KR101673071B1 - 치료 유전자의 선택적 발현을 위한 dna 구조체 - Google Patents

치료 유전자의 선택적 발현을 위한 dna 구조체 Download PDF

Info

Publication number
KR101673071B1
KR101673071B1 KR1020150024366A KR20150024366A KR101673071B1 KR 101673071 B1 KR101673071 B1 KR 101673071B1 KR 1020150024366 A KR1020150024366 A KR 1020150024366A KR 20150024366 A KR20150024366 A KR 20150024366A KR 101673071 B1 KR101673071 B1 KR 101673071B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
gene
mirna
dna construct
cells
mir
Prior art date
Application number
KR1020150024366A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20160101806A (ko
Inventor
이성욱
김성진
Original Assignee
단국대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 단국대학교 산학협력단 filed Critical 단국대학교 산학협력단
Priority to KR1020150024366A priority Critical patent/KR101673071B1/ko
Publication of KR20160101806A publication Critical patent/KR20160101806A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101673071B1 publication Critical patent/KR101673071B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor

Abstract

본 발명은 i) 치료 유전자 및 ii) miRNA의 패신저 스트랜드(passenger strand)의 타겟 서열을 포함하는 DNA 구조체로서, 상기 miRNA는 정상 세포에 존재하며, 질환세포에서는 존재하지 않거나 발현이 감소되며, 상기 miRNA의 패신저 스트랜드의 타겟 서열은 정상 세포에서의 치료 유전자의 발현을 억제하는 것인 DNA 구조체 및 상기 DNA 구조체를 유효성분으로 포함하는 약학 제제에 관한 것이다.
본 발명을 이용하면, 정상 세포에서는 발현하나, 비정상 세포 또는 질환 세포에서 존재하지 않거나 발현이 감소되는 특정 miRNA의 패신저 스트랜드의 타겟 서열을 치료 유전자의 3' 비번역 영역(UTR)의 대응 부위에 포함시킴으로써 비정상 세포에서만 치료 유전자가 발현되도록 하여, 비정상 세포에서만 치료 유전자가 기능을 하게 할 수 있다. 이에 따라, 질환이 있는 조직에서만 치료 유전자를 발현시킴으로써 질병을 치료할 수 있는 장점이 있다.
또한, 본 발명은 i) 리포터 유전자 및 ii) miRNA의 패신저 스트랜드(passenger strand)의 타겟 서열을 포함하는 DNA 구조체로서, 상기 miRNA는 정상 세포에 존재하며, 질환세포에서는 존재하지 않거나 발현이 감소되며, 상기 miRNA의 패신저 스트랜드의 타겟 서열은 정상 세포에서의 리포터 유전자의 발현을 억제하는 DNA 구조체를 유효성분으로 포함하는 질환 진단용 조성물 및 상기 리포터 유전자를 포함하는 DNA 구조체를 생물학적 시료에 도입하는 단계; 및 상기 시료에서 리포터 단백질을 검출하는 단계를 포함하는 질환의 진단을 위한 정보제공방법에 관한 것이다.
이에 의하면, 상기 DNA 구조체 내에 리포터 유전자를 포함함으로써, 정상 세포에서는 리포터 유전자의 활성이 없으나, 비정상 세포 또는 질환 세포에서만 리포터 유전자가 활성화되는 것을 검출함으로써, 손 쉽게 질환 여부를 진단할 수 있다.

Description

치료 유전자의 선택적 발현을 위한 DNA 구조체{DNA structure for selective expression of the therapeutic gene}
본 발명은 i) 치료 유전자 및 ii) miRNA의 패신저 스트랜드(passenger strand)의 타겟 서열을 포함하는 DNA 구조체로서, 상기 miRNA는 정상 세포에 존재하며, 질환세포에서는 존재하지 않거나 발현이 감소되며, 상기 miRNA의 패신저 스트랜드의 타겟 서열은 정상 세포에서의 치료 유전자의 발현을 억제하는 것인 DNA 구조체, i) 리포터 유전자 및 ii) miRNA의 패신저 스트랜드(passenger strand)의 타겟 서열을 포함하는 DNA 구조체로서, 상기 miRNA는 정상 세포에 존재하며, 질환세포에서는 존재하지 않거나 발현이 감소되며, 상기 miRNA의 패신저 스트랜드의 타겟 서열은 정상 세포에서의 리포터 유전자의 발현을 억제하는 DNA 구조체를 유효성분으로 포함하는 암 진단용 조성물 및 상기 리포터 유전자를 포함하는 DNA 구조체를 생물학적 시료에 도입하는 단계; 및 상기 시료에서 리포터 단백질을 검출하는 단계를 포함하는 암의 진단을 위한 정보제공방법에 관한 것이다.
마이크로 RNA(miRNA)는 약 20 내지 25개의 뉴클레오티드(nt)로 구성되는 비-코딩 RNA로, 타겟 mRNA의 3'UTR에 결합하여 불완전 또는 완전 상보적 결합에 의해 타겟 mRNA의 유전자 발현을 조절하는 것으로 알려져 있다. 마이크로 RNA(miRNA)는 유전자 활성의 전사 후 억제제로서 발달 과정, 생리적 반응, 및 병리적 상태를 조절하는데 중요한 역할을 한다. 성숙한 miRNA는 RNase III 효소와 이중 가닥 RNA-결합 도메인 단백질인 Drosha/DGCR8와 Dicer/TRBP4-6를 포함하는 두 가지 독특한 복합체를 통해 두 개의 분열단계에 의해 pri-miRNA로부터 형성된다. 성숙한 miRNA 가이드(guide)-miRNA 패신저(passenger)(*) 듀플렉스(이중가닥)의 가이드 스트랜드는 RNA-induced silence complex (RISC)에 선택적으로 로딩됨으로써 유전자 발현을 조절하는 반면, 패신저 스트랜드는 분해된다. 스트랜드 선택은 miRNA 듀플렉스 말단의 상대적 자유 에너지에 의해 미리 결정되고, 5' 염기쌍에서 덜 안정한 스트랜드는 RISC에 선택적으로 통합된다. 가이드 스트랜드가 RISC에 로딩됨에도 불구하고 패신저 스트랜드는 세포에 축적되고 Argonaute (Ago) 단백질과 관련이 있다. 게다가 miRNA 가이드와 패신저 스트랜드는 인공적인 miRNA 타겟을 세포내로 도입할 때, 타겟의 존재에 의해 보호받는다. 상기 miRNA 패신저 스트랜드는 RISC에 로딩될 수 있고, 전사 후 조절을 매개할 수 도 있다.
miRNA 발현의 변화는 바이러스 감염과, 심혈관 질환, 염증, 그리고 암 같은 다양한 질병과 연관되어 있다. 게다가 miRNA는 치료를 위한 설득력 있는 타겟이다. 그러므로 특정 질병에 있어서 miRNA 발현의 조절 그리고 miRNA와 함께 치료용 트랜스유전자(transgene) 발현 조절 시스템 개발에 대해 많은 연구가 있었다. 외래의 타겟 유전자의 3' UTR에 miRNA 타겟 사이트의 삽입은 대응하는 miRNA의 RNA 간섭에 의한 활동에 의해 세포와 기관에서 트랜스유전자의 발현을 줄일 수 있다. 이러한 시스템을 사용하여, miRNA 타겟 사이트를 가지는 치료용 트랜스유전자의 발현은 세포 또는 조직-특이적인 miRNA에 의해 조절될 수 있으며, 원하는 조직에서만 트랜스유전자의 발현을 가능하게 하고, 상기 트랜스유전자가 동족의 miRNA를 가지는 정상조직에서 발현되지 않게 한다. 그러나, 외래의 트랜스유전자를 조절하는데 miRNA 활성을 가진 내재적 가이드 스트랜드의 타겟팅은 miRNA sponge(miRNA 타겟 사이트에 의해 구동되는 외래의 트랜스유전자가 내재적 miRNA의 타겟 유전자와 경쟁) 같은 세포 대사에 미칠수 있는 잠재적인 부정적 효과에 의해 제한된다. 게다가 miRNA 타겟 사이트를 가진 타겟 유전자가 많을수록 miRNA 활성은 희석될 수 있다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 가이드 스트랜드의 캐리어로 알려진 패신저 스트랜드를 이용하였으며, 구체적으로, miR-122의 패신저 스트랜드인 miR-122-3p의 타겟 사이트를 가지는 트랜스유전자를 코딩하는 벡터를 제조하였으며, miRNA 패신저 스트랜드를 이용하여 타겟팅함으로써 치료용 트랜스유전자의 발현을 안정적이고 효과적으로 조절할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 i) 치료 유전자 및 ii) miRNA의 패신저 스트랜드(passenger strand)의 타겟 서열을 포함하는 DNA 구조체로서, 상기 miRNA는 정상 세포에 존재하며, 질환세포에서는 존재하지 않거나 발현이 감소되며, 상기 miRNA의 패신저 스트랜드의 타겟 서열은 정상 세포에서의 치료 유전자의 발현을 억제하는 것인 DNA 구조체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 DNA 구조체를 유효성분으로 포함하는 약학 제제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 i) 리포터 유전자 및 ii) miRNA의 패신저 스트랜드(passenger strand)의 타겟 서열을 포함하는 DNA 구조체로서, 상기 miRNA는 정상 세포에 존재하며, 질환세포에서는 존재하지 않거나 발현이 감소되며, 상기 miRNA의 패신저 스트랜드의 타겟 서열은 정상 세포에서의 리포터 유전자의 발현을 억제하는 DNA 구조체를 유효성분으로 포함하는 질환 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 리포터 유전자를 포함하는 DNA 구조체를 생물학적 시료에 도입하는 단계; 및 상기 시료에서 리포터 단백질을 검출하는 단계를 포함하는 질환의 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 보다 안전하면서도 효과적으로 내재적 유전자의 발현에는 영향을 주지 않고, 외래의 치료 유전자의 발현을 안정적으로 조절할 수 있는 시스템을 개발하고자 하였다. 그 결과, 가이드 스트랜드를 타겟팅하는 경우 세포 내에 존재하는 가이드 스트랜드가 치료 유전자를 포함하는 DNA 구조체에 존재하는 miRNA의 타겟 서열에 결합함으로써, 세포 내에 존재하는 miRNA의 내재적 타겟 유전자의 발현이 오히려 증가되었다. 그러나, 패신저 스트랜드를 타겟팅하는 경우 내재적 유전자의 발현에 영향이 없이 외부에서 도입된 치료 유전자의 발현만을 안정적이고 효과적으로 조절함을 확인하였다(도 7b).
따라서, 본 발명자들은 miRNA의 패신저 스트랜드를 타겟팅하여 외래 치료 유전자의 발현을 조절할 수 있음을 확인하였고, 이러한 패신저 스트랜드의 효과는 종래에 보고된 바 없으며, 본 발명자에 의하여 최초로 규명되었다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 i) 치료 유전자 및 ii) miRNA의 패신저 스트랜드(passenger strand)의 타겟 서열을 포함하는 DNA 구조체로서, 상기 miRNA는 정상 세포에 존재하며, 질환세포에서는 존재하지 않거나 발현이 감소되며, 상기 miRNA의 패신저 스트랜드의 타겟 서열은 정상 세포에서의 치료 유전자의 발현을 억제하는 것인 DNA 구조체를 제공한다.
본 발명에서, "DNA 구조체"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 RNA를 발현할 수 있는 구조체로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 상기 DNA 구조체 는 바람직하게는 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절요소를 포함하는 발현벡터일 수 있으며, 보다 바람직하게는 바이러스 벡터일 수 있다. 더욱 바람직하게는 유전자 전달의 높은 효율, 미분화세포로 유전자를 전달하는 능력 및 높은 역가의 바이러스 저장물 제조의 용이성을 가지는 아데노바이러스 벡터일 수 있다. 아데노바이러스 벡터는 복제에 필수적인 일련의 유전자들을 삭제시키고, 프로모터 활성의 수준이 높은 사이토메갈로바이러스(CMV) 또는 로우스 사르코마 바이러스(RSV) 프로모터를 넣어 치료 목적 단백질의 생체 내에서의 높은 발현을 유도할 수 있다.
본 발명에서 상기 구조체는 치료 유전자 발현을 위한 프로모터를 포함할 수 있다. 본 발명에서 상기 "프로모터"는 적당한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 다른 핵산 서열의 발현을 조절하는 핵산 서열을 의미하며, 본 발명에서 "작동가능하게 연결(operably linked)"은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. DNA 구조체내에서 프로모터의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.
본 발명에서 상기 프로모터는 사이토메갈로바이러스(CMV) 또는 로우스 사르코마 바이러스(RSV) 프로모터 등이 바람직하며, 보다 바람직하게는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터이다.
본 발명에서 miRNA는 19-25 nt 길이의 단일 가닥 RNA 분자로서 내재적 (endogenous) 헤어핀-구조 전사체 (hairpin-shaped transcript) (Bartel, D.P., Cell, 116:281-297, 2004; Kim, V.N., Mol. Cells. 19:1-15, 2005)에 의해 생성되고, 타겟 서열을 포함하는 mRNA의 3' 비번역 영역(UTR)에 상보적으로 결합하여 전사 후 유전자 억제자 (post-transcriptional gene suppressor)로서 작용하며, 번역 억제와 mRNA 불안정화를 유도함으로써 표적 유전자를 억제한다. miRNA는 발달, 분화, 증식, 세포사멸 및 물질대사와 같은 다양한 과정에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
상기 miRNA는 pri-miRNA로부터 형성되는데, miRNA는 가이드 스트랜드(guide strand)와 패신저 스트랜드(passenger strand) 이중가닥으로 구성되어 있으며, 가이드 스트랜드가 유전자의 발현을 조절하고 패신저 스트랜드는 분해되는 것으로 알려져 있다. 그러나, 본 발명에서는 패신저 스트랜드 역시 가이드 스트랜드와 마찬가지로 유전자의 발현을 조절함을 확인하였다.
본 발명의 구체적 일실시예에서 miRNA 122에 대한 가이드 스트랜드의 타겟서열(miR-122-5p) 또는 패신저 스트랜드(miR-122-3p)의 타겟 서열을 포함하는 리포터 유전자의 컨스트럭트를 제조하여, miR-122를 발현하는 Huh7 세포에 도입한 후 리포터 컨스트럭트의 Renilla luciferase의 활성을 확인한 결과, 리포터 유전자의 활성이 내재적 miR-122-5p 뿐만 아니라 miR-122-3p에 의해서도 하향조절됨을 확인하여, 패신저 스트랜드 역시 유전자의 발현을 하향 조절할 수 있음을 확인하였다(도 3a).
본 발명에서 "miRNA는 정상 세포에 존재하며, 질환세포에서는 존재하지 않거나 발현이 감소되며 "란 miRNA가 정상 세포에서는 존재하나 질환이 있는 세포(비정상 세포)에서는 존재하지 않거나 정상 세포에 비해 miRNA의 발현이 감소되는 것을 의미한다. 이에 따라, 정상 세포에서 존재하는 miRNA의 패신저 스트랜드를 이용하여 타겟팅함으로써, 정상 세포에서의 치료 유전자의 발현을 억제하고, 비정상 세포에서만 치료 유전자를 발현시켜 원하는 기능을 수행하게 할 수 있다.
본 발명의 DNA 구조체의 경우, 정상 세포에서는 miRNA가 존재하므로, 정상 세포 내 miRNA의 패신저 스트랜드가 DNA 구조체 내의 miRNA의 패신저 스트랜드의 타겟 서열에 결합하므로, 치료 유전자의 발현이 억제되고 불활성화된다. 그러나, 질환이 있는 세포(비정상 세포)에서는 miRNA가 존재하지 않거나 발현이 감소되므로, DNA 구조체 내에 존재하는 miRNA의 패신저 스트랜드의 타겟 서열에 결합하지 않거나 일부만 결합하게 되므로, 치료 유전자의 발현 및 기능이 활성화되게 된다.
보다 구체적으로는, 본 발명의 DNA 구조체는 정상 세포에서 존재하거나 발현되는 특정 miRNA의 패신저 스트랜드의 타겟 서열을 치료 유전자의 3' 비번역 영역(UTR)의 대응 부위에 삽입하여 포함시킴으로써 정상세포에서의 치료 유전자의 발현이 억제되도록 하였다. 본 발명에서, "3' 비번역 영역(UTR)의 대응 부위"란 mRNA상의 3' 비번역 영역(UTR)과 대응되는 부분을 의미한다.
또한, 본 발명은 치료 유전자의 3' 비번역 영역(UTR)의 대응 부위에 상기 miRNA의 패신저 스트랜드의 타겟 서열이 2 카피(copy) 이상 포함될 수 있다.
본 발명에서 상기 miRNA는 정상 세포에 존재하면서, 질환이 있는 세포(비정상 세포)에 존재하지 않거나 발현이 감소된다면 특별히 제한되지 않는다.
본 발명에서 상기 miRNA는 정상 세포에서는 발현되나, 암, 염증, 심혈관 질환 또는 간 질환이 있는 세포에서는 발현되지 않거나 발현이 감소되는 것을 특징으로 한다.
상기 miRNA는 miR-122, miR-143 또는 miR-145일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 상기 miR-122의 패신저 스트랜드는 miR-122-3p일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 miR-143 또는 miR-145는 정상 세포에서는 발현되나, 대장암 세포에서는 발현되거 않거나 발현이 감소된다(Reduced Accumulation of Specific MicroRNAs in Colorectal Neoplasia Vol. 1, 882-891, October 2003).
또한, 상기 miR-122의 패신저 스트랜드 miR-122-3p의 타겟 서열은 서열번호 27의 염기서열을 가진다.
본 발명의 "치료 유전자(therapeutic gene)"는 비정상 세포 내에서 발현되어 치료학적 효과를 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 말한다. 본 발명의 치료 유전자는 질환이 있는 세포(비정상 세포)에 작용하여 치료 효과를 갖는 유전자라면 어떠한 것이라도 사용가능하다. 상기 치료 유전자는 암, 염증, 심혈관 질환 또는 간 질환의 치료를 위한 것일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
상기 암 치료를 위한 치료 유전자와 관련하여, 예를 들면, 약제감수성 유전자, 세포사멸 유전자, 세포증식 억제 유전자, 세포독성 유전자, 종양 억제인자 유전자, 항원성 유전자, 항신생 혈관 생성 유전자, 사이토카인 유전자 등이 포함될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 약제감수성 유전자(drug-sensitizinggene)는 독성이 없는 전구체(prodrug)를 독성물질로 전환시키는 효소에 대한 유전자로 유전자가 이입된 세포가 사멸하게 되므로 자살 유전자(suicide gene)로도 불린다. 즉, 정상 세포에는 독성이 없는 전구체를 전신적으로 투여했을 때 암세포에만 전구체가 독성 대사체(toxic metabolite)로 전환되어 약제에 대한 감수성을 변화시킴으로써 암세포를 파괴시키는 방법이다. 대표적으로 HSV-tk(Herpes simplex virus-thymidine kinase) 유전자와 갠시클로비르(ganciclovir), 대장균의 사이토신 탈아미노효소(cytosine deaminase, CD) 유전자와 5-플루오로시토신(5-fluorocytosine, 5-FC)가 가능하다.
상기 세포사멸 유전자(proapoptotic gene)는 발현되어 프로그램된 세포 소멸을 유도하는 뉴클레오타이드 서열을 말한다. 당업자에게 공지된 세포사멸 유전자로, p53 유전자, 아데노바이러스 E3-11.6K 유전자(Ad2 및 Ad5에서 유래), 아데노바이러스 E3-10.5K (Ad에서 유래) 유전자, 아데노바이러스 E4 유전자, p53 경로 유전자 또는 카스파제를 코딩하는 유전자가 포함된다.
상기 세포증식 억제 유전자(cytostatic gene)는 세포 내에서 발현되어 세포 주기 도중에 세포 주기를 정지시키는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 대표적으로 p21 유전자, 망막아세포종 유전자, E2F-Rb 융합 단백질 유전자, 사이클린-종속성 카이네이즈 억제인자를 코딩하는 유전자(예를 들면, p16, p15, p18 및 p19), 성장 중지 특이성 호메오박스(growth arrest specific homeobox, GAX) 유전자(국제특허출원공개 WO 97/16459호 및 WO 96/30385호) 등이 있다.
상기 세포독성 유전자(cytotoxic gene)는 세포 내에서 발현되어 독성 효과를 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 말한다. 일 예로, 슈도모나스 외독소(exotoxin), 리신 독소 또는 디프테리아 독소 등을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 유전자 등이 있다.
상기 종양 억제인자 유전자(tumor suppressor gene)는 표적 세포 내에서 발현되어 종양 표현형을 억제할 수 있거나 세포사멸을 유도할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 대표적으로 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor-α, TNF-α 유전자, p53 유전자, APC 유전자, DPC-4/Smad4 유전자, BRCA-1 유전자, BRCA-2 유전자, WT-1 유전자, 망막아세포종 유전자(Lee et al., Nature, 329,642, 1987), MMAC-1 유전자, 선종양 폴립증 코일 단백질(adenomatous polyposis coil protein)의 유전자(Albertsen et al. 미국특허공보 US 5,783,666호), 결손된 결장 종양(DCC) 유전자, MMSC-2 유전자, NF-1 유전자, 염색체 3p21.3에 위치한 비인후 종양 억제인자 유전자(Cheng et al. Proc.Nat.Acad.Sci., 95,3042-3047, 1998), MTS1 유전자, CDK4 유전자, NF-1 유전자, NF-2 유전자 또는 VHL 유전자가 포함된다.
상기 항원성 유전자(antigenic gene)는 표적 세포 내에서 발현되어 면역 시스템에서 인식할 수 있는 세포 표면 항원성 단백질을 생산하는 뉴클레오타이드 서열을 말한다. 당업자에게 공지된 항원성 유전자의 예에는 암태아성 항원 (carcinoembryonic antigen, CEA) 유전자 또는 p53 유전자(Levine, A., 국제특허출원공개 WO 94/02167호)이 포함된다.
상기 항신생혈관 생성 유전자(anti-angiogenic gene)는 발현되어 항-신생혈관 생성 인자를 세포밖으로 방출하는 뉴클레오타이드 서열을 말한다. 그 예로 안지오스타틴 유전자, 혈관 내피 성장 인자(VEGF)의 억제 인자 유전자 또는 엔도스타틴 유전자 등이 포함된다.
상기 사이토카인 유전자(cytokine gene)는 세포 내에서 발현되어 사이토카인을 생성하는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 대표적으로 GM-CSF 유전자, 인터류킨(IL-1, IL-2, IL-4, IL-12, IL-10, IL-19, IL-20) 유전자, 인터페론 α 유전자, 인터페론 β 유전자 또는 인터페론 γ유전자 등이 포함된다.
상기 목적을 달성하기 위한 또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 DNA 구조체를 유효성분으로 포함하는 약학 제제를 제공하는 것이다.
상기 약학 제제는 정상 세포에서는 세포독성을 갖지 않는 것이다. 구체적으로, 정상 세포에서는 정상 세포 내의 miRNA가 DNA 구조체내에 존재하는 miRNA의 패신저 스트랜드의 타겟 서열과 결합하여, 치료 유전자의 발현이 억제된다. 반면, 질환이 있는 세포(비정상 세포)는 miRNA가 존재하지 않거나 발현이 감소되기 때문에, DNA 구조체내에 존재하는 miRNA의 패신저 스트랜드의 타겟 서열과 결합하지 않거나 일부만 결합하기 때문에 치료 유전자가 발현되게 된다. 따라서, 발현된 치료 유전자는 치료 유전자의 종류에 따라 비정상 세포에 작용하여 다양한 기능을 수행함으로써 질환의 치료가 가능하게 된다. 상기 치료 유전자의 종류는 전술한 바와 같으며 치료 유전자의 종류에 따라 질환을 치료하기 위한 기능 역시 달라지게 된다.
본 발명에서는 조직 특이적이고 질환이 있는 세포(비정상 세포)에서 발현되지 않거나 발현이 감소되는 miRNA의 패신저 스트랜드의 타겟 서열을 DNA 구조체에 포함시킴으로써, 비정상 세포에서 치료 유전자가 발현되고 활성화되므로, 상기 DNA 구조체를 유효성분으로 이용하여 약학 제제에 이용될 수 있다.
본 발명의 구체적 일실시예에서, 패신저 스트랜드를 타겟으로 하는 트랜스유전자 발현의 치료학적 유용성을 알아보기 위해 CT-gp122 3x 또는 CT-pp122 3x가 도입된 세포의 생존율을 비교하였다(도 7c). 그 결과, miR-122 음성의 Hep3B 세포에 CT-pp122 3x의 도입시 HSV-TK가 발현되므로, GCV(ganciclovir) 처리에 의해 CT-gp122 3×와 유사한 효능으로 Hep3B 세포의 퇴행(regression)을 야기했다. Huh7.5 세포에 CT-Scramble을 도입한 경우 HSV-TK가 발현되므로, GCV 처리에 의해 miR-122를 발현하는 Huh7.5 세포의 35%가 사멸하였다. 반면에, miR-122 양성의 Huh7.5 세포에 CT-pp122 3× 및 CT-gp122 3×을 도입한 경우, HSV-TK가 발현되지 않으므로, GCV 처리에 의해서도 Huh7.5 세포의 생존에 영향을 미치지 않았다. 이러한 결과들을 통해 치료를 위한 트랜스유전자의 발현이 패신저 스트랜드에 의해 타겟팅됨으로써 안전하고 효과적으로 조절될 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 약학 제제는 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약학 제제로 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학 제제에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 액상 용액으로 제제화되는 경우 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다.
본 발명의 약학 제제는 포함되는 치료 유전자의 종류에 따라 항암용 제제로 사용될 수 있으며, 종양과 관련된 다양한 질병 또는 질환, 예컨대 뇌암, 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 식도암, 췌장암, 방광암, 전립선암, 대장암, 결장암, 골암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암, 요관암 및 자궁경부암 등의 치료에 이용될 수 있다.
본 발명의 약학 제제는 비경구 투여가 바람직하고, 예컨대 정맥내 투여, 복강내 투여, 종양내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 또는 국부 투여를 이용하여 투여할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 난소암에서 복강내로 투여하는 경우 및 간암에서 문맥으로 투여하는 경우에는 주입 방법으로 투여할 수 있고, 유방암 및 두경부암의 경우에는 종양 매스에 직접 주사하여 투여할 수 있으며, 결장암의 경우에는 관장으로 직접 주사하여 투여할 수 있고, 방광암의 경우에는 카테터 내로 직접 주사하여 투여할 수 있다.
본 발명의 약학 제제의 투여량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 제제에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 제제의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.
본 발명의 약학 제제는 단독으로, 또는 외과적 수술요법 등의 보조 치료 방법들과 병행하여 사용할 수 있다. 본 발명의 제제와 함께 이용될 수 있는 화학 요법제(chemotherapeutic agent)는 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴 carboplatin), 프로카르바진(procarbazine), 메클로레타민(mechlorethamine), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드 (ifosfamide), 멜팔란(melphalan), 클로라부실(chlorambucil), 비술판(bisulfan), 니트로소우레아 (nitrosourea), 디악티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 블레오마이신(bleomycin), 플리코마이신(plicomycin), 마이토마이신(mitomycin), 에토포시드(etoposide), 타목시펜(tamoxifen), 택솔(taxol), 트랜스플라티눔(transplatinum), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 빈크리스틴(vincristin), 빈블라스틴(vinblastin) 및 메토트렉세이트(methotrexate) 등을 포함한다.
본 발명의 제제와 함께 이용될 수 있는 방사 요법은 X-선 조사 및 γ-선 조사 등이다. 바람직하게는 갠시클로비르(ganciclovir)와 병용하여 사용한다.
상기 목적을 달성하기 위한 또 하나의 양태로서, i) 리포터 유전자 및 ii) miRNA의 패신저 스트랜드(passenger strand)의 타겟 서열을 포함하는 DNA 구조체로서, 상기 miRNA는 정상 세포에 존재하며, 질환세포에서는 존재하지 않거나 발현이 감소되며, 상기 miRNA의 패신저 스트랜드의 타겟 서열은 정상 세포에서의 리포터 유전자의 발현을 억제하는 DNA 구조체를 유효성분으로 포함하는 질환 진단용 조성물을 제공한다.
특정 질환과 관련되어 정상 세포에서는 존재하지만, 질환 세포에는 존재하지 않거나 발현이 감소되는 miRNA의 경우, 정상 세포에서는 정상 세포 내의 miRNA가 DNA 구조체 내에 존재하는 miRNA의 패신저 스트랜드의 타겟 서열과 결합하게 되므로, 리포터 유전자의 발현이 억제되는 반면, 비정상 세포(질환 세포)는 miRNA가 존재하지 않거나 발현이 감소되기 때문에, 비정상 세포 내에서는 DNA 구조체내에 존재하는 miRNA의 패신저 스트랜드의 타겟 서열과 결합하지 않거나 일부만 결합하기 때문에 리포터 유전자가 프로모터의 전사 활성에 따라 리포터 단백질로 발현된다. 이에 따라 발현된 리포터 단백질의 활성 또는 양을 측정함으로써 질환 여부를 진단할 수 있다.
이때 리포터 유전자는 본 발명이 속하는 분야에서 공지된 것을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 LacZ, 클로람페니콜 아세틸 전이효소(CAT: chloramphenicol acetyl transferase), 레닐라 루시퍼라제(Renila luciferase), 반딧불이(firefly) 루시페라제, 적색형광단백질(RFP), 녹색형광단백질(GFP), 분비성 태반 알칼라인 포스파타아제(secreted placental alkaline phosphatase, SEAP) 또는 HSV-tk(Herpes simplex virus-thymidine kinase)를 암호화하는 유전자를 사용할 수 있다.
이러한 리포터 단백질들의 활성은, 반딧불이 루시페라제(de Wet J. et al., Mol. Cell Biol., 7, 725-737, 1987 참조), 레닐라 루시페라제([Lorenz W.W. et al., PNAS 88, 4438-42, 1991) 참조), 클로람페니콜 아세틸 전이효소(Gorman C. et al.,Mol. Cell Biol., 2, 1044-1051, 1982 참조), LacZ(Hall C.V. et al., J. Mol. Appl. Genet., 2,101-109, 1983 참조), 인간 성장 호르몬(Selden R. et al.., Mol. Cell Biol., 6, 3173-3179, 1986 참조), 녹색 형광 단백질(Chalfie M. et al., Science, 263, 802-805, 1994 참조) 및 분비성 태반 알칼린 포스파타아제(Berger, J. et al., Gene, 66, 1-10, 1988 참조)에 대하여 당업자에게 공지되어 있는 방법을 사용하여 측정할 수 있다. 또한, 티미딘 키나제(thymidine kinase)를 리포터 단백질로 한 경우 PET(positron emission tomography) 이미징 법을 이용할 수 있다.
본 발명에 의해 진단될 수 있는 질환은 특별히 제한되지 않으며, 암, 염증, 심혈관 질환 또는 간 질환을 포함한다. 바람직하게는 암 또는 종양을 포함하며, 더욱 바람직하게는, 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 대장암, 결장암, 자궁경부암, 뇌암, 전립선암, 골암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암 또는 요관암이며, 가장 바람직하게는 간암이다.
본 발명의 구체적 일실시예에 따르면, miR122+인 Huh7 세포에서 모두 리포터 활성이 현격히 감소된 반면 miR122-인 HepG2 및 Hep3B세포에서는 리포터 활성을 감소시키지 않았다(도 3a 내지 3c). 따라서, 정상조직에는 존재하면서, 비정상 조직에서는 존재하지 않거나 발현이 감소되는 특정 miRNA를 대상으로 하여 질환의 여부를 진단할 수 있는데, 정상 조직에서는 정상 조직 내의 miRNA가 DNA 구조체 내의 miRNA의 패신저 스트랜드의 타겟 서열에 결합하게 되어 리포터 단백질의 활성이 나타나지 않으나, 비정상 조직에서는 miRNA가 존재하지 않거나 발현이 감소하기 때문에, DNA 구조체 내의 miRNA의 패신저 스트랜드의 타겟 서열에 결합하지 않거나 일부만 결합하기 때문에 리포터 단백질의 유전자의 활성이 나타나게 되므로 이에 의해 질환 여부를 진단할 수 있게 된다.
따라서, 비정상 세포에서 존재하지 않거나 발현이 감소되면서, 정상세포에 존재하는 miRNA의 패신저 스트랜드를 이용하여, 정상 세포에서는 리포터 단백질의 활성이 없고, 비정상 조직에서만 리포터 단백질의 활성이 나타나는 원리를 통해, 상기 리포터 유전자를 포함하는 DNA 구조체를 이용하여, 질환 여부의 진단에 활용할 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 또 하나의 양태로서, 상기 리포터 유전자를 포함하는 DNA 구조체를 생물학적 시료에 도입하는 단계; 및 상기 시료에서 리포터 단백질을 검출하는 단계를 포함하는 질환의 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
본원에서 사용되는 용어 “생물학적 시료”란 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 조직 부검 시료(뇌, 피부, 림프절, 척수 등), 세포 배양 상등액, 파열된 진핵세포 및 세균 발현계 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들 생물학적 시료를 조작하거나 조작하지 않은 상태로 본 발명의 DNA 구조체와 반응시켜 리포터 유전자의 활성을 통해 질환의 여부를 확인할 수 있다.
상기 리포터 유전자, 리포터 단백질 및 질환은 전술한 질환 진단용 조성물에 기재된 바와 동일하다.
본 발명을 이용하면, 정상 세포에서는 발현하나, 비정상 세포 또는 질환 세포에서 존재하지 않거나 발현이 감소되는 특정 miRNA의 패신저 스트랜드의 타겟 서열을 치료 유전자의 3' 비번역 영역(UTR)의 대응 부위에 포함시킴으로써 비정상 세포에서만 치료 유전자가 발현되도록 하여, 비정상 세포에서 치료 유전자가 활성화되어 기능을 하게 할 수 있다. 이에 따라, 질환이 있는 조직에서만 치료 유전자를 발현시킴으로써 질병을 치료할 수 있는 장점이 있다.
또한, 리포터 유전자를 포함하는 DNA 구조체를 이용하여, 정상 세포에서는 리포터 유전자의 활성이 없으나, 비정상 세포 또는 질환 세포에서만 리포터 유전자가 활성화 되는 것을 검출함으로써, 손 쉽게 질환 여부를 진단할 수 있다.
도 1은 miR-122-5p 또는 -3p 타겟 사이트를 가진 컨스트럭트 제조에 관한 것이다. (a) miR-122 가이드 또는 패신저 스트랜드에 대한 타겟 사이트의 두 카피(2×) 또는 세 카피(3×)는 TK 프로모터-구동의 Renilla luciferase (R.luc)의 3’비번역 영역(3’UTR)에 삽입되었다. 완전 또는 불완전 상보적인 miRNA 타겟 사이트가 삽입되었다. 음성대조군으로 어떠한 miRNA에 의해서도 타겟되지 않는 스크램블드 서열의 두 카피 또는 세 카피를 TK 프로모터를 가지는 레닐라 루시퍼라제를 발현하는 벡터에 클로닝하였다. (b) miR122-음성(negative) 세포주에서 외래의 miR122를 발현시키기 위하여, U6 프로모터 구동의 premature miR122와 변이체 premature miR122를 클로닝하였다. (c) 항-miRNA를 발현하는 벡터를 제조하기 위하여, U6 프로모터를 가지는 벡터에 항-miR-122-5p 또는 -3p를 삽입하였다. U6 프로모터-구동의 스크램블드 서열(Anti-miRScramble)은 음성 대조군으로 제조하였다.
도 2는 세포내에서 miR122 가이드와 패신저 스트랜드의 발현양상을 나타낸 것이다. 비-동위원소 라벨된 노던 블롯 분석(위) 또는 Taqman miRNA 발현 시스템(아래)에 의해 다양한 세포주에서 miR-122 가이드(a)와 패신저 스트랜드(b)의 검출 결과를 나타낸다. miRNA 발현 수준은 각 세포에서 총 RNA 1ng당 카피수로 제시되었으며, 데이터는 평균±표준 편차이다(n = 3).
도 3은 세포내에서 대응하는 miRNA에 의하여 트랜스유전자를 포함하는 miRNA 타겟 사이트의 조절에 관한 것이다. (a) 외래의 트랜스유전자(Renilla luciferase, R. luci) 활성은 miRNA 타겟 사이트를 포함하는 리포터 벡터와 반딧불 루시퍼라제를 코딩하는 벡터(F. luci)를 miR-122를 발현하는 Huh7 세포에 함께 트랜스펙션하여 분석하였으며, 스크램블드 사이트를 가진 벡터의 리포터 수준의 퍼센티지로 나타내었다. 트랜스유전자의 활성은 상기 리포터 컨스트럭트로 트랜스펙션된 miR-122 음성의 HepG2(b) 또는 Hep3B(c) 세포에서 측정하였다. (d) miRNA 타겟 사이트를 가진 리포터 컨스트럭트와 pre-miR-122 또는 pre-miR-122 mutant를 코딩하는 벡터를 miR122 음성의 Hep3B 세포에 함께 형질전환하여 리포터 활성을 평가하였다. 실험은 세번 반복하였고, 값은 세번의 독립 실험에 대한 평균으로 표준 편차와 함께 표시되었다(*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.005, p > 0.05는 표시하지 않음, unpaired t-test).
도 4는 세포내에서 항-miR-122에 의해 내재적 또는 외래의 miR-122 가이드 또는 패신저-조절된 컨스트럭트의 상향 조절에 관한 것이다. (a) miRNA 타겟 사이트를 포함하는 리포터 벡터와 항-miR-122-5p 또는 -3p의 발현 벡터를 miR-122를 발현하는 Huh7 세포에 함께 트랜스펙션하여, 외래의 트랜스유전자(R. luci) 활성을 분석하였으며, 스크램블드 사이트를 가진 벡터의 리포터 수준의 퍼센티지로 표현하였다. (b) pre-miR-122 또는 mutant pre-miR-122를 코딩하는 벡터, miRNA 타겟 사이트를 포함하는 리포터 벡터 그리고 항-miR-122-5p 또는 -3p에 대한 발현 벡터를 miR-122를 발현하지 않는 Hep3B 세포에 함께 트랜스펙션하였고, 리포터 활성이 분석되었다. 값은 표준 편차와 함께 평균으로 표시했다 (*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.005, p > 0.05는 표시되지 않음, unpaired t-test, n = 3).
도 5는 miR-122 타겟 사이트에 의한 트랜스유전자 mRNA 수준의 하향 조절에 관한 것이다. 외래 트랜스유전자(R. luci) RNA 수준은 miRNA 타겟 사이트를 포함하는 리포터 벡터로 트랜스펙션된 Huh7 세포에서 측정하였고, 스크램블드 사이트를 가진 리포트 벡터의 퍼센티지로 표현되었다. 데이터는 평균±표준 편차이다(n = 3). (***p < 0.005, unpaired t-test).
도 6은 miRNA 타겟 사이트를 가진 컨스트럭트를 안정하게 발현하는 Huh7 세포에서의 miRNA의 조절에 관한 것이다. 항-miRNA 존재하에서 miR-122-5p 타겟 사이트(gp122 3×)(a) 또는 miR-122-3p 타겟 사이트 (pp122 3×)(b)를 포함하는 컨스트럭트를 안정적으로 발현하는 Huh7 세포에서 리포터 유전자(R. luci) 활성을 분석하였고, mock-트랜스펙션된 안정화 세포(stable cells)에서 리포터 활성의 퍼센티지로 표현하였다. 항-miRNA 존재하에서 gp122 3×(c) 또는 pp122 3× (d)를 안정적으로 발현하는 Huh7 세포에서 R. luci RNA 수준을 측정하였고, mock-트랜스펙션된 안정화 세포(stable cells)에서 리포터 RNA 수준의 퍼센티지로 표현하였다.
도 7은 miR122를 발현하는 세포에서 miR-122-5p 또는 -3p-조절된 치료상의 트랜스유전자의 효과에 관한 것이다. (a) miR-122 가이드 또는 패신저 스트랜드 타겟 사이트의 세 카피가 CMV promoter-driven HSV-TK의 3’비번역 영역에 삽입되었다(각각 CT-gp122× 및 CT-pp122×). 음성 대조군으로 CMV promoter와 함께 HSV-TK를 발현하는 벡터에 스크램블 서열의 세카피를 이용하여 클로닝하였다(CT-Scramble 3×). (b) miRNA 타겟 사이트와 함께 HSV-TK 유전자를 코딩하는 각각의 벡터가 트랜스펙션된 Huh7 세포에서 웨스턴 블롯으로 항-cyclin G1을 분석하였다. 튜불린은 로딩 대조군으로 사용되었다. (c) miRNA 타겟 사이트를 포함하는 HSV-TK 컨스트럭트와 GFP를 발현하는 벡터를 함께 Huh7.5 세포에 트랜스펙션하였으며, ganciclovir도 처리하였다. 세포생존력은 GFP 양성 세포의 수를 카운트하여 측정하였으며, CT-gp122× 트랜스펙션되고 GCV 처리된 세포의 생존력 퍼센티지로 표현되었다.
<실험방법>
실시예 1: miR -122-5p 또는 3p 타겟 사이트를 가지는 리포터 벡터의 컨스트럭트( construct ) 제작
1-1. miR -122-5p 또는 3p 타겟 사이트에 대한 리포터 컨스트럭트 제조
miR-122-5p(가이드 스트랜드; MicroRNA database accession No, MIMAT0000421)에 대한 타겟 사이트는 서열번호 1 내지 4의 프라이머를 이용하여, PCR에 의해 합성하였다.
(1) miR-122-5p 완전 매칭 타겟 사이트
정방향 프라이머 : 5'-CCG CTC GAG ACA AAC ACC ATT GTC ACA CTC CAC GAT ACA AAC ACC ATT GTC ACA CTC CA-3'(서열번호 1)
역방향 프라이머 : 5'-CCG CTC GAG TGG AGT GTG ACA ATG GTG TTT GTA TCG TGG AGT GTG ACA ATG GTG TTT GT-3'(서열번호 2)
(2) miR-122-5p 불완전 매칭 타겟 사이트
정방향 프라이머 : 5'-AAC GCC ATT ATC ACA CTA AAT AAT CGA ACG CCA TTA TCA CAC TAA ATA-3'(서열번호 3)
역방향 프라이머 : 5'-TAT TTA GTG TGA TAA TGG CGT TCG ATT ATT TAG TGT GAT AAT GGC GTT-3'(서열번호 4)
miR-122-3p(패신저 스트랜드; MicroRNA database accession No, MIMAT0004590)에 대한 타겟 사이트는 서열번호 5 내지 8의 프라이머를 이용하여, PCR에 의해 합성하였다.
(3) miR-122-3p 완전 매칭 타겟 사이트
정방향 프라이머 : 5′-CCG CTC GAG TAT TTA GTG TGA TAA TGG CGT TCG ATT ATT TAG TGT GAT AAT GGC GTT-3' (서열번호 5)
역방향 프라이머 : 5'-CCG CTC GAG AAC GCC ATT ATC ACA CTA AAT AAT CGA ACG CCA TTA TCA CAC TAA ATA-3' (서열번호 6)
상기 miR-122-3p(패신저 스트랜드, passenger strand)의 타겟 사이트의 서열은 다음과 같다.
TATTTAG TGTGATAATG GCGTT (서열번호 27)
(4) miR-122-3p 불완전 매칭 타겟 사이트
정방향 프라이머 : 5'-TGG AGT GTG ACA ATG GTG TTT GTA TCG TGG AGT GTG ACA ATG GTG TTT GT-3' (서열번호 7)
역방향 프라이머 : 5'-ACA AAC ACC ATT GTC ACA CTC CAC GAT ACA AAC ACC ATT GTC ACA CTC CA-3' (서열번호 8)
상기와 같은 PCR 증폭 후에, miRNA 타겟 사이트의 두 카피(2×) 또는 세 카피(3×)를 XhoI을 사용하여 pRL-TK Renilla luciferase(Promega, Madison, WI, USA)의 3' UTR에 삽입하였다.
또한, 음성 대조군으로 miR-Scramble 타겟 사이트를 서열번호 9와 10의프라이머를 이용하여 PCR에 의해 합성한 후, 스크램블드 서열의 두 카피 또는 세 카피를 TK 프로모터를 가지는 레닐라 루시퍼라제를 발현하는 벡터에 클로닝하였다.
(5) miR-Scramble 타겟 사이트
정방향 프라이머 : 5'- CCG CTC GAG GTC GAC GGT ATC GAT AAG CTT GAT ATC GAA TTC CTG CAG CCC GGG GGA TTC ACT AGT-3'(서열번호 9)
역방향 프라이머 : 5′- CCG CTC GAG GTC GAC GGT ATC GAA CTA GTG AAT CCC CCG GGC TGC AGG AAT TCG ATA TCA AGC TTA-3'(서열번호 10)
1-2. Pre - miRNA -122 또는 Pre - miRNA -122 mutant 제조
Pre-miRNA-122와 pre-miRNA-122 변이체는 시드 서열 야생형 프라이머(seed sequence wild-type primers)와 역시드 서열 프라이머(seed sequence reverse primers)을 이용하여 각각 PCR 증폭과 혼성화에 의해 합성하였다.
(1) Pre-miRNA-122
시드 서열 야생형 정방향 프라이머 : 5'-A CGC GTC GAC CCT TAG CAG AGC TGT GGA GTG TGA CAA TGG TGT TTG TGT CTA AAC TAT CA-3'(서열번호 11)
시드 서열 야생형 역방향 프라이머 : 5'-TGC TCT AGA GCC TAG CAG TAG CTA TTT AGT GTG ATA ATG GCG TTT GAT AGT TTA GAC AC-3' (서열번호 12)
(2) Pre-miRNA-122 변이체
역시드 서열 정방향 프라이머 : 5'-A CGC GTC GAC CCT TAG CAG AGC TGT GTG TGA GGA CTG CGG TAA TTG TGT CTA AAC TAT CA-3' (서열번호 13)
역시드 서열 역방향 프라이머 : 5'-TGC TCT AGA GCC TAG CAG TAG CTA TTA GTG AGG ATT GCG GTA ATT GAT AGT TTA GAC AC-3' (서열번호 14)
이후, 합성된 산물을 SalI와 XbaI을 이용하여, pTZ U6+1 promoter vector에 삽입하였다.
1-3. 항- miR -122를 코딩하는 발현 벡터 제작
항-miR-122-5p 또는 항-miR-122-3p는 서열번호 15 내지 18의 프라이머를 이용하여 95℃에서 2분간 in vitro에서 혼성화하여 제조하였고, 이후 37℃에서 1시간 배양한 후, SalI and XbaI을 가지는 pTZ U6+1 promoter vector에 클로닝하였다.
(1) 항-miR-122-5p
정방향 프라이머 : 5'-TCG ACC AAA CAC CAT TGT CAC ACT CCA-3'(서열번호 15)
역방향 프라이머 : 5'-CTA GAT GGA GTG TGA CAA TGG TGT TTG-3' (서열번호 16)
(2) 항-miR-122-3p
정방향 프라이머 : 5'-TCG ACT ATT TAG TGT GAT AAT GGC GTT T-3'(서열번호 17)
역방향 프라이머 : 5'-CTA GAA ACG CCA TTA TCA CAC TAA ATA G-3'(서열번호 18)
1-4. 네오마이신 유전자 발현 카세트
pcDNA3.1(+) (Promega)으로부터 네오마이신 유전자 발현 카세트를 서열번호 19와 20의 프라이머를 이용하여 증폭하였으며, miRNA 타겟 사이트를 하버링(harboring)하는 리포터 벡터의 BamHI 사이트에 삽입하여 stable 세포주를 제작하였다.
정방향 프라이머 : 5'- CGG GAT CCC GAA TTA ATT CTG TGG AAT GTG TGT CAG TTA-3' (서열번호 19)
역방향 프라이머 : 5'- CGG GAT CCA AGA TAC ATT GAT GAG TTT GGA CA-3 (서열번호 20)
실시예 2: 세포배양
간세포 암종(Huh7, Huh7.5, Hep3B, 및 HepG2), 자궁 경부암(HeLa), 유방암 (MCF-7), T 세포 백혈병 (Jurkat), 그리고 적백혈병(TF-1a) 세포주는 ATCC(American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)에서 구입하였다. Huh7, Huh7.5, Hep3B, HepG2, 및 HeLa는 10% 소 태아 혈청(FBS)을 포함하는 DMEM(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에서 배양했고, MCF-7, Jurkat, 그리고 TF-1a은 10% 소 태아 혈청(FBS)을 포함하는 RPMI 1640(Invitrogen)에서 배양했다.
실시예 3: 듀얼 루시퍼라제 분석 및 웨스턴 블롯 .
세포는 표준 PEI 프로토콜에 따라, 표준화를 위하여 반딧불 루시퍼라아제를 코딩하는 벡터 또는 GFP를 발현하는 벡터와 테스트 컨스트럭트를 폴리에틸렌이민 (PEI) 중합체(Sigma, St Louis, MO, USA)를 사용하여 코-트랜스펙션하였다.
항-miRNA RNA(Integrated DNA Technologies, Coralville, IA, USA)는 제조자의 표준 프로토콜에 따라 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)을 사용하여 세포에 트랜스펙션하였다.
총 단백질은 트랜스펙션 후 24시간이 지나서 수동 용해 버퍼로 추출하였으며, 듀얼 루시퍼라제 리포터 분석(Promega)은 TD-20/20 루미노미터(Turner Designs Instrument, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 제조자의 표준 프로토콜에 따라 수행했다.
웨스턴 블롯 분석을 위해, 총 단백질은 RIPA 버퍼(50 mM Tris-HCl, pH 7.4; 1% NP-40, 0.25%Na-deoxycholate, 150 nM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1 mM Na3VO4, 및 1 mM NaF)를 이용하여, 트랜스펙션 후 24시간이 지나서 트랜스펙션된 세포로부터 분리하였다. 항-cyclin G1 (C-18, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)와 단백질 로딩 대조군으로 항-tubulin (A-6, Santa Cruz Biotechnology)을 가지고 웨스턴 블롯을 수행했다. 마지막으로 40 ㎍의 세포 추출물은 10% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis에 로딩했고, PVDF 멤브레인으로 옮겼다. 상기 멤브레인은 워싱 후, 1:1000 폴리클로날 항-cyclin G1을 이용하여 4℃에서 16시간 동안 인큐베이션하였으며, 이후 1:3000 항-mouse-HRP을 이용하여 25℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다.
실시예 4: RNA 발현 분석
총 RNA는 트리졸시약 (Molecular Research Center Inc., Cincinnati, OH, USA)으로 분리하였으며, 올리고-dT와 MMLV RTase (Applied Biological Materials Inc., Richmond, ONT, Canada)를 이용하여 42℃에서 1시간 동안 역전사 반응을 수행하였다.
상기 반응에 의해 얻어진 cDNA는 반딧불 루시퍼라제 유전자 결합 프라이머인 서열번호 21과 22를 이용하여 리얼-타임 PCR을 수행하여 증폭하였다.
정방향 프라이머 : 5'-CTG GGC GTT AAT CAG AGA GG-3'(서열번호 21)
역방향 프라이머 : 5'-GTG TTC GTC TTC GTC CCA GT-3' (서열번호 22)
또한, 상기 cDNA는 레닐라 루시퍼라제 유전자를 포함하는 특이적인 프라이머인 서열번호 23과 24를 이용하여 리얼-타임 PCR을 수행하여 증폭하였다.
정방향 프라이머 : 5'-ATG ACT TCG AAA GTT TAT GAT CCA-3'(서열번호 23)
역방향 프라이머 : 5'-ATA AGA AGA GGC CGC GTT AC-3'(서열번호 24)
또한, 표준화를 위해 GAPDH 유전자는 서열번호 25와 26을 이용하여 PCR에 의해 증폭하였다.
정방향 프라이머 : 5'-TGA CAT CAA GAA GGT GGT GA-3' (서열번호 25)
역방향 프라이머 : 5'-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3' (서열번호 26)
miR-122-5p 또는 -3p에 대한 총 RNA는 Taqman miRNA 역전사 키트(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 이용하여 역전사하였고, 얻어진 cDNA는 Rotor-Gene (Corbett, Valencia, CA, USA)을 사용하여 제조자의 표준 방법에 따라 Taqman miRNA 발현 어세이(Applied Biosystems)에 의해 증폭하였다.
노던 블롯은 제조자의 표준 방법에 따라 BrightStar-BioDetect Kit (Ambion, Grand Island, NY, USA)을 사용하여 수행하였다. 상기 실험은 동위원소 표지된 프로브 대신에 비오틴 라벨된 프로브-스트렙타비딘 알칼린 포스파타제 컨쥬게이션(SA•AP)에 기초하여 수행하였다. 총 RNA는 15% urea-polyacrylamide gel에 로딩하였고, 상기 젤은 4℃, 200 V하에서 1시간 동안 니트로셀룰로오스 멤브레인에 옮겨졌다. 옮겨진 멤브레인은 1분 동안 UV 선 조사에 의해 가교하였으며 37℃에서 16시간 동안 비오틴-컨쥬게이션된 SA·AP 프로브로 혼성화하였다. RNAs는 AP에 의해 활성화된 발광 기질에 의해 검출되었다.
실시예 5: 세포 생존 분석
Huh7.5 세포는 24시간 동안 완전한 배지에서 웰당 3 × 105 세포에서 배양하였다. miRNA 타겟 사이트를 가지는 HSV-TK 컨스트럭트를 PEI를 사용하여, GFP를 발현하는 벡터와 함께 Huh7.5 세포에 코-트랜스펙션하였으며, 각 세포는 트랜스펙션 후 24시간이 지나서 100 μM GCV(ganciclovir, Cymevene®; Roche, Basel, Switzerland)를 처리하였다. 세포 생존력은 형광 현미경(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)을 사용하여, GFP 양성 세포의 수를 카운트하여, GCV 처리후 48 시간이 지나서 측정했다.
실험예 1: miR -122-5p 또는 3p 타겟 사이트를 가지는 리포터 벡터의 컨스트럭트( construct ) 제작
1-1. miR -122-5p 또는 3p 타겟 사이트에 대한 리포터 컨스트럭트 제조
도 1은 miR-122-5p or -3p 타겟 사이트를 가진 컨스트럭트 제조에 관한 것으로, 구체적으로 miRNA 스트랜드의 조절하에, 리포터 유전자(Renilla luciferase)를 코딩하는 컨스트럭트 벡터의 3’UTR에 불완전 또는 완전 매칭하는 miR-122-5p(가이드 스트랜드, guide strand) 또는 -3p(패신저 스트랜드, passenger strand) 타겟 사이트의 2 또는 3 카피(copy)를 삽입하였다(도 1a).
1-2. Pre - miRNA -122 또는 Pre - miRNA -122 mutant 제조
또한, 세포 내에서 miR-12를 발현시키기 위하여, U6+1 프로모터 하에서 pre-miR-122를 코딩하는 발현 벡터와 변이체 premature miR122를 코딩하는 벡터를 제작하였다(도 1b). 그 결과, 상기 pre-miR-122 발현 벡터는 내재적(endogenous) pre-miR-122와 유사한 mature miR-122-5p 및 -3p를 생산한 반면, 변이체(mutant) pre-miR-122 컨스트럭트(construct)는 mature miR-122-5p 및 -3p의 역시드 서열(reverse seed sequence)를 생산하였다.
1-3. 항- miR -122를 코딩하는 발현 벡터 제작
또한, miRNA의 활성을 확인하기 위하여 U6+1 프로모터 하에서 항-miR-122를 코딩하는 발현 벡터를 제작하였다(도 1 c). 항-miRNA를 발현하는 벡터를 제조하기 위하여, U6 프로모터를 가지는 벡터에 항-miR-122-5p 또는 -3p를 삽입하였다. U6 프로모터-구동의 스크램블드 서열(Anti-miRScramble)은 음성 대조군으로 제조하였다.
실험예 2: 패신저 스트랜드가 대응하는 타겟 사이트를 포함하는 리포터 유전자를 하향 조절하는지 여부
우선, 다양한 세포주에서의 miR-122-5p 및 -3p의 발현 패턴을 관찰하였다. miR-122 스트랜드(strand)는 Huh7 세포 및 정상 간 조직에서 발현되었으나, 이외의 다른 간세포와 다른 세포주에서는 발현되지 않았다(도 2). miR-122-5p 보다 적게 발현되긴 하지만, miR-122-3p가 Huh7 세포에서 발현되는 것을 확인하였으며, 이는 패신저 스트랜드가 타겟 스트랜드 서열을 포함하는 유전자의 발현을 하향 조절할 수 있음을 시사하는 것이다.
miR-122 타겟 사이트를 가진 리포터 유전자의 활성이 내재적 miR-122에 의해 조절되는지 여부를 확인하기 위하여, miR-122를 발현하는 Huh7 세포에서 miR-122-5p 또는 -3p에 대한 타겟 사이트를 포함하는 리포터 컨스트럭의 Renilla luciferase의 활성을 확인하였다(도 3a).
루시퍼라제의 발현은 양성 대조군인 gp122 2x 및 3x 에 의해 감소되었으며, 이는 내재적 miR-122-5p에 의해 리포터 유전자의 활성이 조절됨을 나타내는 것이다. 또한, 리포터 활성은 gip122 2x에 의해 하향 조절되었으나, gip122 3x에 의해서는 조절되지 않았다. 또한, 리포터 활성은 pp122 2x 및 pp122 3x에 의해 약 40% 감소되었으며, 이는 리포터 유전자의 활성이 내재적 miR-122-3p에 조절될 수 있음을 시사하는 것이다. pp122에 의한 리포터 활성의 감소는 gp122에 의한 것보다 낮았는데, 이는 세포 내 miR-122 패신저 스트랜드의 수준이 훨씬 낮기 때문이다. 이와 대조적으로, miR-122가 발현되지 않은 HepG2 및 Hep3B 세포에서는 어떠한 컨스트럭트도 리포터 활성에 영향을 미치지 않았다(도 3b, 도 3c)
다음으로, miRNA 타겟 사이트를 포함하는 리포터 활성의 조절이 miRNA의 활성과 관련된 것인지를 확인하기 위하여, pre-miR-122 또는 pre-miR-122 mutant를 발현하는 컨스트럭트를 miRNA 타겟 사이트를 포함하는 리포터 컨스트럭트와 함께 miR-122를 발현하지 않는 Hep3B 세포 내에 트랜스펙션 하였다(도 3d).
pre-miR-122를 코딩하는 발현 벡터를 도입한 경우, 리포터 활성은 gp122 3x 및 pp122 3x에 의해 하향조절(down regulation)되었으나, pre-miR-122 mutant 발현 컨스트럭트를 도입한 경우 그렇지 않았다. pp122에 의해 하향조절된 리포터 활성의 비율 역시 내재적 miR-122 발현세포에서와 마찬가지로 gp122에 의한 것보다 낮았다. 이러한 결과는 가이드 스트랜드 뿐 아니라 패신저 스트랜드 miRNA도 대응하는 miRNA에 대한 타겟 사이트를 포함하는 트랜스유전자(transgene)의 발현 조절에 관여함을 시사하는 것이다.
실험예 3: 트랜스유전자가 항- miR -122-3p 패신저 스트랜드에 의해 특이적으로 조절되는지 여부
miRNA 타겟 사이트를 포함하는 리포터 유전자의 활성이 miR-122-5p 또는 -3p에 의해 특이적으로 조절되는지 여부를 확인하기 위하여 항-miRNA를 코딩하는 벡터를 miRNA 타겟 사이트를 포함하는 리포터 컨스트럭트와 함께 miR-122를 발현하는 Huh7 세포에 트랜스펙션하여(cotransfection) 관찰하였다(도 4a). gp122 2x 및 3x의 리포터 활성은 항-miR-122-5p의 발현에 의해 상향조절되었으나, 항-miR-122-3p에 의해서는 그렇지 않았다. 게다가, pp122 2x 및 3x의 리포터 활성은 항-miR-122-3p의 도입에 의해서는 회복되었으나, 항-miR-122-5p에 의해서는 그렇지 않았다.
miRNA 매개에 의한 조절의 특이성을 확인하기 위하여, pre-miR-122 또는 pre-miR-122 mutant를 항-miRNA 발현 벡터와 함께 miR-122 negative Hep3B 세포에 도입하였다(도 4b). gp122 3x의 리포터 활성은 pre-miR-122에 의해 효과적으로 하향조절 되었고, 감소된 활성은 항-miR-122-5p에 의해 회복되었으나, 항-miR-122-3p에 의해서는 회복되지 않았다.
pp122 3x의 리포터 활성은 pre-miR-122 발현에 의해 감소되었으며, 하향 조절된 활성은 항-miR-122-3p의 발현에 의해 특이적으로 유도되었으나, 항-miR-122-5p에 의해서는 그렇지 않았다. 리포터 활성은 mutant pre-miR-122를 코딩하는 발현 벡터가 도입된 세포 내에서의 항-miRNA의 발현에 영향을 받지 않았다.
이러한 결과는 가이드 스트랜드 뿐 아니라 패신저 스트랜드 miRNA 역시 대응하는 스트랜드에 대한 타겟 사이트와 함께 트랜스유전자의 발현을 특이적으로 조절할 수 있음을 나타내는 것이다.
실험예 4: 리포터를 포함하는 miRNA 타겟 사이트의 전사 수준이 내재적 패신저 스트랜드에 의해 감소하는지 여부.
miRNA 타겟 사이트를 하버링(harboring)하는 컨스트럭의 발현이 miR-122-5p 또는 -3p에 의해 하향조절되는지 여부를 확인하였다(도 5). miRNA 타겟 사이트를 포함하는 각 리포터 컨스트럭의 RNA 수준을 반-정량적 real time PCR을 이용하여 비교하였다. miR-122-5p 또는 -3p(gp122 3×와 pp122 3×)의 타겟 사이트를 하버링하는 리포터 컨스트럭트가 도입되었을 때, 상기 리포터 유전자의 전사 수준은 miR-122를 발현하는 Huh7 세포에서 효과적으로 감소하였다. 리포터 RNA는 miR-122-3p 타겟 사이트가 존재할 때 70% 감소하였으며, 이는 가이드 스트랜드 뿐 아니라 패신저 스트랜드 miRNA 역시 대응하는 스트랜드에 대한 타겟 사이트를 포함하는 트랜스유전자의 RNA 수준을 하향조절할 수 있음을 나타내는 것이다.
실험예 5: 스트랜드 타겟 사이트를 포함하는 컨스트럭트를 발현하는 stable cell line에서의 패신저 스트랜드 매개의 유전자 조절
트랜스유전자 발현에 대한 패신저 스트랜드의 조절 활성을 확인하기 위하여 miR-122-5p 또는 -3p 결합 사이트를 포함하는 리포터 유전자를 안정적으로 발현하는 Huh7 세포주를 제작하였다(도 6). gp122 3x를 안정적으로 발현하는 세포에서의 리포터 활성은 항-miR-122-5p RNA의 도입에 의해 mock transfection에 비해 12배 이상 유도되었으나, 항-miRScramble RNA에서는 그렇지 않았다(도 6a). 이와 대조적으로, pp122 3x를 안정적으로 발현하는 세포에서의 리포터 활성은 항-miR-122-3p RNA의 도입에 의해 3배 이상 유도되었으나, 항-miR-122-5p RNA 또는 항-miRScramble RNA의 도입에 의해서는 그렇지 않았다(도 6b).
상기 리포터 유전자 RNA 수준은 gp122 3x 세포에서는 항-miR-122-5p RNA에 의해 4배 이상 증가하였으나, 항-miRScramble RNA에 의해서는 그렇지 않았다(도 6c). 더욱이 리포터 유전자 RNA 수준은 pp122 3x 세포에서 항-miR-122-3p에 의해 2.5배 이상 증가하였으나, 항-miR-122-5p 또는 항-miRScramble RNA에 의해서는 그렇지 않았다(도 6d).
이러한 결과들은 가이드 스트랜드 뿐 아니라 패신저 스트랜드 역시 대응하는 스트랜드에 대한 타겟 사이트를 포함하는 트랜스유전자의 발현을 특이적으로 조절할 수 있음을 나타내는 것이다.
실험예 6: 패신저 스트랜드를 치료 유전자의 발현 조절에 적용
내재적 miRNA 가이드 스트랜드를 이용하여 치료상의 트랜스유전자를 조절하기 위한 시도가 있었다. 그러나, 내재적 가이드 스트랜드를 타겟팅하는 것은 대응하는 스트랜드에 의해 타겟이 된 내재적 유전자의 발현을 유도할 수 있어서, 세포의 부작용을 유발할 수 있다.
치료 유전자의 조절을 위해서 패신저 스트랜드를 타겟팅하는 것이 치료적으로 실행가능성이 있는지를 확인하기 위하여, 3’UTR에 miR-122-5p 또는 -3p의 타겟 사이트를 삽입하고 자살 유전자(suicide gene, herpes simplex virus thymidine kinase, HSV-TK)를 발현하는 벡터를 제작하였다(도 7a).
miR-122-5p의 타겟 유전자인 사이클린 G1의 단백질 수준은 mock-트랜스펙션된 세포에 비하여, CT-gp122 3x가 도입된 Huh7 세포에서 5배 이상 증가하였다(도 7b). 이러한 결과는 miR-122-5p 타겟 사이트를 가진 외래의 트랜스유전자의 과발현은, 내재적 miRNA 활성의 포화(saturation)로 인해 내재적 타겟 유전자의 발현에 영향을 줄 수 있으며, 예상치 못한 부작용의 원인이 될 수 있다.
반면 CT-pp122 3x 컨스트럭트를 세포에 도입하였을 때, 사이클린 G1의 발현 수준에는 영향을 미치지 않았으며, 이는 패신저 스트랜드를 타겟팅하는 것이 안정성이 증가함을 의미하는 것이다.
본 발명자들은 패신저 스트랜드를 타겟으로 하는 트랜스유전자 발현의 치료학적 유용성을 알아보기 위해 CT-gp122 3x 또는 CT-pp122 3x가 도입된 세포의 생존율을 비교하였다(도 7c). miR-122 음성의 Hep3B 세포에 CT-pp122 3x의 도입시 HSV-TK가 발현되므로, GCV(ganciclovir) 처리에 의해 CT-gp122 3×와 유사한 효능으로 Hep3B 세포의 퇴행(regression)을 야기했다. Huh7.5 세포에 CT-Scramble을 도입한 경우 HSV-TK가 발현되므로, GCV 처리에 의해 miR-122를 발현하는 Huh7.5 세포의 35%가 사멸하였다. 반면에, miR-122 양성의 Huh7.5 세포에 CT-pp122 3× 및 CT-gp122 3×을 도입한 경우, HSV-TK가 발현되지 않으므로, GCV 처리에 의해서도 Huh7.5 세포의 생존에 영향을 미치지 않았다. 이러한 결과들은 치료를 위한 트랜스유전자의 발현이 패신저 스트랜드를 타겟팅함으로써 안전하고 효과적으로 조절될 수 있음을 나타내는 것이다.
<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Dankook University <120> DNA structure for selective expression of the therapeutic gene <130> KPA141178-KR <160> 27 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-122-5p perfect forward <400> 1 ccgctcgaga caaacaccat tgtcacactc cacgatacaa acaccattgt cacactcca 59 <210> 2 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-122-5p perfect reward <400> 2 ccgctcgagt ggagtgtgac aatggtgttt gtatcgtgga gtgtgacaat ggtgtttgt 59 <210> 3 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-122-5p imperfect forward <400> 3 aacgccatta tcacactaaa taatcgaacg ccattatcac actaaata 48 <210> 4 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-122-5p imperfect reward <400> 4 aacgccatta tcacactaaa taatcgaacg ccattatcac actaaata 48 <210> 5 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-122-3p perfect forward <400> 5 ccgctcgagt atttagtgtg ataatggcgt tcgattattt agtgtgataa tggcgtt 57 <210> 6 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-122-3p perfect reward <400> 6 ccgctcgaga acgccattat cacactaaat aatcgaacgc cattatcaca ctaaata 57 <210> 7 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-122-3p imperfect forward <400> 7 tggagtgtga caatggtgtt tgtatcgtgg agtgtgacaa tggtgtttgt 50 <210> 8 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-122-3p imperfect reward <400> 8 acaaacacca ttgtcacact ccacgataca aacaccattg tcacactcca 50 <210> 9 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-Scramble forward <400> 9 ccgctcgagg tcgacggtat cgataagctt gatatcgaat tcctgcagcc cgggggattc 60 actagt 66 <210> 10 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-Scramble reward <400> 10 ccgctcgagg tcgacggtat cgaactagtg aatcccccgg gctgcaggaa ttcgatatca 60 agctta 66 <210> 11 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pre-miRNA-122 forward <400> 11 acgcgtcgac ccttagcaga gctgtggagt gtgacaatgg tgtttgtgtc taaactatca 60 60 <210> 12 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pre-miRNA-122 reward <400> 12 tgctctagag cctagcagta gctatttagt gtgataatgg cgtttgatag tttagacac 59 <210> 13 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pre-miRNA-122 mutant forward <400> 13 acgcgtcgac ccttagcaga gctgtgtgtg aggactgcgg taattgtgtc taaactatca 60 60 <210> 14 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pre-miRNA-122 mutant reward <400> 14 tgctctagag cctagcagta gctattagtg aggattgcgg taattgatag tttagacac 59 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-miR-122-5p forward <400> 15 tcgaccaaac accattgtca cactcca 27 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-miR-122-5p reward <400> 16 ctagatggag tgtgacaatg gtgtttg 27 <210> 17 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-miR-122-3p forward <400> 17 tcgactattt agtgtgataa tggcgttt 28 <210> 18 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-miR-122-3p reward <400> 18 ctagaaacgc cattatcaca ctaaatag 28 <210> 19 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> neomycin gene expression cassette forward <400> 19 cgggatcccg aattaattct gtggaatgtg tgtcagtta 39 <210> 20 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> neomycin gene expression cassette reward <400> 20 cgggatccaa gatacattga tgagtttgga ca 32 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> firefly luciferase gene binding forward <400> 21 ctgggcgtta atcagagagg 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> firefly luciferase gene binding reward <400> 22 gtgttcgtct tcgtcccagt 20 <210> 23 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Renilla luciferase gene forward <400> 23 atgacttcga aagtttatga tcca 24 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Renilla luciferase gene reward <400> 24 ataagaagag gccgcgttac 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH forward <400> 25 tgacatcaag aaggtggtga 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH reward <400> 26 tccaccaccc tgttgctgta 20 <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-122-3p target site <400> 27 tatttagtgt gataatggcg tt 22

Claims (23)

  1. i) 치료 유전자; 및
    ii) 상기 치료 유전자의 발현을 억제할 수 있는 miRNA의 패신저 스트랜드(passenger strand)의 타겟 서열을 포함하는,
    질환 세포에서 치료 유전자를 선택적으로 발현시키기 위한 DNA 구조체로서,
    상기 miRNA는 정상 세포에 존재하나, 질환세포에서는 존재하지 않거나 발현이 감소된 것인, DNA 구조체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 구조체는 치료 유전자 발현을 위한 프로모터를 포함하는 것인 DNA 구조체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 치료 유전자는 암, 염증, 심혈관 질환 또는 간 질환의 치료를 위한 것인 DNA 구조체.
  4. 제3항에 있어서, 상기 치료 유전자는 암 치료 유전자인 것인 DNA 구조체.
  5. 제4항에 있어서, 상기 암 치료 유전자는 약제감수성 유전자, 세포사멸 유전자, 세포증식 억제 유전자, 세포독성 유전자, 종양 억제인자 유전자, 항원성 유전자, 항신생 혈관 생성 유전자, 또는 사이토카인 유전자인 것인 DNA 구조체.
  6. 제5항에 있어서, 상기 약제감수성 유전자는 HSV-tk(Herpes simplex virus-thymidine kinase) 유전자 또는 대장균의 사이토신 탈아미노효소(cytosine deaminase, CD) 유전자인 것인 DNA 구조체.
  7. 제5항에 있어서, 상기 세포사멸 유전자는 p53 유전자, 아데노바이러스 E3-11.6K 유전자, 아데노바이러스 E3-10.5K 유전자, 아데노바이러스 E4 유전자, p53 경로 유전자 또는 카스파제를 코딩하는 유전자인 것인 DNA 구조체.
  8. 제5항에 있어서, 상기 세포증식 억제 유전자는 p21 유전자, 망막아세포종 유전자, E2F-Rb 융합 단백질 유전자, 사이클린-종속성 카이네이즈 억제인자를 코딩하는 유전자 p16, p15, p18 또는 p19, 또는 성장 중지 특이성 호메오박스(growth arrest specific homeobox, GAX) 유전자인 것인 DNA 구조체.
  9. 제5항에 있어서, 상기 세포독성 유전자는 슈도모나스 외독소(exotoxin), 리신 독소 또는 디프테리아 독소를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 유전자인 것인 DNA 구조체.
  10. 제5항에 있어서, 상기 종양 억제인자 유전자는 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor-α, TNF-α) 유전자, p53 유전자, APC 유전자, DPC-4/Smad4 유전자, BRCA-1 유전자, BRCA-2 유전자, WT-1 유전자, 망막아세포종 유전자, MMAC-1 유전자, 선종양 폴립증 코일 단백질(adenomatous polyposis coil protein)의 유전자, 결손된 결장 종양(DCC) 유전자, MMSC-2 유전자, NF-1 유전자, 염색체 3p21.3에 위치한 비인후 종양 억제인자 유전자, MTS1 유전자, CDK4 유전자, NF-1 유전자, NF-2 유전자 또는 VHL 유전자인 것인 DNA 구조체.
  11. 제5항에 있어서, 상기 항원성 유전자는 암태아성 항원(carcinoembryonic antigen, CEA) 유전자 또는 p53 유전자인 것인 DNA 구조체.
  12. 제5항에 있어서, 상기 항신생혈관 생성 유전자는 안지오스타틴 유전자, 혈관 내피 성장 인자(VEGF)의 억제 인자 유전자 또는 엔도스타틴 유전자인 것인 DNA 구조체.
  13. 제5항에 있어서, 상기 사이토카인 유전자는 GM-CSF 유전자, IL-1 유전자, IL-2 유전자, IL-4 유전자, IL-12 유전자, IL-10 유전자, IL-19 유전자, IL-20 유전자, 인터페론 α 유전자, 인터페론 β 유전자 또는 인터페론 γ 유전자인 것인 DNA 구조체.
  14. 제1항에 있어서, 상기 miRNA의 패신저 스트랜드의 타겟 서열은 치료 유전자의 3'비번역 영역(UTR) 에 포함된 것인 DNA 구조체.
  15. 제14항에 있어서, 상기 타겟 서열을 2 카피(copy) 이상 포함하는 것인 DNA 구조체.
  16. 제1항에 있어서, 상기 miRNA는 정상 세포에서는 발현되나, 암, 염증, 심혈관 질환 또는 간 질환이 있는 세포에서는 발현되지 않거나 발현이 감소되는 것인 DNA 구조체.
  17. 제16항에 있어서, 상기 miRNA는 miRNA-122인 것인 DNA 구조체.
  18. 제17항에 있어서, 상기 miRNA-122의 패신저 스트랜드의 타겟 서열은 서열번호 27의 염기서열을 갖는 것인 DNA 구조체.
  19. 제2항에 있어서, 상기 프로모터는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터인 것인 DNA 구조체.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 DNA 구조체를 유효성분으로 포함하는, 질환 세포에서 치료 유전자를 선택적으로 발현시키는 제제.
  21. 제20항에 있어서, 상기 제제는 정상 세포에서는 세포 독성을 갖지 않는 것인 제제.
  22. 삭제
  23. 삭제
KR1020150024366A 2015-02-17 2015-02-17 치료 유전자의 선택적 발현을 위한 dna 구조체 KR101673071B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020150024366A KR101673071B1 (ko) 2015-02-17 2015-02-17 치료 유전자의 선택적 발현을 위한 dna 구조체

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020150024366A KR101673071B1 (ko) 2015-02-17 2015-02-17 치료 유전자의 선택적 발현을 위한 dna 구조체

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20160101806A KR20160101806A (ko) 2016-08-26
KR101673071B1 true KR101673071B1 (ko) 2016-11-07

Family

ID=56885811

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020150024366A KR101673071B1 (ko) 2015-02-17 2015-02-17 치료 유전자의 선택적 발현을 위한 dna 구조체

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101673071B1 (ko)

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101478869B1 (ko) * 2011-05-26 2015-01-06 단국대학교 산학협력단 마이크로ｒｎａ를 이용한 조절을 통한 암 특이적 유전자 치료제

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Mol. Ther. 2008, Vol. 16, pp. 1719-1726.
Nat Med. 2006, Vol. 12, pp. 585-591.
Nucleic Acids Research, 2013, 1-17*

Also Published As

Publication number Publication date
KR20160101806A (ko) 2016-08-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Morfoisse et al. Hypoxia induces VEGF-C expression in metastatic tumor cells via a HIF-1α-independent translation-mediated mechanism
ES2739804T3 (es) Compuestos terapéuticos
EP3512567B1 (en) Cell-specific expression of modrna
US20110256524A1 (en) Recombinant adenovirus comprising tissue-specific promoter and tumor-targeting trans-splicing ribozyme and uses thereof
KR101478869B1 (ko) 마이크로ｒｎａ를 이용한 조절을 통한 암 특이적 유전자 치료제
US9422559B2 (en) Production and utilization of a novel anti-cancer drug in therapy
JP2011507554A (ja) 遺伝子発現を増加させるための方法および組成物
KR20140065132A (ko) 안전성 및 항암활성이 증가된 재조합 아데노바이러스 및 이의 용도
JP5645044B2 (ja) 遺伝子発現制御機構を含む新規Ａｄベクター
JP2020146033A (ja) 癌特異的トランス−スプライシングリボザイム及びその用途
KR101500804B1 (ko) Ａｉｍｐ２ 유전자의 스플라이싱 변이체 특이적인 트랜스-스플라이싱 활성을 갖는 핵산 분자 및 이를 이용한 폐암 치료용 약학 조성물 및 폐암 진단용 조성물
Kim et al. Therapeutic efficacy of modified anti-miR21 in metastatic prostate cancer
de Solis et al. Viral delivery of shRNA to amygdala neurons leads to neurotoxicity and deficits in Pavlovian fear conditioning
KR101673071B1 (ko) 치료 유전자의 선택적 발현을 위한 dna 구조체
US20100186102A1 (en) Methods and compositions for post-transcriptional gene silencing
WO2015025940A1 (ja) 新規アデノウイルス及びその増殖促進方法
CN111996259B (zh) 微小RNA-3677-3p在医学和诊断学领域中的应用
KR102471898B1 (ko) 면역관문 억제제를 발현하는 암 특이적 트랜스-스플라이싱 리보자임 및 이의 용도
JP5812361B2 (ja) 遺伝子発現制御機構を含む新規Ａｄベクター
EP3344768B1 (en) Micrornas for the treatment of heart diseases
Cho et al. Identification of pathogenic microRNAs in Helicobacter pylori-associated gastric cancer using a combined approach of animal study and clinical sample analysis
Patil Developing microRNA-509-3p as an inhibitor of metastatic progression and cisplatin sensitizer for osteosarcoma
da Costa MicroRnas as Molecular Targets for Non-Viral Gene Therapy of Glioblastoma: Development of a Lipid-Based Nanosystem for Nucleic Acid Delivery to Brain Tumor Cells
Pleasant Targeting Expression of an Oncogene by Splicing Interference (SPLICEi) in Human Mammary Carcinoma Cell Culture Model

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190925

Year of fee payment: 4