcctcctcctgagtgggctcacctggcagcgga gacagaggaagagtagaagaacaatcfagGCTGCCTTGTGCGGGGCTTGCCTTCTGGCCATG CCCTT CTT CT CTCCCTT G CACCT GTACCT CTTGGT CTTT G A ATAA ÁGCCTG AGTAG

GAA (SEQ ID NO: 8)

i 3EQ ID NO:

5’ UTR

Pauta abierta de lectura (Open Reading Frame (ORF))

3 UTR

Clasificación celular específica de CM basada en ARNmod ihCD25

Para ensayar si nuestro diseño novedoso basado en ARNmod específico de CM que permite una expresión génica transitoria de nuestros genes de interés exclusivamente en CM puede usarse para aislar solamente CM transfectados con sistema innovador de clasificación (microesferas magnéticas) basada en CD25 humano (ihCD25) inactivo (solamente dominio extracelular), inyectamos motivo k de nGFP con ARNmod de motivo k de ihCD25 en corazón después de Ml, las células se aislaron y clasificaron con microesferas magnéticas específicas de CD25. Se observaron tanto CM como células no CM nGFP-positivas. Cuando se cotransfectaba motivo k de nGFP, motivo k de ihCD25 con L7AE miR1-miR208 y sin separación magnética, se observaba expresión de nGFP específica de CM. El cultivo también contiene CM y células no CM nGFP-negativas. Cuando se aplicaba separación magnética, solamente se observaban CM nGFP-positivos puros (figura 9).

En una realización, la producción de genes exógenos está dirigida por la expresión de anti-miR a partir de un primer replicón que también codifica una proteína represora. Los anti-miR expresados se unen a los miR que existente de forma natural en cardiomiocitos humanos y de primate y se evita la transcripción de la proteína represora. En ausencia de proteína represora, puede proceder la expresión de gen de interés a partir de un segundo replicó que codifica el gen y que contiene el sitio de reconocimiento de la proteína represora.

Genes inductores del ciclo celular

Puede hacerse que la expresión de un gen de interés, por ejemplo, un gen inductor de la proliferación, sea específica de cardiomiocitos al colocar la transcripción/traducción del gen bajo el control de un sistema regulador de la transcripción/traducción en que uno de un par de ácido nucleicos codifica un anti-microARN (anti-miR) que se une específicamente a un miR diana específico de cardiomiocitos. Un segundo ácido nucleico de proteína supresora de la traducción y un segundo ácido nucleico que comprende un motivo de interacción proteínica supresora que se une a la supresora de la traducción y un gen que codifica una proteína de interés.

Usando el método descrito en este documento, la expresión es transitoria, lo que evita los problemas asociados con la expresión ilimitada, tal como la hipertrofia.

La proteína represora/supresora que se une a un motivo de ARN específico insertado en la región sin traducir 5' de un ARNm modula la traducción de ese mensaje en células de mamífero. La especificidad de expresión para cardiomiocitos humanos y de primate se consigue mediante la inclusión en el oligonucleótido represor/supresor de una secuencia que codifica un elemento de reconocimiento específico para miARN endógenos encontrados en cardiomiocitos de ratón, cerdo, humanos y de primate no humano.

La síntesis de ARNmod para usoin vivoimplica cuatro fases: creación de molde de ADN que contiene el transcrito deseado, transcripciónin vitro(IVT), eliminación de 5' fosfato con fosfatasa Antarctic y precipitación con sal de acetato de amonio 5 M. La investigación en el uso de ARNmod con propósitos experimentales y clínicos está creciendo rápidamente. La transfección diaria con ARNmod que codifica factores de reprogramación OCT4, SOX2, MYC y KLF4 fue satisfactoria en reprogramar fibroblastos humanos de nuevo a pluripotencia (5, 8). Además, se ha mostrado que el ARNmod puede dirigir el destino celularin vitrousando ARNmod MyoD que provocaba la conversión de fibroblastos en células de músculo esquelético (2). El ARNmod también se ha mostrado prometedor en dirigir el destino celularin vivo.El uso en expansión de la tecnología de ARNmodin vivoy su uso potencial en el campo de genoterapia cardiaca no motivó para generar un protocolo simplificado por etapas para la síntesis eficaz de ARNmod para usoin vivo.

Cardiomiocitos

En una realización, la presente divulgación se refiere a un método de tratamiento de un sujeto después de infarto de miocardio (Ml) o insuficiencia cardiaca (HF) en un sujeto, que comprende administrar una cantidad eficaz de una composición que comprende al menos dos ARNmod sintéticos a un sujeto que lo necesita.

La expresión proteínica dura de 5 a 20 días, en algunas realizaciones de 7 a 14 días, y provoca una baja respuesta inmunológica en comparación con ARN no modificado.

Entre otras cosas, la presente divulgación describe un nuevo conjunto de genes inductores del ciclo celular candidatos: Lin28, Pkm2 y ciclina D2 que, cuando se administran como ARNmod, pueden reactivar la proliferación de cardiomiocitos (CM) de mamíferoin vivo(sin aumentar el tamaño de los CM o el número de núcleos), reducir la apoptosis de CM y aumentar la vascularización global del ventrículo izquierdo después de infarto de miocardio (Ml). Cuando la expresión de los genes inductores del ciclo celular se pone bajo el control de un sistema regulador de la transcripción/traducción (regulador de la expresión) para la transcripción (expresión) específica de cardiomiocitos, el resultado es una herramienta para la expresión específica de cardiomiocitos de la proliferación dirigida por el gen inductor del ciclo celular después de lesión, por ejemplo, como resultado de infarto de miocardio (Ml) o insuficiencia cardiaca (HF).

El ARNm modificado (ARNmod) es un sistema de administración génica seguro, eficaz, transitorio y no inmunógeno que permite investigar el efecto de genes inductores del ciclo celular sobre CM después de Ml o HF. Karikoet al.descubrieron que la sustitución de uridina y citidina con seudouridina y 5-metilcitidina, respectivamente, reducía drásticamente la respuesta inmunitaria provocada por ARN exógeno (11, 12). La investigación en el mecanismo reveló que las sustituciones nucleosídicas provocaban un cambio conformacional en el ARN que provocaba respuesta reducida por los receptores de tipo Toll 3, 7 y 8 (TLR3, TLR7, TLR 8), y el gen 1 inducible por ácido retinoico (RIG-1) (13). Se observó una disminución adicional en la respuesta de RIG-1 a partir del ARNmod tras la eliminación de los 5' trifosfatos (4, 10). Para aumentar la estabilidad y la eficacia traduccional, se sustituye un capuchón análogo anticapuchón inverso (ARCA) de 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G en el extremo 5' de la molécula de ARN (4, 5, 10).

Selección celular por afinidad anti-hCD25

La selección celular de cardiomiocitos por clasificación celular FACS tradicional puede ser problemática debido al tamaño de las células. Se ideó una estrategia alternativa a la selección celular. En una realización, usando el sistema regulador de la transcripción de la divulgación, se incluye un ácido nucleico que codifica el dominio extracelular (ECD) de hCD25 en la construcción, que contiene el ácido nucleico que codifica el gen de interés. Para aislar los CM que expresan de forma transitoria el ARNmod de control o el del gen candidato, se seleccionan las células que coexpresan el ECD de hCD25 más el gen de interés usando un anticuerpo anti-ECD de CD25 en una columna de cromatografía de afinidad o usando un método de paneo. Estas células se usan para generar perfiles de expresión génica usando técnicas de secuenciación de ARN, e identificar genes expresados de forma diferencial.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Materiales

Se usan los siguientes materiales junto con el método divulgado.

Todas las soluciones deben prepararse en agua sin nucleasa salvo que se indique de otro modo. Todos los materiales usados en este protocolo deben ser sin nucleasa.

El equipo usado incluye lo siguiente:

1. Termociclador de PCR

2. Microcentrífuga

3. Mezcladora vorticial

4. Termomezcladora (EPPENDORF™)

5. Nano-Drop

6. Agua sin nucleasa

7. Tubos cónicos sin nucleasa de 15 ml

8. Tubos de PCR de separación sin nucleasa

9. Etanol (100% y 70%)

10. Tubos de elución Ambion de 2 ml

Los cebadores usados para PCR con adición de cola son como siguen:

Cebador directo: 5'-TTG GAC CCT CGT ACA GAA GCT AAT ACG-3' (SEQ ID NO: 9)

Cebador inverso: 5'-TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TCT TCC TAC TCA GGC TTT ATT CAA AGA CCA-3' (SEQ ID NO: 10)

La construcción del molde de ADN para transcripciónin vitrousando plásmido pTEMPLZ es como sigue: 1. Enzima polinucleótido cinasa T4

2. ATP 100 mM

3. Mezcla fundamental de PCR KAPA HiFi HotStart ReadyMix 2X

4. EnzimaAlel

5. EnzimaAfel

6. Enzima fosfatasa Antarctic

7. Enzima ADN ligasa T4

8. Células resistentes a fago 2 T1 (T1R) One Shot® ccdB Survival™

9. Kit de extracción de gel QIAquick®

10. Kit de purificación de PCR QIAquick®

11.E. coliquímica competente One Shot

12. Kit QIAprep® spin Miniprep

13. Tampón de fosforilación 10x

Síntesis de molde de ADN lineal con una cola de poli T para la reacción de IVT

1. Mezcla fundamental de PCR KAPA HiFi HotStart ReadyMix<2>X

2. Solución de cebador: 1 pM de cada uno del cebador directo y el inverso

3. EnzimaDpnl

4. Kit de purificación de PCR QIAquick®

Reacción de transcripciónin vitro

1. Kit Ambion T7 Megascript® (Life Technologies n.° cat.: ami 334-5)

2. Solución de GTP 75 mM (proporcionada en el kit Megascript®)

3. Solución de ATP 75 mM (proporcionada en el kit Megascript®)

4. Solución de CTP 75 mM (proporcionada en el kit Megascript®)

5. 5-Metilseudouridina-5'-trifosfato (Trilink)

6. Análogo anticapuchón inverso de Trilink Biotechnologies, 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G 10 emoles (n.° cat.: N-7003) 7. Enzima DNasa T7 TURBO (proporcionada en el kit Megascript®)

8. Kit de limpieza de transcripción Ambion MEGAclear™ (Life Technologies; n.° cat.: AM 1908).

Tratamiento de ARN con fosfatasa

1. Enzima fosfatasa Antarctic

Precipitación de ARN

1. Solución de sal de acetato de amonio 5 M (proporcionada en el kit AmbionMEGAclear™)

2. Tampón de elución (proporcionado en el kit AmbionMEGAclear™)

Preparación para inyección de ARNmod

1. Reactivo de transfección Lipofectamine® RNAiMAX (Thermofisher n.° cat.: 13778150)

2. Medio de suero reducido OptiMEM, sin rojo fenol

3. Aguja ultrafina de jeringa de insulina 31g de 8 mm

Métodos

Los siguientes métodos se usan junto con el método divulgado. Todos los procedimientos se realizaron a temperatura ambiente, en un entorno no estéril salvo que se indique de otro modo. Todos los materiales usados deben estar libre de nucleasa.

Síntesis de ARNmod

Los ARNmod se transcribieronin vitroa partir de moldes plasmídicos usando una mezcla ribonucleotídica personalizada de análogo anticapuchón inverso, 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G (6 mM, TriLink Biotechnologies), trifosfato de guanosina (1,5 mM, Life Technology), trifosfato de adenosina (7,5 mM, Life Technology), trifosfato de citidina (7,5 mM, Life Technology) y N1-metilseudouridina-5'-trifosfato (7,5 mM, TriLink Biotechnologies) como se describe previamente.48-50 El ARNm se purificó usando kit Megaclear (Life Technology) y se trató con fosfatasa Antarctic (New England Biolabs), seguido de repurificación usando kit Megaclear. El ARNm se cuantificó mediante NanoDrop (Thermo Scientific), se precipitó con etanol y acetato de amonio, y se resuspendió en TrisHCI 10 mM, EDTA 1 mM. Para un protocolo detallado, por favor, véase nuestra reciente publicación.48

Transfección de ARNmod. La transfecciónin vivode ARNmod se hizo usando tampón de citrato de sacarosa que contenía 20 |μl de sacarosa en agua sin nucleasa (0,3 g/ml), 20 |μl de citrato (0,1 M pH = 7; Sigma) mezclado con 20 |j| de diferentes concentraciones de ARNmod en solución salina hasta un volumen total de 60 μl . La mezcla de transfección se inyectó directamente (3 inyecciones individuales, 20 μl cada una) en el miocardio. Para transfecciónin vitro,usamos reactivo de transfección RNAiMAX (Life Technologies) que se usó de acuerdo con la recomendación del fabricante.

Construcción de molde de ADN para transcripciónin vitrousando plásmido pTEMPLZ que porta motivo k.

pTEMPLZ es un vector de clonación en que puede insertarse una ORF de interés entre las UTR (figura 1). Las 5'- y 3'-UTR se sintetizande novomediante oligos sintéticos. Las UTR sintetizadas se hibridan juntas y se amplifican usando cebadores directos e inversos. Para proporcionar un sitio de entrada para la ORF, se introducen sitios de restricción deAlelyAfelentre las 5' y 3' UTR. (El nucleótido adenina (A) del 1.er codón (ATG) puede omitirse de la secuencia del cebador directo ya que se proporciona por el sitioAlel.)El fragmento amplificado por PCR y el vector pZErO-2 con resistencia a ampicilina se digieren conHindlllyNotl,y se ligan juntos para crear pTEMPLZ. (El plásmido pTEMPLZ y los derivados deben propagarse en una cepa bacteriana resistente al producto génico ccdB tal como células resistentes a fago 2 T1 (T1R) One Shot® ccdB Survival™.)

Antes de la inserción en pTEMPLZ, la ORF se amplifica usando un par fosforilado de cebador directo e inverso para el gen de interés. La fosforilación de los cebadores se hace usando la enzima polinucleótido cinasa T4 de acuerdo con la reacción a continuación:

Tampón de fosforilación 10 x 5 μl

Cebador directo (100 jM ) 3 μl

Cebador inverso (100 jM ) 3 μl

ATP 100 mM 0,5 μl

Polinucleótido cinasa T4 10 U

Agua sin nucleasa 50 μl

Se incuba la reacción a 37 °C durante 1 hora.

Para inactivar la enzima, la reacción se incuba a 65 °C durante 20 min. La reacción se diluye hasta 300 μl añadiendo 250 μl de agua dando una mezcla final de cebadores 1 jM .

La amplificación de la ORF de interés se hace usando la reacción de PCR a continuación:

Mezcla de cebadores (1 j M) de la anterior 10 μl

ADN de molde 1-100 ng

Agua 50 μl

Mezcla HiFi HotStart ready (2x) 25 μl

La mezcla se procesa en el termociclador con los ajustes de acuerdo con la figura 2. La diana amplificada se aísla usando kit de extracción de gel QIAquick. Antes de la inserción de la ORF, el pTEMPLZ se linealiza y desfosforila. Para linealizar el plásmido, se digiere el pTEMPLZ conAlelyAfelde acuerdo con la reacción a continuación:

ADN de plásmido pTEMPLZ 2 jg

Agua sin nucleasa 30 μl

Tampón 410x 3 μl

Alel5 U

Afel5 U

Se incuba en termomezcladora durante 1 hora a 37 °C. La digestión se purificó usando kit de purificación de PCR QIAquick® y se eluyó en 30 μl de tampón de elución.

El pTEMPLZ linealizado se desfosforila de acuerdo con la reacción a continuación:

Plásmido linealizado de la etapa 1 30 μl

Tampón de fosfatasa Antarctic 10x 5 μl

Fosfatasa Antarctic 5 U

Agua sin nucleasa 50 μl

La reacción se incuba a 37 °C durante 1 hora. La enzima se inactiva incubando a 65 °C durante 15 min.

El plásmido linealizado y desfosforilado se aísla usando kit de extracción de gel QIAquick® y se determina la cantidad de producto de pTEMPLZ usando NanoDrop. El plásmido puede almacenarse en -20 °C para uso futuro.

El ligamiento de extremo romos de la ORF de interés se realiza en pTEMPLZ de acuerdo con la reacción a continuación:

Plásmido TEMPLZ desfosforilado linealizado 50 ng

ORF amplificada exceso molar de factor 3

Tampón de ADN ligasa T4 10x 2 μl

ADN ligasa T4 4 U

Agua sin nucleasa 20 μl

Se mezclan los reactivos y se incuban durante una noche en hielo fundente a temperatura ambiente o a 16 °C. La reacción de ligamiento de control negativo podría ser necesaria para supervisa el autoligamiento del plásmido. La transformación de plásmido se realiza con células competentes y se hace crecer en una placa de agar con ampicilina.

Para aislar clones positivos con la orientación correcta, se realiza PCR de colonias. Se extraen entre 8-10 colonias de placas de agar con ampicilina con una punta de pipeta. Se pincha las puntas individuales en 200 μl de calco Luria (LB) y se aclaran varias veces en 75 μl de tampón TE en pH 8,0, las puntas se incuban en 37 °C en un agitador. Los tubos entonces se hierven durante 5 min para lisar las bacterias y se centrifugan para sedimentar los desechos. La PCR de colonias se realiza con 2 μl de sobrenadante usando cebador directo y cebador inverso específico de gen. La muestra de PCR se procesa en gel de agarosa al 1 % para identificar los clones con orientación positiva. Se cultivan 200 μl de LB con clones en la orientación correcta en un volumen más grande LB durante una noche en un agitador a 37 °C y se extraen usando el kit QIAprep® spin Miniprep. La cantidad de producto plasmídico se determina usando NANODROP™ (Thermo Fisher Scientific) y se diluye hasta una concentración entre 1-5 ng/ul.

Síntesis de molde de ADN con cola

Se preparó una solución fundamental de PCR de 1600 μl de acuerdo con la reacción a continuación:

Solución de plásmido (1-5 ng/μl) (véase la nota 3) 400 μl

Solución de cebadores (cebadores 1<j>M) 400 μl

KAPA HiFi HotStart ReadyMix 2X 800 μl

Se dividieron en alícuotas 50 μl de solución fundamental de PCR en 32 tubos de PCR separados. La PCR se ejecuta usando el termociclador (ajustes enumerados en la figura 2). La duración de la etapa de elongación puede variar dependiendo de la ADN polimerasa usada y la longitud de la ORF (si se usa KAPA HiFi HotStart ReadyMix 2X, por ejemplo, la etapa de elongación del termociclador debe establecerse a una relación de 30 s per kb de longitud de ORF).

Para digerir el ADN plasmídico metilado, se combina el producto en un tubo EPPENDORF™ y se digiere con 30 |μl deDpnl.El producto de PCR se purifica usando el kit de purificación de PCR QIAquick (Qiagen n.° cat.: 28106) y el producto final se eluye en agua sin nucleasa. La concentración del producto con cola se mide usando la máquina NanoDrop y la concentración se ajusta usando agua sin nucleasa hasta 100-200 ng/μl.

Para el análisis de control de calidad, se comprueba el producto de molde de ADN con cola en un gel de agarosa al 1 % junto con el plásmido de ADN original (figura 3a).

Reacción de transcripciónin vitro(IVT) (1 ml de volumen de reacción)

Se prepara una mezcla de NTP personalizada en un tubo EPPENDORF™ de acuerdo con la tabla 2. Los reactivos para la reacción de IVT se mezclan en el siguiente orden en un tubo EPPENDORF™:

a. 400 μl de NTP personalizados de la tabla 2.

b. 400 μl del molde con cola de ADN (200 ng/μl).

c. Se agita con vórtice el tampón de reacción 10x del kit T7 Megascript para disolver cualquier precipitado y se añaden 100 μl .

d. Se añaden 100 μl de enzima T7. Esto dará una reacción de IVT de 1 ml.

e. Se mezcla minuciosamente y se incuba en termomezcladora a 37 °C durante 4-6 horas.

Se añadieron 30 μl de DNasa T7 Turbo y se mezclaron suavemente y después se incubaron a 37 °C en termomezcladora durante 15-20 min para detener la reacción (véase la nota 5).

Se purifica la reacción usando kit de limpieza de transcripción Ambion MEGAclear™ y se eluye cada tubo tres veces con 50 μl de tampón de elución a 95 °C para obtener 150 μl de producto de ARN en cada tubo. Se combina la mezcla de ARN de cada tubo en un tubo EPPENDORF™.

Tratamiento con fosfatasa de ARN

Se añade agua sin nucleasa al ARN para obtener una solución de 1,5 ml. Se añaden 150 μl de tampón de fosfatasa Antarctic (10x) y 150 μl de enzima fosfatasa Antarctic, se mezclan minuciosamente y se incuban en termomezcladora a 37 °C durante 1 hora.

Precipitación de ARN usando acetato de amonio

Los 1800 μl de solución de ARN se transfieren a un tubo cónico de 15 ml. Se añaden 180 μl de acetato de amonio 5 M y se mezclan minuciosamente. Se añaden 5200 μl de etanol al 100 % frío (-20 °C) a la solución y se divide en alícuotas en 3-4 tubos EPPENDORF™ de 2 ml. Se deja que los tubos reposen a -20 °C durante una noche. Los tubos se centrifugan a 10000 rpm durante 30 min a 4 °C. El sobrenadante entonces se descarta cuidadosamente. Cada sedimento se disuelve en 500 μl de etanol al 70 %. Las soluciones en etanol de ARNmod de cada tubo se consolidan en 1 tubo EPPENDORF™. El tubo se centrifuga a 10000 rpm durante 30 min a 4 °C. El sobrenadante se vierte suavemente y se descarta, y usando una toallita Kimwipe, se limpia suavemente el interior del tubo. Se tiene cuidado de no alterar el sedimento. El tubo se invierte y se deja reposar durante no más de 2 min para secar al aire el sedimento. Usando una pipeta, se retira suavemente cualquier gota pequeña de etanol que haya quedado alrededor del sedimento. El sedimento se resuspende usando 45-50 μl de tampón de elución. Se deja el ARNmod en tampón de elución durante 5 min, después se pipetea suavemente hasta que el sedimento se disuelve. Ahora la solución de ARN puede usarsein vivo,se almacena a -20 °C durante hasta 6 meses o -80 °C durante 5 años.

Rendimiento de ARNmod

La concentración se mide usando máquina NanoDrop (figura 3b). La relación de A260/A280 debe ser mayor de 1,8, indicando valores más cercanos a 2,0 mayor pureza. Dependiendo del rendimiento, la concentración debe ser cercana a 20 jg/ul. Para un mejor análisis de control de la calidad, se diluye una muestra de 1 μl de la solución de ARNmod final en 100 μl de agua sin nucleasa. La muestra se analiza usando una máquina Bioanalyzer (figura 3c).

Preparación de ARNmod para inyección miocárdica en ratones

Se combinan 40 μl de RNAiMax con 5 μl de OptiMEM en un tubo EPPENDORF™ y se agita con vórtice. La mezcla se deja asentar durante 10 min a temperatura ambiente. En otro tubo EPPENDORF™, se combinan 150-200 ug de ARNmod con 5 μl de OptiMEM. El tubo se centrifuga para eliminar el líquido en los laterales del tubo. Después de dejar asentar la mezcla de RNAiMAX y OptiMEM durante 10 min a temperatura ambiente, el líquido del tubo con la mezcla de ARNmod se añade al tubo con la mezcla de RNAiMAX. (En algunas realizaciones, es importante añadir la mezcla de ARNmod a la mezcla de RNAiMAX y no a la inversa.) La mezcla combinada se deja reposar durante 15 min a temperatura ambiente. La mezcla se extrae en una jeringa de insulina de calibre 31 y se inyecta en miocardio de ratón. (Ejemplo de resultado mostrado en la figura 4).

Ratones

Todos los procedimientos en animales se realizaron bajo protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidados y Uso del lcahn School of Medicine en Mount Sinai. Se usaron ratones CFW (Swiss Webster) o ratones Rosa26mTmG, macho y hembra. Los ARNmod se sintetizan por transcripciónin vitrocomo se describe anteriormente. Los nucleótidos modificados (Trident) son seudouridina, 5-metil-citidina y análogo de capuchón. Se inyecta un total de 100-200 |jg de ARN modificado en complejo con reactivo de transfección RNAiMax en la región periinfartada del miocardio en una cirugía de pecho abierto después de inducción de Ml. Se realiza MRI con anestesia ligera (valorada para el ritmo cardiaco y nivel de sedación). Se realiza ligamiento LAD y análisis histológico como se describe previamente (46). Se usaron de tres a ocho animales para cada experimento. Para supervivencia a largo plazo, CFW (8-10 semanas de edad) se trataron con ARNmod Luc o Pkm2 específicos de CM (n = 10) después de inducción de Ml, y se dejaron recuperar durante 6 meses en la instalación animal. Se supervisaron las muertes y se documentaron a lo largo del tiempo.

Aislamiento de células de corazón de ratón adulto

Los corazones se escinden y perfunden usando la técnica de Langendorff, las células se procesan adicionalmente usando microesferas magnéticas específicas de CD25 (Dynabeads CD25, Thermo Fisher Scientific) y se aísla el ARN de las células usando un kit RNeasy mini (Qiagen). El ARN se usa además para secuenciación de ARN y análisis de RT-PCR.

Modelo en ratón adulto de infarto de miocardio e insuficiencia cardiaca

El modelo de Ml descrito en la figura 5 se usó para ensayar el efecto terapéutico después de tratamientos con Lin28 específico de CM, Pkm2 en ratones CFW o Rosa26CD25. El diseño experimental incluye 4 grupos de control tratados con a) vehículo solamente, a) 100 jg/corazón de Luc que porta un ARNmod de motivo K, c) l00 jg/corazón de ARNmod L7AE que porta ambos elementos de reconocimiento de miR-1 y miR-208 (L7AE miR1 miR208) y d)<ARNmod específico de>C<m de Luc que contiene una mezcla de Luc que porta un ARNmod de motivo K y L7AE miR1>+ miR208, 100 jg/corazón de cada ARNmod (total de 200 jg/corazón). Los grupos de control servirán para evaluar cualquier efecto inespecífico de reducción de miR-1 y miR-208 en el corazón que no esté directamente relacionado con los ARNmod específicos de CM de inductor del ciclo celular. Los solicitantes compararon los grupos de control con 4 grupos experimentales usando 100 jg/corazón de a) Lin28 y b) Pkm2, que portan un ARNmod de motivo K y mezcla de d) Lin28 y e) Pkm2, que portan un ARNmod de motivo K con L7AE miR1 miR208 (ARNmod específico de CM de inductor del ciclo celular, 100 jg/corazón de cada ARNmod con (200 pg/corazón de ARNmod total). Analizaremos la función cardiaca mejorada después de 28 días después de Ml usando MRI y formación reducida de fibrosis, y densidad capilar aumentada en tasas mayores de supervivencia a largo plazo en comparación con ARNmod de control. También usaremos los ratones Rosa26Tdtomato para el modelo de rastreo de linaje de los CM transfectados en modelo de Ml. Nuestro diseño experimental incluye 1 grupo de control tratado con Luc (50 pg/corazón) y DD-Cre (50 pg/corazón) específicos de CM mezclados junto con 100 pg/corazón de L7AE miR1 miR208. Compararemos los grupos de control con 3 grupos experimentales tratados con ARNmod inductores del ciclo celular específicos de CM. Usaremos una mezcla que contiene DD-Cre (50 pg/corazón) y gen inductor del ciclo celular (Lin28 y Pkm250 pg/corazón) que porta un ARNmod de motivo K mezclado junto con 100 pg/corazón de L7AE miR-1 miR-208 (total de ARNmod 200 pg/corazón). Al corazón de los ratones Rosa26Tdtomato se les practicará inyección intramuscular dirigida con un total de 100 o 200 pg de ARNmod. Usando el modelo de rastreo de linaje de CM ensayaremos el tamaño de los CM 28 días después de la transfección por inyección usando la evaluación de área de sección transversal de los CM con anticuerpo antiaglutinina de germen de trigo (WGA) en análisis de<inmunofluorescencia. Contaremos el número de>C<m transfectados por ventrículo izquierdo y evaluaremos el número>de núcleos por CM en cada uno de los tratamientos. Estos ensayos usando ratones Rosa26Tdtomato nos permitirá evaluar los cambios en la función de los CM después de diferentes tratamientos con ARNmod específicos de CM a lo largo del tiempo.

El modelo de Ml descrito en la figura 5 también se usó para ensayar los cambios de expresión génica en CM transfectados y células no transfectadas del ventrículo izquierdo. Nuestro diseño experimental incluye 3 grupos de control tratados con diferentes Luc específico de CM (50 jg/corazón) y CD25 humanos (solamente dominio extracelular) inactivo (ihCD25, véase la figura 1 y 8, 50 jg/corazón) mezclados junto con 100 jg/corazón de L7AE miR1 miR208 (total de ARNmod 200 jg/corazón). Los grupos de control se comparan con 3 grupos experimentales tratados con ARNmod inductores del ciclo celular específicos de CM. Los solicitantes usaron una mezcla que contenía ihCD25 (50 jg/corazón) y gen inductor del ciclo celular (Lin28 y Pkm2, 50 jg/corazón) que porta un ARNmod de motivo K mezclado junto con 100 pg/corazón de L7AE miR- 1 miR-208 (total de ARNmod 200 jg/corazón). Tres días después del tratamiento con 200 jg de diferentes controles de Luc específicos de CM o inductor del ciclo celular, Lin28 o Pkm2 en ratones CFW (n = 10), los ratones se sacrificarán y los corazones se disociarán con colagenasa. Los CM transfectados se aislarán de la suspensión de células cardiacas usando nuestra estrategia de clasificación de ARNmod específico de CM. Esta estrategia de clasificación se basa en el uso de ARNmod ihCD25 específico de CM y microesferas magnéticas anti-hCD25 disponibles en el mercado (Thermo Fisher). El aislamiento de microesferas magnéticas se ha usado para una diversidad de aplicaciones, incluyendo clasificación celular, durante más de 30 años. Las microesferas magnéticas que se han usado para clasificación celular se preacoplan con anticuerpo que puede reconocer un gen de superficie celular. Como los CM transfectados habitualmente no portan genes de superficie celular específicos, usamos el hCD25 truncado para marcar los CM transfectados y permitir que las microesferas magnéticas anti-hCD25 reconozcan y se fijen exclusivamente a CM transfectados. Usando un imán y elusión de microesferas residuales y células no transfectadas se producirá una población celular pura de CM transfectados aislados. Inmediatamente después del aislamiento, se extrae el ARN de los CM transfectados clasificados y de la fracción eluida de células (células no transfectadas) y se envía para secuenciación de ARN usando el sistema Hlseq2500 en la Mount Sinai Genomics Core Facility. Algo de ARN se usa para la validación de las mediciones de secuenciación de ARN usando reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con retrotranscripción (qRT-PCR). La selección de dianas posteriores se basa en: a) genes expresados de forma diferencial en Luc de control frente a ARNmod específicamente en CM; b) candidatos solapantes entre los diferentes tratamientos con ARNmod inductores del ciclo celular; c) genes expresados de forma diferencial en CM que pueden influir en la expresión génica observada en células no transfectadas. Por ejemplo, la regulación por aumento de un receptor relevante en la población no transfectada indica la secreción de su ligando desde CM. d) Extracción de datos de la bibliografía. Se seleccionan 3-5 dianas para la validación usando la estrategia anterior. Para ensayar la hipótesis, inyectamos motivo k de nGFP específico de CM, CD25 humano (solamente dominio extracelular) inactivo (ihCD25) mezclado junto con L7AE miR1-miR208 después de Ml y clasificamos satisfactoriamente los CM que expresan nGFP e ihCD25 después de 24 h después de la inyección. Figura 19.

Imágenes p o r resonancia magnética (MRI) y ecocardiografía (Eco).

Ratones CFW (8 semanas de edad) tratados con ARNmod de motivo k de Luc, motivo k de Luc miR1-208, miR1-208, motivo k de Pkm2 y motivo k de Pkm2 miR1-208 se sometieron a evaluación de MRI en el día 28 después de ligamiento LAD.11 Obtuvimos imágenes CINE de potenciación retardada en un 7-T Bruker Pharmascan con sincronización cardiaca y respiratoria (SA Instruments, Inc, Stony Brook, Nueva York). Los ratones se anestesiaron con mescla de isoflurano/aire al 1-2 %. Se colocaron sondas de ECG, respiratoria y de temperatura en el ratón, que se mantuvo caliente durante las exploraciones. La toma de imágenes se realizó de 10 a 20 min después de inyección IV de 0,3 mmol/kg de gadolinio-ácido dietilentriaminapentaacético. Se adquirió una pila de ocho a diez cortes del eje corto del corazón que abarcan del ápice hasta la base con una secuencia FLASH activada por ECG y sincronizada a la respiración con los siguientes parámetros: tiempo de eco (TE) 2,7 ms con resolución de 200 pm x 200 pm; grosor del corte de 1 mm; 16 fotogramas por intervalo R-R; 4 excitaciones con ángulo de volteo a 60°. La fracción de expulsión se calculó como la diferencia en los volúmenes diastólico final y sistólico final, dividida por el volumen diastólico final. La adquisición de MRI y los análisis se realizaron desconociendo los grupos de tratamiento. Para la evaluación eco de la función sistólica ventricular izquierda se usó un GE Cares en el lugar (V7R5049) equipado con una sonda de ultrasonidos de ratón de 40 MHz. Se calculó el acortamiento fraccionario en función de las dimensiones diastólica final y sistólica final obtenidas de ultrasonidos en modo M. Los ecocardiogramas se realizaron en grupos de 6-8 corazones/tratamiento.

Aislam iento de ARN y perfilado de expresión génica usando PCR instantánea

Se aisló el ARN total usando el kit RNeasy mini (Qiagen) y se retrotranscribió usando retrotranscriptasa Superscript III (Invitrogen), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se realizaron análisis de qPCR instantánea en un Mastercycler realplex 4 Sequence Detector (Eppendorf) usando SYBR Green (kit de PCR Quantitect™ SYBR Green, Qiagen). Los datos se normalizaron a la expresión de18s,cuando fuera apropiado (controles endógenos). Los factores de cambio en la expresión génica se determinaron por el método de ddCT y se presentaron con respecto a un control interno. Las secuencias de cebadores de PCR se muestran en la tabla complementaria 3.

a a

Rastreo de linaje en ratones R26mTmG

Se obtuvieron ratones Rosa26mTmG del Jackson Laboratory. Todos los experimentos se realizaron en ratones coincidentes de edad y sexo con una relación igual de ratones macho y hembra. Se eligieron ratones sanos aleatoriamente de la colonia de expansión para cada experimento. En esta línea de ratones, se expresa tdTomato dirigido a membrana bajo el control del promotor ubicuo en el locus Rosa26, mientras que la eGFP dirigida a membrana se vuelve activa después de escisión mediada por Cre de tdTomato flanqueado por flox. El ARNmod Cre específico de CM (motivo K de Cre miR1-miR208) se usó para expresar exclusivamente Cre en CM transfectados. Esto permitió el rastreo del linaje de los CM transfectados y su descendencia mucho después de que disminuyera la expresión de ARNmod (>10 días). Los ratones Rosa26mTmG se genotiparon por PCR con ADN con cola como se describe en los protocolos del genotipado del Jackson Laboratory. Las secuencias cebadoras son como sigue: Rosa26mT/mG, directo de tipo silvestre, 5'-CTCTGCTGCCTCCTGGCTTCT-3', inverso de tipo silvestre, 5'-CGAGGCGGATCACAAGCAATA-3' e inverso mutante, 5'-TCAATGGGCGGGGGTCGTT-3'. En este modelo, medimos el nivel de transfección de ARNmod Cre específico de CM, el tamaño y número de los CM, y el número de núcleos en CM después de transfección con ARNmod Luc o Pkm2 específicos de Cm .

Aislamiento de CM neonatales de rata y adultos de ratón

Se aislaron CM de corazón de rata neonatal de 3-4 días de edad como se describe previamente. Se aislaron los CM ventriculares de ratas neonatales de ratas Sprague Dawley (Jackson) de 4 días de edad. Se usaron múltiples rondas de digestión con 0,14 mg/ml de colagenasa II (Invitrogen). Después de cada digestión, el sobrenadante se recogió en suero de caballo (Invitrogen). La suspensión celular total se centrifugó a 1500 rpm durante 5 min. Los sobrenadantes se descartaron y las células se resuspendieron en medio DMEM (GIBCO) con ácido ascórbico 0,1 mM (Sigma), un 0,5% de insulina-transferrina-selenio (l00x), penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (100 pg/ml). Las células se sembraron en placas de cultivo de plástico durante 90 min hasta que la mayoría de las células que no eran miocitos se fijaron a la placa y los miocitos permanecieron en suspensión. Los miocitos entonces se sembraron a 1 x 105 células/pocillo en una placa de 24 pocillos. Los CM de rata neonatal se incubaron durante 48 horas en medio DMEM que contenía un 5 % de suero de caballo más Ara c. Después de la incubación, las células se transfectaron con diferentes dosis de diferentes ARNmod como se describe en el texto. Se aislaron CM adultos de ratones CFW después de 28 días después de Ml e inyección de ARNmod usando el método de Langendorff como se describe previamente.2 Para el recuento de CM, promediamos 3 recuentos diferentes/muestra y 3 corazones/grupo usando un hemocitómetro. El número total de CM contado fue aproximadamente 150-200 CM/alícuota (muestras alícuotas de 10 ul usando una pipeta de orificio ancho del volumen total de CM obtenidos después de digestión). Los CM cultivados se tiñeron con anticuerpo (abcam) contra a-actinina (CM, rojo) y Hoechst 33342 para los recuentos de núcleos. Para el recuento de núcleos, se contaron aproximadamente 1 x 103 C<m>por muestra, usando 3-4 muestras independientes por grupo, el recuento de núcleos se representó como el porcentaje de CM contados. Para el aislamiento de CM adultos transfectados y el aislamiento de ARN, por favor, véase la figura complementaria 8.

Modelo de Ml de ratón e histología

Todos los procedimientos quirúrgicos y experimentales con ratones se realizaron de acuerdo con protocolos aprobados por los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales en el Icahn School of Medicine en Mount Sinai, Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) y el centro MSSM para Medicina Comparativa y Cirugía (CCMS). Se anestesiaron ratones CFW, R26mTmG (6-8 semanas de edad) con isoflurano. Se indujo Ml mediante ligamiento permanente del LAD, como se describe previamente3. En resumen, se afeitó la región torácica izquierda y se esterilizó. Después de intubación, el corazón se expuso a través de una toracotomía izquierda. Se puso una sutura para ligar el LAD. La toracotomía y la piel se suturaron cerradas en capas. Se retiró el exceso de aire de la cavidad torácica, y el ratón se quitó de la ventilación cuando se estableció respiración normal. Para determinar el efecto del ARNmod sobre el desenlace cardiovascular después de Ml, se inyectaron ARNmod (100-150 pg/corazón) en la zona infartada inmediatamente después de ligamiento LAD. La zona periinfartada cerca del ápice se congeló inmediatamente para el aislamiento de ARN y posteriores estudios de qPCR instantánea, o se fijaron en un 4 % de PFA para crioseccionamiento e inmunotinción. En todos los experimentos, el cirujano era desconocedor del grupo de tratamiento. Para la evaluación de la histología cardiaca, se recogieron los corazones al final de cada estudio. Los corazones se escindieron, se lavaron brevemente en PBS, se perfundieron con tampón de perfusión, se pesaron y se fijaron en un 4 % de PFA a 4 °C durante una noche. En el siguiente día, los corazones se lavaron con PBS y se incubaron durante una noche en un 30 % de sacarosa. Después, los corazones se pusieron OCT, se congelaron y se almacenaron a -80 °C. Los tacos de corazón se seccionaron transversalmente a 8-9 pm usando un criostato. Los cortes se procesaron adicionalmente para evaluación usando inmunotinción (véase a continuación) o tinción histológica de fibrosis usando kit de tinción tricrómica de Masson (Sigma) y se realizaron de acuerdo con procedimientos convencionales. La medición de la relación del peso del corazón al peso corporal se hizo usando una báscula. La relación se midió al final de cada experimento. Esta relación se calculó como el peso de tejido cardiaco con respecto al peso corporal total del ratón en gramos (g).

Inmunotinción de secciones de corazón después de tratamiento con ARNmod

Los corazones de ratón se recogieron y perfundieron usando tampón de perfusión y un 4 % de paraformaldehído (PFA). Los corazones se fijaron en un 4 % de PFA/PBS durante una noche en un agitador y después se calentaron con PBS durante 1 h y se incubaron en un 30 % de sacarosa/PBS a 4 °C durante una noche. El siguiente día, los corazones se fijaron en OCT y se congelaron a -80 °C. Se hicieron secciones transversales del corazón (8-10 pM) mediante un criostato. Las secciones congeladas se rehidrataron en PBS durante 5 min seguido, de permeabilización con PBS con un 0,1 % de Triton X100 (PBST) durante 7 min. Los cortes entonces se trataron con un 3 % de H<2>O<2>durante 5 min. Después de 3 lavados con PBST durante 5 minutos cada uno, las muestras se bloquearon con PBS un 5% de suero normal de burro un 0,1 % de Triton X100 (PBSST) durante 2 horas a temperatura ambiente y se añadieron anticuerpos primarios diluidos en PBSST. Los cortes entonces se incubaron durante una noche a 4 °C. Los cortes se lavaron con PBST (5 veces durante 4 minutos cada uno) seguido de incubación con un anticuerpo secundario (Invitrogen, 1:200) diluido en PBST durante 2 horas a temperatura ambiente. Las muestras se lavaron adicionalmente con PBST (3 veces durante 5 min cada una) y se tiñeron con Hoechst 33342 (1 pg/ml) diluido en PBST durante 7 min. Después de 5 lavados con PBST durante 4 minutos cada uno, y una vez con agua corriente (durante 4 minutos), los cortes se montaron con medio de montaje (VECTASHIELD) para la toma de imágenes. Los cortes teñidos se almacenaron a 4 °C. Todas las tinciones se realizaron sobre 3-8 corazones/grupo, con 2-3 secciones/corazón. En el caso de inmunotinción con aglutinina de germen de trigo (WGA) para la cuantificación del tamaño de los CM, se capturaron imágenes de aumento 20X y se usó ImageJ para determinar el área de cada célula. Los análisis cuantitativos implicaron contar múltiples campos de 3-6 corazones independientes por grupo, y 3 secciones/corazón (~50 células por campo evaluado, hasta un total de ~250 células por muestra). Para inmunotinción de BrdU, se añadió BrdU (1 mg/ml, Sigma) al agua de beber de los ratones adultos (2-3-meses de edad) durante 7 10 días antes de recoger los corazones. Los análisis cuantitativos implicaron contar los CM BrdU positivos en múltiples campos de tres muestras independientes por grupo, y 3 secciones/corazón. El número total de CM contados fue ~1-2 x 103 CM per sección. La inmunotinción de TUNEL se realizó de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (kit de detección de muerte celularin situ,Fluoresceína, n.° cat. 11684795910, Roche). Para inmunotinción de CM neonatales después de tratamiento con ARNmod, se fijaron los CM neonatales transfectados con ARNmod en cubreobjetos con un 3,7 % de PFA durante 15 min a temperatura ambiente. Después de la permeabilización con un 0,5 % de Triton X en PBS durante 10 min a temperatura ambiente, las células se bloquearon con un 5 % de suero normal de cabra/burro 0,5 % de Tween 20 durante 30 minutos. Los cubreobjetos se incubaron con anticuerpos primarios (véase la tabla complementaria 1) en cámara húmeda durante 1 hora a temperatura ambiente seguido de incubación con los anticuerpos secundarios correspondientes conjugados con Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 647 y Alexa Fluor 555, y tinción con Hoechst 33342 para la visualización de los núcleos (todo de Invitrogene). Las imágenes fluorescentes se tomaron en microscopio fluorescente Zeiss a aumento 10X, 20X y 40X.

Imágenes de células vivas de cardiomiocitos neonatales de rata aislados

Las imágenes en intervalos de tiempo de cardiomiocitos neonatales de rata aislados después de transfección con ARNmod de nGFP específico de CM o cotransfectados con ARNmod nGFP y Pkm2 específicos de CM se adquirieron con una lente de objetivo 10X cada 10 s con un microscopio de disco giratorio confocal (Zeiss) después de 24 horas de adquisición en intervalos de tiempo.

Análisis estadístico

La significación estadística se determinó por ensayo de latpara datos emparejados para los resultados de MRI, ensayo del orden logarítmico (Mantel-Cox) para las curvas de supervivencia o ensayo de latde Student o ANOVA unidireccional, ensayoa posterioride Bonferroni para otros experimentos como se detalla en las leyendas de figura respectivas, con *p <0,05 o menor significación considerada. Todos los gráficos representan valores promedio, y los valores se presentaron como la media ± error típico de la media. El ensayo de latde Student bilateral se basó en distribuciones normales supuestas. Para la cuantificación del número CM con estructuras luminales CD31, WGA, CD45, CD3, TUNEL, BrdU+, k¡67+, pH3+ o Aurora B+, los resultados se adquirieron de al menos 3 secciones de corazón.

Tabla 2

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Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Un sistema regulador de la expresión para expresión específica de célula de un gen de interés (GOI) que comprende:

un primer ácido nucleico que codifica un elemento de reconocimiento de microARN (miR) cerca de su 3'UTR que se une específicamente a un miR específico de célula diana, y codifica una proteína supresora de la traducción; y

un segundo ácido nucleico que comprende un motivo de interacción con proteína supresora que se une a la proteína supresora de la traducción, y un gen que codifica una proteína de interés,

en donde la célula diana es un cardiomiocito y el miR de célula diana se selecciona del grupo que consiste en miR1, miR208 y miR1 más miR208, en donde dicho primer y segundo ácido nucleico son ARN modificados (ARNmod), en donde el ARNmod comprende una modificación y la modificación se selecciona de uno o más de una sustitución de uridina con seudouridina, una sustitución de citidina con 5-metilcitidina y un capuchón de 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G sustituido en un extremo 5'.

2. El sistema de la reivindicación 1, en donde la proteína supresora de la traducción es L7Ae y el motivo de interacción con proteína supresora es un motivo k.

3. El sistema de la reivindicación 1, en donde la proteína de interés comprende una proteína indicadora o marcador de selección; opcionalmente en donde la proteína indicadora o marcador de selección es una proteína fluorescente o marcador de resistencia a antibiótico; y/o en donde la proteína indicadora o marcador de selección se selecciona del grupo que consiste en proteína fluorescente verde (GFP), GFP nuclear (nGFP), CD25 humano inactivo (ihCD25) y CD25 de ratón inactivo (imCD25).

4. El sistema de la reivindicación 1, en donde la proteína de interés es una proteína inductora del ciclo celular; opcionalmente, en donde la proteína inductora del ciclo celular se selecciona del grupo que consiste en Lin28, Pkm2 y ciclina D2.

5. El sistema de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho primer ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4; y/o en donde dicho segundo ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8.

6. Una composición que comprende el primer y segundo ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. Un métodoin vitrooex vivopara expresar una proteína en cardiomiocitos (CM), comprendiendo el método poner en contacto dichos CM con un primer ARNmod que codifica la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2, s Eq ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4, y un segundo ARNmod que codifica la proteína y que comprende un motivo K, en donde el primer y segundo ARNmod comprenden cada uno independientemente una modificación y la modificación se selecciona de uno o más de una sustitución de uridina con seudouridina, una sustitución de citidina con 5-metilcitidina y un capuchón de 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G sustituido en un extremo 5'.

8. Un vector que comprende el primer y segundo ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

9. Un kit regulador de la expresión que comprende un vector que comprende el primer y segundo ácido nucleico de la reivindicación 1.

10. Un método para inducir/reactivar la proliferación de cardiomiocitos neonatales o adultosin vitrodespués de infarto de miocardio (Ml), comprendiendo el método poner en contacto una parte de dichos cardiomiocitos con un primer ARNmod que codifica un elemento de reconocimiento para un miR específico de cardiomiocitos y una proteína supresora de la traducción y un segundo ARNmod que codifica un motivo k para unirse a la proteína supresora de la traducción y un gen inductor del ciclo celular, en donde el miR específico de cardiomiocitos se selecciona de miR1, miR208 y miR1 más miR208, y el primer ARNmod y el segundo ARNmod comprenden una modificación y la modificación se selecciona de uno o más de una sustitución de uridina con seudouridina, una sustitución de citidina con 5-metilcitidina y un capuchón de 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G sustituido en un extremo 5', en donde el gen inductor del ciclo celular se selecciona del grupo que consiste en Lin28 y Pkm2 y ciclina D2.

11. Un métodoin vitrooex vivopara expresar un gen de interés en un cardiomiocito humano o de primate, pero no en ninguna otra célula, comprendiendo el método: introducir en dicho cardiomiocito un primer ARNmod sintetizadoin vitroque codifica un sitio de unión a supresor de la traducción y el gen de interés, y un segundo ARNmod sintetizadoin vitroque codifica una proteína supresora de la traducción y un anti-microARN (miR), en donde la expresión de dicho gen de interés está bajo el control regulador del segundo ARNmod sintetizadoin vitro,que codifica un sitio de reconocimiento/unión a proteína supresora y un anti-miR (miR) específico para cardiomiocitos humanos o de primate; en donde dicho anti-miR es anti-miR1, anti-miR208, o una combinación de anti-miR1 y anti-miR208, y el primer ARNmod sintetizadoin vitroy el segundo ARNmod sintetizadoin vitrocomprenden una modificación y la modificación se selecciona de uno o más de una sustitución de uridina con seudouridina, una sustitución de citidina con 5-metilcitidina y un capuchón de 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G sustituido en un extremo 5'.

12. El sistema regulador de la expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para su uso en el tratamiento de Ml o HF.