KR102133693B1

KR102133693B1 - 타액선 유래 줄기세포를 타액선 조직으로 분화시키는 방법 및 구강 건조증 치료 또는 예방용 조성물

Info

Publication number: KR102133693B1
Application number: KR1020180172856A
Authority: KR
Inventors: 권성근; 김주영; 최지숙
Original assignee: 서울대학교병원
Priority date: 2018-12-28
Filing date: 2018-12-28
Publication date: 2020-07-13
Also published as: KR20200082352A

Abstract

본 발명은 타액선 유래 줄기세포를 타액선 조직으로 분화시키는 방법 및 구강 건조증 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 방법은 타액선 유래 줄기세포와 지방조직 유래 중간엽 줄기세포를 Wnt/β-카테닌 활성제를 포함하는 배지에서 공배양하는 단계를 포함한다. 또한, 본 발명에 따른 구강 건조증 치료 또는 예방용 조성물은 타액선 유래 줄기세포, 지방조직 유래 중간엽 줄기세포, 및 Wnt/β-카테닌 활성제를 포함한다.

Description

타액선 유래 줄기세포를 타액선 조직으로 분화시키는 방법 및 구강 건조증 치료 또는 예방용 조성물 {Method for differentiating salivary gland stem cell to salivary gland tissue and pharmaceutical composition for treating or preventing xerostomia}

본 발명은 타액선 유래 줄기세포를 타액선 조직으로 분화시키는 방법 및 구강 건조증 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다.

타액은 타액선에서 생성되어 구강 내로 배출되는 체액 성분으로, 인체 항상성 유지에 매우 중요하다. 타액은 예를 들어, 뮤신(mucin) 또는 면역 글로불린을 통해 일차 방어 작용을 하고, 윤활 및 수분을 유지하고 pH를 중화시키는 역할을 함으로써 구강 점막 및 치아를 보호하는 작용을 하며, 아밀라아제와 같은 소화액을 통하여 소화 작용을 담당한다.

이와 같이 타액을 분비하는 조직을 타액선이라하며, 주타액선에서는 하루에 1 내지 1.5L의 타액이 생성되는 것으로 알려졌다. 타액선은 이하선(parotid gland), 악하선(submandibular gland), 설하선(sublingual gland) 및 소타액선으로 구성되어 있으며, 하위 조직으로 분비 조직인 세엽 (acini) 및 도관 조직인 관 (ducts)으로 구성된다. 타액선 구성 세포는 점액 세엽세포(mucous acinar cell), 장액 세엽세포(serous acinar cell), 관세포(duct cell), 근상피 세포(myoepithelial cell), 전구 줄기 세포(progenitor stem cell), 신경 세포(nerve cell), 및 혈관세포(blood vessel cells)를 포함한다.

타액선의 기능이 저하되는 경우, 구강 건조증이 발생될 수 있는데, 특히 난치성 구강건조증은 두경부암 치료를 위한 방사선 치료, 갑상선암 치료를 위한 방사선 동위원소요법, 노화, 경구용 약물 남용, 쇼그렌 증후군(Siogren syndrome) 등에 따른 타액선 기능저하가 주된 원인으로 알려져 있다. 구강 건조증이 발병한 경우, 구강점막의 갈라짐·함몰 및 자정작용의 부족으로 인한 치과 질환이 발병되는데, 타액선, 특히 타액선 전구 세포(salivary gland progenitor cell)는 골수, 림프기관과 함께 방사선에 가장 취약한 기관으로 알려져 있다.

구강 건조증의 치료 방법으로는 무설탕 껌을 씹거나 타액 대치액을 사용하는 것과 같은 대증적인 방법, 비타민 혹은 호르몬 투여, 또는 스테로이드 계통의 약물 복용, 필로카핀 (pilocarpin) 또는 브로모헥신 (bromohexin) 투여와 같은 약물 치료 방법이 있다. 그러나 만성 구강 건조증의 경우에는 치료제가 개발되지 않아 완치가 어려운 실정이다.

WO 2014/003307

본 발명은 타액선 유래 줄기세포를 타액선 조직으로 분화시키는 방법 및 구강 건조증 치료 또는 예방용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

항목 1. 타액선 유래 줄기세포와 지방조직 유래 중간엽 줄기세포를 Wnt/β-카테닌 활성제를 포함하는 배지에서 공배양하는 단계를 포함하는, 타액선 유래 줄기세포로부터 타액선 조직 형태로 분화시키는 방법.

항목 2. 항목 1에 있어서, Wnt/β-카테닌 활성제는 CHIR99021 (6-[[2-[[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(5-methyl-1H-imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethyl]amino]-3-pyridinecarbonitrile) 또는 Wnt5a인, 방법.

항목 3. 항목 1 또는 2에 있어서, 상기 타액선 유래 줄기세포와 지방조직 유래 중간엽 줄기세포는 하이드로겔에서 공배양되는, 방법.

항목 4. 항목 2에 있어서, 상기 CHIR99021은 2μM 내지 10μM로 배지에 포함되는, 방법.

항목 5. 항목 2에 있어서, 상기 Wnt5a은 0.2μg/ml 내지 0.8μg/ml로 배지에 포함되는, 방법.

항목 6. 항목 1 또는 2에 있어서, 상기 타액선 조직 세포는 세엽세포(acinar cell), 관세포(duct cell), 또는 세엽세포 및 관세포인, 방법.

항목 7. 타액선 유래 줄기세포, 지방조직 유래 중간엽 줄기세포, 및 Wnt/β-카테닌 활성제를 포함하는, 구강 건조증 치료 또는 예방용 조성물.

항목 8. 항목 7에 있어서, 상기 타액선 유래 줄기세포 및 지방조직 유래 중간엽 줄기세포는 스페로이드(spheroid) 형태인, 조성물.

항목 9. 항목 7 또는 8에 있어서, Wnt/β-카테닌 활성제는 CHIR99021 (6-[[2-[[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(5-methyl-1H-imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethyl]amino]-3-pyridinecarbonitrile) 또는 Wnt5a인, 조성물.

항목 10. 항목 9에 있어서, 상기 CHIR99021은 2μM 내지 10μM 로 배지에 포함되는, 조성물.

항목 11. 항ahr 9에 있어서, 상기 Wnt5a은 0.2μg/ml 내지 0.8μg/ml 로 배지에 포함되는, 조성물.

항목 12. 항목 7 또는 8에 있어서, 상기 조성물은 하이드로겔 형태인, 조성물.

본 발명에 따른 타액선 유래 줄기세포로부터 타액선 조직으로 분화시키는 방법은 기존에 알려진 FGF7 또는 FGF10을 이용하는 경우에 비하여 타액선 세포로 분화되는 속도가 빠르고, 특히 세엽세포 및/또는 관세포를 포함하는 다양한 타액선 조직 세포로 분화되므로, 구강 건조증 치료에 유용한 약물을 스크리닝하기 위한 플랫폼으로써 이용할 수 있다.

또한 본 발명에 따른 조성물을 이용함으로써 구강 건조증을 치료하거나 예방할 수 있다.

도 1은 계대수 증가에 따른, 줄기세포 마커인 CD24, CD44, CD49, CD133 표면 단백질 및 세엽세포의 마커인 CD166 표면 단백질의 발현 양을 FACs 분석을 이용하여 확인한 결과이다.
도 2는 계대수 증가에 따라 세엽세포에서 주로 발현된다고 알려진 aquaporin5(AQP5) 및 amylase의 mRNA발현량 및 관세포에서 발현된다고 알려진 Cp2l-1 (grainyhead-related transcription factor)의 발현량을 확인한 결과이다.
도 3은 대조군 배지 및 세엽세포 분화 배지에서 각각 CHIR99021의 포함 여부에 따른 줄기 세포의 세엽세포 및 관세포로의 분화를 시간별(0일, 3일, 5일 및 7일)로 확인한 사진이다.
도 4는 대조군 배지 및 세엽세포 분화 배지에서 각각 CHIR99021 및 Wnt5a의 포함 여부 및 지방조직 유래 중간엽 줄기세포의 공배양 여부에 따른 줄기 세포의 세엽세포 및 관세포로의 분화를 시간별(1일, 3일, 및 6일)로 확인한 사진이다.
도 5는 대조군 배지 및 세엽세포 분화 배지에서 각각 FGF7 및 FGF10의 포함 여부에 따른 지방조직 유래 중간엽 줄기세포의 공배양 시 줄기 세포의 세엽세포 및 관세포로의 분화를 시간별(1일, 3일, 및 6일)로 확인한 사진이다.
도 6a는 세엽세포 분화 배지에서 지방조직 유래 중간엽 줄기세포의 공배양 시 6일째에 줄기 세포의 분화 정도를 확인한 사진이고, 도 6b는 CHIR99021을 포함하는 세엽세포 분화 배지에서 지방조직 유래 중간엽 줄기세포의 공배양 시 6일째에 줄기 세포의 분화 정도를 확인한 사진이며, 도 6c는 Wnt5a를 포함하는 세엽세포 분화 배지에서 지방조직 유래 중간엽 줄기세포의 공배양 시 6일째에 줄기 세포의 조직으로의 분화 및 발전 정도를 확인한 사진이고, 도 6d는 FGF7을 포함하는 세엽세포 분화 배지에서 지방조직 유래 중간엽 줄기세포의 공배양 시 6일째에 줄기 세포의 분화 정도를 확인한 사진이고, 도 6e는 FGF10을 포함하는 세엽세포 분화 배지에서 지방조직 유래 중간엽 줄기세포의 공배양 시 6일째에 줄기 세포의 분화 정도를 확인한 사진이다.
도 7a는 세엽세포 분화 배지에서 지방조직 유래 중간엽 줄기세포의 공배양 시 6일째에 줄기 세포의 분화 정도를 H&E 염색법으로 염색하여 확인한 결과이고, 도 7b는 CHIR99021을 포함하는 세엽세포 분화 배지에서 지방조직 유래 중간엽 줄기세포의 공배양 시 6일째에 줄기 세포의 분화 정도를 H&E 염색법으로 염색하여 확인한 결과이다.
도 8은 CHIR99021을 포함하는 세엽세포 분화 배지에서 지방조직 유래 중간엽 줄기세포의 공배양 시 6일째에 AQP5 및 cytokeratin7 (CK7)을 이용한 조직 염색 결과이다.
도 9는 Wnt5a, FGF7 또는 FGF10을 포함하는 세엽세포 분화 배지에서 지방조직 유래 중간엽 줄기세포의 공배양 시 6일째에 AQP5 및 CK7을 이용한 조직 염색 결과이다.
도 10은 세엽세포 분화 배지에서 CHIR99021 또는 Wnt5a의 포함 여부에 따른 지방조직 유래 중간엽 줄기세포의 공배양 시 6일째에 AQP5 및 CK7을 이용한 조직 염색 결과이다.

이제 본 발명은 첨부된 도면을 참조로 하기에서 더욱 충분히 기술될 것이며, 그러나 본 발명의 전부가 아닌 단지 일부의 구체예가 예시된다. 실제로, 이들 발명은 많은 다양한 형태로 구체화될 수 있으며, 본원에 제시된 구체예로 제한되는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용되는 단수 형태는 달리 명확하게 지시하지 않는 한 복수한 대상을 포함한다.

본 발명은 타액선 유래 줄기세포로부터 타액선 조직으로 분화시키는 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 방법은 타액선 유래 줄기세포와 지방조직 유래 중간엽 줄기세포를 공배양하는 단계를 포함한다. 타액선 유래 줄기세포를 단독 배양하는 경우에 비하여 지방조직 유래 중간엽 줄기세포를 타액선 유래 줄기세포와 함께 배양하는 경우, 타액선 조직세포로의 분화 속도가 증진되는 것을 확인하였다. 또한 본 발명에 따른 방법은 Wnt/β-카테닌 활성제를 더 포함하여 타액선 조직 세포로의 분화를 촉진할 수 있다. Wnt/β-카테닌 활성제는 Wnt/β-카테닌 신호전달 체계를 활성화시킬 수 있는 물질로, 예를 들어, Wnt agonist 1, CHIR98014, SB216763, CHIR99021 또는 Wnt5a를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서, Wnt/β-카테닌 활성제는, 바람직하게는 CHIR99021, Wnt5a, 또는 CHIR99021 및 Wnt5a이다. CHIR99021은 6-[[2-[[4-(2,4-디클로로페닐)-5-(5-메틸-1H-이미다졸-2-일)-2-피리미디닐]아미노]에틸]아미노]-3-피리딘카보니트릴 (6-[[2-[[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(5-methyl-1H-imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethyl]amino]-3-pyridinecarbonitrile)이고, CHIR98014는 N-6-[2-[[4-(2,4-디클로로페닐)-5-(1H-이미다졸-1-일)-2-피리미디닐]아미노]에틸]-3-니트로-2,6-피리딘디아민 (N-6-[2-[[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(1H-imidazol-1-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethyl]-3-nitro-2,6-pyridinediamine)으로서, 상업적으로 이용 가능하다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 타액선 유래 줄기세포 및 지방조직 유래 중간엽 줄기세포는 접착 배양, 부유 배양, 또는 삼차원배양 방법을 통해 공배양할 수 있으며, 이 때, 예를 들어, 합성배지, 복합배지, 농화배지, 선택배지, 감별배지, 증식배지, 또는 유지배지를 이용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서 타액선 유래 줄기세포 및 지방조직 유래 중간엽 줄기세포는 삼차원배양 방법으로 배양하는 것이 바람직하며, 삼차원배양은 하이드로겔을 이용할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 하이드로겔은 생체와 유사한 외부 환경 (extracellular matrix)을 조성하기 위한 물질로, 예를 들어, 폴리에스터 중합체, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리카프로락톤, 및/또는 폴리락트산-글리콜산의 공중합체, 폴리하이드로옥시부티르산, 폴리하이드로옥시발레르산 및 폴리하이드로옥시부티르산-발레르산의 공중합체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 하이드로겔은 콜라겐, 히알루론산, 글루코스아미노글리칸, 파이브로넥틴, 카르복시메틸 셀룰로우즈, 알긴산, 키토산, 폴리카프로락톤, 폴리락틱엑시드, 폴리글리콜산, 히드록시아파타이트, 또는 트리칼슘 포스페이트, 또는 이의 조합을 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 하이드로겔은 마트리젤(Matrigel)일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 CHIR99021은 2μM 내지 10μM, 본 발명의 일 실시예에서는 3μM 내지 7μM, 본 발명의 다른 실시예에서는 4μM 내지 6μM, 본 발명의 또 다른 실시예에서는 5μM로 배지에 포함되고, 상기 Wnt5a은 0.2μg/ml 내지 0.8 μg/ml, 본 발명의 일 실시예에서는 0.3μg/ml 내지 0.7μg/ml, 본 발명의 다른 실시예에서는 0.4μg/ml 내지 0.6μg/ml, 본 발명의 또 다른 실시예에서는 0.5μg/ml로 배지에 포함될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 타액선 유래 줄기세포, 지방조직 유래 중간엽 줄기세포, 및 Wnt/β-카테닌 활성제를 포함하는, 구강 건조증 치료 또는 예방용 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 조성물은 줄기세포 치료법을 통하여 대상체에 이식함으로써 구강 건조증을 치료하거나, 구강 건조증이 발생될 위험이 있는 대상체에 본 발명에 따른 조성물을 이식함으로써 구강 건조증 발생을 예방할 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 구강 건조증으로 고통받는 대상체를 치료할 수 있는 약학적 유효량의 타액선 유래 줄기세포, 및 지방조직 유래 중간엽 줄기세포를 포함하고, 상기 타액선 유래 줄기세포, 및/또는 지방조직 유래 중간엽 줄기세포는 상기 대상체로부터, 또는 동종, 또는 이종으로부터 얻을 수 있다. 상기 조성물은 스페로이드가 포함된 하이드로겔 형태로 이식될 수 있고, 상기 하이드로겔은 생체 독성이 약하거나 없는 물질로서 생체 적합성 물질이면 제한 없이 이용 가능 하다. 예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니나, 하이드로겔은 폴리에스터 중합체, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리카프로락톤, 및/또는 폴리락트산-글리콜산의 공중합체, 폴리하이드로옥시부티르산, 폴리하이드로옥시발레르산 및 폴리하이드로옥시부티르산-발레르산의 공중합체일 수 있고, 콜라겐, 히알루론산, 글루코스아미노글리칸, 파이브로넥틴, 카르복시메틸 셀룰로우즈, 알긴산, 키토산, 폴리카프로락톤, 폴리락틱엑시드, 폴리글리콜산, 히드록시아파타이트, 또는 트리칼슘 포스페이트, 또는 이의 조합을 더 포함할 수 있다.

상기 조성물의 투여량은 각각의 경우에서 각 대상체의 필요에 따라 변경될 수 있다. 비경구적으로 투여되는 경우, 일반적으로 대상체에게 약 0.01 내지 약 5.0 x 10⁶mg/kg의 용량으로 투여된다. 사용되는 세포의 수는 대상체의 체중 및 건강 상태에 따라 달리질 수 있으며, 투여 회수 또는 주기와 같은 다른 변수들은 본 발명에 속한 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 변경하여 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 이식될 조직, 장기 또는 세포에 따라 적합한 방법으로 투여될 수 있는데, 예를 들어, 비경구적으로, 정맥 주사와 같이 전신으로 투여될 수 있고, 치료가 요망되는 부위, 예를 들어, 구강에 국소적으로 투여될 수 있으며, 피하 또는 근육에 주입될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물에서 세포는 약 0.01 내지 5×10⁶ cells/ml의 농도로 적절한 용매에 부유되어있거나, 스페로이드(spheroid) 형태일 수 있다. 투여에 적합한 부형제는 식염수와 같은 세포 및 대상체에 생리적으로 적합한 물질일 수 있다. 주사용의 수용액으로서는, 예를 들면 생리 식염수, 포도당이나 그 외의 보조약을 포함한 등장용액, 예를 들면 D-소르비톨, D-만노스, D-만니톨, 염화 나트륨을 들 수 있어 적당한 용해 보조제, 예를 들면 알코올, 구체적으로는 에탄올, 폴리 알코올, 예를 들면 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 비이온성 계면활성제, 예를 들면 폴리소르베이트 80(TM), HCO-50으로 병용할 수 있다. 유성액으로서는 참기름, 콩기름을 들 수 있어 용해 보조제로서 안식향산벤질, 벤질 알코올과 병용할 수 있다.

줄기세포(stem cell)는 자기 복제능 및 분화능을 갖는 미분화 상태의 세포를 의미한다. 줄기세포는 유래에 따라 배아 줄기 세포 및 성체 줄기 세포로 구분되며, 분화능에 따라 만능 (totipotent, omnipotent), 전분화능 (pluripotent), 다분화능(multipotent, oligopotent), 및 단분화능 (unipopent) 줄기세포로 분류될 수 있다. 만능 줄기세포는 생체를 구성하는 모든 조직이나 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖는 세포를 의미하고, 전분화능 줄기세포는 생체를 구성하는 모든 조직이나 세포는 아니지만 대부분의 조직이나 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖는 세포를 의미하고 다분화능 줄기세포는 복수 종의 조직이나 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖는 세포를 의미하며, 단분화능 줄기세포는 특정한 조직이나 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖는 세포를 의미한다. 전분화능 줄기세포는, 예를 들어, 배아 줄기세포, 미분화생식선세포, 및 역분화줄기세포를 포함하고, 다분화능 줄기세포는, 예를 들어, 지방조직 유래 줄기세포, 골수유래 줄기세포, 제대혈 유래 줄기세포 및 탯줄 유래 간엽계 줄기세포, 조혈계 줄기세포, 신경계 줄기세포, 및 생식 줄기세포와 같은 성체 줄기세포를 포함하고, 단분화능 줄기세포는 예를 들어, 간세포(Committed stem cell)를 포함한다.

배지(media)는 세포를 유지하거나 증식시키거나 분화시키기 위한 영양 조성물을 의미한다. 본 발명에서 대조군 배지 (control media; CM)는 F12/DMEM 기반 배지로서, 10% 우태아혈청, 1% 페니실린/스트렙토마이신을 포함하고, 세엽세포 분화 배지 (acinar differentiated media; AM)는 F12/DMEM 기반 배지로서 1% N2 supplement, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 20 ng/mL 재조합 인간 FGF-2, 20 ng/mL 재조합 인간 EGF를 포함한다 (Singh, Shree Ram (Ed.), Somatic Stem Cells: Methods and Protocols, 2012).

Wnt5a는 WNT5A 유전자(NM_001256105, NM_003392)에 의해 인코딩되는 단백질(NP_001243153.1, NP_033550.2)로, Wnt 패밀리에 속한다. Wnt5a는 암 발생 및 여러 발달 과정에서 관련되어 있으며, 특히, 세포 운명의 조절이나 배아발생 동안의 패턴에도 연관되어 있다. Wnt5a는 류마티스 관절염, 결핵, 및 죽상경화증과 같은 염증성 질환에 관련되어 있고, 암 및 염증성 질환에서 Wnt5a는 대식세포에 의해 주로 분비되는 것으로 알려졌다 (Blumenthal, Antje, et al., The Wingless homolog WNT5A and its receptor Frizzled-5 regulate inflammatory responses of human mononuclear cells induced by microbial stimulation, Blood. 108 (3), 965-973; Sen, Malini, et al., Blockade of Wnt-5A/Frizzled 5 signaling inhibits rheumatoid synoviocyte activation, Arthritis & Rheumatism. 44 (4), 772-781).

FGF7은 섬유아세포 성장 인자 7 (fibroblast growth factor 7) 단백질로서, FGF7 유전자(NM_002009)에 의해 인코딩 되며 (NP_002000), 타액선의 형태 발생, 특히 세엽세포의 발생을 촉진시킨다고 알려져 있다 (Vaishall N. Patel, et al., Salivary gland branching morphogeneis, Differentiation (2006) 74: 349-364; Kuniharu Morita, et al., EGF-Dependent Lobule Formation and FGF7-DependentStalk Elongation in Branching Morphogenesis of MouseSalivary Epithelium In Vitro, DEVELOPMENTAL DYNAMICS (1999) 215:148-154; Hiroaki Taketa, et al., Peptide-modified Substrate for Modulating Gland Tissue Growth and Morphology In Vitro, Nature Scientific Report (2015) 5:11468, 1-9).

FGF10은 섬유아세포 성장 인자 10 (fibroblast growth factor 10) 단백질로서, FGF10 유전자(NM_004465)에 의해 인코딩 되며 (NP_004456), 타액선의 발달 (Itoh N, et al., Fgf10: a paracrine-signaling molecule in development, disease, and regenerative medicine, Current Molecular Medicine. (2014) 14 (4): 504-9; Kirsty L. Wells, et al., Dynamic relationship of the epithelium and mesenchyme during salivary gland initiation: the role of Fgf10, Biology Open (2013) 0, 1-9), 및 관세포의 신장에 관여하는 것으로 알려졌다 (Hiroaki Taketa, et al., Peptide-modified Substrate for Modulating Gland Tissue Growth and Morphology In Vitro, Nature Scientific Report (2015) 5:11468, 1-9).

구강 건조증은 타액이 감소하는 현상을 의미하며, 구강 내 조직이 건조해지고 작열감을 나타낸다. 통상적으로 타액의 분비가 50% 이상 감소된 환자의 경우 구강건조증의 증상이 나타난다고 알려져 있고, 통상적으로 자극 시 분당 05~0.7 mL 이하 또는 비자극 시 분당 0.1 mL 이하의 타액이 분비되는 경우에 타액분비저하증으로 정의한다 (Jeong Seok Choi, Jae Yol Lim, Diagnosis and treatment of xerostomia, Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 2016;59(6): 424-429). 혀는 위축성 변화를 나타내면서 갈라지고, 치아는 다발성 우식증에 생길 가능성이 높아지며, 치주질환, 캔디다균의 감염, 구취 등이 발생할 수 있다. 또한 음식물을 삼키기가 어렵고, 음식의 맛을 느낄 수 없으며, 발음장애 등이 나타날 수도 있다.

스페로이드(spheroid)는 3차원 세포 모델의 한가지 유형으로, 2차원 세포 모델에 비하여 세포 간의 상호 작용 및 세포와 매트릭스와의 상호작용과 같은 살아있는 세포의 환경 조건을 더 잘 시뮬레이션할 수 있다. 스페로이드의 형성 방법은, 예를 들어, 저 세포 점착 플레이트를 사용하는 방법, 행잉-드롭(hanging-drop) 방법, 및 회전 벽 베슬 생물 반응기(rotating wall vessel bioreactor)를 이용하는 방법이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

하기 실시예는 오직 예시목적으로 의도되며, 어떤한 식이든 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것이 아니다.

실시예

실시예 1. 타액선 조직 유래 줄기세포의 분리

실시예 1.1

8 내지 12주령의 수컷 C57BL/6 마우스로부터 타액선을 적출하고, 이를 DMEM/F12 (Gibco)에 페니실린 (100U/ml), 스트렙토마이신 (100U/ml)(Gibco)과 암포테리신 B(Amphotericin B) (5μg/ml, Gibco)이 포함된 세척 완충액으로 헹구어 주었다. 수술용 가위와 칼을 이용하여 물리적으로 잘게 부수어준 조직을 10ml의 분리 완충액(dissociation buffer) (DMEM/F12에 Liberase TM (0.2U/ml, Roche)과 0.1% 트립신/EDTA가 포함된 완충액)에 옮겨 담아 30분동안 37℃ 항온 수조에 반응시키되, 10분에 한번씩 교반하였다. 이후 300xg로 5분동안 원심분리한 후, 상층액은 버리고 모아진 펠렛에 10ml의 분리 완충액을 다시 넣어주고 위와 같은 작업을 반복하였다. 얻어진 펠렛에 1ml의 DNase (10mg/ml, Sigma-Aldrich) 용액을 넣어준 후, 2분간 혼합하고, 228xg로 5분간 원심분리 해 주었다. 이후 10% FBS(Gibco)가 포함된 DMEM 20ml로 세척 후, 70μm 세포 여과기(cell strainer)를 통과시킨 후 228xg로 5분간 원심분리하고 배양액에서 세포를 부유시켜 배양하였다.

사용한 배양 배지는 대조군 배지(control media; CM)와 세엽세포 분화 배지(acinar differentiation media; AM) 두가지로 사용하였으며, DMED/F12에 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 대조군 배지를 이용하여 세엽세포로 분화되지 않은 전 단계의 세포를 구축하였고, DMEM/F12에 1% N2 supplement (Gibco), 1% 페니실린/스트렙토마이신, 20 ng/mL rhFGF-2 (R&D), 20 ng/mL rhEGF (R&D)가 포함된 세엽세포 분화 배지를 이용하여 세엽세포로 분화시킨 세포를 구축하였다.

실시예 1.2

상기 실시예 1로부터 분리된 타액선 조직 유래 줄기세포를 대조군 배지와 세엽세포 분화 배지를 이용하여 분화시키고 각 계대수 별로 줄기세포 성질을 나타낸다고 알려진 마커를 확인해보았다.

계대수 증가에 따른 줄기세포 마커의 발현량의 변화를 CD24, CD44, CD49, CD133의 표면 단백질의 FACs 분석을 이용하여 확인하였으며, 세엽세포의 분화는 CD166 표면 단백질의 발현량을 동일한 방법으로 조사함으로써 확인하였다.

그 결과 계대 수 증가에 따라 선별되는 세포 군집의 변화가 보였으며 (붉은색 군집에서 녹색 군집으로 변화함), 여기서 주요 군집이 되는 세포들(녹색)의 CD24, CD44 및 CD49의 발현량이 증가하는 것으로 보아, 줄기세포의 성격을 가지는 전발생 세포 (progenitor cell)가 선별되어 살아남는 것을 확인하였다. (도 1a, b)

또한, 세엽세포 분화배지를 이용한 경우, 세엽세포 마커인 CD166의 발현량이 증가하는 것으로 보아, 세엽세포로 분화 가능한 전발생 세포인 것으로 확인되었다. (도 1b)

실시예 1.3

실시예 6.1에서 사용한 세포들을 지속적으로 계대하여 얻어진 세포들의 표현형을 알아보고자, 계대수 15와 계대수 28 일때, 이들의 RNA를 분리하여 cDNA를 합성하여 qRT-PCR을 진행하여 관세포와 세엽세포에서 주로 발현된다고 알려진 유전자의 발현량을 확인해보았다.

계대수 증가에 따라 세엽세포에서 주로 발현된다고 알려진 aquaporin5(AQP5)와 아밀라아제의 mRNA발현량을 확인해본 결과, 계대수가 증가할수록, 세엽세포 분화배지에서 키운 세포일수록 AQP5의 발현량이 증가하였고, 아밀라아제는 대조군 배지와 세엽세포 분화배지 모두에서 발현량이 증가함을 알 수 있었다. 또한 관세포에서 발현된다고 알려진 Cp2l-1 (grainyhead-related transcription factor)의 발현량은 계대수가 증가할수록 대조군 배지에서 키워진 세포에서만 발현되는 것을 확인하였다. (도 2)

실시예 2. CHIR99021이 관세포 및 세엽세포로의 분화에 미치는 영향

실시예 2.1

상기 실시예 1로부터 분리된 타액선 조직 유래 줄기세포를 대조군 배지 (control media; CM) (F12/DMEM (Gibco), 10% 우태아혈청 (Gibco), 1% (w/v) 페니실린/스트렙토마이신(Gibco)) (Singh, Shree Ram (Ed.), Somatic Stem Cells: Methods and Protocols, 2012)를 포함하는 마트리젤(matrigel, Corning Life Sciences)에 접종하고 37℃에서 7일간 배양하며 0일, 3일, 5일 및 7일째에 각각 분화 정도를 확인하였다.

실시예 2.2

상기 실시예 2.1의 CM에 CHIR99021 (6-[[2-[[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(5-methyl-1H-imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethyl]amino]-3-pyridinecarbonitrile; CAS Number 1797989-42-4, Selleckchem) 5μM가 더 포함된 것을 제외하고 상기 실시예 2.1과 동일한 방법으로 배양하고 분화 정도를 확인하였다.

실시예 2.3

상기 실시예 1로부터 분리된 타액선 조직 유래 줄기세포를 세엽세포 분화 배지 (acinar differentiated media; AM) (F12/DMEM (Gibco), 1% N2 supplement (Gibco), 1% (w/v) 페니실린/스트렙토마이신 (Gibco), 20 ng/mL rhFGF-2 (R&D), 20 ng/mL rhEGF (R&D)) (Singh, Shree Ram (Ed.), Somatic Stem Cells: Methods and Protocols, 2012)를 함유하는 마트리젤에 접종하고 37℃에서 7일간 배양하며 0일, 3일, 5일 및 7일째에 각각 분화 정도를 확인하였다.

실시예 2.4

상기 실시예 2.3의 AM에 CHIR99021 (Selleckchem) 5μM가 더 포함된 것을 제외하고 상기 실시예 2.3와 동일한 방법으로 배양하고 분화 정도를 확인하였다.

상기 실시예 2.2의 경우 상기 실시예 2.1에 비하여 관세포(ductal cell) 신장 (elongation) 성질이 더 증가함을 확인하였다. 또한, 상기 실시예 2.4의 경우, 상기 실시예 2.3에 비하여 세엽세포(acinar cell)의 출아(budding) 성질이 더 증가됨을 확인할 수 있었다 (도 3).

이를 통하여, Wnt/β-카테닌 활성제인 CHIR99021이 타액선 조직 유래 줄기세포의 세엽세포 및 관세포로의 분화를 촉진함을 확인할 수 있었다.

실시예 3. 지방조직 유래 중간엽 줄기세포와 공배양 시 Wnt/b-카테닌 활성제의 관세포 분화에 미치는 영향

실시예 3.1

상기 실시예 2.1 및 실시예 2.3에따라 배양된 침샘 조직 세포와 지방조직 유래 중간엽 줄기세포(Lonza)로 하기와 같이 스페로이드(spheroid)를 만들었다:

3D 배양이 가능한 아가 몰드(agar mold)를 만들어 침샘 조직세포와 지방조직 유래 중간엽 줄기세포를 동일한 양 (2.5x10⁵ cells/ml)으로 뿌려주고, 24시간동안 37℃ CO₂ 배양기에 배양하여 250μm의 직경을 가진 스페로이드를 제조하였다. 이렇게 만들어진 스페로이드를 모아 마트리젤 50μl와 스페로이드 용액 50μl와 섞어 12 웰 플레이트에 접종하여 6일동안 배양 및 관찰하였다.

제작된 스페로이드를 CM를 포함하는 마트리젤(matrigel, Corning Life Sciences, Cat.No. 356237)에 접종하고 37℃에서 6일간 배양하였으며, 1일, 3일, 및 6일째에 각각 분화 정도를 확인하였다.

실시예 3.2

상기 실시예 3.1의 CM에 CHIR99021 (Selleckchem) 5μM가 더 포함된 것을 제외하고 상기 실시예 3.1과 동일한 방법으로 배양하고 분화 정도를 확인하였다.

실시예 3.3

상기 실시예 3.1의 CM에 Wnt5a (R&D systems) 0.5μg/ml가 더 포함된 것을 제외하고 상기 실시예 3.1과 동일한 방법으로 배양하고 분화 정도를 확인하였다.

실시예 3.4

상기 실시예 3.1의 CM에 FGF7 (R&D systems) 100ng/ml이 더 포함된 것을 제외하고 상기 실시예 3.1과 동일한 방법으로 배양하고 분화 정도를 확인하였다.

실시예 3.5

상기 실시예 3.1의 CM에 FGF10 (R&D systems) 100ng/ml이 더 포함된 것을 제외하고 상기 실시예 3.1과 동일한 방법으로 배양하고 분화 정도를 확인하였다.

실시예 3.6

상기 실시예 1로부터 분리된 타액선 조직 유래 줄기세포와 지방조직 유래 중간엽 줄기세포로 스페로이드(spheroid)를 실시예 3.1과 동일한 방법으로 만들었다.

제작된 스페로이드를 AM를 포함하는 마트리젤(matrigel, Corning Life Sciences, Cat.No. 356237)에 접종하고 37℃에서 6일간 배양하였으며, 1일, 3일, 및 6일째에 각각 분화 정도를 확인하였다.

실시예 3.7

상기 실시예 3.6의 AM에 CHIR99021 (Selleckchem) 5μM이 더 포함된 것을 제외하고 상기 실시예 3.6과 동일한 방법으로 배양하고 분화 정도를 확인하였다.

실시예 3.8

상기 실시예 3.6의 AM에 Wnt5a (R&D systems) 0.5μg/ml가 더 포함된 것을 제외하고 상기 실시예 3.6과 동일한 방법으로 배양하고 분화 정도를 확인하였다.

실시예 3.9

상기 실시예 3.6의 AM에 FGF7 (R&D systems) 100ng/ml이 더 포함된 것을 제외하고 상기 실시예 3.6과 동일한 방법으로 배양하고 분화 정도를 확인하였다.

실시예 3.10

상기 실시예 3.6의 AM에 FGF10 (R&D systems) 100ng/ml이 더 포함된 것을 제외하고 상기 실시예 3.6과 동일한 방법으로 배양하고 분화 정도를 확인하였다.

CHIR99021 또는 Wnt5a를 포함하는 AM에서 타액선 유래 줄기세포를 지방조직 유래 중간엽 줄기세포와 공배양한 경우(각각 실시예 3.7 및 실시예 3.8), 6일째에 스페로이드들이 응집하면서 관 조직이 형성되는 것을 확인할 수 있었다. 또한, Wnt/β-카테닌 활성제를 포함하지 않는 AM에서 타액선 유래 줄기세포를 지방조직 유래 중간엽 줄기세포와 공배양한 경우(실시예 3.6), Wnt/β-카테닌 활성제를 포함하지 않는 CM에서 타액선 유래 줄기세포를 지방조직 유래 중간엽 줄기세포와 공배양한 경우(실시예 3.1)에 비하여 관 조직 형성 속도가 빠른 것으로 확인되었다. 또한 CHIR99021 또는 Wnt5a를 포함하는 CM에서 타액선 유래 줄기세포를 지방조직 유래 중간엽 줄기세포와 공배양한 경우(실시예 3.2 및 실시예 3.3), Wnt/β-카테닌 활성제를 포함하지 않는 CM의 경우(실시예 3.1)에 비하여 스페로이드 간의 응집이 다소 관찰되었으나 관 조직은 발견되지 않았다 (도 4).

CHIR99021과 Wnt5a는 AM에서 모두 스페로이드들이 응집하면서 관조직으로의 발전을 통하여 침샘조직의 기능을 할 수 있는 형태학적 변화를 촉진하였다. 또한, CHIR99021과 Wnt5a는 CM으로 키워진 타액선 유래 줄기세포와 지방조직 유래 중간엽세포와의 공배양의 경우에는 관 형태는 보이지 않으나, 관세포의 특징으로 보이는 스페로이드들간의 연결성을 증가시킬 수 있는 뻗어나가는 성질이 증가되어 있는 것을 확인할 수 있었다 (도 4, arrowhead로 표시함). CM에서 배양된 세포는 관세포의 성격이 강하며, AM에서 배양된 세포는 세엽세포의 성격이 강하여 지방조직 유래 줄기세포와 공배양을 할 경우, 지방조직 유래 줄기세포가 주변 골격을 만들어 관형태를 잘 형성시키는 것으로 생각되며, CM의 경우에는 둘의 시너지적 효과가 AM의 경우보다 적은 것으로 사료된다.

한편, FGF7를 포함하는 AM에서 타액선 유래 줄기세포를 지방조직 유래 중간엽 줄기세포와 공배양한 경우(실시예 3.9), 스페로이드의 출아가 증가함을 확인할 수 있었고, FGF10을 포함하는 AM에서 타액선 유래 줄기세포를 지방조직 유래 중간엽 줄기세포와 공배양한 경우(실시예 3.10)에는 관 조직 형성이 증가함을 확인할 수 있었다. 그러나 이러한 양상은 CHIR99021 또는 Wnt5a을 처리한 경우(실시예 3.7 및 실시예 3.8)에 비하여 약하게 나타났다 (도 5).

실시예 4. CHIR99021 및 Wnt5a에 의한 타액선 조직 형성 촉진

실시예 4.1

상기 실시예 2.4에 따라 세엽세포로 분화된 세포를 지방조직 유래 줄기세포와 공배양하여 스페로이드를 제조하고, AM를 포함하는 마트리젤에 접종 후 37℃에서 6일동안 배양하였다.

실시예 4.2

상기 실시예 4.1 중 AM에 CHIR99021 (Selleckchem) 5μM이 더 포함된 것을 제외하고 상기 실시예 4.1과 동일한 방법으로 배양하였다.

실시예 4.3

상기 실시예 4.1 중 AM에 Wnt5a (R&D systems) 0.5μg/ml이 더 포함된 것을 제외하고 상기 실시예 4.1과 동일한 방법으로 배양하였다.

실시예 4.4

상기 실시예 4.1 중 AM에 FGF7 (R&D systems) 100ng/ml이 더 포함된 것을 제외하고 상기 실시예 4.1과 동일한 방법으로 배양하였다.

실시예 4.5

상기 실시예 4.1 중 AM에 FGF10 (R&D systems) 100ng/ml이 더 포함된 것을 제외하고 상기 실시예 4.1과 동일한 방법으로 배양하였다.

그 결과, Wnt/β-카테닌 활성제를 포함하지 않는 AM의 경우(실시예 4.1)에 비하여 (도 6a), CHIR99021을 포함하는 AM의 경우(실시예 4.2, 도 6b) 및 Wnt5a를 포함하는 AM의 경우(실시예 4.3, 도 6c)에서 모두 관 조직이 형성되는 것을 확인할 수 있었다. 또한, FGF7을 포함하는 AM의 경우(실시예 4.4)에는 출아가 관찰되었고(도 6d), FGF10을 포함하는 AM의 경우(실시예 4.5)에도 관 조직이 형성되는 것을 확인할 수 있었으나(도 6e), 실시예 4.2 및 실시예 4.3에 비하여 진행 속도가 현저히 느리게 나타났다.

실시예 5. 구조체의 특성 및 분자 마커 발현의 확인

상기 실시예 3.6 및 실시예 3.7에 따라 마트리젤 안에서 배양된 스페로이드 구조체를 조직염색을 하기 위하여 Histogel (Thermoscientific)을 이용하여 고정화하고, H&E 염색법으로 염색하였다. Histogel은 세포 또는 스페로이드를 파라핀 포매가 용이하도록 만들어진 젤로 65℃의 온도에서 액상을 나타내어 그 안에 마트리젤 안에 있는 스페로이드 응집체를 넣고 상온에서 굳힌 다음 이를 파라핀 블록으로 만들어 절편을 얻어 면역조직염색에 이용하였다.

그 결과, 실시예 3.6에 따른 스페로이드의 경우 붉은 색으로 염색된 부분이 확인되지 않았으나 (도 7a), 실시예 3.7에 따른 스페로이드의 경우, 분홍색으로 염색된 부분이 확인되었으며, 세엽세포의 형상을 나타내었다 (도 7b).

또한 실시예 3.7에 따라 배양된 스페로이드를 세엽세포의 분자 마커인 AQP5 및 관세포의 분자 마커인 CK7을 각각 조직 염색하였다. 면역조직염색은 위의 Histogel을 이용하여 만들어진 파라핀 절편이 올려진 슬라이드에서 자일렌을 이용하여 파라핀을 제거하고 에탄올을 이용하여 재수화를 거치고, 시트르산 완충액으로 조직 내 항원을 노출시켰다. 이후 3% H₂O₂를 이용하여 내인성 퍼옥시다아제를 제거하고, 세엽세포 마커로 알려진 AQP5를 인지하는 1차 항체와 관세포 마커로 알려진 CK7을 인지하는 1차 항체를 각각 일정시간 노출시킨 후 1차 항체를 인지하고 퍼옥시다아제가 탑재된 2차 항체를 결합시키고 여기에 DAB 용액을 처리하여 발색을 유도하였다. Hematoxylin&Eosin (H&E)염색법은 상기 재수화 단계 이후, 바로 Hematoxylin과 Eosin을 조직에 처리하여 염색함으로써 수행하였다. AQP5를 이용한 조직 염색을 통하여 갈색으로 발색되는 부분이 H&E 염색법에서 분홍색으로 염색된 부분과 겹쳐지는 것을 통해서 세엽세포인 것을 확인할 수 있었고, CK7을 이용한 조직 염색의 갈색부분은 세엽세포가 존재하는 이외의 부분에 존재하여 아직 관형태를 띄진 않지만 두 세포의 분리가 이루어져 있음을 알 수 있었으며, 붉은색으로 염색된 것으로 보아 세엽세포 외에도 관세포로도 분화됨을 확인하였다 (도 8).

실시예 3.8 및 실시예 3.9의 경우 모두 세엽세포가 형성된 것을 확인할 수 있었으나, 실시예 3.9는 관세포의 형성이 실시예 3.7 및 실시예 3.8에 비하여 느린 것으로 보이고, 실시예 3.10의 경우 세엽세포는 확인되지 않았고 관세포만 형성된 것으로 확인되었다 (도 9).

한편, 실시예 3.1 내지 실시예 3.3에서 배양된 스페로이드를 Histogel을 이용하여 고정하고 H&E 염색법 및 조직 염색법으로 AQP5 및 CK7을 염색하였다.

그 결과, CHIR99021이 배지에 첨가된 경우, 세엽세포뿐만 아니라 관세포로의 분화도 이루어졌음을 확인할 수 있었다 (도 10).

예를 들어, 청구항 구성 목적을 위해, 이하 기재되는 청구항은 어떤 식으로든 이의 문자 그대로의 언어보다 좁게 해석되어선 안 되고, 따라서 명세서로부터의 예시적 구현예가 청구항으로 읽혀서는 안 된다. 따라서, 본 발명은 예시로서 기재되었고, 청구항의 범위에 대한 제한이 아님이 이해되어야 한다. 따라서, 본 발명은 하기 청구항에 의해서만 제한된다. 본 출원에 인용된 모든 간행물, 발행된 특허, 특허 출원, 서적 및 저널 논문은 이들의 전체내용이 참조로서 본원에 각각 포함된다.

Claims

타액선 유래 줄기세포와 지방조직 유래 중간엽 줄기세포를 Wnt/β-카테닌 활성제를 포함하는 배지에서 공배양하는 단계를 포함하는, 체외에서 타액선 유래 줄기세포로부터 타액선 조직 세포로 분화시키는 방법.
청구항 1에 있어서, Wnt/β-카테닌 활성제는 CHIR99021 (6-[[2-[[4-(2,4-디클로로페닐)-5-(5-메틸-1H-이미다졸-2-일)-2-피리미디닐]아미노]에틸]아미노]-3-피리딘카보니트릴) 또는 Wnt5a인, 방법.
청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 타액선 유래 줄기세포와 지방조직 유래 중간엽 줄기세포는 하이드로겔에서 공배양되는, 방법.
청구항 2에 있어서, 상기 CHIR99021은 2μM 내지 10μM 로 배지에 포함되는, 방법.
청구항 2에 있어서, 상기 Wnt5a은 0.2μg/ml 내지 0.8μg/ml 로 배지에 포함되는, 방법.
청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 타액선 조직 세포는 세엽세포(acinar cell), 관세포(duct cell), 또는 세엽세포 및 관세포인, 방법.
타액선 유래 줄기세포, 지방조직 유래 중간엽 줄기세포, 및 Wnt/β-카테닌 활성제를 포함하는 배지를 포함하는, 구강 건조증 치료 또는 예방용 조성물.
청구항 7에 있어서, 상기 타액선 유래 줄기세포 및 지방조직 유래 중간엽 줄기세포는 스페로이드(spheroid) 형태인, 조성물.
청구항 7 또는 8에 있어서, Wnt/β-카테닌 활성제는 CHIR99021 (6-[[2-[[4-(2,4-디클로로페닐)-5-(5-메틸-1H-이미다졸-2-일)-2-피리미디닐]아미노]에틸]아미노]-3-피리딘카보니트릴) 또는 Wnt5a인, 조성물.
청구항 9에 있어서, 상기 CHIR99021은 2μM 내지 10μM 로 배지에 포함되는, 조성물.
청구항 9에 있어서, 상기 Wnt5a은 0.2μg/ml 내지 0.8μg/ml 로 배지에 포함되는, 조성물.
청구항 7 또는 8에 있어서, 상기 조성물은 하이드로겔 형태인, 조성물.