CN109477070A - 改进的分化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及祖细胞(例如哺乳动物上皮干细胞)的分化方法，用于所述方法的分化培养基，可通过所述方法获得的类器官和细胞及其用途(包括治疗用途)。

Description

改进的分化方法
本文引用的所有文件均通过引用整体并入。
技术领域
本发明属于细胞培养基和方法，特别是用于分化祖细胞(例如人上皮干细胞)的培养基和方法领域。
发明背景
人们对用于分化祖细胞的培养基和方法非常感兴趣。可以将祖细胞及其分化子代用于细胞分析、药物筛选和毒性分析。祖细胞及其分化子代还显示出用于基于细胞的疗法的前景，如在用于治疗受损组织的再生医学方面。此外，有效的细胞培养基对于提供并维持细胞群以用于研究目的是重要的。
已经描述了用于来源于数种组织(例如胰腺、结肠、肠隐窝、胃、肝和前列腺)的祖细胞或组织碎片的长期培养的方法(参见WO201 0/090513、WO2012/014076、WO2012/168930和WO 2015/173425)。需要改进的培养基和方法，其导致更高的祖细胞分化效率和更接近地反映体内相应细胞类型的分化细胞的产生。
发明概述
本发明提供了分化祖细胞的方法，其中所述方法包括：
在分化培养基中培养所述细胞，所述分化培养基包含基础培养基和一种或多种受体酪氨酸激酶配体、Notch抑制剂、糖皮质激素、TGF-β抑制剂和一种或多种Wnt抑制剂。
本发明还提供了分化祖细胞的方法，其中所述方法包括：
在分化培养基中培养所述细胞，所述分化培养基包含基础培养基和一种或多种受体酪氨酸激酶配体、Notch抑制剂、糖皮质激素、TGF-β抑制剂以及GSK-3抑制剂。
本发明还提供了分化祖细胞的方法，其中所述方法包括：
在分化培养基中培养所述细胞，所述分化培养基包含基础培养基和一种或多种受体酪氨酸激酶配体、Notch抑制剂、糖皮质激素、TGF-β抑制剂以及AP-1刺激剂。
本发明还提供了培养上皮干细胞，优选地以获得类器官的方法，其中所述方法包括：
在扩增培养基存在下，培养与细胞外基质接触的一种或多种上皮干细胞；优选地，其中所述扩增培养基包含基础培养基，并且还包含：一种或多种受体酪氨酸激酶配体、一种或多种Wnt激动剂、TGF-β抑制剂和cAMP通路激活剂；和
在本发明的分化培养基中培养一种或多种扩增的上皮干细胞。
本发明还提供了培养肝脏上皮干细胞，优选地以获得分化的肝脏类器官的方法，并且其中所述方法包括：
在扩增培养基存在下，培养与细胞外基质接触的一种或多种肝脏上皮干细胞；优选地，其中所述扩增培养基包含基础培养基，并且还包含：EGF、FGF10、HGF、Wnt激动剂(例如Rspondin)、烟酰胺、TGF-β抑制剂、毛喉素和胃泌素；以及随后
在本发明的分化培养基存在下，培养与细胞外基质接触的一种或多种扩增的肝脏上皮干细胞。
本发明还提供了通过本发明的方法可获得的或获得的类器官。
本发明还提供了类器官，其中至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少99％的细胞表达肝细胞标志物。
本发明还提供了本发明的类器官或来源于所述类器官的细胞，其用于医学中的用途。
本发明还提供了本发明的类器官或来源于所述类器官的细胞在下述中的用途：药物发现筛选；毒性分析；诊断；组织胚胎学、细胞谱系和分化途径的研究；包括重组基因表达的基因表达研究；组织损伤和修复中涉及的机制的研究；炎性和传染性疾病的研究；发病机制研究；或者细胞转化和癌症病因机制的研究。
本发明还提供了药物制剂，其包含一种或多种受体酪氨酸激酶配体、Notch抑制剂、糖皮质激素、TGF-β抑制剂、Wnt通路抑制剂、GSK-3β抑制剂和AP-1刺激剂。
筛选治疗性或预防性药物或化妆品的方法，其中所述方法包括：
使本发明的分化的类器官与候选分子(或候选分子库)接触，
评估所述类器官的任何影响(例如细胞中的任何变化，如增殖的减少或丧失、形态变化和/或细胞死亡)或类器官中的变化(例如器官大小或运动性)；
将导致所述影响的候选分子鉴定为潜在的药物或化妆品；并且任选地
将所述候选分子制备为药物或化妆品。
发明详述
先前已在WO2010/090513、WO2012/014076、WO2012/168930和WO2015/173425中描述了分化来自多种组织的祖细胞的方法。本发明的发明人惊奇地发现，向培养基中添加Wnt抑制剂改善了祖细胞的分化，例如如使用肝脏细胞所示(参见实施例1)。例如，向培养基中添加Wnt抑制剂可以导致类器官中较高比例的细胞群的分化。此外，添加Wnt抑制剂可以导致分化的类器官中的细胞更类似于在体内的分化的细胞(例如肝细胞)。例如，在肝脏细胞情境下，更高水平的Cyp3A4表达。这是令人惊讶的，因为帕内特细胞分化需要Wnt并且成熟肝细胞具有有效的Wnt信号转导(参见例如，Farin等人(2012)Gastroenterology 143：1518-1529；Yang等人(2014)Hepatology 60(3)：964-976以及Gerbal Chaloin等人(2014)Molecular Pharmacology 86：624 634)。因此，令人惊讶的是，通过阻断该通路可能改善分化。本发明的发明人已经显示在任何水平阻断该通路都是有用的，如阻断Wnt分泌或抑制β-连环蛋白靶基因表达(参见“Wnt抑制剂”下的进一步评论)。因此，本发明提供了Wnt抑制剂在分化祖细胞(例如肝脏上皮干细胞)中的用途。
本发明的发明人还出乎意料地发现，向分化培养基中添加GSK-3抑制剂具有有利的影响。例如，它促进祖细胞的分化。例如，向培养基中添加GSK-3抑制剂可以导致类器官中较高比例的细胞群的分化。此外，添加GSK-3抑制剂可以导致分化的类器官中的细胞更类似于在体内的分化的细胞(例如肝细胞)。因此，本发明提供了GSK-3抑制剂在分化祖细胞(例如肝脏上皮干细胞)中的用途。通过包含作用于β-连环蛋白破坏复合物下游的Wnt抑制剂，增强了与向分化培养基中添加GSK-3抑制剂相关的有利影响。这是令人惊讶的，因为已知GSK-3抑制剂是Wnt激动剂，其先前已被用于培养基中以扩增而非分化祖细胞(例如参见WO2010/090513)。此外，组合使用Wnt抑制剂和Wnt激动剂并不是显而易见的。因此，本发明提供了GSK-3抑制剂与作用于β-连环蛋白破坏复合物的下游的Wnt抑制剂的组合在分化祖细胞(例如肝脏上皮干细胞)中的用途。
AP-1是由Jun和Fos基因家族的产物组成的二聚转录因子。本发明的发明人惊奇地发现向分化培养基中添加AP-1刺激剂(如毒蕈碱乙酰胆碱受体激动剂)具有有利的影响。例如，它促进祖细胞的分化。例如，向培养基中添加AP-1刺激剂(如毒蕈碱乙酰胆碱受体激动剂)可以导致类器官中较高比例的细胞群的分化。此外，添加AP-1刺激剂可以导致分化的类器官中的细胞更类似于在体内的分化的细胞(例如肝细胞)。这是令人惊讶的，因为先前认为AP-1与增殖相关，如肝脏再生期间的肝细胞增殖(参见例如，Stepniak等人，2006)。确实，先前报道AP-1在肝癌发生期间作为致癌基因起作用(参见例如，Trierweiler等人(2015)Cell Death and Differentiation 1-7)。因此，发明人观察到AP-1刺激剂可以促进分化是非常出乎意料的。因此，本发明提供了AP-1刺激剂在分化祖细胞(例如肝脏上皮干细胞)中的用途。本发明还提供了毒蕈碱乙酰胆碱受体激动剂在分化祖细胞(例如肝脏上皮干细胞)中的用途。
本发明的发明人还出乎意料地发现，在分化培养基中培养祖细胞之前分离祖细胞培养物具有有利的影响。例如，它促进祖细胞的分化。例如，在分化培养基中培养它们之前分离祖细胞可以导致类器官中较高比例的细胞群的分化。此外，在分化培养基中培养祖细胞之前分离祖细胞培养物可以导致分化的类器官中的细胞更类似于在体内的分化的细胞(例如肝细胞)。
发明人表明，对分化方法的这些改进是相加的，因此当培养基包含Wnt抑制剂、GSK-3抑制剂和AP-1刺激剂中的两种或更多种的组合时，和/或当在分化之前分离祖细胞的培养物时，分化方法得到最大改进。
因此，提供了分化祖细胞的方法，其中所述方法包括在分化培养基中培养一种或多种祖细胞，所述分化培养基包含基础培养基并且还包含：(a)一种或多种Wnt抑制剂，(b)一种或多种GSK-3抑制剂(并且优选作用于β-连环蛋白破坏复合物下游的一种或多种Wnt抑制剂)和/或(c)一种或多种AP-1刺激剂(例如一种或多种毒蕈碱乙酰胆碱受体激动剂)。分化培养基是本发明的分化培养基。例如，在一个实施方案中，分化培养基包含基础培养基并且还包含一种或多种Wnt抑制剂(例如Wnt分泌抑制剂(如IWP-2)和/或TCF/LEF的抑制剂(如iCRT3))。在另一实施方案中，分化培养基包含基础培养基并且还包含一种或多种GSK-3抑制剂(例如CHIR99021)，和优选作用于β-连环蛋白破坏复合物下游的一种或多种Wnt抑制剂(例如iCRT3)。在另一实施方案中，分化培养基包含基础培养基并且还包含一种或多种AP-1刺激剂(例如卡巴胆碱)。这些实施方案在技术上是兼容的并且可以以任何方式组合。
在优选实施方案中，除了上述一种或多种组分外，本发明的分化培养基还包含以下列出的一种或多种，优选所有组分：一种或多种受体酪氨酸激酶配体(例如EGF、HGF和/或FGF19)、Notch抑制剂(例如DAPT)、糖皮质激素(例如地塞米松)和TGF-β抑制剂(例如ALK5、ALK4或ALK7抑制剂，如A83-01)。分化培养基任选地还包含BMP通路激活剂(例如BMP7)和/或胃泌素。分化培养基任选地被补充有N-乙酰半胱氨酸、B27和/或N2。在一些实施方案中，本发明的分化培养基包含缓冲剂(例如HEPES)。在优选的实施方案中，基础培养基是改良型DMEM/F12(Gibco)。
本发明的分化培养基特别有利于分化肝脏祖细胞(例如肝脏上皮干细胞)，例如如实施例1中所示。预期该分化培养基对于与肝脏密切相关的组织(如胰腺)以及其它上皮组织也是有利的。以下详细描述分化培养基的每种组分。
在一些实施方案中，该方法还包括扩增步骤，其中在随后在本发明的分化培养基中培养之前，首先将祖细胞(例如上皮干细胞)在扩增培养基中培养。因此，提供了培养祖细胞的方法，其中所述方法包括(a)在扩增培养基中培养一种或多种祖细胞以获得扩增的祖细胞群(优选扩增类器官(expansion organoid))，和(b)在本发明的分化培养基中培养扩增的祖细胞群或扩增类器官，以获得分化的祖细胞群(优选分化类器官(differentiationorganoid))。
还提供了培养祖细胞(例如上皮干细胞)的方法，其中所述方法包括在分化培养基存在下培养之前，分离祖细胞培养物。在一些实施方案中，该方法还包括扩增步骤，其中在分离细胞之前，将祖细胞在扩增培养基中培养，然后在本发明的分化培养基中培养。例如，提供了培养祖细胞的方法，其中所述方法包括(a)在扩增培养基中培养一种或多种祖细胞以获得扩增的祖细胞群(优选扩增类器官)，(b)分离扩增的祖细胞群或扩增类器官以获得分离的祖细胞，和(c)在分化培养基中培养一种或多种分离的祖细胞以获得分化的祖细胞群(优选分化类器官)。所用的分化培养基优选地是如本文所述的本发明的分化培养基。在分化之前分离培养物的有利影响被认为与以下事实相关：它导致更完全地移除任何先前的培养基(例如扩增培养基)；和/或，当培养上皮类器官时，在分化前分离导致类器官大小减小，这可能导致细胞更好地接近分化培养基中的分化因子。因此，在一些实施方案中，本发明的分化方法还包括在分化之前移除任何先前培养基(例如移除扩增培养基)的步骤。这可以通过分离培养物和/或通过本领域已知的任何其它方法来实现。在一些实施方案中，提供了培养祖细胞的方法，其中所述方法包括(a)在第一培养基(例如扩增培养基)中培养一种或多种祖细胞，(b)移除第一培养基，例如通过分离细胞，和(c)在分化培养基中培养一种或多种祖细胞以获得分化的祖细胞群(优选分化类器官)。
可以在分化之前使用适合于上皮细胞的任何扩增培养基。在优选的实施方案中，使用的扩增培养基是WO2010/090513、WO2012/014076、WO2012/168930或WO2015/173425中描述的任何扩增培养基。
因此，还提供了分化培养基，其包含一种或多种Wnt抑制剂(例如1、2、3、4种或多于4种)、一种或多种受体酪氨酸激酶配体(例如1、2、3、4种或多于4种)、Notch抑制剂、糖皮质激素和TGF-β抑制剂。
因此，还提供了分化培养基，其包含一种或多种GSK-3抑制剂(例如1、2、3、4种或多于4种)、一种或多种受体酪氨酸激酶配体(例如1、2、3、4种或多于4种)、Notch抑制剂、糖皮质激素和TGF-β抑制剂。在一些实施方案中，所述培养基还包含作用于β-连环蛋白破坏复合物下游的Wnt抑制剂。
因此，还提供了分化培养基，其包含一种或多种AP-1刺激剂(例如1、2、3、4种或多于4种)、一种或多种受体酪氨酸激酶配体(例如1、2、3、4种或多于4种)、Notch抑制剂、糖皮质激素和TGF-β抑制剂。在一些实施方案中，所述一种或多种AP-1刺激剂包含一种或多种毒蕈碱乙酰胆碱受体激动剂。
在一些实施方案中，分化培养基包含一种或多种GSK-3抑制剂(例如1、2、3、4种或多于4种)、包含作用于β-连环蛋白破坏复合物下游的Wnt抑制剂的一种或多种Wnt抑制剂(例如1、2、3、4种或多于4种)、一种或多种AP-1刺激剂(例如1、2、3、4种或多于4种)、一种或多种受体酪氨酸激酶配体(例如1、2、3、4种或多于4种)、Notch抑制剂、糖皮质激素和TGF-β抑制剂，所述Wnt抑制剂包括作用于β-连环蛋白破坏复合物下游的Wnt抑制剂。
在一些实施方案中，一种或多种GSK-3抑制剂包含CHIR99021。在一些实施方案中，一种或多种Wnt抑制剂包含Wnt分泌抑制剂(例如IWP-2)和β-连环蛋白靶基因表达的抑制剂(例如β-连环蛋白：TCF/Lef转录复合物的抑制剂，如iCRT3)。在一些实施方案中，一种或多种AP-1刺激剂包含一种或多种毒蕈碱乙酰胆碱受体激动剂(如卡巴胆碱)。在一些实施方案中，一种或多种受体酪氨酸激酶配体包含EGF、HGF和/或FGF(例如FGF19)。在一些实施方案中，Notch抑制剂是DAPT。在一些实施方案中，糖皮质激素是地塞米松。在一些实施方案中，TGF-β抑制剂是A83-01。
在一些实施方案中，分化培养基还包含BMP通路激活剂(如BMP7)。
在一些实施方案中，分化培养基还包含胃泌素。
在一些实施方案中，分化培养基还包含N-乙酰半胱氨酸。在一些实施方案中，分化培养基还包含B27，优选不含维生素A的B27。在一些实施方案中，分化培养基还包含N2。在一些实施方案中，分化培养基还包含用于动物或人细胞的基础培养基，其为改良型DMEM/F12(Gibco)。
因此，本发明提供了Wnt抑制剂、GSK-3抑制剂和/或AP-1刺激剂在分化祖细胞中的用途。在一些实施方案中，祖细胞(例如上皮干细胞)来自肝脏、胰腺、肠、胃、前列腺、乳腺、卵巢、唾液腺、毛囊、皮肤、食道、耳朵、膀胱或甲状腺。在一些实施方案中，祖细胞来自肝脏或胰腺。在一些实施方案中，上皮细胞来自肝脏。
本发明还提供了使用分化上皮干细胞的方法，其使用如WO2010/090513、WO2012/014076、WO2012/168930或WO2015/173425中所述的分化培养基，其中向所述分化培养基中添加至少一种(例如1、2、3、4种或多于4种)Wnt抑制剂、至少一种(例如1、2、3、4种或多于4种)GSK-3抑制剂，和/或至少一种(例如1、2、3、4种或多于4种)AP-1刺激剂。
下面详细讨论本发明的多个实施方案及其组分。如技术人员将会理解的，这些实施方案中的任何方案在技术上是兼容的并且可以将它们的组分进行组合。
Wnt抑制剂
当被激活时，Wnt信号转导通路通常阻止β-连环蛋白降解并增强β-连环蛋白介导的信号转导。该通路由当包含卷曲蛋白受体和LRP5/6的细胞表面Wnt受体复合物被激活时发生的一系列事件所限定，所述激活通常通过细胞外信号转导分子(如Wnt家族成员)进行。这导致蓬乱蛋白家族蛋白的激活，其抑制降解细胞内β-连环蛋白的蛋白质的破坏复合物。破坏复合物由招募酪蛋白激酶CK1α、δ和ε以及GSK-3的结构组分(包括APC和轴蛋白)形成。破坏复合物被认为使β-连环蛋白磷酸化并将其暴露于泛素连接酶β-TrCP。然后β-连环蛋白的泛素化导致其在蛋白酶体中降解。
β-连环蛋白的主要效应功能在细胞核中，其中它通过与多种转录因子的相互作用调节转录，所述转录因子包括TCF/LEF家族转录因子(例如Tcf-1、Tcf-3、Tcf-4和Lef1)。
Wnt通路受到高度调控。例如，当Rspondin与其受体(Lgr4、Lgr5和/或Lgr6)结合时，Wnt信号转导被增强。然而，已经显示两种跨膜E3泛素连接酶Rnf43和Znrf3从细胞表面移除Rspondin受体(例如Lgr4、Lgr5和/或Lgr6)(参见例如de Lau等人，2016)。Rspondin是脊椎动物特异性的Wnt增强剂。此外，可以通过Dapper家族蛋白(例如Dapper1和Dapper3)抑制蓬乱蛋白家族蛋白与卷曲蛋白受体的结合。此外，破坏复合物的活性被认为部分受APC、轴蛋白和GSK-3的磷酸化状态的调节。例如，磷酸酶(例如丝氨酸/苏氨酸磷酸酶，如PP1、PP2C或PP2A)对APC或轴蛋白的去磷酸化可以抑制β-连环蛋白的降解。此外，激酶(例如p38MAPK、PKA、PKB、PKC、p90RSK或p70S6K)对GSK-3的磷酸化可以抑制GSK-3的活性，并因此抑制β-连环蛋白的降解。
破坏复合物的稳定性被认为部分受到两种PARP，端锚聚合酶1和2的调节。这些端锚聚合酶对轴蛋白的聚(ADP-核糖基)化和自身聚(ADP-核糖基)化可以促进破坏复合物的去寡聚化。
在细胞核中，蓬乱蛋白家族蛋白质可以与组蛋白脱乙酰酶SIRT1形成复合物，所述组蛋白脱乙酰酶SIRT1支持Wnt靶基因的转录。
被认为对Wnt分泌关键的蛋白质是多通道膜蛋白Porcupine(Porc)，其丧失导致Wnt在内质网中积聚。
可以在许多水平上抑制Wnt信号转导通路，并且在Voronkov和Krauss(2013)Current Pharmaceutical Design 19：634 664中详细综述了Wnt抑制剂。
Wnt抑制剂被限定为抑制细胞或细胞群中TCF/LEF介导的转录的试剂。因此，适用于本发明的Wnt抑制剂包括：
(1)Wnt分泌抑制剂(例如Porc的抑制剂，如LGK974、IWP-1或IWP-2)，
(2)Wnt或Rspondin与它们各自受体之间相互作用的竞争性和非竞争性抑制剂(例如OMP-18R5、OMP54F28)，
(3)促进Wnt受体复合物的组分降解的因子如LRP(例如氯硝柳胺)，和促进Rspondin受体降解的因子如Znrf3和/或Rnf43，或者激活Znrf3和/或Rnf43的因子，
(4)蓬乱蛋白家族蛋白抑制剂，如减少蓬乱蛋白家族蛋白与卷曲蛋白受体和/或破坏复合物组分的结合的抑制剂(例如Dapper家族蛋白、FJ9、舒林酸、3289-8625，J01-017a、NSC668036)或者下调蓬乱蛋白家族蛋白的表达的抑制剂(例如氯硝柳胺)，
(5)促进破坏复合物活性的因子，包括(a)使破坏复合物的组分(如轴蛋白和/或APC)去磷酸化的磷酸酶(例如PP1、PP2A和/或PP2C)的抑制剂(例如冈田酸或变构霉素(tautomycin))和(b)使GSK-3磷酸化的激酶(例如p38MAPK、PKA、PKB、PKC、p90RSK或p70S6K)的抑制剂(例如SB239063、SB203580或Rp-8-Br-cAMP)，
(6)破坏复合物去寡聚化的抑制剂，如端锚聚合酶1和/或2的抑制剂(例如XAV939、IWR1、JW74、JW55、2-[4-(4-氟苯基)哌嗪-1-基]-6-甲基嘧啶-4(3H)-酮或PJ34)，以及
(7)β-连环蛋白靶基因表达的抑制剂，包括β-连环蛋白：TCF/Lef转录复合物的抑制剂，如破坏β-连环蛋白：TCF-4复合物的抑制剂(例如iCRT3、CGP049090、PKF118310、PKF115-584、ZTM000990、PNU-74654、BC21、iCRT5、iCRT14或FH535)和组蛋白脱乙酰酶SIRT1的抑制剂(例如cambinol)。
发明人惊奇地发现，在分化培养基中包含Wnt抑制剂可以增强上皮干细胞的分化。例如，发明人发现在分化培养基中包含Wnt分泌抑制剂(IWP-2)增加了肝脏类器官中肝细胞标志物(例如白蛋白和cyp3A4)的表达(参见图2D)。相反，他们发现向分化培养基中添加Wnt导致白蛋白的表达降低(参见图2C)。该观察特别令人惊讶，因为发明人发现不存在Wnt激动剂不足以实现这些有利影响，需要对Wnt通路进行主动抑制。这非常出乎意料，因为一些细胞类型(例如帕内特细胞)需要体内自分泌Wnt通路信号转导才能存活。
因此，本发明的分化培养基优选包含Wnt抑制剂。可以如以上(1)-(7)中所述使用任何合适的Wnt抑制剂。例如，在一个优选的实施方案中，Wnt抑制剂是Wnt分泌抑制剂，如Porc抑制剂(例如选自IWP-2、IWP-1和LGK974)。在另一个优选的实施方案中，Wnt抑制剂是β-连环蛋白靶基因表达的抑制剂，例如β-连环蛋白：TCF/Lef转录复合物的抑制剂或组蛋白脱乙酰酶SIRT1的抑制剂(例如cambinol)。在一些实施方案中，β-连环蛋白：TCF/Lef转录复合物的抑制剂是破坏β-连环蛋白：TCF-4复合物的抑制剂，例如选自以下的抑制剂：iCRT3、CGP049090、PKF118310、PKF115-584、ZTM000990、PNU-74654、BC21、iCRT5、iCRT14和FH535。
在一些实施方案中，Wnt抑制剂选自：IWP-2、OMP-18R5、OMP54F28、LGK974、3289-8625、FJ9、NSC 668036、IWR1和XAV939。
在一些实施方案中，Wnt抑制剂选自：iCRT3、PFK115-584、CGP049090、iCRT5、iCRT14和FH535。
在一些实施方案中，Wnt抑制剂是以下表1中列出的化合物之一。
表1-Wnt抑制剂
在一些实施方案中，本发明的分化培养基包含表1中列出的任何Wnt抑制剂中的一种或多种。
优选向培养基中添加一定量的Wnt抑制剂，如在相同细胞类型中所评估的，相对于所述分子不存在的情况下所述Wnt活性的水平，所述量有效抑制细胞中至少10％，更优选至少20％，更优选至少30％，更优选至少50％，更优选至少70％，更优选至少90％，更优选100％的Wnt活性。如技术人员已知的，可以通过测量Wnt的转录活性来确定Wnt活性，例如通过pTOPFLASH和pFOPFLASH Tcf荧光素酶报告基因构建体(Korinek等人，1997.Science275：1784-1787)。因此，技术人员可以使用本领域已知的分析容易地鉴定新的Wnt抑制剂。
在一些实施方案中，本发明的分化培养基包含以下浓度的Wnt抑制剂：0.01-150μM、0.1-150μM、0.5-100μM、0.1-100μM、0.5-50μM、1-100μM或10-80μM、1-20μM或者1-5μM。
在一些实施方案中，本发明的分化培养基包含以下浓度的IWP-2：0.01-150μM、0.1-100μM、0.5-50μM、1-20μM或者1-5μM。例如，在一些实施方案中，本发明的分化培养基包含浓度为约3μM的IWP-2。
在一些实施方案中，本发明的分化培养基包含以下浓度的iCRT3：0.05-150μM、0.1-150μM、0.5-100μM、1-100μM或者10-80μM。例如，在一些实施方案中，本发明的分化培养基包含浓度为约50μM的iCRT3。在一些实施方案中，本发明的分化培养基还包含以下浓度的IWP-2：0.01-150μM、0.1-100μM、0.5-50μM、1-20μM、1-5μM或者约3μM。例如，在一些实施方案中，本发明的分化培养基包含浓度为约50μM的iCRT3和浓度为约3μM的IWP-2。
在一些实施方案中，分化培养基不包含结合并激活Wnt受体复合物的Wnt激动剂，包括任何和所有Wnt家族蛋白和Rspondin。
GSK-3抑制剂
如以上所讨论的，发明人惊奇地发现在分化培养基中包含Wnt抑制剂可以增强上皮干细胞的分化。出乎意料的是，发明人还发现包含GSK-3抑制剂(实施例1中的CHIR99021)也改善了上皮干细胞的分化。如上所述，GSK-3是β-连环蛋白破坏复合物的组分。抑制GSK-3活性导致β-连环蛋白的破坏减少，并因此GSK-3抑制剂是Wnt激动剂。通过添加抑制破坏复合物下游TCF/LEF介导的转录的Wnt抑制剂(iCRT3)，极大地增加了通过分化培养基中包含GSK-3抑制剂所引起的增强的分化(参见图2E)。因此，发明人发现，当分化培养基中包括Wnt激动剂(CHIR99021)和Wnt抑制剂(iCRT3)两者时，肝细胞标志物(白蛋白和Cyp3A4)的表达显著提高。在不希望受任何理论束缚的情况下，发明人认为GSK-3抑制剂刺激并抑制上皮干细胞的分化(其中刺激比抑制强)。通过GSK-3抑制剂抑制分化被认为经由促进β-连环蛋白的破坏而发生。相反，通过GSK-3抑制剂促进分化被认为是通过不同的效应机制发生的。因此，发明人认为，在含有GSK-3抑制剂的分化培养基中包含抑制破坏复合物下游TCF/LEF介导的转录的Wnt抑制剂中和了GSK-3抑制剂的分化抑制作用。作用于破坏复合物下游的Wnt抑制剂包括上述第(7)类中的Wnt抑制剂，即β-连环蛋白靶基因表达的抑制剂，包括β-连环蛋白：TCF/Lef转录复合物的抑制剂，如破坏β-连环蛋白：TCF-4复合物的抑制剂(例如iCRT3、CGP049090、PKF118310、PKF115-584、ZTM000990、PNU-74654、BC21、iCRT5、iCRT14或FH535)和组蛋白脱乙酰酶SIRT1的抑制剂(例如cambinol)。
因此，GSK-3抑制剂的分化促进作用保持不受影响，并且通过Wnt抑制剂的分化促进作用而增加。
因此，在一些实施方案中，本发明的分化培养基包含GSK-3抑制剂。可以使用任何合适的GSK-3抑制剂。GSK-3抑制剂被限定为降低GSK-3激酶活性的试剂。
在人类中发现了两种不同的GSK-3同种型(GSK-3α和GSK-3β)。已知抑制剂抑制这些同种型中的一种或两种。因此，在一些实施方案中，GSK-3抑制剂抑制GSK-3α和GSK-3β。在一些实施方案中，GSK-3抑制剂抑制GSK-3α但不抑制GSK-3β。在一些实施方案中，GSK-3抑制剂抑制GSK-3β但不抑制GSK-3α。
在一些实施方案中，分化培养基包含多于一种的GSK-3抑制剂(例如两种、三种、四种、五种或更多种GSK-3抑制剂)。
在一些实施方案中，GSK-3抑制剂是CHIR99021。
优选向培养基中添加一定量的GSK-3抑制剂，如在相同细胞类型中所评估的，相对于所述分子不存在的情况下所述GSK-3活性的水平，所述量有效抑制细胞中至少10％，更优选至少20％，更优选至少30％，更优选至少50％，更优选至少70％，更优选至少90％，更优选100％的GSK-3活性。如技术人员已知的，可以通过监测特定GSK-3底物(例如β-连环蛋白)的磷酸化来测量GSK-3活性(参见例如，Cole等人(2008)Methods Mol Biol.468：45-65)。因此，技术人员可以使用本领域已知的分析容易地鉴定新的GSK-3抑制剂。
在一些实施方案中，GSK-3抑制剂选自以下中的一种或多种：CHIR99201、6-BIO、Dibromocantharelline、海门地塞(Hymenialdesine)、靛玉红(Indirubins)、Meridianins、CT98014、CT98023、CT99021、TWS119、SB-216763、SB-41528、AR-A014418、AZD-1080、阿特波龙(Alsterpaullone)、Cazpaullone、肯帕罗酮(Kenpaullone)、Aloisines、Manzamine A、Palinurine、Tricantine、TDZD-8、NP00111、NP031115、Tideglusib、HMK-32和L803-mts。
在一些实施方案中，本发明的分化培养基包含以下浓度的GSK-3抑制剂：0.001-500μM、0.01-150μM、0.1-100μM、1-100μM、0.5-50μM、1-50μM、1-20μM或者1-5μM。
在一些实施方案中，本发明的分化培养基包含以下浓度的CHIR99021：0.01-150μL、0.1-100μM、1-100μM、0.5-50μM、1-50μM、1-20μM或者1-5μM。例如，在一些实施方案中，本发明的分化培养基包含浓度为约3μM的CHIR99021。
在一些实施方案中，本发明的分化培养基包含GSK-3抑制剂和作用于破坏复合物下游的Wnt抑制剂(如如前所述的β-连环蛋白靶基因表达的抑制剂)。例如，在一些实施方案中，本发明的分化培养基包含GSK-3抑制剂和β-连环蛋白靶基因表达的抑制剂。β-连环蛋白靶基因表达的抑制剂包括β-连环蛋白：TCF/Lef转录复合物的抑制剂，如破坏β-连环蛋白：TCF-4复合物的抑制剂(例如iCRT3、CGP049090、PKF118310、PKF115-584、ZTM000990、PNU-74654或BC21)和组蛋白脱乙酰酶SIRT1的抑制剂(例如cambinol)。
因此，在一些实施方案中，本发明的分化培养基包含GSK-3抑制剂(例如浓度为0.001-500μM、0.01-150μM、0.1-100μM、0.5-50μM、1-20μM或者1-5μM)和β-连环蛋白靶基因表达的抑制剂(例如浓度为0.001-500μM、0.01-150μM、0.1-100μM、0.5-50μM、1-500μM、1-150μM、1-100μM、1-50μM、1 20μM或者1-5μM)。在一些实施方案中，β-连环蛋白靶基因表达的抑制剂是β-连环蛋白：TCF/Lef转录复合物的抑制剂。
因此，在一些实施方案中，本发明的分化培养基包含CHIR99021(例如浓度为0.01-150μM、0.1-100μM、0.5-50μM、1-20μM或者1-5μM)和iCRT3(例如浓度为0.05-150μM、0.1-150μM、1-150μM、0.5-100μM、1-100μM或者10-80μM)。例如，在一些实施方案中，本发明的分化培养基包含浓度为约3μM的CHIR99021和浓度为约50μM的iCRT3。
CHIR99021激动剂
如上所述，本发明的发明人意外地发现在分化培养基中包含Wnt激动剂CHIR99021促进了分化。因此，在一些实施方案中，本发明的分化培养基包含CHIR99021或CHIR99021激动剂。CHIR99021激动剂在本文中被限定为与CHIR99021共享一种或多种生物活性的试剂。
因此，提供了分化祖细胞的方法，其中所述方法包括在分化培养基中培养一种或多种祖细胞，所述分化培养基包含基础培养基并且还包含CHIR99021或CHIR99021激动剂，以及优选地作用于β-连环蛋白破坏复合物下游的一种或多种Wnt抑制剂(例如iCRT3)。在优选的实施方案中，该分化培养基还包含以下列出的一种或多种，优选所有组分：一种或多种受体酪氨酸激酶配体(例如EGF、HGF和/或FGF19)、Notch抑制剂(例如DAPT)、糖皮质激素(例如地塞米松)和TGF-β抑制剂(例如ALK5、ALK4或ALK7抑制剂，例如A83-01)。分化培养基任选地还包含以下列出的一种或多种，优选所有组分：BMP通路激活剂(例如BMP7)、胃泌素，N-乙酰半胱氨酸、B27。在一些实施方案中，分化培养基包含缓冲剂(例如HEPES)。在优选的实施方案中，人或动物细胞的基础培养基是改良型DMEM/F12(Gibco)。
本发明还提供了CHIR99021或CHIR99021激动剂在分化祖细胞(例如肝脏上皮干细胞)中的用途。
AP-1刺激剂
激活蛋白1(AP-1)复合物是转录因子，其是由属于Fos蛋白家族、Jun、ATF和JDP家族的蛋白组成的异二聚体。该转录因子响应多种刺激调节基因表达，所述刺激包括细胞因子、生长因子、胁迫以及细菌和病毒感染。
发明人意外地观察到，与原代肝细胞相比，人肝脏类器官具有降低的AP-1复合物组分的表达。基于这一观察，他们假设刺激AP-1复合物的形成将促进肝脏类器官中的上皮干细胞分化成肝细胞的命运。发明人发现，在分化培养基中包括AP-1刺激剂卡巴胆碱(氯化2-[(氨基羰基)氧基]-N，N，N-三甲基乙铵)增加了肝细胞标志物(包括Cyp3A4和白蛋白)的表达。
发明人测试的AP-1刺激剂是毒蕈碱乙酰胆碱受体激动剂。存在五种毒蕈碱乙酰胆碱受体亚型(M1-M5)。这些是存在于多种细胞类型(例如神经元)的细胞膜中的G蛋白偶联受体。
因此，在一些实施方案中，本发明的分化培养基包含AP-1刺激剂。在一些实施方案中，AP-1刺激剂是毒蕈碱乙酰胆碱受体激动剂。可以使用任何合适的毒蕈碱乙酰胆碱受体激动剂。在一些实施方案中，毒蕈碱乙酰胆碱受体激动剂是M3毒蕈碱乙酰胆碱受体激动剂(例如乙酰胆碱、氨甲酰甲胆碱、卡巴胆碱、氧代震颤素或毛果芸香碱)。
在一些实施方案中，毒蕈碱乙酰胆碱受体激动剂选自以下中的一种或多种：乙酰胆碱、氨甲酰甲胆碱、卡巴胆碱、氧代震颤素、L-689,660(1-氮杂双环[2.2.2]辛烷、3-(6-氯吡嗪基)马来酸盐)、毛果芸香碱、毒蕈碱、McN-A 343(4-[[[(3-氯苯基)氨基]羰基]氧基]-N,N,N-三甲基-2-丁炔-1-氯化铵)、77-LH-218-1(1-[3-(4-丁基-1-哌啶基)丙基]-3,4-二氢-2(1H)-喹啉酮)和乙酰甲胆碱。
在一些实施方案中，毒蕈碱乙酰胆碱受体激动剂是卡巴胆碱。
在一些实施方案中，AP-1刺激剂(例如毒蕈碱乙酰胆碱受体激动剂)以以下浓度存在于本发明的分化培养基中：0.001-500μM、0.01-500μM、0.01-250μM、0.01-150μM、0.1-500μM、0.1-100μM、0.5-500μM、0.5-100μM、0.5-50μM、1-500μM、1-300μM、1-200μM、1-20μM、1-5μM、10-300μM、50-300μM、50-200μM或50-150μM。
在一些实施方案中，本发明的分化培养基包含以下浓度的卡巴胆碱：0.001-500μM、0.001-300μM、0.01-500μM、0.01-300μM、0.1-500μM、0.1-300μM、1-500μM、10-500μM、100-500μM、1-300μM、10-300μM、50-300μM、50-200μM或50-150μM。例如，在一些实施方案中，本发明的分化培养基包含浓度为100μM的卡巴胆碱。
毒蕈碱乙酰胆碱受体激动剂
如上所述，发明人意外地发现，在分化培养基中包含毒蕈碱乙酰胆碱受体激动剂卡巴胆碱促进分化。因此，在一些实施方案中，本发明的分化培养基包含毒蕈碱乙酰胆碱受体激动剂。
因此，提供了分化祖细胞的方法，其中所述方法包括在分化培养基中培养一种或多种祖细胞，所述分化培养基包含基础培养基并且还包含毒蕈碱乙酰胆碱受体激动剂，以及优选地作用于β-连环蛋白破坏复合物下游的一种或多种Wnt抑制剂(例如iCRT3)。在优选的实施方案中，该分化培养基还包含以下列出的一种或多种，优选所有组分：一种或多种受体酪氨酸激酶配体(例如EGF、HGF和/或FGF19)、Notch抑制剂(例如DAPT)、糖皮质激素(例如地塞米松)和TGF-β抑制剂(例如ALK5、ALK4或ALK7抑制剂，如A83-01)。分化培养基任选地还包含以下列出的一种或多种，优选所有组分：BMP通路激活剂(例如BMP7)、胃泌素、N-乙酰半胱氨酸、B27。在一些实施方案中，本发明的分化培养基包含缓冲剂(例如HEPES)。在优选的实施方案中，基础培养基是改良型DMEM/F12(Gibco)。
可以使用任何合适的毒蕈碱乙酰胆碱受体激动剂。在一些实施方案中，毒蕈碱乙酰胆碱受体激动剂是M3毒蕈碱乙酰胆碱受体激动剂(例如乙酰胆碱、氨甲酰甲胆碱、卡巴胆碱、氧代震颤素或毛果芸香碱)。
在一些实施方案中，毒蕈碱乙酰胆碱受体激动剂选自以下中的一种或多种：乙酰胆碱、氨甲酰甲胆碱、卡巴胆碱、氧代震颤素、L-689,660(1-氮杂双环[2.2.2]辛烷、3-(6-氯吡嗪基)马来酸盐)、毛果芸香碱、毒蕈碱、McN-A 343(4-[[[(3-氯苯基)氨基]羰基]氧基]-N,N,N-三甲基-2-丁炔-1-氯化铵)、77-LH-218-1(1-[3-(4-丁基-1-哌啶基)丙基]-3,4-二氢-2(1H)-喹啉酮)和乙酰甲胆碱。
在一些实施方案中，毒蕈碱乙酰胆碱受体激动剂是卡巴胆碱。
在一些实施方案中，AP-1刺激剂(例如毒蕈碱乙酰胆碱受体激动剂)以以下浓度存在于本发明的分化培养基中：0.001-500μM、0.01-500μM、0.01-250μM、0.01-150μM、0.1-500μM、0.1-100μM、0.5-500μM、0.5-100μM、0.5-50μM、1-500μM、1-300μM、1-200μM、1-20μM、1-5μM、10-300μM、50-300μM、50-200μM或50-150μM。
在一些实施方案中，本发明的分化培养基包含以下浓度的卡巴胆碱：0.001-500μM、0.001-300μM、0.01-500μM、0.01-300μM、0.1-500μM、0.1-300μM、1-500μM、10-500μM、100-500μM、1-300μM、10-300μM、50-300μM、50-200μM或50-150μM。例如，在一些实施方案中，本发明的分化培养基包含浓度为100μM的卡巴胆碱。
本发明还提供了毒蕈碱乙酰胆碱受体激动剂在分化上皮细胞(例如肝脏祖细胞或干细胞)中的用途。
卡巴胆碱激动剂
如上所述，发明人意外地发现，在分化培养基中包含毒蕈碱乙酰胆碱受体激动剂卡巴胆碱促进分化。因此，在一些实施方案中，本发明的分化培养基包含卡巴胆碱或卡巴胆碱激动剂。卡巴胆碱激动剂在本文中被限定为与卡巴胆碱共享一种或多种生物活性的试剂。
因此，提供了分化上皮细胞的方法，其中所述方法包括在分化培养基存在下培养与细胞外基质接触的一种或多种上皮细胞，所述分化培养基包含用于动物或人细胞的基础培养基并且还包含卡巴胆碱或卡巴胆碱激动剂，以及优选地作用于β-连环蛋白破坏复合物下游的一种或多种Wnt抑制剂(例如iCRT3)。在优选的实施方案中，该分化培养基还包含以下列出的一种或多种，优选所有组分：一种或多种受体酪氨酸激酶配体(例如EGF、HGF和/或FGF19)、Notch抑制剂(例如DAPT)、糖皮质激素(例如地塞米松)和TGF-β抑制剂(例如ALK5、ALK4或ALK7抑制剂，如A83-01)。分化培养基任选地还包含以下列出的一种或多种，优选所有组分：BMP通路激活剂(例如BMP7)、胃泌素、N-乙酰半胱氨酸、B27。在一些实施方案中，分化培养基包含缓冲剂(例如HEPES)。在优选的实施方案中，基础培养基是改良型DMEM/F12(Gibco)。
本发明还提供了卡巴胆碱或卡巴胆碱激动剂在分化祖细胞(例如肝脏上皮干细胞)中的用途。
受体酪氨酸激酶配体
受体酪氨酸激酶(RTK)是多肽生长因子、细胞因子和激素的高亲和力细胞表面受体。RTK是细胞维持、生长和发育的关键调节剂，并且在许多类型的癌症的发展和进展中发挥关键作用。本发明的分化培养基优选包含一种或多种受体酪氨酸激酶配体。在本发明的上下文中，受体酪氨酸激酶配体是激活RTK的任何配体。许多受体酪氨酸激酶配体是促有丝分裂生长因子。因此，在一些实施方案中，分化培养基中的一种或多种受体酪氨酸激酶配体包含一种或多种促有丝分裂生长因子。
大约存在20种不同的已知类型的RTK、包括RTK I类(EGF受体家族)(ErbB家族)、RTK II类(胰岛素受体家族)、RTK III类(PDGF受体家族)、RTK IV类(FGF受体家族)、RTK V类(VEGF受体家族)、RTK VI类(HGF受体家族)、RTK VII类(Trk受体家族)、RTK VIII类(Eph受体家族)、RTK IX类(AXL受体家族)、RTK X类(LTK受体家族)、RTK XI类(TIE受体家族)、RTK XII类(ROR受体家族)、RTK XIII类(DDR受体家族)、RTK XIV类(RET受体家族)、RTK XV类(KLG受体家族)、RTK XVI类(RYK受体家族)、RTK XVII类(MuSK受体家族)。在一些实施方案中，一种或多种受体酪氨酸激酶配体包含针对这20类RTK中的一种或多种或者全部的配体。在优选的实施方案中，一种或多种受体酪氨酸激酶配体包含以下配体中的一种或多种或者全部：针对RTK I类(EGF受体家族)(ErbB家族)的配体、针对RTK IV类(FGF受体家族)的配体和针对RTK VI类(HGF受体家族)的配体。例如，在一些实施方案中，一种或多种受体酪氨酸激酶配体包含针对RTK I类(EGF受体家族)(ErbB家族)的配体。在一些实施方案中，一种或多种受体酪氨酸激酶配体包含针对RTK IV类(FGF受体家族)的配体。在一些实施方案中，一种或多种受体酪氨酸激酶配体包含针对RTK VI类(HGF受体家族)的配体。
因此，在一些实施方案中，在分化培养基中的一种或多种受体酪氨酸激酶配体选自表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)和肝细胞生长因子(HGF)。在一些实施方案中，一种或多种受体酪氨酸激酶配体包含EGF和FGF。在一些实施方案中，一种或多种受体酪氨酸激酶配体包括EGF和HGF。在一些实施方案中，一种或多种受体酪氨酸激酶配体包括FGF和HGF。在优选的实施方案中，一种或多种受体酪氨酸激酶配体包括EGF、FGF和HGF。在一些实施方案中，在分化培养基中仅包括一种受体酪氨酸激酶配体，例如，其中受体酪氨酸激酶选自FGF、HGF和EGF。
FGF优选是能够与FGFR2或FGFR4结合的FGF，并且优选是FGF19。
在本发明的分化培养基中可以使用三种或更多种(例如3、4、5种或更多种)受体酪氨酸激酶配体。
EGF
EGF是多种培养的外胚层细胞和中胚层细胞的有效促有丝分裂生长因子，并且对体内和体外特定细胞以及细胞培养物中的一些成纤维细胞的分化具有深远的影响。EGF前体作为膜结合分子存在，其被蛋白水解切割以产生刺激细胞的53个氨基酸的肽激素。
可以使用任何合适的EGF，例如从Peprotech获得的EGF。在一些实施方案中，EGF是人EGF。
EGF优选以以下浓度存在于本发明的分化培养基中：0.01-500ng/ml、0.1-250ng/ml、1-200ng/ml、1-100ng/ml、10-90ng/ml或者25-75ng/ml。优选的浓度为至少10、20、25、30、40、45或50ng/ml且不高于500、450、400、350、300、250、200、150或100ng/ml。例如，在一些实施方案中，以约1-100ng/ml的浓度向基础培养基中添加EGF。在一些实施方案中，以约50ng/ml的浓度向基础培养基中添加EGF。
FGF
FGF家族成员具有广泛的促有丝分裂和细胞存活活性，并且参与多种生物过程，包括胚胎发育、细胞生长、形态发生、组织修复、肿瘤生长和侵袭。FGF通过与细胞表面酪氨酸激酶受体(FGFR)相互作用来刺激细胞。已经鉴定了四种密切相关的受体(FGFR1-FGFR4)。已经显示FGFR1-FGFR3基因编码多种同种型，并且这些同种型在确定配体特异性中可能是关键的。在一些实施方案中，FGF是FGF1-10中的任何一种。
大多数FGF结合多于一种受体(Ornitz J Biol Chem.1998Feb 27；273(9)：5349-57)。在一些实施方案中，FGF是能够结合FGFR2和/或FGFR4的FGF。在一些实施方案中，FGF是能够结合FGFR4的FGF(如FGF19)。例如，在优选的实施方案中，分化培养基中包括FGF19作为受体酪氨酸激酶配体。
在一些实施方案中，使用不多于一种FGF。在其它实施方案中，使用两种或更多种FGF(例如，2、3种或更多种)。在一些实施方案中，用激活FGFR2或FGFR4通路的化合物(“FGF通路激活剂”)取代FGF。在一些实施方案中，用激活FGFR的可替代化合物取代FGF。因此，在一些实施方案中，用FGFR激动剂取代FGF。
优选以以下浓度向基础培养基中添加FGF：0.1-500ng/ml、0.1-250ng/ml、1-200ng/ml、10-200ng/ml或20-150ng/ml。例如，在一些实施方案中，以约100ng/ml的浓度向基础培养基中添加FGF。
在制备分化培养基时，优选以以下浓度向基础培养基中添加FGF19：0.1-500ng/ml、0.1-250ng/ml、1-200ng/ml、10-200ng/ml或20-150ng/ml。FGF19的优选浓度为约20、50、100、250、500ng/ml，不高于500ng/ml。例如，在一些实施方案中，以约100ng/ml的浓度向基础培养基中添加FGF19。
HGF
肝细胞生长因子/散射因子(HGF/SF)是形态发生因子，其通过在与原致癌性(proto-oncogenic)c-Met受体结合之后激活酪氨酸激酶信号转导级联放大来调节细胞生长、细胞运动性和形态发生。可以使用任何合适的HGF(例如，从Peprotech获得的HGF)。在一些实施方案中，用激活HGF受体的化合物取代HGF。因此，在一些实施方案中，用HGR受体激动剂取代HGF。
优选以以下浓度向基础培养基中添加HGF：0.01-500ng/ml、0.1-250ng/ml、1-200ng/ml、1-100ng/ml、10-90ng/ml或25-75ng/ml。HGF的优选浓度为约1、10、20、25、50ng/ml，不高于50ng/ml。例如，在一些实施方案中，以约25ng/ml的浓度向基础培养基中添加HGF。
Notch抑制剂
Notch是跨膜表面受体，其可以通过多种蛋白水解切割而被激活，其中一种蛋白水解切割是通过被称为γ-分泌酶的具有蛋白酶活性的蛋白复合物进行的切割。γ-分泌酶是在膜内发挥其切割活性的蛋白酶。γ-分泌酶是多组分酶，并且由至少四种不同的蛋白(即早老素(早老素1或2)、呆蛋白(nicastrin)、PEN-2和APH-1)组成。早老素是γ-分泌酶的催化中心。在配体结合时，Notch受体经历允许胞外域通过是金属蛋白酶的ADAM蛋白酶的作用脱落的构象变化。紧接着是γ-分泌酶复合物的作用，其导致Notch细胞内结构域(NICD)的释放。NICD易位至细胞核，在那它与CSL(C启动子结合因子/重组信号序列结合蛋白Jκ/无毛抑制因子/Lagl(C-promoter-binding factor/recombinant signal-sequence bindingprotein Jκ/Supressor-of-Hairless/Lagl))相互作用。NICD的结合将CSL从转录抑制因子转变为激活因子，这导致Notch靶基因的表达。
先前在体内胆细胞(biliary cell)的命运中已经涉及了Notch信号转导通路。例如，Rbpj(实现有效Notch信号转导所必需的)的缺失导致异常的管腺增生(ZongY.Development 2009)。此外，先前已经表明，在分化培养基中包含Notch抑制剂可以抑制胆管细胞的命运并引发细胞向更多的肝细胞表型分化(参见WO2012/168930)。具体地，发现在分化培养基中包含Notch抑制剂(如DAPT)增强成熟肝细胞标志物的表达并增加肝细胞样细胞的数量。
因此，优选地，分化培养基包含Notch抑制剂。可以使用任何合适的Notch抑制剂。
在一些实施方案中，Notch抑制剂是能够减少配体介导的Notch激活的抑制剂(例如经由Notch的显性阴性配体或者经由显性阴性Notch或者经由能够至少部分阻断Notch配体与Notch之间的相互作用的抗体)或ADAM蛋白酶的抑制剂。
在一些实施方案中，Notch抑制剂是γ分泌酶抑制剂，例如DAPT、二苯并氮杂(DBZ)、苯二氮(BZ)或LY-411575。可以使用一种或多种Notch抑制剂，例如2、3、4中或更多种。
在一些实施方案中，以以下浓度使用Notch抑制剂(例如DAPT)：0.001-200μM、0.01-100μM、0.1-50μM、0.1-20μM、1-100μM、1-50μM、1-30μM、5-100μM、5-50μM或5-20μM。例如，在一些实施方案中，分化培养基包含浓度为约10μM的DAPT。
糖皮质激素
糖皮质激素是一类皮质类固醇，其是一类类固醇激素。糖皮质激素是与糖皮质激素受体结合的皮质类固醇。皮质醇是最重要的人糖皮质激素。氢化可的松是皮质醇的合成形式。存在许多具有相关结构的其它合成的糖皮质激素(例如泼尼松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、地塞米松、倍他米松、曲安西龙、倍氯米松和醋酸氟氢可的松)。糖皮质激素具有不同的激活糖皮质激素受体的效力。这被称为糖皮质激素效力，并且通常与皮质醇比较测量。多种糖皮质激素的生物化学、药理学和作用机理在例如Cecil Textbook of Medicine(1988)，第128-130页，和The Science and Practice of Pharmacy第20版(2000)，第1363-1370页中进行了综述。
优选地，分化培养基包含糖皮质激素。可以使用任何合适的糖皮质激素。在一些实施方案中，糖皮质激素选自以下中的一种或多种：皮质醇、可的松、醋酸氢化可的松、盐酸氢化可的松、戊酸氢化可的松、泼尼松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、地塞米松、倍他米松、二丙酸倍他米松、戊酸倍他米松、曲安西龙、曲安奈德、倍氯米松、二丙酸倍氯米松、氟氢可的松、醋酸氟氢可的松、氟替卡松、氟替卡松缩丙酮、丙酸氟替卡松、氟尼缩松、布地奈德、氯倍他索、丙酸氯倍他索、双氟拉松、二醋酸双氟拉松、卤倍他索、丙酸卤倍他索、安西奈德、去羟米松、氟轻松醋酸酯(fluocinonide)、氟轻松醋酸酯缩丙酮(fluocinonide acetonide)、哈西奈德、莫米松、糠酸莫米松、氟氢缩松、泼尼卡酯、阿氯米松、二丙酸阿氯米松、地奈德、氟新诺龙(flucinolone)、氟新诺龙缩丙酮(flucinolone acetonide)、丙吗卡因以及盐酸丙吗卡因。
地塞米松是最有效的糖皮质激素之一，并且是用于本发明的分化培养基的优选的糖皮质激素。在一些实施方案中，糖皮质激素是具有与地塞米松相同或更高的糖皮质激素效力的任何糖皮质激素。
倍他米松和醋酸氟氢可的松也是高效的糖皮质激素。因此，倍他米松是用于本发明分化培养基的优选的糖皮质激素。在一些实施方案中，糖皮质激素是具有与倍他米松相同或更高的糖皮质激素效力的任何糖皮质激素。因此，醋酸氟氢可的松是用于本发明分化培养基的优选的糖皮质激素。在一些实施方案中，糖皮质激素是具有与醋酸氟氢可的松相同或更高的糖皮质激素效力的任何糖皮质激素。
在一些实施方案中，糖皮质激素是具有与皮质醇相同或更高的糖皮质激素效力的任何糖皮质激素。
下面提供了用于本发明的分化培养基的示例性糖皮质激素的列表。所呈现的效力是指口服给药。
糖皮质激素 糖皮质激素效力
皮质醇(氢化可的松) 1
可的松 0.8
泼尼松 3.5-5
泼尼松龙 4
甲基泼尼松龙 5-7.5
地塞米松 25-80
倍他米松 25-30
曲安西龙 5
醋酸氟氢可的松 15
在一些实施方案中，以以下浓度使用糖皮质激素(例如地塞米松)：0.01-150μM、0.1-15μM、0.5-10μM或1-5μM。在优选的实施方案中，糖皮质激素是地塞米松。例如，在一些实施方案中，分化培养基包含浓度为约3μM的地塞米松。
TGF-β抑制剂
TGF-β信号转导涉及许多细胞功能，包括细胞生长、细胞命运和细胞凋亡。信号转导通常始于TGF-β超家族配体与II型受体的结合，所述II型受体招募并磷酸化I型受体。然后，I型受体磷酸化SMAD，SMAD作为细胞核中的转录因子发挥作用并调节靶基因的表达。
先前在体内胆细胞的命运中已经涉及了TGF-β抑制剂信号转导通路。例如，向肝脏外植体中添加TGF-β促进了体外胆分化(Clotman等人(2005)Genes Dev.19(16)：1849-54)。此外，先前已经表明，在分化培养基中包含TGF-β抑制剂可以抑制胆管细胞命运并引发细胞向更多肝细胞表型分化(参见WO2012/168930)。具体地，发现在分化培养基中包含TGF-β抑制剂(如A83-01)增强成熟肝细胞标志物的表达并增加肝细胞样细胞的数量。
因此，本发明的分化培养基优选包含TGF-β抑制剂。
TGF-β超家族配体包含骨形态发生蛋白(BMP)、生长和分化因子(GDF)、抗缪勒氏管激素(AMH)、激活素、nodal和TGF-β。通常，Smad2和Smad3被TGF-β/激活素通路中的ALK4、5和7受体磷酸化。相比之下，Smad1、Smad5和Smad8被磷酸化作为骨形态发生蛋白(BMP)通路的一部分。尽管通路之间存在一些交叉，但在本发明的上下文中，“TGF-β抑制剂”或“TGF-β信号转导的抑制剂”优选是TGF-β通路的抑制剂，其经由Smad2和Smad3和/或经由ALK4、ALK5或ALK7起作用。因此，在一些实施方案中，TGF-β抑制剂不是BMP抑制剂，即TGF-β抑制剂不是头蛋白。在一些实施方案中，除TGF-β抑制剂之外，还向培养基中添加BMP抑制剂。因此，TGF-β抑制剂可以是任何试剂，其降低TGF-β信号转导通路，优选经由Smad2和/或Smad3起作用的信号转导通路，更优选经由ALK4、ALK5或ALK7起作用的信号转导通路的活性。
存在多种破坏TGF-β信号转导通路的方法，这些方法是本领域已知的并且可以与本发明联合使用。例如，可以通过以下方式破坏TGF-β信号转导：通过小干扰RNA策略抑制TGF-β的表达；抑制弗林蛋白酶(TGF-β激活蛋白酶)；通过生理抑制剂抑制通路；用单克隆抗体中和TGF-β；用TGF-β受体激酶1(也被称为激活素受体样激酶ALK5)、ALK4、ALK6、ALK7或其它TGF-β相关受体激酶的小分子抑制剂进行抑制；例如通过过表达它们的生理抑制剂Smad7或者通过使用硫氧还蛋白作为Smad锚使Smad无法激活来抑制Smad 2和Smad 3信号转导(Fuchs,O.Inhibition of TGF-Signaling for the Treatment of Tumor Metastasisand Fibrotic Diseases.Current Signal Transduction Therapy,第6卷,第1期,2011年1月,pp.29-43(15))。
用于确定物质是否是TGF-β抑制剂的多种方法是已知的，并且可以与本发明联合使用。例如，可以使用细胞分析，其中用包含人PAI-1启动子或Smad结合位点的报告基因构建体稳定转染细胞，驱动荧光素酶报告基因。可以将相对于对照组的荧光素酶活性的抑制用作化合物活性的程度(De Gouville等人，Br J Pharmacol.2005年5月；145(2)：166-177)。因此，本领域技术人员可以容易地鉴定新的TGF-β抑制剂。
根据本发明的TGF-β抑制剂可以是蛋白质、肽、小分子、小干扰RNA、反义寡核苷酸、适配子或抗体。抑制剂可以是天然存在的或合成的。在一个实施方案中，TGF-β抑制剂是ALK4、ALK5和/或ALK7的抑制剂。例如，TGF-β抑制剂可以结合并直接抑制ALK4、ALK5和/或ALK7。可以被用于本发明的上下文的优选的小分子TGF-β抑制剂的实例包括但不限于以下表2中列出的小分子抑制剂。
表2：靶向受体激酶的小分子TGF-β抑制剂
在一些实施方案中，TGF-β抑制剂是小分子抑制剂，其任选地选自：A83-01、SB-431542、SB-505124、SB-525334、LY 364947、SD-208和SJN 2511。
在一些实施方案中，在分化培养基中存在不多于一种TGF-β抑制剂。在其它实施方案中，在分化培养基中存在多于一种的TGF-β抑制剂(例如，2、3、4种或更多种)。在一些实施方案中，本发明的分化培养基包含表2中列出的任何抑制剂中的一种或多种。分化培养基可以包含一种抑制剂与列出的另一种抑制剂的任何组合。例如，培养基可以包含SB-525334或SD-208或A83-01；或者SD-208和A83-01。技术人员将会理解存在许多其它小分子抑制剂，将其主要设计为靶向其它激酶，但是在高浓度下也可以抑制TGF-β受体激酶。例如，SB-203580是p38MAP激酶抑制剂，其在高浓度(例如大约10μM或更高)下被认为抑制ALK5。也可以在本发明的上下文中使用抑制TGF-β信号转导通路的任何此类抑制剂。
在一些实施方案中，TGF-β抑制剂(例如A83-01)以以下浓度存在于分化培养基中：至少1nM，例如至少5nM、至少50nM、至少100nM、至少300nM、至少450nM或至少475nM。例如，TGF-β抑制剂(例如A83-01)以以下浓度存在于分化培养基中：1nM-200μM、10nM-200μM、100nM-200μM、1μM-200μM、10nM-100μM、50nM-100μM、50nM-10μM、100nM-1μM、200nM-800nM、350-650nM或约500nM。因此，在一些实施方案中，分化培养基包含浓度为约500nM的A83-01。
BMP通路激活剂
在一些实施方案中，分化培养基包含BMP通路激活剂。在一些实施方案中，BMP通路激活剂选自BMP7、BMP4和BMP2。BMP7是优选的。BMP7诱导SMAD1和SMAD5的磷酸化。因此，在一些实施方案中，BMP通路激活剂是能够诱导SMAD1和SMAD5的磷酸化的任何化合物。此外，当提及BMP7时，可以使用任何诱导SMAD1或SMAD5的磷酸化的化合物来代替BMP7。
在一些实施方案中，BMP通路激活剂(如BMP7)以以下浓度存在于分化培养基中：至少0.01ng.ml、至少0.1ng/ml、至少1ng/ml、至少10ng/ml、至少20ng/ml、至少25ng/ml。在一些实施方案中，BMP通路激活剂(如BMP7)以以下浓度存在于分化培养基中：约0.01ng/ml至约500ng/ml，约1ng/ml至约500ng/ml，约10ng/ml至约500ng/ml，约20ng/ml至约500ng/ml。在一些实施方案中，BMP通路激活剂(如BMP7)以以下浓度存在于分化培养基中：约0.01ng/ml至约200ng/ml，约0.1ng/ml至约100ng/ml，约1ng/ml至约100ng/ml，约10ng/ml至约100ng/ml，约10ng/ml至约50ng/ml，约15ng/ml至约30ng/ml。在一些实施方案中，BMP通路激活剂(如BMP7)以约25ng/ml存在于分化培养基中。
在一些实施方案中，分化培养基不包含BMP通路激活剂。
另外的组分
在一些实施方案中，本发明的分化培养基包含胃泌素。在一些实施方案中，本发明的分化培养基包含以下浓度的胃泌素：0.01-500nM、0.1-100nM、1-100nM、1-20nM或5-15nM。例如，在一些实施方案中，本发明的分化培养基包含浓度为约10nM的胃泌素。
本发明的分化培养基优选被补充有选自B27、N-乙酰半胱氨酸和N2的化合物中的一种或多种(例如1、2、3种或全部)。因此，在一些实施方案中，分化培养基还包含选自B27、N2和N-乙酰半胱氨酸的一种或多种组分。例如，在一些实施方案中，分化培养基还包含B27、N-乙酰半胱氨酸和N2。
据信B27(Invitrogen)、N-乙酰半胱氨酸(Sigma)和N2(Invitrogen)以及烟酰胺(Sigma)控制细胞的增殖并有助于DNA稳定性。
在一些实施方案中，N-乙酰半胱氨酸以以下浓度存在于分化培养基中：0.1-200mM、0.1-100mM、0.1-50mM、0.1-10mM、0.1-5mM、0.5-200mM、0.5-100mM、0.5-50mM、0.5-10mM、0.5-5mM、1-100mM、1-50mM、1-10mM、1-5mM。在一些实施方案中，N-乙酰半胱氨酸以约1.25mM的浓度存在于分化培养基中。
在一些实施方案中，B27补充剂是‘B27补充剂减去维生素A’(本文中也被称为“不含维生素A的B27”或“B27wo VitA”；可获自Invitrogen，Carlsbad，CA；www.invitrogen.com；当前目录号12587010；以及获自PAA Laboratories GmbH，Pasching，奥地利；www.paa.com；目录号F01-002；Brewer等人，J Neurosci Res.，35(5)：567-76,1993)。在一些实施方案中，可以用包含选自以下列出的一种或多种组分的通用制剂代替B27补充剂：生物素、胆固醇、亚油酸、亚麻酸、黄体酮、腐胺、视黄醇乙酸酯、亚硒酸钠、三碘甲腺原氨酸(T3)、DL-α生育酚(维生素E)、白蛋白、胰岛素和转铁蛋白。
由PAA Laboratories GmbH提供的B27补充剂是液体的50x浓缩液，其中含有生物素、胆固醇、亚油酸、亚麻酸、黄体酮、腐胺、视黄醇、视黄醇乙酸酯、亚硒酸钠、三碘甲腺原氨酸(T3)、DL-α生育酚(维生素E)、白蛋白、胰岛素和转铁蛋白等其它成分。在这些成分中，至少亚麻酸、视黄醇、视黄醇乙酸酯和三碘甲腺原氨酸(T3)是核激素受体激动剂。可以将B27补充剂作为浓缩物添加到分化培养基中，或者在添加到分化培养基之前对其进行稀释。它可以以1x最终浓度或其它最终浓度(例如0.1x至4x的浓度、0.1x至2x的浓度、0.5x至2x的浓度、1x至4x的浓度或1x至2x的浓度)被使用。使用B27补充剂是向本发明的分化培养基中掺入生物素、胆固醇、亚油酸、亚麻酸、黄体酮、腐胺、视黄醇、视黄醇乙酸酯、亚硒酸钠、三碘甲腺原氨酸(T3)、DL-α生育酚(维生素E)、白蛋白、胰岛素和转铁蛋白的便捷方式。还设想可以向分化培养基中分别添加这些组分中的一些或全部，而非使用B27补充剂。因此，分化培养基可以包含这些组分中的一些或全部。
在一些实施方案中，分化培养基中使用的B27补充剂中不存在视黄酸和/或分化培养基中不存在视黄酸。
‘N2补充剂’(在本文中也被称为“N2”)可获自Invitrogen，Carlsbad，CA；www.invitrogen.com；目录号17502-048；以及获自PAA Laboratories GmbH,Pasching,奥地利；www.paa.com；目录号F005-004；Bottenstein&Sato，PNAS，76(1)：514-517,1979。由PAA Laboratories GmbH提供的N2补充剂是100x液体浓缩，其含有500μg/ml人转铁蛋白、500μg/ml牛胰岛素、0.63μg/ml黄体酮、1611μg/ml腐胺和0.52μg/ml亚硒酸钠。可以将N2补充剂作为浓缩物添加到分化培养基中，或者在添加到分化培养基之前对其进行稀释。它可以以1x最终浓度或其它最终浓度(例如0.1x至4x的浓度、0.1x至2x的浓度、0.5x至2x的浓度、1x至4x的浓度或1x至2x的浓度)使用。使用N2补充剂是向本发明的分化培养基中掺入转铁蛋白、胰岛素、黄体酮、腐胺和亚硒酸钠的便捷方式。当然还设想可以向分化培养基中分别添加这些组分中的一些或全部，而非使用N2补充剂。因此，分化培养基可以包含这些组分中的一些或全部。
在其中培养基包含B27的一些实施方案中，它也不包含N2。因此，如果需要，本发明的实施方案可以适于当存在B27时排除N2。
在一些实施方案中，N2不存在于分化培养基中。
在其中培养基包含N2的一些实施方案中，它也不包含B27。因此，如果需要，本发明的实施方案可以适于当存在N2时排除B27。
在一些实施方案中，B27不存在于分化培养基中。
在一些实施方案中，将分化培养基补充有B27和/或N2。
在一些实施方案中，将基础培养基补充有150ng/ml至250ng/ml的N-乙酰半胱氨酸；优选地，将基础培养基补充有约200ng/ml的N-乙酰半胱氨酸。
可以使用任何合适的pH。例如，培养基的pH可以在约7.0至7.8的范围内，在约7.2至7.6的范围内或者为约7.4。可以使用缓冲剂维持pH。本领域技术人员可以容易地选择合适的缓冲剂。可以使用的缓冲剂包括碳酸盐缓冲剂(例如NaHCO3)和磷酸盐(例如NaH2PO4)。通常以约50至约500mg/l使用这些缓冲剂。也可以使用其它缓冲剂如N-[2-羟乙基]-哌嗪-N’-[2-乙烷磺酸](HEPES)和3-[N-吗啉代]丙磺酸(MOPS)，通常为约1000至约10,000mg/l。在一些实施方案中，缓冲剂选自以下列出的一种或多种：磷酸盐缓冲剂(例如KH2PO4、K2HPO4、Na2HPO4、NaCl、NaH2PO4)醋酸盐缓冲剂(例如HOAc或NaOAc)、柠檬酸盐缓冲剂(例如柠檬酸或柠檬酸钠)或TRIS缓冲剂(例如TRIS、TRIS-HCl)或有机缓冲剂。在一些实施方案中，有机缓冲剂是两性离子缓冲剂，如Good’s缓冲剂，例如选自HEPES、MOPS、MES、ADA、PIPES、ACES、MOPSO、氯化胆胺、BES、TES、DIPSO、acetamindoglycine、TAPSO、POPSO、HEPPSO、HEPPS、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)、甘氨酰胺、N-二羟乙基甘氨酸(Bicine)、TAPS、AMPSO、CABS、CHES、CAPS和CAPSO。优选的缓冲剂是HEPES，例如浓度为0.1-100mM、0.1-50mM、0.5-50mM、1-50mM、1-20mM或5-15mM的HEPES。在一些实施方案中，以约10mM向培养基中添加HEPES。分化培养基还可以包含pH指示剂(如酚红)以使得能够容易地监测培养基的pH状态(例如，以约5至约50mg/升)。
用于本发明的分化培养基可以包含一种或多种氨基酸。技术人员理解用于分化培养基的氨基酸的适当类型和量。可以存在的氨基酸包括L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸及其组合。一些分化培养基将含有所有这些氨基酸。通常，当存在时，除了以约0.05至约1g/L(通常约0.1至约0.75g/L)存在的L-谷氨酰胺之外，每种氨基酸以约0.001至约1g/L培养基(通常为约0.01至约0.15g/L)存在。氨基酸可以是合成来源的。
用于本发明的分化培养基可以包含一种或多种维生素。技术人员理解用于分化培养基的维生素的适当类型和量。可以存在的维生素包括硫胺素(维生素B1)、核黄素(维生素B2)、烟酸(维生素B3)、D-泛酸钙(维生素B5)、吡哆醛/吡哆胺/吡哆醇(维生素B6)、叶酸(维生素B9)、氰钴维生素(维生素B12)、抗坏血酸(维生素C)、钙化醇(维生素D2)、DL-α生育酚(维生素E)、生物素(维生素H)以及甲萘醌(维生素K)。
用于本发明的分化培养基可以包含一种或多种无机盐。技术人员理解用于分化培养基的无机盐的适当类型和量。分化培养基中通常包括无机盐以帮助维持细胞的渗透平衡并帮助调节膜电势。可以存在的无机盐包括钙、铜、铁、镁、钾、钠、锌的盐。通常以氯化物、磷酸盐、硫酸盐、硝酸盐和碳酸氢盐的形式使用盐。可以使用的具体盐包括CaCl2、CuSO4-5H2O、Fe(NO3)-9H2O、FeSO4-7H2O、MgCl、MgSO4、KCl、NaHCO3、NaCl、Na2HPO4、Na2HPO4-H2O和ZnSO4-7H2O。
培养基的同渗容摩可以在约200至约400mOsm/kg的范围内，在约290至约350mOsm/kg的范围内或者在约280至约310mOsm/kg的范围内。培养基的同渗容摩可以小于约300mOsm/kg(例如约280mOsm/kg)。
用于本发明的分化培养基可以包含一种或多种糖形式的碳能源。技术人员理解用于分化培养基的糖的适当类型和量。可以存在的糖包括葡萄糖、半乳糖、麦芽糖和果糖。糖优选是葡萄糖，特别是D-葡萄糖(右旋糖)。碳能源通常将以约1至约10g/L存在。
本发明的分化培养基可以包含血清。可以使用获自任何适当来源的血清，包括胎牛血清(FBS)、山羊血清或人血清。优选地，使用人血清。根据常规技术，可以以培养基体积的约1％至约30％使用血清。
在其它实施方案中，本发明的分化培养基可以包含血清替代物。多种不同的血清替代物制剂可商购获得并且是技术人员已知的。当使用血清替代物时，根据常规技术，其可以以培养基体积的约1％至约30％被使用。
在其它实施方案中，本发明的分化培养基可以是无血清和/或无血清替代物的。无血清培养基是不含任何类型动物血清的培养基。无血清培养基可能是优选的，以避免干细胞可能的异种污染。无血清替代物培养基是尚未补充任何商业血清替代物制剂的培养基。
在优选实施方案中，分化培养基补充有纯化的、天然的、半合成的和/或合成的生长因子，并且不包含不确定的组分，如胎牛血清或小牛血清。例如，诸如B27(Invitrogen)、N-乙酰半胱氨酸(Sigma)和N2(Invitrogen)的补充剂刺激一些细胞的增殖。在一些实施方案中，分化培养基补充有这些补充剂中的一种或多种，例如这些补充剂中的一种、任意两种或全部三种。
用于本发明的分化培养基可以包含一种或多种微量元素，如下述的离子：钡、溴、钴、碘、锰、铬、铜、镍、硒、钒、钛、锗、钼、硅、铁、氟、银、铷、锡、锆、镉、锌和/或铝。
培养基可以包含还原剂，如浓度为约0.1mM的β-巯基乙醇。
本发明的分化培养基可以包含一种或多种另外的试剂，如先前报道用于改善干细胞培养的营养物或生长因子，如胆固醇/转铁蛋白/白蛋白/胰岛素/黄体酮、腐胺、亚硒酸盐/其它因子。
基础培养基
用于本发明的方法的分化培养基包含基础培养基。基础培养基是用于动物或人细胞的任何合适的基础培养基，其受本文提供的限制。
用于动物或人细胞培养的基础培养基通常含有大量成分，这些成分是支持培养细胞的维持所必需的。考虑以下公开内容，技术人员可以容易地配制合适的成分组合。如文献中以及以上更加详细描述的，用于本发明的基础培养基将通常包含营养液，所述营养液包含标准细胞培养成分，如氨基酸、维生素、脂质补充剂、无机盐、碳能源和缓冲剂。在一些实施方案中，还将培养基补充有一种或多种标准细胞培养成分，例如选自氨基酸、维生素、脂质补充剂、无机盐、碳能源和缓冲剂的细胞培养成分。
技术人员将从公知常识中理解培养基的类型，其可以在本发明的分化培养基中被用作基础培养基。潜在合适的细胞培养基可商购获得，包括但不限于杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle Media,DMEM)、最小必需培养基(MEM)、Knockout-DMEM(KO-DMEM)、格拉斯哥最小必需培养基(Glasgow Minimal Essential Medium,G-MEM)、伊格尔基础培养基(Basal Medium Eagle,BME)、DMEM/Ham's F12、改良型DMEM/Ham's F12、Iscove改良杜尔贝科培养基和和最小必需培养基(MEM)、Ham's F-10、Ham's F-12、培养基199以及RPMI 1640培养基。
例如，基础培养基可以选自补充有谷氨酰胺、胰岛素、青霉素/链霉素和转铁蛋白的DMEM/F12和RPMI 1640。在进一步优选的实施方案中，使用改良型DMEM/F12或改良型RPMI，其针对无血清培养进行了优化，并且已经包含了胰岛素。在这种情况下，所述改良型DMEM/F12或改良型RPMI培养基优选补充有谷氨酰胺和青霉素/链霉素。补充有N2和B27的AdDMEM/12(Invitrogen)也是优选的。优选地，基础培养基是改良型DMEM/F12。更优选地，基础培养基包含改良型DMEM/F12、谷氨酰胺和B27。
在一些实施方案中，基础培养基包含改良型DMEM/F12、HEPES、青霉素/链霉素、谷氨酰胺、N-乙酰半胱氨酸、B27、N2和胃泌素。
在一些实施方案中，基础培养基包含补充有青霉素/链霉素、10mM HEPES、Glutamax、1×N2、1×B27(全部来自Invitrogen)和约1.25mM N-乙酰半胱氨酸(Sigma)的改良型DMEM/F12或者由其组成。
另外优选地，所述基础培养基补充有纯化的、天然的、半合成的和/或合成的生长因子，并且不包含不确定的组分(如胎牛血清或小牛血清)。多种不同的血清替代物制剂可商购获得并且是技术人员已知的。当使用血清替代物时，根据常规技术，它可以以培养基体积的约1％至约30％被使用。
如本文其它地方所述，本发明中使用的分化培养基可以包含血清，或者可以是无血清和/或无血清替代物的。培养基和细胞制备优选是符合FDA对生物制剂产品所要求的标准并确保产品一致性的GMP过程。
通常将在去离子蒸馏水中配制本发明的分化培养基。在使用前，通常将本发明的分化培养基进行灭菌以防止污染，例如通过紫外线、加热、辐射或过滤。可以冷冻分化培养基(例如在-20℃或-80℃下)以存储或运输。培养基可以含有一种或多种抗生素以防止污染。培养基可以具有低于0.1个内毒素单位/ml的内毒素含量，或者可以具有低于0.05个内毒素单位/ml的内毒素含量。用于确定培养基的内毒素含量的方法在本领域是已知的。
优选的基础培养基是确定的合成培养基，其用基于碳酸盐的缓冲剂将pH缓冲为7.4(优选pH为7.2-7.6或者至少7.2且不高于7.6)，同时在包含5％至10％CO2或者至少5％且不超过10％CO2，优选5％CO2的环境中培养细胞。
在一些实施方案中，提供的分化培养基具有准备用于分化方法的基础培养基。在其它实施方案中，提供的分化培养基不含基础培养基，例如作为培养基补充剂，并且可以在用于分化方法之前添加基础培养基(或其它组分)。因此，提供了本文所述的任何分化培养基，其中不存在基础培养基或者其中基础培养基仅是任选组分。
组合物和容器
本发明还提供了组合物或细胞培养容器，其包含根据上述本发明任一方面所述的细胞和/或类器官以及根据上述本发明任一方面所述的分化培养基。例如，此类组合物或细胞培养容器可以包含在如上所述的分化培养基中根据本发明的方法培养的任何数量的细胞或类器官。
根据本发明的另外的方面，提供了含有本发明的分化培养基的气密密封容器。气密密封容器可以优选用于运输或储存分化培养基，以防止污染。容器可以是任何合适的容器，如细颈瓶、平板、瓶子、罐子、小瓶或袋子。
本发明的示例性培养基
在一些实施方案中，本发明的分化培养基包含：
(i)一种或多种受体酪氨酸激酶配体，例如选自针对RTK I类的配体(例如EGF)、针对RTK IV类的配体(例如FGF)和针对RTK VI类的配体(例如HGF)，各自优选浓度为1至200ng/ml，
(ii)一种或多种TGF-β抑制剂，如ALK5、ALK4或ALK7中的一种或多种抑制剂，例如选自A83-01、SB-431542、SB-505124、SB-525334、LY 364947、SD-208和SJN 2511的抑制剂，优选浓度为100nM至200μM，
(iii)Notch抑制剂，例如γ-分泌酶抑制剂，例如选自DAPT、二苯并氮杂(DBZ)、苯二氮(BZ)和LY-411575的γ-分泌酶抑制剂，优选浓度为0.001至100μM，和
(iv)一种或多种Wnt抑制剂，如(a)Wnt分泌抑制剂，例如选自IWP-2、LGK974和IWP-1的Porc抑制剂，优选浓度为0.01-150μM，和/或(b)β-连环蛋白靶基因表达的抑制剂，例如选自iCRT3、CGP049090、PKF118310、PKF115-584、ZTM000990、PNU-74654、BC21、iCRT5、iCRT14和FH535，优选浓度为0.05-150μM。
在一些实施方案中，本发明的分化培养基包含：
(i)一种或多种受体酪氨酸激酶配体，例如选自针对RTK I类的配体(例如EGF)、针对RTK IV类的配体(例如FGF)和针对RTK VI类的配体(例如HGF)的受体酪氨酸激酶配体，各自优选浓度为1至200ng/ml，
(ii)一种或多种TGF-β抑制剂，如ALK5、ALK4或ALK7中的一种或多种抑制剂，例如选自A83-01、SB-431542、SB-505124、SB-525334、LY 364947、SD-208和SJN 2511的抑制剂，优选浓度为100nM至200μM，
(iii)Notch抑制剂，例如γ-分泌酶抑制剂，例如选自DAPT、二苯并氮杂(DBZ)、苯二氮(BZ)和LY-411575，优选浓度为0.001至100μM，和(iv)GSK-3抑制剂，例如选自CHIR99021,6-BIO、Dibromocantharelline、海门地塞、靛玉红、Meridianins、CT98014、CT98023、CT99021、TWS119、SB-216763、SB-41528、AR-A014418、AZD-1080、阿特波龙、Cazpaullone、肯帕罗酮、Aloisines、Manzamine A、Palinurine、Tricantine、TDZD-8、NP00111、NP031115、Tideglusib、HMK-32和L803-mts，优选浓度为0.01-150μM。
在一些实施方案中，本发明的分化培养基包含：
(i)一种或多种受体酪氨酸激酶配体，例如选自针对RTK I类的配体(例如EGF)、针对RTK IV类的配体(例如FGF)和针对RTK VI类的配体(例如HGF)，各自优选浓度为1至200ng/ml，
(ii)一种或多种TGF-β抑制剂，如ALK5、ALK4或ALK7中的一种或多种抑制剂，例如选自A83-01、SB-431542、SB-505124、SB-525334、LY 364947、SD-208和SJN 2511，优选浓度为100nM至200μM，
(iii)Notch抑制剂，例如γ-分泌酶抑制剂，例如选自DAPT、二苯并氮杂(DBZ)、苯二氮(BZ)和LY-41157，优选浓度为0.001至100μM，
(iv)一种或多种Wnt抑制剂，如(a)Wnt分泌抑制剂，例如选自IWP-2、LGK974和IWP-1的Porc抑制剂，优选浓度为0.01-150μM，和/或(b)β-连环蛋白靶基因表达的抑制剂，例如选自iCRT3、CGP049090、PKF118310、PKF115-584、ZTM000990、PNU-74654、BC21、iCRT5、iCRT14和FH535，优选浓度为0.05-150μM，和
(v)GSK-3抑制剂，例如选自CHIR 99021、6-BIO、Dibromocantharelline、海门地塞、靛玉红、Meridianins、CT98014、CT98023、CT99021、TWS119、SB-216763、SB-41528、AR-A014418、AZD-1080、阿特波龙、Cazpaullone、肯帕罗酮、Aloisines、Manzamine A、Palinurine、Tricantine、TDZD-8、NP00111、NP031115、Tideglusib、HMK-32和L803-mts，优选浓度为0.01-150μM。
在一些实施方案中，本发明的分化培养基包含：
(i)一种或多种受体酪氨酸激酶配体，例如针对选自RTK I类的配体(例如EGF)、针对RTK IV类的配体(例如FGF)和针对RTK VI类的配体(例如HGF)，各自优选浓度为1至200ng/ml，
(ii)一种或多种TGF-β抑制剂，如ALK5、ALK4或ALK7中的一种或多种抑制剂，例如选自A83-01、SB-431542、SB-505124、SB-525334、LY 364947、SD-208和SJN 2511，优选浓度为100nM至200μM，
(iii)Notch抑制剂，例如γ-分泌酶抑制剂，例如选自DAPT、二苯并氮杂(DBZ)、苯二氮(BZ)和LY-411575，优选浓度为0.001至100μM，
(iv)GSK-3抑制剂，例如选自CHIR 99021、6-BIO、Dibromocantharelline、海门地塞、靛玉红、Meridianins、CT98014、CT98023、CT99021、TWS119、SB-216763、SB-41528、AR-A014418、AZD-1080、阿特波龙、Cazpaullone、肯帕罗酮、Aloisines、Manzamine A、Palinurine、Tricantine、TDZD-8、NP00111、NP031115、Tideglusib、HMK-32和L803-mts，优选浓度为0.01-150μM，和
(v)一种或多种Wnt抑制剂，其作用于β-连环蛋白破坏复合物的下游，如β-连环蛋白靶基因表达的抑制剂，例如选自iCRT3、CGP049090、PKF118310、PKF115-584、ZTM000990、PNU-74654、BC21、iCRT5、iCRT14和FH535，优选浓度为0.05-150μM。
在一些实施方案中，本发明的分化培养基包含：
(i)一种或多种受体酪氨酸激酶配体，例如选自针对RTK I类的配体(例如EGF)、针对RTK IV类的配体(例如FGF)和针对RTK VI类的配体(例如HGF)，各自优选浓度为1至200ng/ml，
(ii)一种或多种TGF-β抑制剂，如ALK5、ALK4或ALK7中的一种或多种抑制剂，例如选自A83-01、SB-431542、SB-505124、SB-525334、LY 364947、SD-208和SJN 2511，优选浓度为100nM至200μM，
(iii)Notch抑制剂，例如γ-分泌酶抑制剂，例如选自DAPT、二苯并氮杂(DBZ)、苯二氮(BZ)和LY-411575，优选浓度为0.001至100μM，和(iv)AP-1刺激剂，如毒蕈碱乙酰胆碱受体激动剂，例如选自卡巴胆碱、乙酰胆碱、氨甲酰胆碱、氧代震颤素、L-689,660(1-氮杂双环[2.2.2]辛烷、3-(6-氯吡嗪基)马来酸盐)、毛果芸香碱、毒蕈碱、McN-A343(4-[[[(3-氯苯基)氨基]羰基]氧基]-N,N,N-三甲基-2-丁炔-1-氯化铵)、77-LH-218-1(1-[3-(4-丁基-1-哌啶基)丙基]-3,4-二氢-2(1H)-喹啉酮)和乙酰甲胆碱，优选浓度为0.001-300μM。
在一些实施方案中，本发明的分化培养基包含：
(i)一种或多种受体酪氨酸激酶配体，例如选自针对RTK I类的配体(例如EGF)、针对RTK IV类的配体(例如FGF)和针对RTK VI类的配体(例如HGF)，各自优选浓度为1至200ng/ml，
(ii)一种或多种TGF-β抑制剂，如ALK5、ALK4或ALK7中的一种或多种抑制剂，例如选自A83-01、SB-431542、SB-505124、SB-525334、LY 364947、SD-208和SJN 2511，优选浓度为100nM至200μM，
(iii)Notch抑制剂，例如γ-分泌酶抑制剂，例如选自DAPT、二苯并氮杂(DBZ)、苯二氮(BZ)和LY-411575，优选浓度为0.001至100μM，
(iv)一种或多种Wnt抑制剂，(a)Wnt分泌抑制剂，例如选自IWP-2、LGK974和IWP-1的Porc抑制剂，优选浓度为0.01-150μM，和/或(b)β-连环蛋白靶基因表达的抑制剂，例如选自iCRT3、CGP049090、PKF118310、PKF115-584、ZTM000990、PNU-74654、BC21、iCRT5、iCRT14和FH535，优选浓度为0.05-150μM，和
(v)AP-1刺激剂，例如毒蕈碱乙酰胆碱受体激动剂，例如选自卡巴胆碱、乙酰胆碱、氨甲酰胆碱、氧代震颤素、L-689,660(1-氮杂双环[2.2.2]辛烷、3-(6-氯吡嗪基)马来酸盐)、毛果芸香碱、毒蕈碱、McN-A 343(4-[[[(3-氯苯基)氨基]羰基]氧基]-N,N,N-三甲基-2-丁炔-1-氯化铵)、77-LH-218-1(1-[3-(4-丁基-1-哌啶基)丙基]-3,4-二氢-2(1H)-喹啉酮)和乙酰甲胆碱，优选浓度为0.001-300μM。
在一些实施方案中，本发明的分化培养基包含：
(i)一种或多种受体酪氨酸激酶配体，例如选自针对RTK I类的配体(例如EGF)、针对RTK IV类的配体(例如FGF)和针对RTK VI类的配体(例如HGF)，各自优选浓度为1至200ng/ml，
(ii)一种或多种TGF-β抑制剂，如ALK5、ALK4或ALK7中的一种或多种抑制剂，例如选自A83-01、SB-431542、SB-505124、SB-525334、LY 364947、SD-208和SJN 2511，优选浓度为100nM至200μM，
(iii)Notch抑制剂，例如γ-分泌酶抑制剂，例如选自DAPT、二苯并氮杂(DBZ)、苯二氮(BZ)和LY-411575，优选浓度为0.001至100μM，
(iv)GSK-3抑制剂，例如选自CHIR 99021、6-BIO、Dibromocantharelline、海门地塞、靛玉红、Meridianins、CT98014、CT98023、CT99021、TWS119、SB-216763、SB-41528、AR-A014418、AZD-1080、阿特波龙、Cazpaullone、肯帕罗酮、Aloisines、Manzamine A、Palinurine、Tricantine、TDZD-8、NP00111、NP031115、Tideglusib、HMK-32和L803-mts，优选浓度为0.01-150μM，和
(v)AP-1刺激剂，如毒蕈碱乙酰胆碱受体激动剂，例如选自卡巴胆碱、乙酰胆碱、氨甲酰胆碱、氧代震颤素、L-689,660(1-氮杂双环[2.2.2]辛烷、3-(6-氯吡嗪基)马来酸盐)、毛果芸香碱、毒蕈碱、McN A 343(4-[[[(3-氯苯基)氨基]羰基]氧基]-N,N,N-三甲基-2-丁炔-1-氯化铵)、77-LH-218-1(1-[3-(4-丁基-1-哌啶基)丙基]-3,4-二氢-2(1H)-喹啉酮)和乙酰甲胆碱，优选浓度为0.001-300μM。
在一些实施方案中，本发明的分化培养基包含：
(i)一种或多种受体酪氨酸激酶配体，例如选自针对RTK I类的配体(例如EGF)、针对RTK IV类的配体(例如FGF)和针对RTK VI类的配体(例如HGF)，各自优选浓度为1至200ng/ml，
(ii)一种或多种TGF-β抑制剂，如ALK5、ALK4或ALK7中的一种或多种抑制剂，例如选自A83-01、SB-431542、SB-505124、SB-525334、LY 364947、SD-208和SJN 2511的抑制剂，优选浓度为100nM至200μM，
(iii)Notch抑制剂，例如γ-分泌酶抑制剂，例如选自DAPT、二苯并氮杂(DBZ)、苯二氮(BZ)和LY-411575，优选浓度为0.001至100μM，
(iv)一种或多种Wnt抑制剂，(a)Wnt分泌抑制剂，例如选自IWP-2、LGK974和IWP-1的Porc抑制剂，优选浓度为0.01-150μM，和/或(b)β-连环蛋白靶基因表达的抑制剂，例如选自iCRT3、CGP049090、PKF118310、PKF115-584、ZTM000990、PNU-74654、BC21、iCRT5、iCRT14和FH535的β-连环蛋白靶基因表达的抑制剂，优选浓度为0.05-150μM，
(v)GSK-3抑制剂，例如选自CHIR 99021、6-BIO、Dibromocantharelline、海门地塞、靛玉红、Meridianins、CT98014、CT98023、CT99021、TWS119、SB-216763、SB-41528、AR-A014418、AZD-1080、阿特波龙、Cazpaullone、肯帕罗酮、Aloisines、Manzamine A、Palinurine、Tricantine、TDZD-8、NP00111、NP031115、Tideglusib、HMK-32和L803-mts，优选浓度为0.01-150μM，和
(vi)AP-1刺激剂，如毒蕈碱乙酰胆碱受体激动剂，例如选自卡巴胆碱、乙酰胆碱、氨甲酰胆碱、氧代震颤素、L-689,660(1-氮杂双环[2.2.2]辛烷、3-(6-氯吡嗪基)马来酸盐)、毛果芸香碱、毒蕈碱、McN A 343(4-[[[(3-氯苯基)氨基]羰基]氧基]-N,N,N-三甲基-2-丁炔-1-氯化铵)、77-LH-218-1(1-[3-(4-丁基-1-哌啶基)丙基]-3,4-二氢-2(1H)-喹啉酮)和乙酰甲胆碱，优选浓度为0.001-300μM。
在这些实施方案的任何实施方案中，分化培养基还可以包含BMP通路激活剂(例如BMP7)(优选浓度为0.01ng/ml至500ng/ml)和/或胃泌素(优选浓度为0.01nM至500nM)。
在优选实施方案中，本发明的分化培养基包含(i)一种或多种受体酪氨酸激酶配体(例如EGF、HGF和/或FGF19)，(ii)一种或多种TGF-β抑制剂(例如A83-01)，(iii)Notch抑制剂(例如DAPT和/或DBZ)，(iv)糖皮质激素(例如地塞米松)，(v)一种或多种Wnt抑制剂(例如IWP-2和/或iCRT3)，(vi)GSK-3抑制剂(例如CHIR99021)和(vii)AP-1刺激剂(例如毒蕈碱乙酰胆碱受体激动剂，如卡巴胆碱)。在一些实施方案中，本发明的分化培养基还包含：(viii)BMP通路激活剂(例如BMP7)和/或(ix)胃泌素。
因此，在一些实施方案中，本发明的分化培养基包含(i)EGF(例如浓度为约50ng/ml)、HGF(例如浓度为约25ng/ml)和FGF19(例如浓度为约100ng/ml)，(ii)A83-01(例如浓度为约0.5μM)，(iii)DAPT(例如浓度为约10μM)，(iv)地塞米松(例如浓度为约3μM)，(v)IWP-2(例如，浓度为约3μM)和iCRT3(例如浓度为约50μM)，(vi)CHIR99021(例如浓度为约3μM)，(vii)卡巴胆碱(例如浓度为约100μM)，(viii)BMP7(例如浓度为约25ng/ml)以及(ix)胃泌素(例如浓度为约10nM)。
这些分化培养基特别适用于分化肝细胞。还设想这些培养基可用于密切相关的组织(如胰腺)。还设想这些培养基更普遍地用于上皮细胞的分化。
分离
发明人惊奇地发现，如果在分化培养基中培养较小的类器官，则可以改善分化。具体地，发明人发现在将类器官添加到分化培养基之前分离肝脏类器官培养物导致更高的分化效率(参见图2F)。因此，更大比例的细胞群展现出肝细胞标志物(例如白蛋白和Cyp3A4)，并且分化的细胞展现出更高水平的肝细胞标志物。
因此，在一些实施方案中，在分化培养基中培养之前分离祖细胞培养物。在一些实施方案中，该分离发生在在扩增培养基中培养至少三天、至少四天、至少五天、至少六天或至少七天之后。例如，在一些实施方案中，将祖细胞(例如上皮干细胞)在扩增培养基中培养5天，然后分离培养物，然后在本发明的分化培养基中进行培养。
在一个实施方案中，本发明提供了培养单个上皮干细胞、上皮干细胞群或分离的组织碎片的方法，优选以产生类器官，其中所述方法包括：
在扩增培养基中培养上皮细胞、上皮细胞群或分离的组织碎片以获得扩增的细胞群(优选地以获得一种或多种类器官)；
在扩增培养基中培养至少三天、至少四天、至少五天、至少六天或至少七天之后分离扩增培养物；以及
在分化培养基中培养扩增的细胞群或一种或多种类器官。
在一些实施方案中，在分离之前向扩增培养基中添加如本文所述的BMP通路激活剂(例如BMP7)。例如，在一些实施方案中，在扩增培养基中培养至少三天、至少四天、至少五天、至少六天或至少七天之后向扩展培养基中添加BMP7。
细胞外基质
在一些实施方案中，培养细胞的方法(例如扩增和/或分化细胞的方法)包括培养与细胞外基质(ECM)接触的细胞。可以使用任何合适的ECM。优选在微环境中培养细胞，所述微环境至少部分模拟所述细胞天然存在的细胞小生境。由细胞和所述小生境中的细胞分泌的ECM部分确定细胞小生境。可以通过在提供与细胞膜蛋白(如整合蛋白)的相互作用的生物材料或合成材料的存在下培养所述细胞来模拟细胞小生境。因此，如本文所述的ECM是例如通过与细胞膜蛋白(如整合蛋白)相互作用，模拟体内细胞小生境的任何生物材料或合成材料或其组合。
在本发明优选的方法中，将细胞与ECM接触培养。“接触”意为物理或机械或化学接触，这意味着为了将所述得到的类器官或上皮细胞群与所述细胞外基质分离，需要使用力。在一些实施方案中，ECM是三维基质。在一些实施方案中，将细胞嵌入ECM中。在一些实施方案中，细胞附着于ECM。可以将本发明的培养基扩散进三维ECM中。
在另一实施方案中，ECM处于悬浮状态，即细胞在悬浮系统中与ECM接触。在一些实施方案中，ECM以至少1％、至少2％或至少3％的浓度存在于悬浮液中。在一些实施方案中，ECM以1％至约10％或1％至约5％的浓度存在于悬浮液中。对于规模扩大的方法，悬浮方法可能具有优势。
一种类型的ECM由上皮细胞、内皮细胞、腔壁内胚层样细胞(例如Hayashi等人(2004)Matrix Biology 23:47 62中描述的Englebreth–Holm-Swarm腔壁内胚层样细胞)和结缔组织细胞分泌。该ECM包含多种多糖、水、弹性蛋白和糖蛋白，其中糖蛋白包含胶原蛋白、巢蛋白(entactin)(巢蛋白(nidogen))、纤连蛋白和层粘连蛋白。因此，在一些实施方案中，用于本发明的方法的ECM包含选自以下列出的一种或多种组分：多糖、弹性蛋白和糖蛋白(例如其中所述糖蛋白包含胶原蛋白、巢蛋白(entactin)(巢蛋白(nidogen))、纤连蛋白和/或层粘连蛋白)。例如，在一些实施方案中，将胶原蛋白用作ECM。不同类型的ECM是已知的，其包含不同的组成，包括不同类型的糖蛋白和/或糖蛋白的不同组合。
可以在移除这些细胞和添加分离的组织碎片或分离的上皮细胞之前通过在容器中培养产生ECM的细胞(如例如上皮细胞、内皮细胞、腔壁内胚层样细胞或成纤维细胞)来提供ECM。产生细胞外基质的细胞的实例是软骨细胞(主要产生胶原蛋白和蛋白聚糖)、成纤维细胞(主要产生IV型胶原、层粘连蛋白、间质前胶原和纤连蛋白)和结肠肌成纤维细胞(主要产生胶原蛋白(I型、III型和V型)、硫酸软骨素蛋白聚糖、透明质酸、纤连蛋白和肌腱蛋白-C。这些是“天然产生的ECM”。可以商业提供天然产生的ECM。可商购获得的细胞外基质的实例包括：细胞外基质蛋白(Invitrogen)和来自Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤细胞的基底膜制剂(例如基底膜提取物(Trevigen,Inc.)或MatrigelTM(BDBiosciences))。
因此，在一些实施方案中，是天然产生的ECM。在一些实施方案中，ECM是含有层粘连蛋白的ECM，如MatrigelTM(BD Biosciences)。在一些实施方案中，ECM是MatrigelTM(BDBiosciences)，其包含层粘连蛋白、巢蛋白和胶原蛋白IV。在一些实施方案中，ECM包含层粘连蛋白、巢蛋白、胶原蛋白IV和硫酸肝素蛋白聚糖(例如2型基底膜提取物(Trevigen,Inc.))。在一些实施方案中，ECM包含至少一种糖蛋白(如胶原蛋白和/或层粘连蛋白)。用于本发明方法的优选的ECM包含胶原蛋白和层粘连蛋白。进一步优选的ECM包含层粘连蛋白、巢蛋白和胶原蛋白IV。如果需要，可以使用天然产生的或合成的ECM材料的混合物。
在另一实施方案中，ECM可以是合成的ECM。例如，可以使用合成的ECM，如ProNectin(Sigma Z378666)。在另一实例中，ECM可以是塑料(例如聚酯)或水凝胶。在一些实施方案中，可以用生物材料(例如一种或多种糖蛋白，如胶原蛋白或层粘连蛋白)包被合成基质
三维ECM支持培养三维上皮类器官。细胞外基质材料通常将是平皿底部的液滴，其中细胞悬浮在其中。通常，当基质在37℃凝固时，添加培养基并扩散进ECM中。培养基中的细胞通过与其表面结构的相互作用(例如与整合蛋白的相互作用)而粘附于ECM。
可以将培养基和/或细胞可以置于ECM上，嵌入ECM中或与ECM混合。
例如，在一些实施方案中，将单个细胞、细胞群或组织碎片嵌入MatrigelTM(其是任选地生长因子减少和/或不含酚红)中。
在一些实施方案中，将培养基置于ECM的顶部。然后可以在需要时移除和补充培养基。在一些实施方案中，每1、2、3、4、5、6或7天补充培养基。如果向培养基“添加”或从培养基“移除”组分，则在一些实施方案中，这可以意味着从ECM移除培养基本身，和然后将含有“添加的”组分或具有排除的“移除的”组分的新培养基置于ECM上。
用于培养的祖细胞和干细胞和获得所述细胞
分化方法可用于祖细胞。祖细胞在本文被限定为具有分化潜能的任何细胞。因此，术语“祖细胞”涵盖干细胞，其包括但不限于成体干细胞、胚胎干细胞和iPS细胞。祖细胞可以是例如原代干细胞或扩增的干细胞或部分分化的干细胞。在一些实施方案中，祖细胞是原代细胞，意为直接从活组织获得。在其它实施方案中，祖细胞是次级细胞，即已经培养和/或传代的细胞。在一些实施方案中，祖细胞是扩增的细胞。术语“扩增的”意为在分化之前细胞已在促进细胞扩增(例如增殖)的培养基中体外培养细胞。
在优选实施方案中，祖细胞是成体祖细胞，即来源于成体组织。在一些实施方案中，成体祖细胞是成体干细胞(例如成体上皮干细胞)。在该情境下，“成体”包括新生儿或儿童，但排除胚胎或胎儿。在一些实施方案中，祖细胞不来源于胚胎干细胞或胚胎干细胞系(例如人胚胎干细胞或人胚胎干细胞系)。在一些实施方案中，祖细胞不来源于脐带和/或胎盘组织。
在优选的实施方案中，祖细胞是上皮祖细胞。例如，在优选的实施方案中，祖细胞来源于上皮组织，更优选成体上皮组织。上皮组织包括肝脏、胰腺、肠、胃、前列腺、肺、乳腺、卵巢、唾液腺、毛囊、皮肤、食道、耳朵、膀胱或甲状腺。因此，在一些实施方案中，祖细胞获自肝脏、胰腺、肠、胃、前列腺、肺、乳腺、卵巢、唾液腺、毛囊、皮肤、食道、耳朵、膀胱或甲状腺。在一些实施方案中，祖细胞获自肝脏或胰腺。在优选的实施方案中，祖细胞获自肝脏。
在优选的实施方案中，祖细胞是哺乳动物细胞。例如，在优选的实施方案中，细胞来源于哺乳动物组织。例如，在一些实施方案中，祖细胞是人细胞。在一些实施方案中，祖细胞来自实验动物(例如小鼠、兔、大鼠、豚鼠)、伴侣动物(例如狗、猫、马)或农场动物(例如牛、猪、绵羊、山羊)。
原代细胞代表了体内情况的最佳实验模型。在本发明的优选的实施方案中，祖细胞是(或来源于)原代祖细胞(例如原代上皮干细胞)。可以将原代细胞培养物传代以形成次级细胞培养物。除癌细胞外，传统的次级上皮细胞培养物具有有限的寿命。在一定数量的群体倍增(例如50-100代)后，细胞经历衰老过程并停止分裂。可以将来自次级培养物的细胞变成永生化以成为连续细胞系。永生化可以自发发生，或者可以是病毒或化学诱导的。永生化细胞系也被称为转化的细胞。在本发明优选的实施方案中，细胞获自扩增的上皮干细胞培养物，优选扩增的类器官，其已经被扩增和/或传代而没有永生化或转化。在一些实施方案中，这些扩增的上皮培养物或类器官可以是遗传异质性的(与传统细胞系不同)。因此，在一些实施方案中，祖细胞不是永生化的细胞或转化的细胞或者不来源于永生化的细胞系或转化的细胞系。
可以通过任何合适的方法获得祖细胞，例如如WO2010/090513、WO2012/014076、WO2012/168930或WO2015/173425中所述。在一些实施方案中，例如如实施例中和Dorell等人，2008(Hepatology.2008Oct；48(4):1282-91.Surface markers for the murine ovalcell response.Dorrell C,Erker L,Lanxon-Cookson KM,Abraham SL,Victoroff T,RoS,Canaday PS,Streeter PR,Grompe M)中所述，通过胶原酶消化来分离细胞。在一些实施方案中，在组织活检切片上进行胶原酶消化。在一些实施方案中，使用胶原酶和细胞消化液(accutase)消化来获得用于本发明的祖细胞。
在一些实施方案中，祖细胞是表达Lgr5的上皮干细胞。优选使用来自成体组织的细胞，优选来自成体组织的上皮干细胞，更优选表达Lgr5的上皮干细胞获得类器官。
在一些实施方案中，祖细胞是正常细胞，意为细胞具有正常核型、基因型和/或表型。在可替代的实施方案中，祖细胞是疾病细胞，意为它们具有疾病核型、基因型和/或表型。例如，在一些实施方案中，祖细胞是癌细胞。因此，设想例如上皮干细胞可以是Lgr5阳性癌症干细胞。因此，如果需要可以从肿瘤获得细胞。在可替代的实施方案中，祖细胞是患病祖细胞，例如用细胞内病原体(例如细菌、病毒或寄生虫)感染的祖细胞。
示例性方法
本发明提供了分化祖细胞的方法，其中所述方法包括在本文所述的分化培养基中培养细胞。在优选的实施方案中，如本文所述将细胞与ECM接触培养。
本发明还提供了培养祖细胞的方法，其中所述方法包括在扩增培养基中培养细胞，并随后在本文所述的分化培养基中培养细胞。在一些实施方案中，在扩增和/或分化步骤期间，如本文所述将细胞与ECM接触培养。在一些实施方案中，在分化培养基中培养细胞之前，移除扩增培养基，例如通过反复洗涤或分离细胞培养物。
本发明提供了培养单个上皮干细胞、上皮干细胞群或分离的组织碎片的方法，优选以获得类器官，其中所述方法包括：
在扩增培养基中培养上皮干细胞、上皮干细胞群或分离的组织碎片以提供扩增的细胞群；和
在分化培养基中培养扩增的细胞群。
本发明还提供了分化单个祖细胞或祖细胞群的方法，其中所述方法包括：
在分化培养基中培养祖细胞或祖细胞群。
分化培养基可以是本文描述的任何分化培养基。例如，在一些实施方案中，分化培养基包含(i)一种或多种受体酪氨酸激酶配体(例如EGF、HGF和/或FGF19)，(ii)一种或多种TGF-β抑制剂(例如A83-01)，(iii))Notch抑制剂(例如DAPT和/或DBZ)，(iv)糖皮质激素(例如地塞米松)，(v)一种或多种Wnt抑制剂(例如IWP-2和/或iCRT3)，(vi)GSK-3抑制剂(例如CHIR99021)和(vii)AP-1刺激剂(例如毒蕈碱乙酰胆碱受体激动剂，如卡巴胆碱)。在一些实施方案中，本发明的分化培养基还包含：(viii)BMP通路激活剂(例如BMP7)和/或(ix)胃泌素。
扩增培养基可以是用于上皮干细胞或祖细胞的任何合适的扩增培养基，优选用于上皮干细胞的合适的扩增培养基(例如如WO2010/090513、WO2012/014076、WO2012/168930或WO2015/173425中所述)。
在一些实施方案中，扩增培养基包含一种或多种受体酪氨酸激酶配体(例如EGF、HGF和/或FGF10)、烟酰胺和一种或多种Wnt激动剂(例如Rspondin条件化培养基和/或Wnt条件化培养基)。
在一些实施方案中，扩增培养基包含一种或多种受体酪氨酸激酶配体(例如EGF、HGF和/或FGF10)、一种或多种Wnt激动剂(例如Rspondin条件化培养基和/或Wnt条件化培养基)和一种或多种TGF-β抑制剂(例如A83-01)。
在一些实施方案中，扩增培养基包含一种或多种受体酪氨酸激酶配体(例如EGF、HGF和/或FGF10)、烟酰胺、一种或多种Wnt激动剂(例如Rspondin条件化培养基和/或Wnt条件化培养基)和一种或多种TGF-β抑制剂(例如A83-01)。
在这些实施方案的任何实施方案中，扩增培养基还可以包含cAMP通路激活剂(例如毛喉素)、胃泌素和/或BMP抑制剂(例如头蛋白)。
例如，在一些实施方案中(例如在用于肝脏的优选的实施方案中)，扩增培养基包含(i)EGF(例如约50ng/ml)、HGF(例如约25ng/ml)和FGF10(例如约100ng/ml)；(ii)A83-01(例如约5μM)；(iii)Rspondin条件化培养基(例如约10％)；(iv)烟酰胺(例如约0.01M)；(v)毛喉素(例如约10μM)和(vi)胃泌素(例如约10nM)。在一些实施方案中，扩增培养基还包含n-乙酰半胱氨酸(例如约1.25mM)、1x N2和1x B27(任选地不含维生素A的1xB27)。
优选地，在分化之前扩增细胞以产生一种或多种(例如至少2、3、4、5、6、10、15、20或多于20种)类器官。
在一些实施方案中，最初在本文所述的扩增培养基中培养细胞，一旦建立成功的类器官，则用本文所述的分化培养基替换扩增培养基。因此，在一些实施方案中，在一次或多次(例如在两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次或更多次之后)传代之后，用分化培养基替换扩增培养基。
对于本领域技术人员显而易见的是，本发明优选的培养方法是有利的，因为不需要饲养细胞。通常使用饲养细胞层以支持干细胞的培养，并抑制它们的分化。饲养细胞层通常是与目标细胞共培养的单层细胞，其提供适于目标细胞生长的表面。饲养细胞层提供了其中目标细胞可以生长的环境。饲养细胞通常是有丝分裂失活的(例如通过辐射或用丝裂霉素C处理)以防止它们的增殖。饲养细胞的使用是非期望的，因为它使细胞的传代变得复杂(在每次传代时，必须将细胞与饲养细胞分离，并且在每次传代时需要新的饲养细胞)。饲养细胞的使用还可导致饲养细胞污染所需细胞。这对于任何医学应用显然是有问题的，并且甚至在研究情境下，这使对细胞进行的任何实验的结果分析复杂化。如本文其它地方所指明的，本发明的培养基是特别有利的，因为可以将它们用于在没有饲养细胞接触的情况下培养细胞，即本发明的方法不需要饲养细胞层来支持其生长受到帮助的细胞。
因此，本发明的组合物可以是不含饲养细胞的组合物。如果组合物中的细胞在不存在饲养细胞层的情况下已经培养了至少一代，则通常认为组合物不含饲养细胞。本发明的不含饲养细胞的组合物将通常含有少于约5％，少于约4％，少于约3％，少于约2％，少于约1％的饲养细胞(表示为组合物中的细胞总数的％)或者优选根本不含饲养细胞。
在另一方面，提供了获得分化细胞群或类器官的方法，其中所述方法包括在本发明的分化培养基中培养祖细胞。优选地，该方法包括使用如本文所述的分化方法在本发明的分化培养基中培养祖细胞。
在一些实施方案中，该方法包括从单个上皮干细胞获得类器官/分化细胞群。在另一实施方案中，该方法包括从上皮干细胞群或从上皮组织碎片获得类器官/分化细胞群。
在具体的实施方案中，提供了获得分化的类器官的方法，其中所述方法包括在本发明的分化培养基中培养上皮祖细胞(例如上皮干细胞，任选地表达Lgr5的上皮干细胞)，优选地其中上皮祖细胞与ECM(优选三维ECM)接触。
在一些实施方案中，该方法包括在扩增培养基中培养祖细胞一段时间，例如3天至10周，1至10周，1至4周或10天至3周，然后将细胞传代(例如将细胞分离成单细胞密度，以每个容器(例如每个孔)1个细胞的比例接种一个或多个细胞)，使用扩增培养基继续扩增细胞一段时间，例如3天至10周，1至10周，1至4周或10天至3周，并在分化细胞之前重复传代和扩增步骤至少一次、至少两次、至少三次、至少四次、至少五次、至少六次、至少七次、至少八次、至少九次、至少十次、至少十一次、至少十二次、至少十三次或至少十四次。
在一些实施方案中，该方法包括在分化培养基中培养祖细胞至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天。在一些实施方案中，该方法包括在分化培养基中培养祖细胞约1至约20天、约1至约10天或约1至约5天。
分化之后，该方法还可以包括获得和/或分离一种或多种分化的细胞或分化的类器官。例如，在培养祖细胞后，从培养基中移出培养基中培养的一种或多种细胞和/或一种或多种类器官用于后续应用可能有用。可以使用本领域已知的许多物理分离方法中的任何一种来选择本发明的细胞并将它们与其它细胞类型区分开。此类物理方法可以包括基于由本发明的细胞特异性表达的标志物的FACS和多种免疫亲和方法。
在一个实施方案中，可以利用抗体(例如针对这些标志物之一的抗体)通过FACS分离细胞，。对本领域技术人员显而易见的是，这可以通过荧光标记的抗体或者通过对一级抗体具有结合特异性的荧光标记的二级抗体来实现。合适的荧光标记的实例包括但不限于FITC、Alexa488、GFP、CFSE、CFDA-SE、DyLight 488、PE、PerCP、PE-AlexaPE-Cy5)、PE-Cy5.5、PI、和PE-Cy7。该列表仅作为示例提供，并非旨在进行限制。
可替代地，可以通过免疫亲和纯化分离细胞，免疫亲和纯化是本领域众所周知的分离方法。该方法依赖于抗体在纯化柱上的固定。然后将细胞样品加载到柱上，允许适当的细胞与抗体结合，并因此与柱结合。洗涤步骤之后，使用优先与固定化抗体结合的竞争剂从柱上洗脱细胞，并允许细胞从柱中被释放出来。
对本领域技术人员显而易见的是，使用固定化抗体的免疫亲和纯化将提供纯化的细胞群。然而，在一些实施方案中，可以优选通过使用一种或多种其它可鉴定的标志物进行又一轮的免疫亲和纯化来进一步纯化细胞群，并使用等分试样的分离的克隆来确定其它相关的细胞内标志物的表达。
对本领域技术人员显而易见的是，不一定需要顺序纯化步骤涉及相同的物理分离方法。
分化的细胞和类器官
本发明还提供了分化的类器官或一种或多种分化细胞群。
分化的类器官是包含分化的上皮细胞类型的三维结构。分化的类器官通常是自组织的，这意味着当细胞分化时，类器官中细胞的三维排列自发地发生。在一些实施方案中，分化的类器官来源于上皮干细胞，任选地表达Lgr5的上皮干细胞。
在一个实施方案中，本发明提供了通过本发明的方法可获得的或获得的分化的类器官或一种或多种分化细胞群，例如所述本发明的方法包括在本发明的分化培养基中培养祖细胞，优选地其中祖细胞是与三维ECM接触的。
细胞“群”是大于1的任何数目的细胞，但优选至少10个细胞、至少50个细胞、至少100个细胞、至少500个细胞、至少1x103个细胞、至少1x104个细胞、至少1x105个细胞、至少1x106个细胞、至少1x107个细胞、至少1x108个细胞或者至少1x109个细胞。
根据本发明的分化的类器官可以包含具有以下细胞数的细胞群：至少10个细胞，至少50个细胞，至少100个细胞，至少500个细胞，至少1x103个细胞，至少1x104个细胞，至少1x105细胞，至少1×106个细胞，至少1×107个细胞或者更多。在一些实施方案中，每个类器官包含大约1×103个细胞至5×103个细胞；通常，一个孔(例如24孔板的一个孔)中可以一起生长10-20个类器官。
技术人员清楚的是，本发明的类器官不是天然存在的组织碎片和/或不包含血管。例如，在本发明的肝脏类器官的情况下，它不包含天然存在的肝小叶或天然存在的胆管。
例如，本发明的类器官与天然存在的组织不同，因为它们仅包含上皮细胞类型(并且不包含间充质细胞或其它结构细胞类型)。因此，在一些实施方案中，本发明的分化的类器官仅包含上皮细胞。在一些实施方案中，分化的类器官不包含非上皮细胞。例如，在具体的实施方案中，分化的类器官不包含间充质细胞。
本文所述的分化培养基优选在培养至少五天期间诱导或促进细胞的特异性分化。如本文所限定的，可以通过检测与特定组织谱系(例如肝脏谱系)相关的特定标志物的存在来判断分化。如本文所限定的，可以通过检测与组织谱系(例如肝脏谱系)相关的特定标志物的存在来判断分化。根据标志物的特性，可以在如本文所限定的分化培养基中培养至少5、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或更多天之后通过RTPCR或免疫组织化学来评估所述标志物的表达。
术语“表达”被用于描述细胞内标志物的存在。为了被认为是表达，标志物必须以可检测的水平存在。“可检测的水平”意为可以使用标准实验室方法之一(如PCR、印迹或FACS分析)来检测标志物。如果在30个PCR循环(这对应于每个细胞至少约100个拷贝的细胞中的表达水平)后可以合理地检测到表达，则认为基因由本发明群体的细胞表达。术语“表达(express)”和“表达(expression)”具有一致的含义。在低于该阈值的表达水平，认为标志物不被表达。可以优选通过比较已经从相同物种中分离出来的两种细胞类型来进行本发明的细胞中的标志物的表达水平与另一细胞(如例如胚胎干细胞)中相同标志物的表达水平之间的比较。优选地，该物种是哺乳动物，并且更优选地该物种是人。可以使用逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)实验方便地进行此类比较。
本发明的分化的类器官或本发明的分化的细胞群优选包含至少50％的活细胞，更优选至少60％的活细胞，更优选至少70％的活细胞，更优选至少80％的活细胞，更优选至少90％的活细胞。可以在FACS中使用Hoechst染色或中的碘化丙啶染色来评估细胞的活力。活细胞优选具有相应的体内功能或特性。例如，活的肝脏细胞优选具有肝功能或特征或者肝细胞。
在一些实施方案中，类器官是肝脏、胰腺、肠、胃、前列腺、肺、乳腺、卵巢、唾液腺、毛囊、皮肤、食道、耳朵、膀胱或甲状腺类器官。这意味着类器官来源于肝脏、胰腺、肠、胃、前列腺、肺、乳腺、卵巢、唾液腺、毛囊、皮肤、食道、耳朵、膀胱或甲状腺细胞。在一些实施方案中，类器官是肝脏或胰腺类器官。在优选的实施方案中，类器官是肝脏类器官。
在一些实施方案中，本发明的分化的细胞群来源于肝脏、胰腺、肠、胃、前列腺、肺、乳腺、卵巢、唾液腺、毛囊、皮肤、食道、耳朵、膀胱或甲状腺细胞。在一些实施方案中，分化的细胞群来源于肝脏细胞或胰腺细胞。在优选的实施方案中，分化的细胞群来源于肝脏细胞。
发明人已经表明，通过本发明的方法获得的肝脏类器官得到了改善，因为这些类器官中分化细胞的比例大于先前在WO2012/014076和WO2015/173425中所述的分化的肝脏类器官中分化的细胞的比例，并且这些类器官中分化的细胞的比例大于实施例1中所述的旧的分化培养基(DM)中分化的肝脏类器官中分化的细胞的比例(例如本发明的类器官中更大比例的细胞群表达肝细胞标志物)。此外，本发明的类器官中分化的细胞比先前WO2012/014076和WO2015/173425中描述的分化的肝脏类器官中的分化的细胞更类似于肝细胞，并且本发明的类器官中的分化的细胞比在实施例1中所述的旧的分化培养基(DM)中分化的肝脏类器官中的分化细胞更类似于肝细胞(例如本发明的类器官中个体分化细胞的肝细胞标志物的平均表达水平更高)。此外，与先前在WO2012/014076和WO2015/173425中描述的肝脏类器官或在实施例1中描述的旧的分化培养基(DM)中分化的肝脏器官相比，肝脏类器官具有降低的胆命运承诺。
在一些实施方案中，本发明的分化的类器官是分化的肝脏类器官，其中至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％。％、至少80％、至少90％或至少99％的细胞表达肝细胞标志物(例如白蛋白、HNF4a、ASGPR、CYP1A2和/或CYP3A4)。在一些实施方案中，通过免疫荧光染色来测量mRNA的表达。
在一些实施方案中，分化的细胞群是分化的肝脏细胞群，其中至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少99％的细胞表达肝细胞标志物(例如白蛋白、、HNF4a、ASGPR、CYP1A2和/或CYP3A4)。在一些实施方案中，通过免疫荧光染色测量mRNA表达。
在一些实施方案中，本发明的分化的类器官是分化的肝脏类器官，其中比先前DM培养基中分化的相应肝脏类器官(实施例1中所述)多至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％、至少200％或至少300％的细胞表达肝细胞标志物(例如白蛋白、HNF4a、ASGPR、CYP1A2和/或CYP3A4)。在一些实施方案中，通过免疫荧光染色测量mRNA的表达。在该背景下，“相应的肝脏类器官”意为来自相同来源(例如来源于相同的类器官培养物和相同个体的细胞)的肝脏类器官。相同的限定适用于本部分的其它地方。
在一些实施方案中，分化的细胞群是分化的肝脏细胞群，其中比先前DM培养基中分化的相应肝脏细胞群(实施例1中所述)多至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％、至少200％或至少300％的细胞表达肝细胞标志物(例如白蛋白、HNF4a、ASGPR、CYP1A2和/或CYP3A4)。在一些实施方案中，通过免疫荧光染色测量mRNA的表达。在该背景下，“相应的肝脏细胞群”意为来自相同来源的肝脏细胞群，即来源于相同的细胞培养物和相同个体的细胞。相同的限定适用于本部分的其它地方。
如以下详细描述的，可以基于相对于管家基因(例如GAPDH)的mRNA表达水平的多种标志物(例如白蛋白、HNF4、SerpinA1、ASPGR、Cyp1A2、Cyp3A4、CK7和/或CK19)的mRNA表达水平来限定分化的肝脏类器官或分化的肝脏细胞群。在一些实施方案中，使用RT-PCR测定这些标志物中的一种或多种以及管家基因的mRNA表达水平。在一些实施方案中，所述测定包括：(a)从本发明的分化的肝脏类器官或本发明的分化的肝脏细胞群中分离mRNA，(b)将分离的mRNA逆转录为cDNA，(c)PCR扩增与以下相对应的cDNA：(i)目标标志物(例如白蛋白、HNF4、SerpinA1、ASPGR、Cyp1A2、Cyp3A4、CK7或CK19)和(ii)管家基因(例如GAPDH)，以及(d)相对于获自PCR扩增的与管家基因(如GAPDH)相对应的cDNA的PCR产物的量，定量获自PCR扩增的与目标标志物(例如白蛋白、HNF4、SerpinA1、ASPGR、Cyp1A2、Cyp3A4、CK7或CK19)相对应的cDNA的PCR产物的量。
在一些实施方案中，本发明的分化的类器官是分化的肝脏类器官，其中白蛋白的mRNA表达水平为至少1.0x10-2、至少1.0x10-1、至少1.0x100、至少1.0x101或至少5.0x101(相对于GAPDH的表达)。
在一些实施方案中，分化的细胞群是分化的肝脏细胞群，其中白蛋白的mRNA表达水平为至少1.0x10-2、至少1.0x10-1、至少1.0x100、至少1.0x101或至少5.0x101(相对于GAPDH的表达)。
在一些实施方案中，本发明的分化的类器官是分化的肝脏类器官，其中HNF4a的mRNA表达水平为至少0.002、至少0.003、至少0.004、至少0.005、至少0.006、至少0.007、至少0.008、至少0.009或至少0.01(相对于GAPDH的表达)。
在一些实施方案中，分化的细胞群是分化的肝脏细胞群，其中HNF4a的mRNA表达水平为至少0.002、至少0.003、至少0.004、至少0.005、至少0.006、至少0.007、至少0.008、至少0.009或至少0.01(相对于GAPDH的表达)。
在一些实施方案中，本发明的分化的类器官是分化的肝脏类器官，其中SerpinA1的mRNA表达水平为至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10(相对于GAPDH的表达)。
在一些实施方案中，分化的细胞群是分化的肝脏细胞群，其中SerpinA1的mRNA表达水平为至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10(相对于GAPDH的表达)。
在一些实施方案中，本发明的分化的类器官是分化的肝脏类器官，其中ASPGR的mRNA表达水平为至少0.001、至少0.002、至少0.003、至少0.004、至少0.005、至少0.006、至少0.007、至少0.008、至少0.009、至少0.01、至少0.02、至少0.03、至少0.04、至少0.05、至少0.06、至少0.07、至少0.08、至少0.09或至少0.1(相对于GAPDH的表达)。
在一些实施方案中，分化的细胞群是分化的肝脏细胞群。
在一些实施方案中，本发明的分化的类器官是分化的肝脏类器官，其中Cyp1A2的mRNA表达水平为至少2.0x10-5、至少3.0x10-5、至少4.0x10-5、至少5.0x10-5、至少6.0x10-5、至少7.0x10-5、至少8.0x10-5、至少9.0x10-5、至少1.0x10-4、至少2.0x10-4、至少3.0x10-4、至少4.0x10-4、至少5.0x10-4、至少7.0x10-4、至少1.0x10-3、至少5.0x10-3、至少1.0x10-2或至少5.0x10-2(相对于GAPDH的表达)。
在一些实施方案中，分化的细胞群是分化的肝脏细胞群，其中Cyp1A2的mRNA表达水平为至少2.0x10-5、至少3.0x10-5、至少4.0x10-5、至少5.0x10-5、至少6.0x10-5、至少7.0x10-5、至少8.0x10-5、至少9.0x10-5、至少1.0x10-4、至少2.0x10-4、至少3.0x10-4、至少4.0x10-4、至少5.0x10-4、至少7.0x10-4、至少1.0x10-3、至少5.0x10-3、至少1.0x10-2或至少5.0x10-2(相对于GAPDH的表达)。
在一些实施方案中，本发明的分化的类器官是分化的肝脏类器官，其中Cyp3A4的mRNA表达水平为至少0.1、至少0.2、至少0.3、至少0.4、至少0.5、至少0.6、至少0.6 0.7、至少0.8、至少0.9或至少1.0(相对于GAPDH的表达)。在一些实施方案中，本发明的分化的类器官是分化的肝脏类器官，其中Cyp3A4的mRNA表达水平为正常人肝细胞中发现的表达水平的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少99％。
在一些实施方案中，分化的细胞群是分化的肝脏细胞群，其中Cyp3A4的mRNA表达水平为至少0.1、至少0.2、至少0.3、至少0.4、至少0.5、至少0.6、至少0.7、至少0.8、至少0.9或至少1.0(相对于GAPDH的表达)。在一些实施方案中，本发明的分化的类器官是分化的肝脏类器官，其中Cyp3A4的mRNA表达水平为正常人肝细胞中发现的表达水平的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少99％。
在一些实施方案中，本发明的分化的类器官是分化的肝脏类器官，其中CK7的mRNA表达水平小于0.08、小于0.07、小于0.06、小于0.05、小于0.04、小于0.03、小于0.02、小于0.01、小于0.009、小于0.008、小于0.007、小于0.006、小于0.005、小于0.004、小于0.003或小于0.002(相对于GAPDH表达)。
在一些实施方案中，分化细胞群是分化的肝脏细胞群，其中CK7的mRNA表达水平小于0.08、小于0.07、小于0.06、小于0.05、小于0.04、小于0.03、小于比0.02、小于0.01、小于0.009、小于0.008、小于0.007、小于0.006、小于0.005、小于0.004、小于0.003或小于0.002(相对于GAPDH的表达)。
在一些实施方案中，本发明的分化的类器官是分化的肝脏类器官，其中CK19的mRNA表达水平小于0.03、小于0.02、小于0.01、小于0.009、小于0.008、小于0.007、小于0.006、小于0.005、小于0.004、小于0.003或小于0.002(相对于GAPDH的表达)。在一些实施方案中，CK19的mRNA表达水平高于正常人肝细胞中CK19的mRNA表达水平小于10倍、小于9倍、小于8倍、小于7倍、小于6倍、小于5倍、小于4倍、小于3倍或者小于2倍。
在一些实施方案中，分化的细胞群是分化的肝脏细胞群，其中CK19的mRNA表达水平小于0.03、小于0.02、小于0.01、小于0.009、小于0.008、小于0.007、小于比0.006、小于0.005、小于0.004、小于0.003或小于0.002(相对于GAPDH的表达)。在一些实施方案中，CK19的mRNA表达水平高于正常人肝细胞中CK19的mRNA表达水平小于10倍、小于9倍、小于8倍、小于7倍、小于6倍、小于5倍、小于4倍、小于3倍或者小于2倍。
在一些实施方案中，本发明的分化的类器官是分化的肝脏类器官，其中平均Cyp3A4活性为正常人肝细胞中发现的平均Cyp3A4活性的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少99％。
在一些实施方案中，分化的细胞群是分化的肝脏细胞群，其中平均Cyp3A4活性为正常人肝细胞中发现的平均Cyp3A4活性的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少50％、60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少99％。
在一些实施方案中，使用P450-GloTM分析(Promega)测量Cyp3A4的活性。P450-GloTM分析包括用于测量细胞色素P450活性的发光方法。具体地，通过孵育细胞色素P450和发光细胞色素P450底物进行常规的细胞色素P450反应。P450-GloTM分析的底物是甲虫萤光素的衍生物。通过细胞色素P450将衍生物转变为萤光素，其转而与荧光素酶反应以产生光。产生的光的量直接与细胞色素P450的活性成比例。在一些实施方案中，Cyp3A4活性的测量单位是发光/ml/1000个细胞。
在一些实施方案中，本发明的分化的类器官是分化的肝脏类器官，其中白蛋白的分泌水平为正常人肝细胞中发现的白蛋白分泌水平的至少1％、至少2％、至少3％、至少5％、至少10％、至少30％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少99％。在一些实施方案中，白蛋白分泌的测量单位是ng/106个细胞/24小时。在一些实施方案中，白蛋白分泌的水平为至少100ng/106个细胞/24小时、至少200ng/106个细胞/24小时、至少500ng/106个细胞/24小时、至少1000ng/106个细胞/24小时或至少2000ng/106个细胞/24小时。
在一些实施方案中，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测量白蛋白的分泌。例如，可以使用基于夹心ELISA的人白蛋白ELISA试剂盒(Bethyl Laboratories，Inc.)。在以下段落中列出人白蛋白ELISA试剂盒所基于的原则。然而，可以使用任何合适的ELISA试剂盒。
可以通过预先被吸附于微量滴定孔表面上的抗人白蛋白抗体来捕获存在于测试样品中的人白蛋白。样品结合之后，洗去未结合的蛋白和分子，并向孔中添加生物素化的检测抗体以结合捕获的白蛋白。然后添加链霉亲和素缀合的辣根过氧化物酶(SA-HRP)以催化与显色底物TMB(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺)的比色反应。比色反应产生蓝色产物，当通过添加稀硫酸终止反应时，蓝色产物变成黄色。黄色产物在450nM处的吸光度与样品中存在的白蛋白分析物的量成比例，并且可以产生四参数标准曲线。然后可以通过内插来自与样品平行产生的标准曲线的它们的吸光度来定量测试样品中的白蛋白浓度。在将样品稀释度作为因素计入之后，最终可以计算原始样品中的白蛋白浓度。
以下提供人白蛋白ELISA试剂盒示例性步骤的概述：
(1)向指定孔中添加100μl标准品或样品。一式两份运行每个标准品或样品。
(2)盖上板，并在室温(20-25℃)孵育1小时。
(3)将板洗涤四次。
(4)向每孔添加100μl抗白蛋白检测抗体。
(5)盖上板，并在室温孵育1小时。
(6)将板洗涤四次。
(7)向每孔添加100μl HRP溶液A。
(8)盖上板，并在室温孵育30分钟。
(9)将板洗涤四次。
(10)向每孔添加100μl TMB底物溶液。
(11)将板在室温下在黑暗中孵育30分钟。
(12)通过向每孔添加100μl终止溶液终止反应。
(13)在平板读出仪上测量450nm处的吸光度。
在一些实施方案中，分化细胞群是分化的肝脏细胞群，其中咪达唑仑转变为1-OH-咪达唑仑的水平为至少1mg/L/106个细胞、至少1.5mg/L/106个细胞、至少2mg/L/106个细胞、至少2.5mg/L/106个细胞、至少3mg/L/106个细胞、至少3.5mg/L/106个细胞或至少4mg/L/106个细胞。
在一些实施方案中，本发明的分化的类器官是分化的肝脏类器官，其中咪达唑仑转变为1-OH-咪达唑仑的水平为至少1mg/L/106个细胞、至少1.5mg/L/106个细胞、至少2mg/L/106个细胞、至少2.5mg/L/106个细胞、至少3mg/L/106个细胞、至少3.5mg/L/106个细胞或至少4mg/L/106个细胞。
在一些实施方案中，如使用合适的mRNA表达分析(例如如本文所述)所测定的，与在先前DM培养基中分化的相应的肝脏类器官或分化的肝细胞群(实施例1所述)相比，本发明的分化的肝脏类器官或分化的肝脏细胞群的选自白蛋白、HNF4a、ASGPR、CYP1A2和CYP3A4的一种或多种(或全部)肝细胞标志物的表达高至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％、至少2倍、至少5倍、至少10倍或至少100倍。
在一些实施方案中，如使用合适的mRNA表达分析(例如如本文所述)所测定的，与在先前DM培养基中分化的相应的肝脏类器官或分化的肝脏细胞群(实施例1所述)相比，本发明的分化的肝脏类器官或分化的肝脏细胞群的选自CK7和/或CK19的一种或多种胆标志物的表达低至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％、至少2倍、至少5倍、至少10倍或至少100倍。
在一些实施方案中，如使用合适的咪达唑仑代谢分析(例如如本领域已知的)所测定的，与在先前DM培养基中分化的相应的肝脏类器官或分化的肝脏细胞群(实施例1所述)相比，本发明的分化的肝脏类器官或分化的肝脏细胞群具有至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％、至少2倍、至少3倍或至少5倍的更高的咪达唑仑代谢。
在一些实施方案中，如使用合适的Cyp3A4活性分析(例如如使用如本文所述的P450-GloTM分析(Promega))所测定的，与在先前DM培养基中分化的相应的肝脏类器官或分化的肝脏细胞群(实施例1所述)相比，本发明的分化的肝脏类器官或分化的肝脏细胞群具有至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％、至少2倍、至少5倍、至少10倍或至少100倍的平均Cyp3A4活性。
在一些实施方案中，如使用合适的Cyp1A2活性分析(例如如使用如本文所述的P450-GloTM分析(Promega))所测定的，与在先前DM培养基中分化的相应的肝脏类器官或分化的肝脏细胞群(实施例1所述)相比，本发明的分化的肝脏类器官或分化的肝脏细胞群具有至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％、至少2倍、至少5倍、至少10倍或至少100倍的平均Cyp1A2的活性。
在一些实施方案中，如使用合适的白蛋白分泌分析(例如如本文所述的人白蛋白ELISA试剂盒(Bethyl Laboratories,Inc.)所测定的，与在先前DM培养基中分化的相应的肝脏类器官或分化的肝脏细胞群(实施例1所述)相比，本发明的分化的肝脏类器官或分化的肝脏细胞群具有至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％、至少2倍、至少5倍、至少10倍或至少100倍的白蛋白分泌水平。
在一些实施方案中，本发明的分化的类器官是分化的肝脏类器官，其中不存在以下细胞类型中的一种或多种(例如一种、两种、三种、四种或五种)：肝脏巨噬细胞、库普弗细胞、肝星状细胞、内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞。
在一些实施方案中，分化的类器官具有带有中央腔的囊性结构。在一些实施方案中，中央腔被上皮细胞单层包围。
在一些实施方案中，分化的类器官是分化的肝脏类器官，其不包含血管或形成的胆管。
在一些实施方案中，分化的类器官是分化的肝脏类器官，其中肝细胞被整合进上皮细胞单层中。
在一些实施方案中，分化的类器官是具有以下特性中的一种或多种的分化的肝脏类器官：(a)其具有囊状结构，其中中央腔被上皮细胞单层包围；(b)不存在以下细胞类型中的一种或多种(例如一种、两种、三种、四种或五种)：肝脏巨噬细胞、库普弗细胞、肝星状细胞、内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞；(c)其不包含血管或形成的胆管；以及(d)肝细胞被整合进上皮细胞单层中。
在一些实施方案中，分化的类器官是球状的分化的肝脏类器官。
在一些实施方案中，分化的类器官是直径为0.02-3mm的分化的肝脏类器官。
在一些实施方案中，分化的类器官是展现出以下功能中的一种或多种的分化的肝脏类器官：(i)分泌、代谢和/或促合成肝细胞功能和(ii)分泌、代谢和/或促合成胆管上皮细胞(cholangyocyte)的功能。
在一些实施方案中，分化的类器官是没有展现出以下功能中的一种或多种的分化的肝脏类器官：(i)胆汁产生；(ii)胆汁运输；(iii)血液过滤。
还提供了在本发明的分化培养基中的本发明的分化的类器官或分化的肝脏上皮细胞群。
在一个实施方案中，提供了在分化培养基中的类器官(例如如本文所述的)。
在实施方案中，分化的类器官是仍然使用本发明的方法培养并因此与细胞外基质接触的类器官。优选地，将分化的类器官嵌入非间充质细胞外基质中。
类器官或祖细胞群可以来自任何哺乳动物组织，但优选来自人。在一些实施方案中，它来自小鼠、兔、大鼠、豚鼠或其它非人哺乳动物。
表3-分化的肝脏类器官与原代肝脏组织之间的差异
分化的类器官的用途
同样提供了本文所述的类器官和来源于所述类器官的细胞的用途。当在本部分提及类器官时，这些是根据本发明的分化的类器官。本领域技术人员将会理解，其用途也可适用于通过本发明的方法获得的和/或可获得的分化细胞群。还提供了通过本发明的方法获得的和/或可获得的分化的细胞群的此类用途。
例如，本发明提供了分化的类器官或来源于所述类器官的细胞在下述中的用途：药物发现筛选；毒性分析；组织胚胎学、细胞谱系和分化途径的研究；包括重组基因表达的基因表达研究；组织损伤和修复中涉及的机制的研究；炎性和传染性疾病研究；发病机制研究；或者细胞转化和癌症病因机制的研究。
本发明还提供了本发明的类器官或来源于所述类器官的细胞，其用于医学中的用途。
本发明还提供了本发明的类器官或来源于所述类器官的细胞，其用于治疗病症、病况或疾病中的用途。
本发明还提供了本发明的类器官或来源于所述类器官的细胞，其用于再生医学中的用途，例如其中所述用途涉及将类器官或细胞移植到患者体内。
本发明提供了本发明的类器官或来源于所述类器官的细胞在药物筛选、(药物)靶标验证、(药物)靶标发现、毒理学和毒理学筛选、个性化医学、再生医学和/或作为离体细胞/器官模型(如疾病模型)中的用途。
认为根据本发明的培养基和方法培养的细胞和类器官忠实地代表了体内情况。这对于生长自正常组织的分化的细胞群和类器官以及对于生长自患病组织的分化的细胞群和类器官都是如此。因此，除了提供正常的离体细胞/器官模型外，可以将本发明的类器官用作离体疾病模型。
本发明的类器官也可以被用于培养病原体，并因此可以被用作离体感染模型。可以使用本发明的类器官进行培养的病原体的实例包括在其动物宿主中引起疾病的病毒、细菌、朊病毒或真菌。因此，本发明的类器官可以被用作代表感染状态的疾病模型。在本发明的一些实施方案中，可以将类器官用于疫苗开发和/或生产。
因此，可以通过本发明的类器官研究的疾病包括遗传性疾病、代谢性疾病、病原性疾病、炎性疾病等，例如包括但不限于：囊性纤维化、炎症性肠病(如克罗恩氏病)、癌、腺瘤、腺癌、结肠癌、糖尿病(如I型或II型)、巴雷特食管、高雪氏病、α-1-抗胰蛋白酶缺乏症、莱施-奈恩综合征、贫血症、Schwachman-Bodian-Diamond综合征、真性红细胞增多症、原发性骨髓纤维化、糖原贮积病、家族性高胆固醇血症、克里格勒-纳贾尔综合征、遗传性酪氨酸血症、庞贝氏病、进行性家族性胆汁淤积、Hreler综合征、SCID或渗漏型SCID、Omenn综合征、软骨毛发发育不全、单纯疱疹病毒性脑炎、硬皮病、成骨不全症、贝克型肌营养不良症、杜氏肌营养不良症、先天性角化不良症等。
传统上，细胞系和最近的iPS细胞已被用作离体细胞/器官和/或疾病模型(例如参见Robinton等人，Nature 481,295,2012)。然而，这些方法存在许多挑战和缺点。例如，不能从所有患者获得细胞系(仅某些活组织检查产生成功的细胞系)，并因此细胞系不能用于个性化诊断和医学。iPS细胞通常要求一定水平的遗传操作以将细胞重编程进特定的细胞命运。可替代地，使它们经受影响karotypic完整性的培养条件，并且因此培养时间必须保持最短(人胚胎干细胞也是如此)。这意味着iPS细胞不能准确地代表体内情况，而是试图模拟体内细胞的行为。细胞系和iPS细胞也经受遗传不稳定性。
相比之下，本发明的类器官提供了忠实地代表体内情况的遗传稳定的平台。在一些实施方案中，本发明的类器官包含存在于相应体内环境中的所有分化细胞类型。在其它实施方案中，可以进一步分化本发明的类器官以提供体内存在的所有分化的细胞类型。因此，可以将本发明的类器官用于获得对多种疾病和治疗的机理洞察，以进行体外药物筛选，评估潜在的治疗，鉴定用于未来新型(药物)疗法开发的可能靶标(例如蛋白质)和/或探索与细胞替代疗法相结合的基因修复。
可以冷冻和解冻本发明的类器官并投入培养而不丧失其遗传完整性或表型特性并且不丧失增殖能力。因此，可以容易地储存和运输类器官。因此，在一些实施方案中，本发明提供冷冻的类器官。
由于这些原因，本发明的类器官或分化的细胞群可以是用于药物筛选、靶标验证、靶标发现、毒理学和毒理学筛选以及个性化医学的工具。
因此，在另一方面，本发明提供了根据本发明的类器官或来源于所述类器官的细胞在药物发现筛选、毒性分析或在医学(如再生医学)中的用途。例如，可将小肠、结肠、胰腺、胃、肝脏或前列腺类器官中的任何一种用于药物发现筛选、毒性分析或用于医学(如再生医学)中。
粘膜疫苗
类器官的另一个重要用途是开发粘膜接种疫苗。粘膜疫苗是经粘膜施用的疫苗。这可以是任何粘膜表面，如经鼻、口或直肠。它们可以经吸入器、喷雾器或其它外部辅助施用。与注射相比，这具有几个明显的益处，如不需要医务人员来施用疫苗，例如在发展中国家，这可能是重要的。
在肠中，M细胞(或“微皱褶细胞”)是在回肠聚集的淋巴结的滤泡相关上皮中发现的细胞。它们将来自肠腔的生物体和颗粒穿过上皮屏障运输到免疫细胞，并因此在刺激粘膜免疫中是重要的。它们具有经由内吞作用或吞噬作用从小肠腔摄取抗原的独特能力，然后经由转胞吞作用将其递送到位于它们基底侧的独特口袋样结构的树突状细胞(抗原递呈细胞)和淋巴细胞(即T细胞)。
在一些情况下，当用RANK配体刺激时，类器官可以发育成M细胞(例如参见WO2012/169830的图49)。因此，在本发明的一些实施方案中，分化的细胞群包含M细胞。在本发明的一些实施方案中，类器官包含M细胞。在一些实施方案中，提供了获得M细胞或包含M细胞的类器官的方法，其中所述方法包括用RANK配体刺激类器官。
当粘膜疫苗靶向M细胞时，它们的效率可以被显著提高。因此，可以将本发明的分化的细胞群或类器官用于测试M细胞摄取病原体或抗原并将其呈递给免疫系统的能力。因此，在一些实施方案中，本发明提供了本发明的类器官在药物筛选(例如在疫苗开发和/或疫苗生产)中的用途。例如，在一些实施方案中，可以将类器官用于开发或生产针对病毒、细菌、真菌或其它寄生虫感染(例如(但不限于)霍乱、呼吸道合胞体病毒(RSV)、轮状病毒和HIV)的疫苗。在具体的实施方案中，本发明提供了在包含RANKL的本发明的培养基中已经分化的类器官在粘膜疫苗开发中的用途。
药物筛选
为了优选地高通量目的，将本发明所述类器官在多孔板(例如96孔板或384孔板)中培养。将分子文库用于鉴定影响所述类器官的分子。优选的文库包括抗体片段文库、肽噬菌体展示文库、肽文库(例如LOPAPTM，Sigma Aldrich)、脂质文库(BioMol)、合成化合物文库(例如LOP ACTM，Sigma Aldrich)或天然化合物文库(Specs，TimTec)。此外，可以使用遗传文库来诱导或抑制干细胞子代中一种或多种基因的表达。这些遗传文库包含cDNA文库、反义文库和siRNA或其它非编码RNA文库。优选将细胞暴露于多种浓度的测试试剂一段时间。在暴露期结束时，评估培养物。术语“影响”用于覆盖细胞中的任何变化，包括但不限于增殖的减少或丧失、形态变化和细胞死亡。还可以将本发明的所述类器官用于鉴定特异性靶向上皮癌细胞而非本发明所述的类器官的药物。
在短时间(天)内获得本发明的可用类器官的能力表明，类器官对于测试个体患者对特定药物的响应并根据响应性定制治疗非常有用。在一些实施方案中，其中类器官获自患者的活组织检查，将所述类器官培养少于21天、例如少于14天、少于13天、少于12天、少于11天、少于10天、少于9天、少于8天、少于7天(等)。
类器官也可用于更广泛的药物发现目的(例如参见WO2013/093812，其描述了筛选用于囊性纤维化或霍乱的药物)。因此，在一些实施方案中，可以将本发明的类器官用于筛选囊性纤维化药物。然而，本领域技术人员将会理解，本发明的类器官将广泛适用于下述的药物筛选工具：人胃肠道的感染性、炎症性和肿瘤病理学和胃肠道的其它疾病以及本文所述的其它组织(包括胰腺、肝脏和前列腺)的感染性、炎症性和肿瘤病理学以及其它疾病。在一些实施方案中，可以将本发明的类器官用于筛选癌症药物。
在一些实施方案中，可以将本发明的类器官用于测试化学品、抗体、天然产物(植物提取物)等的文库用作药物、化妆品和/或预防性药物的适用性。例如，在一些实施方案中，可以使用本发明的培养基和方法培养来自目标患者的细胞活组织检查(如来自癌症患者的肿瘤细胞)，然后用化学化合物或化学文库对其进行处理。然后可以确定哪些化合物有效地修饰、杀死和/或处理患者的细胞。这允许测试具体患者对特定药物的响应性，从而允许针对具体患者定制治疗。因此，这允许个性化医学方法。
以这种方式使用类器官鉴定药物的附加优点是它还可以筛选正常的类器官(来源于健康组织的类器官)以检查哪些药物和化合物对健康组织的影响最小。这允许筛选具有最小脱靶活性或非期望的副作用的药物。
可以以这种方式筛选用于许多疾病的药物。例如，可以将本发明的类器官用于筛选用于囊性纤维化、巴雷特食管、癌、腺癌、腺瘤、炎症性肠病(如克罗恩氏病)、肝脏疾病等的药物。测试参数取决于目标疾病。例如，当筛选用于癌症的药物时，癌细胞死亡通常是最终目标。对于囊性纤维化，测量在针对药物和CFTR的刺激的响应中类器官的扩增是目的。在其它实施方案中，可以评估代谢物或基因表达以研究筛选的化合物和药物对目标细胞或类器官的影响。
因此，本发明提供了筛选治疗性或预防性药物或化妆品的方法，其中所述方法包括：
使分化的细胞群或类器官与候选分子(或候选分子库)接触，
评估所述分化的细胞群或类器官的任何影响(例如细胞中的任何变化，如增殖的减少或丧失、形态变化和/或细胞死亡)或类器官中的变化(例如类器官大小或运动性)；
将引起所述影响的候选分子鉴定为潜在的药物或化妆品；以及任选地
将所述候选分子制备为药物或化妆品。
在一些实施方案中，本发明提供了制备药物或化妆品的方法，其中所述方法包括：
使分化的细胞群或类器官与候选分子(或候选分子库)接触，
评估所述分化的细胞群或类器官的任何影响(例如细胞中的任何变化，如增殖的减少或丧失、形态变化和/或细胞死亡)或类器官中的变化(例如类器官大小或运动性)；
将引起所述影响的候选分子鉴定为潜在的药物或化妆品；以及任选地
将所述候选分子制备为药物或化妆品。
在一些实施方案中，采用计算机或机器人辅助的培养和数据收集方法来增加筛选通量。在一些实施方案中，类器官来源于患者活组织检查。在一些实施方案中，向所述患者施用引起对培养的分化细胞群(例如类器官)的期望影响的候选分子。
因此，在一个方面，提供了治疗患者的方法，其包括：
(a)从患者的目标患病组织获得活组织检查切片；
(b)培养活组织检查切片以获得类器官；
(c)使用本发明的筛选方法筛选合适的药物；以及
(d)用步骤(c)中获得的药物治疗所述患者。
在一些实施方案中，将药物或化妆品用于治疗、预防或改善遗传性疾病、代谢性疾病、病原性疾病、炎性疾病等的症状，例如包括但不限于：囊性纤维化、炎症性肠病(如克罗恩氏病)、癌、腺瘤、腺癌、结肠癌、糖尿病(如I型或II型)、巴雷特食管、高雪氏病、α-1-抗胰蛋白酶缺乏症、莱施-奈恩综合征、贫血症、Schwachman-Bodian-Diamond综合征、真性红细胞增多症、原发性骨髓纤维化、糖原贮积病、家族性高胆固醇血症、克里格勒-纳贾尔综合征、遗传性酪氨酸血症、庞贝氏病、进行性家族性胆汁淤积、Hreler综合征、SCID或渗漏型SCID、Omenn综合征、软骨毛发发育不全、单纯疱疹病毒性脑炎、硬皮病、成骨不全症、贝克型肌营养不良症、杜氏肌营养不良症、先天性角化不良症等。
在一些实施方案中，本发明提供了筛选用于再生医学的药物(例如用于再生肝脏的药物)的方法。
靶标发现
在一些实施方案中，可以将本发明的类器官用于靶标发现。可以将来源于健康或患病组织的类器官细胞用于靶标识别。可以将本发明的类器官用于发现以下疾病的药物靶标：囊性纤维化、炎症性肠病(如克罗恩氏病)、癌、腺瘤、腺癌、结肠癌、糖尿病(如I型或II型)、巴雷特食管、高雪氏病、α-1-抗胰蛋白酶缺乏症、莱施-奈恩综合征、贫血症、Schwachman-Bodian-Diamond综合征、真性红细胞增多症、原发性骨髓纤维化、糖原贮积病、家族性高胆固醇血症、克里格勒-纳贾尔综合征、遗传性酪氨酸血症、庞贝氏病、进行性家族性胆汁淤积、Hreler综合征、SCID或渗渗漏型SCID、Omenn综合征、软骨毛发发育不全、单纯疱疹性脑炎、硬皮病、成骨不全症、贝克型肌营养不良症、杜氏肌营养不良症、先天性角化不良症等。根据本发明的培养基和方法培养的类器官被认为忠实地代表了体内情况。因此，它们可以成为发现特定疾病的新的(分子)靶标的工具。
为了寻找新的药物靶标，可以将化合物文库(如siRNA)用于转导细胞并使特定基因失活。在一些实施方案中，用siRNA转导细胞以抑制(大)基因组的功能。可以使用基因组的任何功能性读出或特定细胞功能来确定靶标是否与研究相关。可以使用本领域众所周知的分析确定疾病特异性读出。例如，分析细胞增殖以测试癌症中涉及的基因。例如，可以将如本文所述的Topflash分析用于检测由siRNA抑制引起的Wnt活性变化。当生长减少或细胞死亡发生时，可以通过本领域已知的方法鉴定相应的siRNA相关基因。这些基因是抑制这些细胞生长的可能靶标。在鉴定时，将需要通过本领域众所周知的方法确定所鉴定靶标对研究的细胞过程的特异性。使用这些方法，可以将新分子鉴定为疗法的可能药物靶标。
靶标和药物验证筛选
可以将从患病和/或正常组织获得的患者特异性类器官用于高通量筛选中鉴定的分子的靶标验证。对于在高通量筛选中被鉴定为可能的治疗药物的化合物的验证也是如此。在类器官培养系统中分化的原代患者材料的使用可用于测试来自高通量药物发现细胞系研究的假阳性等。
在一些实施方案中，可以将本发明的类器官用于验证在高通量筛选中已被鉴定为可能的药物或化妆品的化合物。
毒性分析
所述分化的干细胞群(例如本发明的类器官)(如肝脏类器官、肠类器官或胰腺类器官)可以在潜在新药或者已知的或新的食品补充剂的毒性分析中进一步替代细胞系(如Caco-2细胞)的使用。
毒理学筛选以与药物筛选相似的方式工作(如上所述)，但它们测试药物的毒性作用而非治疗效果。因此，在一些实施方案中，候选化合物的作用是有毒的。
培养病原体
此外，可以将本发明的类器官用于培养病原体，如目前缺乏合适的组织培养物或动物模型的诺如病毒。
再生医学和移植
本发明提供了类器官在再生医学和/或移植中的用途。本发明还提供了治疗方法，其中该方法包括将类器官移植到动物或人体内。
本发明的类器官(如肝脏类器官、肠类器官或胰腺类器官)可用于再生医学，例如用于治疗肝硬化、肠上皮的放射后和/或手术后修复、罹患炎症性肠病(如克罗恩氏病和溃疡性结肠炎)的患者中肠上皮的修复，以及罹患短肠综合征的患者中肠上皮的修复。另外的用途存在于在患有小肠/结肠遗传性疾病患者的肠上皮修复中。包含胰腺类器官的培养物也可用于再生医学，例如作为胰腺或其部分切除之后的移植物，以及用于治疗糖尿病(如I型糖尿病和II型糖尿病)。
在可替代的实施方案中，将从类器官中分离的类器官或细胞重编程为相关的组织命运，例如包括胰腺β-细胞或肝细胞或肝脏的导管细胞的胰腺细胞，。本发明的培养方法将使得能够分析将密切相关的上皮干细胞转分化为胰腺细胞(包括胰腺β-细胞或肝细胞)的因子。
技术人员清楚的是，可以将基因疗法另外用于旨在修复受损或疾病组织的方法中。例如，可以使用腺病毒或逆转录病毒基因递送载体来向干细胞递送遗传信息(如DNA和/或RNA)。技术人员可以替换或修复基因疗法中靶向的特定基因。例如，可以将正常基因插入基因组内的非特异性位置以替换非功能基因。在另一实例中，可以通过同源重组将异常基因序列替换为正常基因序列。可替代地，选择性回复突变可使基因恢复其正常功能。另一实例是改变具体基因的调控(基因打开或关闭的程度)。优选地，通过基因治疗方法离体处理类器官细胞或来源于类器官的细胞，并随后转移至哺乳动物，优选需要治疗的人。
由于可以在没有任何明显限制或遗传损害的情况下扩增从成年捐赠者获取的小活组织检查切片，因此该技术可用于产生用于再生目的的可移植上皮。可以将类器官冷冻和解冻并投入培养而不丧失它们的3D结构和完整性并且没有显著的细胞死亡的事实进一步增加了类器官用于移植目的的适用性。此外，在一些实施方案中，可将嵌入ECM中或与ECM接触的类器官移植进哺乳动物中，优选移植进人体内。在另一实施方案中，可以将类器官和ECM同时移植进哺乳动物中，优选移植进人体内。
技术人员将会理解，可以将ECM用作3D支架以获得包含根据本发明的扩增的细胞群或类器官的组织样结构。然后可以通过本领域众所周知的方法将此类结构移植进患者体内。可以使用ECM蛋白(如胶原蛋白和/或层粘连蛋白)合成制备ECM支架，或者可替代地可以通过“脱细胞化(decellularising)”分离的器官或组织碎片以留下由ECM组成的支架而获得ECM支架(例如参见Macchiarini等人，The Lancet，372卷，9655期，第2023-2030页,2008)。在一些实施方案中，可以通过使器官或组织碎片脱细胞化来获得ECM支架，其中任选地所述器官或组织碎片来自胰腺、肝脏、肠、胃或前列腺。
本发明提供了本发明的类器官或来源于所述类器官的细胞在移植进哺乳动物，优选移植进人体内的用途。还提供了治疗需要移植的患者的方法，其包括将本发明的类器官或来源于所述类器官的细胞移植进所述患者体内，其中所述患者是哺乳动物，优选人。在一些实施方案中，在移植进所述患者之前，进一步分化类器官。
例如，从成年捐赠者获取小活组织检查切片并通过扩增方法扩增，并随后根据本发明进行分化。因此，可以将本文提供的技术用于产生用于再生目的的可移植上皮。
本发明提供了治疗患者的胰岛素缺乏病症(如糖尿病)或者治疗患有胰腺功能障碍的患者的方法，其包括将本发明的胰腺类器官或来自本发明的胰腺类器官的细胞移植进患者体内。本发明还提供了治疗患者的肝脏疾病或病况的方法，其中所述方法包括将本发明的肝脏类器官或来自本发明的肝脏类器官的细胞移植进患者体内。
在一些实施方案中，细胞或类器官在移植进患者中时不表达或分泌胰岛素，但在患者体内分化以使它们分泌胰岛素。例如，分泌胰岛素的能力可能在移植之后不能立即检测到，但可能在移植之后约一个月存在，例如移植之后6周、2个月或3个月。
患者优选是人，但也可以是非人哺乳动物(如猫、狗、马、牛、猪、绵羊、兔或小鼠)。
因此，在本发明的范围包括通过细胞疗法治疗人或非人动物患者的方法。此类细胞疗法涵盖通过任何适当的方法将本发明的干细胞或类器官应用于患者。具体地，此类治疗方法涉及受损组织的再生。根据本发明，可以用同种异体或自体干细胞或类器官治疗患者。“自体”细胞是来源于相同生物体的细胞，它们被重新引入其中用于细胞疗法，例如为了允许组织再生。然而，细胞不一定分离自与它们被引入的组织相同的组织。自体细胞不需要与患者匹配以克服排斥问题。“同种异体”细胞是来源于不同于细胞被引入以用于细胞疗法(例如为了允许组织再生)的个体的个体的细胞，尽管是相同的物种。仍可能需要某种程度的患者匹配以防止排斥问题。因此，在一些实施方案中，移植涉及自体细胞。在一些实施方案中，移植涉及同种异体细胞。
通常，通过注射或植入将本发明的细胞或类器官引入患者体内。通常将细胞直接注射进其中它们要作用的组织中。可替代地，将通过门静脉注射细胞。含有本发明的细胞和药学上可接受的载体的注射器被包括在本发明的范围内。与含有本发明的细胞和药学上可接受的载体的注射器相连的导管被包括在本发明的范围内。
技术人员将能够根据待移植的材料(即细胞群、细胞悬液中的单个细胞、类器官或类器官碎片)以及待治疗的器官来选择合适的施用方法和途径。
如上所讨论的，可以将本发明的类器官或细胞用于组织再生。为了实现该功能，可以根据细胞在体内的位置将细胞直接注射或植入它们可以繁殖并最终分化成所需的细胞类型处的受损组织中。可替代地，可以将类器官直接注射或植入受损组织中。易于治疗的组织包括所有受损组织，特别包括那些可能因疾病、损伤、创伤、自身免疫反应或者通过病毒或细菌感染而受损的那些组织。在本发明的一些实施方案中，本发明的细胞或类器官被用于再生结肠、小肠、胰腺、食道或胃系统。
例如，在一个实施方案中，使用汉密尔顿注射器将本发明的细胞或类器官注射进患者体内。
技术人员将会意识到对于待治疗的具体病况本发明的细胞或类器官的适当剂量是多少。
在一个实施方案中，本发明的类器官或细胞，无论是在溶液中，微球中还是多种组合物的微粒中，都将被施用进动脉灌注需要再生的组织或受损器官部分。通常，将使用导管进行此类施用。导管可以是用于血管成形术和/或细胞递送的多种球状导管之一，或者是被设计用于向身体特定部位递送细胞的特定目的的导管。对于某些用途，可以将细胞或类器官包封到由许多不同的可生物降解的化合物制成的并且直径为约15μM的微球中。该方法可以允许血管内施用的细胞或类器官以保留在损伤部位，而不是通过毛细血管网络并进入第一阶段的体循环。毛细血管网络的动脉侧的保留也可以促进它们易位到血管外的空间。
在另一实施方案中，可以将类器官或细胞逆行注射到血管树中，或者通过静脉将它们递送到整个身体，或者局部注射到流入细胞或类器官所针对的组织或身体部位的特定静脉中。对于该实施方案，可以使用许多上述制剂。
在另一实施方案中，可以将本发明的细胞或类器官植入粘附于生物相容性植入物的受损组织中。在该实施方案中，细胞可以在植入患者体内之前体外粘附于生物相容性植入物上。本领域技术人员将会清楚，在植入之前，可以使用多种粘附物中的任何一种将细胞粘附到植入物上。仅举例而言，此类粘附物可以包括纤维蛋白、整合蛋白家族的一个或多个成员、钙粘蛋白家族的一个或多个成员、选择蛋白家族的一个或多个成员、一种或多种细胞粘附分子(CAM)、免疫球蛋白家族中的一种或多种以及一种或多种人工粘附物。该列表仅以说明的方式提供，并且不旨在具有限制性。本领域技术人员将会清楚，可以使用一种或多种粘附物的任何组合。
在另一实施方案中，在将基质植入患者体内之前，可以将本发明的类器官或细胞嵌入基质中。通常，将基质植入患者的受损组织中。基质的实例包括基于胶原蛋白的基质、基于纤维蛋白的基质、基于层粘连蛋白的基质、基于纤连蛋白的基质和人造基质。该列表仅以说明的方式提供，并且不旨在具有限制性。
在又一实施方案中，可以将本发明的类器官或细胞与基质形成组分一起植入或注射到患者体内。这可以允许细胞在注射或植入之后形成基质，确保细胞或类器官保留在患者体内的适当位置。基质形成组分的实例包括纤维蛋白胶液体烷基、氰基丙烯酸酯单体、增塑剂、多糖(如葡聚糖)、含环氧乙烷的寡聚物、嵌段共聚物(如泊洛沙姆和普朗尼克类)、非离子表面活性剂(如吐温和Triton'8')，以及人造基质形成组分。该列表仅以说明的方式提供，并且旨在具有限制性。本领域技术人员将会清楚，可以使用一种或多种基质形成组分的任何组合。
在又一实施方案中，可以将本发明的类器官或细胞包含在微球内。在该实施方案中，可以将细胞包封在微球的中心内。同样在该实施方案中，可以将细胞嵌入微球的基质材料中。基质材料可包括任何合适的生物可降解聚合物，包括但不限于藻酸盐、聚乙二醇(PLGA)和聚氨酯。该列表仅作为示例提供，并且不旨在具有限制性。
在又一实施方案中，可以将本发明的细胞或类器官粘附于用于植入的医疗装置上。此类医疗装置的实例包括支架、针、缝线、分离器(splits)、起搏器、假关节、人造皮肤和杆。该列表仅以说明的方式提供，并且不旨在具有限制性。本领域技术人员将会清楚，可以通过多种方法使细胞粘附到医疗装置上。例如，可以使用纤维蛋白、整合蛋白家族的一个或多个成员、钙粘蛋白家族的一个或多个成员、选择蛋白家族的一个或多个成员、一种或多种细胞粘附分子(CAM)、一种或多种免疫球蛋白家族以及一种或多种人工粘附物使细胞或类器官粘附到医疗装置上。该列表仅以说明的方式提供，并且不旨在具有限制性。本领域技术人员将会清楚，可以使用一种或多种粘附物的任何组合。
使用本发明的方法获得的类器官或上皮干细胞群或群体或分化的细胞群具有多种用途。例如，本发明提供了如本文所述的类器官或上皮干细胞群/分化的细胞群在下述中的用途：药物发现筛选；毒性分析；胚胎学、细胞谱系和分化途径的研究；包括重组基因表达的基因表达研究；损伤和修复中涉及的机制的研究；炎性和传染性疾病研究；发病机制研究；或者细胞转化和癌症病因机制的研究。
在一个方面，本发明提供了如本文所述的类器官或上皮干细胞群/分化的细胞群在药物发现筛选、毒性分析或再生医学中的用途。类似地，本发明提供了本发明的类器官子代在这些用途中的用途。
毒性分析可以是使用类器官或其部分或来源于类器官的细胞的体外分析。这些子代和类器官易于培养并且比例如当前用于毒性分析的上皮细胞系(如Caco-2(ATCC HTB-37)、I-407(ATCC CCL6)和XBF(ATCC CRL 8808))更类似于原代上皮细胞。预期用类器官获得的毒性结果更类似患者中获得的结果。使用基于细胞的毒性测试来确定器官特异性细胞毒性。在所述测试中测试的化合物包含癌症化学预防剂、环境化学品、食品补充剂和潜在毒物。将细胞暴露于多种浓度的测试试剂一段时间。在初步分析中使用5天的暴露和来自最高可溶性浓度的对数稀释来确定分析中测试试剂的浓度范围。在暴露期结束时，评估培养物对生长的抑制。分析数据以确定抑制50％终点的浓度(TC50)。
例如，根据本发明的该方面，可以使候选化合物与如本文所述的细胞或类器官接触，并且可以监测细胞或细胞活性的任何变化。
出于高通量的目的，在多孔板(如例如96孔板或384孔板)中培养所述类器官。将分子文库用于鉴定影响所述类器官的分子。优选的文库包含抗体片段文库、肽噬菌体展示文库、肽文库(例如LOPAPTM，Sigma Aldrich)、脂质文库(BioMol)、合成化合物文库(例如LOPACTM，Sigma Aldrich)或天然化合物文库(Specs，TimTec)。此外，可以使用遗传文库来诱导或抑制腺瘤细胞后代中一种或多种基因的表达。这些遗传文库包括cDNA文库、反义文库和siRNA或其它非编码RNA文库。优选将细胞暴露于多种浓度的测试剂一段时间。在暴露期结束时，评估培养物。术语“影响”用于覆盖细胞中的任何变化，包括但不限于增殖的减少或丧失、形态变化和细胞死亡。还可以将所述类器官用于鉴定特异性靶向上皮癌细胞而非所述类器官的药物。
根据本发明的类器官还可以在药物发现筛选和潜在新药或已知药物或者已知或新型食品补充剂的毒性分析中替代细胞系(如Caco-2细胞)的使用。
此外，可以将此类类器官用于培养病原体。
本发明还提供了本发明的分化的类器官或本发明的分化的细胞群在治疗中的用途。还提供了本发明的分化类器官或来源于所述类器官的细胞在治疗如本文所述的疾病或病况中的用途。
类似地，提供了治疗如本文所述的疾病或病况的方法，其包括施用一种或多种本发明的类器官或来源于所述类器官的细胞。
发明人还证明了将类器官成功移植进免疫缺陷小鼠中(参见WO2012/014076的实施例7)，其中移植的肝脏类器官源性细胞在体内产生胆管上皮细胞和肝细胞。因此，在一个实施方案中，本发明提供了用于移植进人或动物的本发明的类器官或类器官源性细胞。
本发明的类器官的优点是它们可以被冷冻并随后解冻而不丧失功能。这使得能够进行细胞存储、易于存储和急性用途的快速可用性。例如，这可用于制备“现成的”产品，例如，在肝脏的情况下，可以被用于治疗急性肝脏毒性的“现成的”产品。类器官也可以生长自作为取自活体捐赠者的小活组织检查切片的细胞或组织碎片，从而使对治疗的任何伦理反对最小化。捐赠者甚至可以来自待治疗的患者，这可以减少与外来细胞和器官移植相关的任何负面副作用，并减少对免疫抑制药物的需求。
在一些实施方案中，本发明还提供了药物制剂，其包含本文所述的分化培养基组分和药学上可接受的稀释剂和/或赋形剂。例如，提供了包含以下的药物制剂：一种或多种Wnt抑制剂(例如IWP-2和/或iCRT3)、一种或多种GSK-3抑制剂(例如CHIR99021)、一种或多种AP-1刺激剂(例如卡巴胆碱)、一种或多种受体酪氨酸激酶配体(例如EGF、HGF和/或FGF19)、一种或多种TGF-β抑制剂(例如A83-01)、一种或多种Notch抑制剂(例如DAPT)、一种或多种糖皮质激素(例如地塞米松)以及药学上可接受的稀释剂和/或赋形剂。在优选的实施方案中，药物制剂不包含基础培养基。在一些实施方案中，药物制剂不包含细胞外基质。设想此类制剂可以适合于促进体内干细胞的分化，例如用于再生疗法。可以原位施用(例如在组织损伤部位)或全身施用此类制剂。可替代地，可以配制制剂以使其适于通过本领域已知的任何施用途径(例如静脉内、皮下、肌肉内施用、粘膜、真皮内、皮内、口服和眼部施用)施用。因此，药物制剂可以是适于此类施用的任何形式，例如片剂、输注流体、胶囊、糖浆等
因此，本发明的范围内包括通过细胞疗法治疗人或非人动物患者的方法。这里的术语“动物”表示所有哺乳动物。患者可以处于发育的任何阶段，包括胚胎和胎儿阶段。例如，患者可以是成人，或者该疗法可以用于儿科用途(例如新生儿、儿童或青少年)。此类细胞疗法涵盖通过任何适当的方法向患者施用根据本发明产生的细胞或类器官。具体地，此类治疗方法涉及受损组织的再生。本文所用的术语“施用”是指公认的施用形式，如静脉内或注射以及通过移植施用，例如通过手术移植，移植(grafting)或移植(transplantation)来源于根据本发明的细胞或类器官的组织工程化的细胞群。在细胞的情况下，可以向个体全身施用，例如经由胸导管输注到肠系膜上动脉、腹腔动脉、锁骨下静脉，经由上腔静脉输注到心脏，随后经由膈下淋巴管迁移细胞输注进腹膜腔，或经由输注到肝动脉血液供应或到门静脉直接进入肝脏部位。
在一些实施方案中，每次输注施用104个至1013个细胞/100kg人。优选地，每100kg人可以静脉内输注约1-5×104个至1-5×107个细胞。更优选地，每100kg人可以静脉内输注约1×104个至10×106个细胞。在一些实施方案中，提供了细胞或类器官的单次施用。在其它实施方案中，使用多次施用。可以在初始治疗方案中提供多次施用(例如连续3-7天)，然后在其它时间重复施用。
如本文所解释的，还可以从表达Lgr5的一种单个细胞获得类器官。可以通过引入如本文所限定的核酸构建体来修饰该单个细胞，例如以校正遗传缺陷或突变。还可以根据需要，例如使用siRNA特异性地消除表达。待表达的潜在多肽可以是代谢性疾病中缺乏的那些多肽中的任何一种，包括例如代谢性肝脏疾病中的多肽缺乏，如AAT(α抗胰蛋白酶)。为了阐明生理学，我们还可以表达Wnt、EGF、FGF、BMP或notch通路中涉及的基因或使其失活。此外，为了筛选药物毒性，负责肝脏药物代谢的基因(例如CYP家族中的基因)的表达或失活受到高度关注。当本发明的细胞是肝脏细胞时，这尤其相关。
在一个实施方案中，扩增的上皮干细胞可以重编程为相关的组织命运(如例如包括肝细胞和胆管上皮细胞的肝脏细胞)。本发明的培养方法将使得能够分析将密切相关的上皮干细胞转分化为肝脏细胞(包括肝细胞和胆管上皮细胞)的因子。
本领域技术人员将会清楚，可以将基因疗法另外用于旨在修复受损或患病组织的方法中。例如，可以使用腺病毒或逆转录病毒基因递送载体来向干细胞递送遗传信息(如DNA和/或RNA)。技术人员可以替换或修复基因疗法中靶向的特定基因。例如，可以将正常基因插入基因组内的非特异性位置以替换非功能性基因。在另一实例中，可以通过同源重组将异常基因序列替换为正常基因序列。可替代地，选择性回复突变可以使基因恢复到其正常功能。又一实例是改变特定基因的调控(基因打开或关闭的程度)。优选地，将干细胞通过基因治疗方法进行离体处理，并随后转移至哺乳动物，优选需要治疗的人。例如，在移植进患者之前，可以在培养基中对类器官源性细胞进行遗传修饰。
因此，在一些实施方案中，类器官或上皮干细胞群用于医学，例如用于治疗病症、病况或疾病和/或用于再生医学中。
在一个优选的实施方案中，例如如果将类器官用于再生医学，则该方法可以从上皮细胞或从组织碎片开始，其中细胞或组织碎片是自体的或同种异体的组织碎片。仍可能需要某种程度的患者匹配来防止排斥问题。用于使组织排斥最小化的技术对于本领域技术人员来说是已知的。
在将类器官和/或细胞移植进患者体内的实施方案中，在支架中施用细胞可能是有利的。因此，提供了包含一种或多种本发明的类器官或来源于所述类器官的细胞的支架。支架提供二维或三维网络。用于此类种支架的合适的合成材料包含选自多孔固体、纳米纤维和水凝胶的聚合物，如例如肽(包括自组装肽)，由聚乙二醇磷酸酯、聚乙二醇富马酸酯、聚丙烯酰胺、聚羟乙基甲基丙烯酸酯、聚醋酸纤维素组成的水凝胶和/或它们的共聚物(参见例如，Saha等人,2007.Curr Opin Chem Biol.11(4)：381-387；Saha等人,2008.Biophysical Journal 95：4426-4438；Little等人，2008.Chem.Rev 108,1787-1796)。如本领域技术人员已知的，机械性质(如例如支架的弹性)影响干细胞的增殖、分化和迁移。优选的支架包含生物可降解的(共)聚合物，其在移植进对象中之后被天然存在的组分替换，例如以促进组织再生和/或伤口愈合。进一步优选地，所述支架在移植进对象中之后基本上不诱导免疫原性应答。将所述支架补充有天然的、半合成的或合成的配体，其提供干细胞增殖和/或分化和/或迁移所需的信号。在优选的实施方案中，所述配体包含确定的氨基酸片段。所述合成聚合物的实例包括嵌段共聚物表面活性剂(BASF)和(Johnson和Johnson)。在一些实施方案中，在支架中培养细胞。在其它实施方案中，将它们培养，然后添加到支架中。
本发明的用途可以使用单个类器官，或者它们可以使用多于一种类器官(例如2、3、4、5、10、15、20、30、50、100、200或更多种类器官)。有利地，本发明的方法允许在短时间内产生大量的类器官和上皮干细胞(因为它们导致指数生长)，从而确保足够的细胞可用于目标应用。在本文中不论何处提及“治疗方法”或“用于治疗的方法”，例如涉及本发明的类器官或获自所述类器官的细胞，这同样也涉及“用于治疗”的类器官或细胞和“用于制造药物”的类器官或细胞。
人造器官
在一些实施方案中，提供了分化的类器官或来源于分化的类器官的细胞在人造器官中的用途。可以通过其它地方解释的方法体内移植人造器官。可替代地，人造器官可以是离体的。在一些实施方案中，离体人造器官可以例如经由血液供应与患者相连。例如，可以将包含分化的类器官的人造器官用作血液透析机的一部分。因此，可以将分化的类器官用于支持具有患病的或损伤的上皮组织的患者。
以下例示了关于肝脏和胰腺的本发明的用途。
肝脏类器官和细胞群的用途
使用本发明的方法获得的肝脏类器官或分化的肝脏细胞群具有多种用途。例如，本发明提供了如本文所述的肝脏类器官或分化的肝脏细胞群在下述中的用途：药物发现筛选；毒性分析；肝脏胚胎学、肝脏细胞谱系和分化途径的研究；包括重组基因表达的基因表达研究；肝脏损伤和修复中涉及的机制的研究；肝脏炎性和传染性疾病研究；发病机制研究；或者肝脏细胞转化和肝癌病因机制的研究。
在一个方面，本发明提供了如本文所述的肝脏类器官或肝脏分化的细胞群在药物发现筛选、毒性分析或再生医学中的用途。类似地，本发明提供了本发明的肝脏类器官子代在这些用途中的用途。
毒性分析可以是使用肝脏类器官或其部分或来源于肝脏类器官的细胞的体外分析。此类子代和肝脏类器官易于培养，并且比例如当前用于毒性分析的上皮细胞系(如Caco-2(ATCC HTB-37)、I-407(ATCC CCL6)和XBF(ATCC CRL 8808))更类似于原代上皮细胞。预期用肝脏类器官获得的毒性结果更类似于患者中得到的结果。将基于细胞的毒性测试用于确定器官特异性细胞毒性。在所述测试中测试的化合物包含癌症化学预防剂、环境化学品、食品补充剂和潜在毒物。将细胞暴露于多种浓度的测试试剂一段时间。在初步分析中使用5天的暴露和来自最高可溶性浓度的对数稀释来确定分析中测试试剂的浓度范围。在暴露期结束时，评估培养物对生长的抑制。分析数据以确定抑制50％终点的浓度(TC50)。
例如，在肝脏肝细胞中细胞色素P450酶的诱导是决定药物效力和毒性的关键因素。具体地，P450的诱导是棘手的药物-药物相互作用的重要机制，并且它也是限制药物效力和控制药物毒性的重要因素。细胞色素P450诱导分析难以开发，因为它们需要完整的正常人肝细胞。已证明难以产生足以维持高通量分析的大规模生产的数量的这些细胞。
本发明提供了根据本发明的肝脏类器官或肝脏细胞群在医学或诊断学中的用途。在一个实施方案中，本发明提供了根据本发明的肝脏类器官或肝脏细胞群在再生医学(例如在肝脏上皮的辐射后和/或术后修复、罹患慢性或急性肝功能衰竭或疾病的患者上皮的修复)中的用途。可以使用肝脏类器官或来源于所述类器官的细胞的肝脏疾病包括但不限于：肝细胞癌、Alagille综合征、α-1-抗胰蛋白酶缺乏症、自身免疫性肝炎、胆管闭锁、慢性肝炎、肝癌、肝硬化、肝囊肿、脂肪肝病、半乳糖血症Gilbert综合征、原发性胆汁性肝硬化、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、原发性硬化性胆管炎、雷尔氏综合症、结节病、酪氨酸血症、I型糖原贮积病、威尔逊氏病、新生儿肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、卟啉症以及血色沉着病。
在一些实施方案中，将肝脏类器官或肝脏细胞群用于治疗遗传病况。导致肝功能衰竭的遗传病况可以受益于使用根据本发明的培养基和/或方法培养的细胞以部分或全细胞替换形式的基于细胞的疗法。导致肝功能衰竭以及可通过本发明可治疗的遗传病况的非限制性列表包括：进行性家族性肝内胆汁淤积、III型糖原贮积病、酪氨酸血症、脱氧鸟苷激酶缺乏症、丙酮酸羧化酶缺乏症、先天性红细胞生成异常性贫血、多囊性肝病多囊性肾病、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、尿素循环缺陷(ureum cycle defect)、有机酸血症(organicacidemiea)、溶酶体贮积病和脂肪酸氧化障碍。可能也受益于基于细胞的疗法的其它病况包括威尔逊氏病和遗传性淀粉样变性(FAP)。
需要完全完整的肝脏移植以达到完全治疗效果的肝功能衰竭的其它非肝细胞相关原因仍然可以受益于使用使用根据本发明的培养基和/或方法培养的细胞的基于细胞的疗法的功能的一些暂时性恢复。可通过本发明类器官和/或细胞群治疗的此类病况的实例的非限制性列表包括：原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、Aglagille综合征、纯合家族性高胆固醇血症、乙型肝炎合并肝硬化、丙型肝炎合并肝硬化、布加综合征、原发性高草酸尿症、自身免疫性肝炎和酒精性肝病。
可以将本发明的肝脏类器官用于治疗涉及肝细胞功能障碍的遗传性疾病的方法中。此类疾病可能是早发型或晚发型。早发型疾病包括代谢相关的器官衰竭(例如α-1-抗胰蛋白酶缺乏症)、糖原贮积病(例如GSD II、庞贝氏病)、酪氨酸血症、轻度DGUOK、I型CDA、尿素循环缺陷(例如OTC缺乏症)、有机酸血症和脂肪酸氧化障碍。晚发型疾病包括原发性高草酸尿症、家族性高胆固醇血症、威尔逊氏病、遗传性淀粉样变性和多囊性肝病。用来源于本发明的肝脏类器官的健康肝细胞进行的部分或完全替换可用于恢复肝脏功能或延迟肝功能衰竭。因此，本发明提供了肝脏类器官和/或肝脏细胞群在恢复肝脏功能或延迟肝功能衰竭中的用途。
可以将本发明的肝脏类器官用于治疗由于遗传性代谢疾病或肝细胞感染而引起的慢性肝功能衰竭的方法中。遗传性代谢疾病的治疗可以包括施用本发明的遗传修饰的自体肝脏类器官。肝细胞感染的治疗可以包括施用本发明的同种异体肝脏类器官。在一些实施方案中，经2-3个月的时期施用肝脏类器官。
可以将本发明的肝脏类器官用于治疗急性肝功能衰竭，例如由于使用对乙酰氨基酚、药物或酒精引起的肝脏中毒。在一些实施方案中，恢复肝脏功能的疗法将包括注射来自获自本发明的类器官的冷冻的即用型同种异体肝细胞的肝细胞悬浮液。冷冻合适的类器官的能力意为类器官可以适于立即递送，并因此没有必要等待输血。
在替换或校正肝脏功能不足的情况下，可以从根据本发明产生的一种或多种肝脏类器官构建细胞基质结构。因此，在一些实施方案中，提供了来源于肝脏类器官并适用于本文所述的疗法的细胞基质结构。
据认为，仅约10％的肝细胞量是足够功能所必需的。由于相对有限的捐赠者的可用性和青少年器官的尺寸较小，这使得向儿童中植入类器官单元组合物特别优于整个器官移植。例如，一个8个月大的孩子的正常肝脏重大约250g。因此，那个孩子需要约25g组织。成人肝脏重约1500g；因此，所需的植入物仅为成人肝脏的约1.5％。因此，在一些实施方案中，本部分中描述的治疗用于儿童。在其它实施方案中，它用于成人。
在一些实施方案中，移植步骤涉及支架(如聚合物支架)。当植入根据本发明的类器官单元时，任选地其与聚合物支架连接，增殖将在新宿主中发生，并且产生的肝细胞团替换缺乏的宿主功能。发明人已经表明，可以从适合移植进非人动物或人的成体肝脏干细胞或包含干细胞的肝脏组织碎片中产生成熟肝细胞。使用根据本发明的分化培养基，发明人已经表明，肝母细胞可以在体内分化为适于移植目的的成熟肝细胞。因此，发明人提供了用于肝脏再生、肝脏功能不足的替代换或校正的肝细胞的新来源。
在一些实施方案中，希望用来自本发明的肝脏类器官的健康肝细胞重新填充/替换10-20％的患者肝脏。
在一些实施方案中，本发明提供了获自分化培养基的肝脏类器官或肝脏细胞群在治疗中的用途。此类类器官和细胞群可用于治疗导管细胞疾病。例如，可以将此类类器官和细胞群用于治疗导管树疾病，例如由Jagged1(JAG1)突变引起的疾病(例如Alagille综合征)或由转运蛋白ABCB4突变引起的疾病(例如低磷脂相关胆石病)。也可以使用本发明的肝脏类器官或扩增的肝细胞群进治疗其它非遗传性胆管病(如原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎和Caroli病)。此类疾病可能受益于培养中扩增的导管细胞。可以用本发明的类器官或扩增的肝脏细胞群治疗的其它疾病包括遗传性肝病，其中胆红素代谢受到影响。此类疾病将受益于肝细胞移植。已知的胆红素代谢遗传缺陷的实例是克里格勒-纳贾尔综合征(UGT1A1基因突变)、杜宾-约翰逊综合征(cMOAT突变)和Rotor综合征(SLCO1B1和SLCO1B3中的突变)。
因此，在一些实施方案中，肝脏类器官或肝脏上皮细胞群用于治疗肝脏病症、病况或疾病或者用于再生医学。
胰腺类器官和细胞群的用途
培养胰腺细胞的方法描述于WO2010/090513中。设想本发明的分化培养基和方法将增强获自胰腺的上皮干细胞的分化。
因此，在一些实施方案中，本发明提供了胰腺类器官或获自胰腺类器官的细胞在医学中的用途，例如在治疗胰腺病症、病况或疾病中的用途或者在再生医学中的用途。
本发明还提供了胰腺类器官或获自胰腺类器官的细胞在治疗糖尿病(例如I型或II型糖尿病)、胰腺炎、胰腺癌或囊性纤维化中的用途，其中治疗任选地包括将类器官或获自胰腺类器官的细胞移植进有需要的患者中。在一些实施方案中，移植的细胞是胰岛素分泌细胞。在其它实施方案中，细胞是在移植进胰岛素分泌细胞后进一步成熟的祖细胞。
缩写词
β-TrCP：含有β-转导蛋白重复的蛋白
GSK-3：糖原合成酶激酶3
LGR：含有富亮氨酸重复的G蛋白偶联受体
LRP：低密度脂蛋白受体相关蛋白
PP1：蛋白磷酸酶1
PP2A：蛋白磷酸酶2A
PP2C：蛋白磷酸酶2C
定义
如本文所用的动词“包含”及其变形以其非限制性含义使用，意为包括该单词之后的项目，但不排除未具体提及的项目。此外，如果需要，动词“由……组成”可以由“基本上由......组成”代替，意为本文限定的产品可以包含除具体标识组份之外的其它组分，所述其它组分不改变本发明的独特性。此外，如本文所限定的方法可以包含除具体标识的步骤之外的其它步骤，所述其它步骤不改变本发明的独特特性。此外，不定冠词“一个/一种(a/an)”对元素的引用不排除存在多于一个/多于一种元素的可能性，除非上下文明确要求存在一个/一种且仅一个/一种元素。因此，不定冠词“一个/一种(a/an)”通常意为“至少一个/一种”。
如本文所用的术语“约”或“大约”意为所呈现的值可以变化+/-10％。该值也可以作为精确值被读取，因此可以省略术语“约”。例如，术语“约100”涵盖90-110，并且也涵盖100。
在此将本说明书中引用的所有专利和参考文献均通过引用整体并入。
提供以下实施例仅用于说明目的，并不旨在以任何方式限制本发明的范围。
附图描述
图1.(A)用于扩增和分化肝脏上皮干细胞群的改进方法。肝脏上皮干细胞在EM+BMP7培养基(EM+BMP7包含作为基础培养基的Gibco改良型DMEM/F12，向其中添加了：N2、不含视黄酸的B27、EGF、HGF、TGF-β抑制剂、烟酰胺、Rspondin、毛喉素、胃泌素、N-乙酰半胱氨酸、FGF10和BMP7)中生长5天。在该预处理之后，将类器官培养物破坏、分离并转移至DM+培养基。用于扩增和分化肝脏上皮干细胞群的先前方法包括使肝脏上皮干细胞在EM+BMP7培养基中生长5天，然后在不进行破坏或分离的情况下将其转移至DM培养基。(B)DM和DM+培养基的组分。DM+培养基包含作为基础培养基的Gibco改良型DMEM/F12，向其中添加了：10mMHEPES、1x B27-VitA、1xN2、1.25mM N-乙酰半胱氨酸、50ng/ml hEGF、10nM胃泌素、25ng/mlHGF、0.5μM A83.01、25ng/ml BMP7、100ng/ml FGF19、10μM DAPT、3μM地塞米松、3μM IWP-2、3μM Chir、50μM iCRT3和100μM卡巴胆碱。DM培养基包含作为基础培养基的Gibco改良型DMEM/F12，向其中添加了：10mM HEPES、1x B27-VitA、1xN2、1.25mM N-乙酰半胱氨酸、50ng/ml hEGF、10nM胃泌素、25ng/ml HGF、0.5μM A83.01、25ng/ml BMP7、100ng/ml FGF19、10μMDAPT和3μM地塞米松。
图2.(A)未对肝细胞分化显示积极影响的因素列表。(B)-(F)在分化培养基(DM)中11天之后或在DM加修饰中11天之后，在扩增培养基(EM)中的类器官的qRT-PCR分析。(B)向DM培养基中添加AP-1刺激剂卡巴胆碱改善了肝细胞细胞标志物白蛋白和Cyp3A4的表达。(C)向DM培养基中添加Wnt降低了白蛋白和Cyp3A4的表达。(D)向DM培养基中添加Wnt分泌抑制剂IWP-2增强了白蛋白和Cyp3A4的表达。(E)向DM培养基中添加CHIR99021(通过干扰β-连环蛋白破坏复合物的活性强烈增加Wnt信号转导的GSK-3β抑制剂)增加了白蛋白和Cyp3A4的表达。添加CHIR99021和iCRT3(能够阻断β-连环蛋白与TCF4的结合，并因此能够阻断β-连环蛋白破坏复合物下游的Wnt信号转导的小分子)导致白蛋白和Cyp3A4表达显著增加，同时降低了CK19(胆细胞标志物)的表达。(F)在EM+BMP7预处理5天之后破坏并分离类器官培养物并直接变为DM培养基改善了白蛋白和Cyp3A4的水平。(G)在标准条件下(标准DM)或使用新的分离技术(分离的DM)分化11天之后的人肝脏类器官。分离类器官培养物导致类器官的大小减小，这可能有助于增强分化。分离程序期间完全移除所有扩增培养基生长因子也可以促进分化。
图3.扩增培养基(EM)中的或者遵循标准分化方案(DM)或改进的程序(DM+)分化11天之后的原代肝细胞或类器官的qRT-PCT分析，所述改进的程序将DM+培养基与分离程序组合。描绘了指示基因相对于GAPDH的表达水平。每个点代表一个独立的实验。与分离程序组合的DM+培养基导致肝细胞标志物(如(A)白蛋白、(B)HNFa、(C)serpinA1和(D)ASPGR)的表达的显著改善。然而，最值得注意的是，细胞色素(如(E)Cyp1A2和(F)Cyp3A4)的表达强烈增加。与DM方案(没有分离)相比，Cyp3A4的表达平均高50x并达到原代肝细胞的水平。在新的DM+方案中，胆标志物(如(G)CK7和(H)CK19)的表达明显降低，这证实了向肝细胞谱系的分化增加。
图4.DM+分化之后人肝脏类器官中改善的肝细胞功能。(A)在遵循标准(DM)或改进的(DM+)方案分化11天之后白蛋白的免疫荧光染色。提供了使用每种方案获得的示例性类器官的三个视图：白蛋白、DAPI和明场。DM+方案显著增加了分化为肝细胞命运的细胞的数目。(B)在第11天测量的在扩增培养基(EM)、标准分化培养基(DM)或遵循改进的分化程序(DM+)中的HepG2、原代肝细胞和人肝脏类器官的Cyp3A4活性(P450-Glo分析)。使用DM+方案分化的细胞的Cyp3A4活性处于原代肝细胞的水平，并且远远超过HepG2细胞或旧的DM条件所达到的水平。(C)在第11天，在EM、DM或遵循改进的分化程序(DM+)中HepG2、原代肝细胞和人肝脏类器官的白蛋白分泌。(D)在第11天，在EM、DM或遵循改进的分化程序(DM+)中HepG2、人肝脏类器官的咪达唑仑(药物)转变为1-OH-咪达唑仑。在使用DM+方案分化的细胞中观察到改善的药物处理活性。(B)-(D)每个点代表一个独立的捐赠者。
实施例
实施例1
我们显著提高了我们将人肝脏类器官从双潜能干细胞分化为肝细胞状态的能力。在先前建立的(旧的)分化方案(DM)的基础上，我们开发了新的改进程序(DM+)，其将处理与4种其它的分化因子组合以及将改变的分离方案用于分化过程(图1A和B)。在下表中总结了先前和改进的分化培养基中的组分。DM+方案导致所有测试的肝细胞标志物的表达增加并降低了分化过程期间的胆命运承诺。最值得注意的是，DM+导致细胞色素(例如原代肝细胞水平的Cyp3A4)的表达和活性的显著提高，细胞色素是肝细胞中药物代谢的关键酶。因此，DM+是使人肝脏类器官适应商业应用(如毒理学分析和药物开发)的重要步骤。
根据先前在WO2012/014076、WO2012/168930和WO2015/173425中描述的方法，从在扩增培养基(例如参见下表)中培养的人肝脏干细胞获得人肝脏类器官。为了改善人类肝脏器官的分化，我们测试了具有潜在有益效果的多种不同因子。然而，这些中的大多数对分化的改善没有贡献(参见图2A)。由于与原代肝细胞相比，人肝脏类器官具有降低的AP-1复合物组分表达(数据未显示)，除了我们的标准分化培养基之外，我们测试了AP-1刺激剂卡巴胆碱，并且观察到白蛋白和Cyp3A4的表达略有提高(图2B)。向分化培养基中添加WNT具有相反效果并降低了白蛋白的表达(图2C)。因此，我们测试了阻断内源性WNT信号转导的WNT分泌抑制剂(IWP-2)，并观察到白蛋白和Cyp3A4表达的增加。在同一组实验中，我们还测试了GSK-3β抑制剂CHIR，它通过干扰β-连环蛋白破坏复合物的活性强烈增加WNT信号转导。与预期相反，添加CHIR99021不阻断分化(因为WNT的刺激确实如此)，但是我们观察到白蛋白和Cyp3A4表达的小幅增加。这使我们得出结论，CHIR99021刺激具有分化促进组分和分化抑制组分的双重作用。从之前的实验中我们知道WNT信号转导将是抑制组分。因此，我们研究了将CHIR99021刺激与破坏复合物下游的WNT信号转导阻断组合以抵消抑制组分的可能性。确实，将CHIR99021与能够阻断β-连环蛋白与TCF4结合的小分子iCRT3组合导致白蛋白和Cyp3A4表达的显著增加，同时降低了胆标志物CK19的表达(图2E)。除了培养基添加剂，我们还研究了分化过程的技术优化。我们发现在EM+BMP7预处理5天之后破坏并分离类器官培养物并直接变为分化培养基提高了白蛋白和Cyp3A4的水平(图2F)。这可能是降低的类器官大小(图2G)和分离程序期间所有扩增培养基生长因子的完全移除的组合效果。
我们测试了卡巴胆碱、IWP-2、CHIR99021+iCRT3以及新的的分离程序的分化改善是否是相加的，事实证明情况确实如此。因此，我们将我们新的分化方案DM+限定为以上的组合(图1A和B)。DM+导致肝细胞标志物(如白蛋白(图3A)、HNFa(图3B)、SerpinA1(图3C)和ASGPR(图3D))的表达甚至更高的改善。然而，最值得注意的是，细胞色素(如Cyp1A2和Cyp3A4)的表达强烈增加(图3E和F)。与旧的DM方案相比，Cyp3A4的表达平均高50x并达到原代肝细胞的水平。在新的DM+方案中，胆标志物(如CK7和CK19)的表达明显降低(图3G和H)，这证实了向肝细胞谱系的分化增加。
通常，DM+方案显著增加了分化为肝细胞命运的细胞的数目(图4A)。这在功能分析(如Cyp3A4活性分析)和白蛋白分泌(图4B和C)中也很明显。根据DM+方案分化的细胞的Cyp3A4活性处于原代肝细胞水平，并且远远超过HepG2细胞或旧DM条件所达到的水平。这也反映在提高的药物处理活性(如咪达唑仑向1-OH-咪达唑仑的处理(图4D))上。总之，DM+是人肝脏类器官向肝细胞命运分化的重要一步，并且改善了它们在多种药物代谢和毒理学分析中的性能。除了这些应用之外，改进的分化特征也可以表明在疾病建模和移植中的更好的性能。

Claims (40)

1.分化祖细胞的方法，其中所述方法包括：
在分化培养基中培养所述细胞，所述分化培养基包含基础培养基并且还包含一种或多种受体酪氨酸激酶配体、Notch抑制剂、糖皮质激素、TGF-β抑制剂和一种或多种Wnt抑制剂。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种Wnt抑制剂选自：(1)Wnt分泌抑制剂，(2)Wnt或Rspondin与Wnt受体复合物之间相互作用的竞争性或非竞争性抑制剂，(3)促进Wnt受体复合物组分降解的抑制剂，(4)蓬乱蛋白家族蛋白抑制剂，(5)促进破坏复合物活性的激活剂，(6)破坏复合物的去寡聚化抑制剂和/或(7)β-连环蛋白靶基因表达的抑制剂。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述一种或多种Wnt抑制剂包含Wnt分泌抑制剂，例如选自IWP 2、LGK974和IWP 1的Porc抑制剂。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述分化培养基还包含GSK-3抑制剂。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述一种或多种Wnt抑制剂包含作用于β-连环蛋白破坏复合物下游的抑制剂，例如抑制β-连环蛋白靶基因表达的Wnt抑制剂。
6.分化祖细胞的方法，其中所述方法包括：
在分化培养基中培养所述细胞，所述分化培养基包含基础培养基并且还包含一种或多种受体酪氨酸激酶配体、Notch抑制剂、糖皮质激素、TGF-β抑制剂和GSK-3抑制剂。
7.如权利要求4-6中任一项所述的方法，其中所述GSK-3抑制剂选自：CHIR99201、6-BIO、Dibromocantharelline、海门地塞(Hymenialdesine)、靛玉红(Indirubins)、Meridianins、CT98014、CT98023、CT99021、TWS119、SB-216763、SB-41528、AR-A014418、AZD-1080、阿特波龙(Alsterpaullone)、Cazpaullone、肯帕罗酮(Kenpaullone)、Aloisines、Manzamine A、Palinurine、Tricantine、TDZD-8、NP00111、NP031115、Tideglusib、HMK-32和L803-mts。
8.如权利要求6或权利要求7所述的方法，其中所述分化培养基还包含作用于β-连环蛋白破坏复合物的下游至少一种Wnt抑制剂，例如β-连环蛋白靶基因表达的抑制剂。
9.如权利要求5或权利要求8所述的方法，其中所述β-连环蛋白靶基因表达的Wnt抑制剂选自：iCRT3、CGP049090、PKF118310、PKF115 584、ZTM000990、PNU 74654、BC21、iCRT5、iCRT14和FH535。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述分化培养基还包含AP-1刺激剂。
11.分化祖细胞的方法，其中所述方法包括：
在分化培养基中培养所述细胞，所述分化培养基包含基础培养基并且还包含一种或多种受体酪氨酸激酶配体、Notch抑制剂、糖皮质激素、TGF-β抑制剂和AP-1刺激剂。
12.如权利要求10或权利要求11所述的方法，其中所述AP-1刺激剂是毒蕈碱乙酰胆碱受体激动剂，例如选自乙酰胆碱、氨甲酰甲胆碱、卡巴胆碱、氧代震颤素或毛果芸香碱。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述一种或多种受体酪氨酸激酶配体包含以下配体中的一种或多种或者全部：针对RTK I类的配体(EGF受体家族)(ErbB家族)、针对RTK IV类的配体(FGF受体家族)和针对RTK VI类的配体(HGF受体家族)。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述一种或多种受体酪氨酸激酶配体选自：表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)和肝细胞生长因子(HGF)。
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述Notch抑制剂是γ-分泌酶抑制剂，任选地DAPT或二苯并氮杂(DBZ)或苯二氮(BZ)或LY-411575。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述糖皮质激素选自：地塞米松、泼尼松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、倍他米松、曲安西龙、倍氯米松和醋酸氟氢可的松。
17.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述TGF-β抑制剂是ALK4、ALK5或ALK7的抑制剂，任选地选自：A83-01、SB-431542、SB-505124、SB-525334、LY 364947、SD-208和SJN 2511。
18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述分化培养基还包含BMP通路激活剂，任选地选自BMP7、BMP4和BMP2中的一种或多种。
19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述分化培养基还包含胃泌素。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述分化培养基包含：
EGF、FGF19和HGF作为受体酪氨酸激酶配体，
DAPT作为notch抑制剂，
IWP2和iCRT3作为Wnt抑制剂，
地塞米松作为糖皮质激素，
CHIR99021为GSK-3抑制剂，
以及卡巴胆碱作为AP-1抑制剂。
21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述分化培养基还包含选自以下的一种或多种组分：B27、不含视黄酸的B27和N2。
22.权利要求1-21任一项中所描述的分化培养基。
23.培养上皮干细胞的方法，其中所述方法包括：
在上皮干细胞的扩增培养基存在下培养所述上皮干细胞，以获得扩增的上皮干细胞；以及随后
在权利要求21所述的分化培养基中培养所述一种或多种扩增的细胞。
24.如权利要求1-21和23中任一项所述的方法，其中将所述细胞与细胞外基质接触培养。
25.如权利要求1-21和23-24中任一项所述的方法，其中所述方法还包括获得和/或分离分化的细胞群或分化的类器官。
26.如权利要求1-21和23-25中任一项所述的方法，其中所述祖细胞是上皮细胞，其例如来自肝脏、胰腺、肠、胃、前列腺、肺、乳腺、卵巢、唾液腺、毛囊、皮肤、食道、膀胱、耳朵或甲状腺。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述祖细胞来自肝脏或胰腺。
28.如权利要求1-21和23-27中任一项所述的方法，其中所述祖细胞是哺乳动物祖细胞，例如人祖细胞。
29.培养肝脏上皮干细胞，优选地以获得分化的肝脏类器官的方法，并且其中所述方法包括：
在扩增培养基存在下，培养与细胞外基质接触的一种或多种肝脏上皮干细胞；优选地，其中所述扩增培养基包含基础培养基，并且还包含：EGF、FGF10、HGF、Wnt激动剂(例如Rspondin)、烟酰胺、TGF-β抑制剂、毛喉素和胃泌素；以及随后
在权利要求21所述的，优选地如权利要求20所述的分化培养基的存在下，培养与细胞外基质接触的一种或多种扩增的肝脏上皮干细胞。
30.如权利要求22-28所述的方法，其中在扩增培养基中培养至少三天之后，破坏并分离培养物，然后在分化培养基中培养。
31.通过权利要求1-21和23-29中任一项所述的方法可获得的或获得的类器官。
32.如权利要求31所述的类器官，其中所述类器官来源于肝脏、胰腺、肠、胃、前列腺、肺、乳腺、卵巢、唾液腺、毛囊、皮肤、食道、膀胱、耳朵或甲状腺。
33.如权利要求31或32所述的肝脏类器官，其中所述肝脏类器官来源于人，并且其中至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少99％的细胞表达肝细胞标志物。
34.如权利要求31-33中任一项所述的肝脏类器官，其中所述肝脏类器官来源于小鼠，并且其中至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少99％的细胞表达肝细胞标志物。
35.组合物，其包含例如权利要求31-34中任一项所述的类器官和权利要求21所述的分化培养基。
36.如权利要求31-35中任一项所限定的类器官或者来源于所述类器官的细胞在下述中的用途：药物发现筛选；毒性分析；诊断；组织胚胎学、细胞谱系和分化途径的研究；包括重组基因表达的基因表达研究；组织损伤和修复中涉及的机制的研究；炎性和传染性疾病研究；发病机制研究；或者细胞转化和癌症病因机制的研究。
37.权利要求31-34中任一项所述的类器官或者来源于所述类器官的细胞，其用于医学，例如在治疗病症、病况或疾病中的用途。
38.如权利要求37所述的类器官或者来源于所述类器官的细胞，其中所述医学是再生医学，例如其中所述用途涉及将所述类器官或细胞移植到患者体内。
39.药物制剂，其包含一种或多种受体酪氨酸激酶配体、Notch抑制剂、地塞米松、TGF-β抑制剂、一种或多种Wnt抑制剂、GSK-3抑制剂和AP-1刺激剂。
40.筛选治疗性或预防性药物或化妆品的方法，其中所述方法包括：
使权利要求31-34中任一项所述的分化的类器官与候选分子(或候选分子库)接触，
评估所述类器官的任何影响(例如细胞中的任何变化，如增殖的减少或丧失、形态变化和/或细胞死亡)或类器官中的变化(例如类器官的大小或运动性)；
将引起所述影响的候选分子鉴定为潜在的药物或化妆品；以及任选地
将所述候选分子制备为药物或化妆品。
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