DE69734395T2

DE69734395T2 - Verbesserte chondrogene differenzierung von menschlichen mesenchym-stammzellen

Info

Publication number: DE69734395T2
Application number: DE69734395T
Authority: DE
Inventors: F. Mark PITTENGER; M. Alastair MACKAY; Mary J. MURPHY; P. Francis BARRY
Original assignee: Osiris Therapeutics Inc
Current assignee: Osiris Therapeutics Inc
Priority date: 1996-12-06
Filing date: 1997-12-05
Publication date: 2006-07-27
Anticipated expiration: 2017-12-06
Also published as: CA2274122C; ATE306811T1; DK0948255T3; AU742638B2; EP0948255A1; EP0948255A4; EP0948255B1; DE69734395D1; AU5591198A; JP2001512304A; CA2274122A1; ES2251746T3; JP4531135B2; WO1998032333A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Verfahren und Zusammensetzungen zum Dirigieren von mesenchymalen, in vitro-gezüchteten Progenitorzellen zur Differenzierung zu spezifischen Zellabstammungslinien und insbesondere zu einer derartigen Abstammungslinieninduktion vor oder gleichzeitig mit ihrer Implantation in einen Empfänger oder Wirt zur therapeutischen Behandlung von pathologischen Zuständen bei Menschen und anderen Spezies.
Mesenchymale Stammzellen (MSCs) sind die formativen, pluripotenten Blasten oder embryoartigen Zellen, die in Knochenmark, Blut, Dermis und Periosteum auftreten und zur Differenzierung zu speziellen Typen von Mesenchym- oder Bindegeweben, einschließlich adipösen, knochenartigen, knorpelartigen, elastischen, muskelartigen und faserigen Bindegeweben, befähigt sind. Der spezifische Differenzierungsweg, den diese Zellen einschlagen, hängt von verschiedenen Einflüssen ab, und zwar von mechanischen Einflüssen und/oder endogenen, bioaktiven Faktoren, wie Wachstumsfaktoren, Cytokinen und/oder lokalen Mikroumgebungsbedingungen, die sich durch das Wirtsgewebe ergeben. Obgleich diese Zellen normalerweise im Knochenmark nur in sehr geringer Häufigkeit auftreten, wird in den US-Patenten 5 197 985, 5 226 914 und 5 486 359 (Caplan et al.) und in Mesenchymal stem cells, J. Orthoped. Res., Bd. 9 (1991), S. 641–650, über ein Verfahren zur Isolierung, Reinigung und mitotischen Expansion der Population dieser Zellen in Gewebekultur berichtet.
In pränatalen Organismen ist die Differenzierung von MSCs zu spezialisierten Bindegewebszellen gut belegt; beispielsweise differenzieren embryonale Hühner-, Mäuse- oder humane Gliedmaßen-Knospen-Mesenchymzellen zu Knorpel-, Knochen und anderen Bindegeweben (A. I. Caplan, Mesenchymal stem cells, J. Orthoped. Res., Bd. 9 (1991), S. 641–650; 39th Annual Symposium of the Society for Developmental Biology, Hrsg. S. Subtelney und U. Abbott, New York, Alan R. Liss Inc., (1981), S. 3768; Elmer et al., Teratology, Bd. 24 (1981), S. 215–223; S. D. Hauschka, Dev. Biol., Bd. 37 (1974), S. 345–368; Solursh et al., Dev. Biol., Bd. 83 (1981), S. 9–19; Swalla et al., Dev. Biol., Bd. 116 (1986), S. 31–38). Ferner wurde gezeigt, dass eine kalvariale, klonale Rattenfötus-Zelllinie zu Muskeln, Fett, Knorpel und Knochen differenziert (Goshima et al., Clin. Orthop. Rel. Res., Bd. 269 (1991), S. 274–283). Das Auftreten von MSCs in postnatalen Organismen wurde nicht eingehend mit dem Ziel untersucht, die Differenzierung von postembryonalen Zellen zu verschiedenen mesodermalen Phänotypen zu belegen. Die wenigen Untersuchungen, die bisher durchgeführt wurden, betreffen die Bildung von Knochen und Knorpel durch Knochenmarkzellen unter anschließendem Einbau in Diffusionskammern sowie die in vivo-Transplantation (Ashton et al., Clin. Orthop. Rel. Res., Bd. 151 (1980), S. 294–307; Bruder et al., Bone Mineral, Bd. 11 (1990), S. 141–151). Kürzlich wurden Zellen aus Hühner-Periosteum isoliert und in Kultur expandiert. Unter Bedingungen hoher Dichte wurde in vitro gezeigt, dass sie zu Knorpel und Knochen differenzieren (Nakahara et al., Exp. Cell. Res., Bd. 195 (1991), S. 492–503). Von Mesenchymzellen, die von Ratten-Knochenmark abgeleitet waren, wurde gezeigt, dass sie zur Differenzierung zu Osteoblasten und Chondrozyten befähigt sind, wenn sie in vivo implantiert werden (Dennis et al., Cell Transpl., Bd. 1 (1991), S. 2332; Goshima et al., Clin. Orthop. Rel. Res., Bd. 269 (1991), S. 274–283). Von den in Kultur befindlichen Phänotypen von Chondrozyten wurde berichtet, dass sie durch die Konzentrationen von für die Glycolyse und den Citronensäurezyklus verfügbaren Zuckern beeinflusst werden (P. Otte, "Basic cell metabolism of articular cartilage. Manometric studies", Z. Rheumatol., Bd. 50 (1991), S. 304–12; und J. M. Lane, C. T. Brighton und B. J. Menkowitz, "Anaerobic and aerobic metabolism in articular cartilage", J. Rheumatol., Bd. 4 (1977), S. 334–42).
Kürzlich beschrieben Johnstone et al. (Trans. Orthop. Res. Soc., Bd. 42 (1996), S. 65, In vitro chondrogenesis of bone marrow-derived mesenchymal cells, Transactions of the Orthopaedic Research Society, Bd. 21 (1996), S. 65) die Kulturbedingungen, unter denen Ratten-MSCs in vitro einen chondrozytenartigen Phänotyp entwickeln. Die Zellen werden unter minimalen Kulturbedingungen in Abwesenheit von Serum, jedoch in Gegenwart von Dexamethason, ITS und Ascorbinsäurephosphat gezüchtet. Wenn die Zellen bei niedriger Geschwindigkeit zentrifugiert wurden, entstand eine Schicht, die innerhalb von 1 bis 2 Tagen ein frei fließendes Pellet bildete. Innerhalb von Wochen beginnen die Zellen mit der Synthese und Sekretion von Kollagen vom Typ II, was den ursprünglichen Beobachtungen unter Verwendung von humanen Zellen entspricht.
Eine Schädigung von artikulären Oberflächen von synovialen Gelenken kann durch Trauma, Krankheiten, wie Osteoarthritis, und als Folge des Alterungsvorgangs auftreten. Die sozialen und wirtschaftlichen Kosten von Gelenkschädigungen sind hoch und wirksame Therapien, die die Gelenkfunktion wiederherstellen können, wären hochwillkommen. Gelenkknorpel wird während des pränatalen und postnatalen Wachstums durch Mesenchymzellen, die zu artikulären Chondrozyten differenziert sind, erzeugt und aufrechterhalten. Individuen können mit zunehmender Reife die Fähigkeit zur Reparatur von größeren Synovialdefekten verlieren, da ihren Gelenken eine ausreichende Anzahl an Zellen fehlt, die in entsprechender Weise differenziert sind, um Gelenkknorpel zu regenerieren. Somit besteht ein großes Interesse an der Hypothese, dass geschädigte Gelenkoberflächen durch Implantation von autologen Zellen, die eine geeignete extrazelluläre Matrix rekonstituieren, repariert werden können. Eine Untersuchung, die die Einführung von gezüchteten Chondrozyten in das Knie beinhaltet, erschien sehr vielversprechend¹. Der Orthopäde Joseph Buckwalter betonte in einem kürzlich erschienenen Artikel, dass diesen und ähnlichen Anstrengungen ein widersprüchlicher Langzeiterfolg beschieden ist (J. A. Buckwalter, "Regenerating articular cartilage: Why the sudden interest?", Orthopedics Today, 12. April 1996).
Somit bestehen weiterhin Bedürfnisse und Chancen in bezug auf Knorpel-Regenerationstherapien.
WO-96/23059 beschreibt Dulbecco-modifiziertes Eagle-Medium mit einem niedrigen Glucosegehalt zur Züchtung von humanen, mesenchymalen Stammzellen.
Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
Bisher war es nicht möglich, eine große Anzahl von hMSCs in einheitlicher Weise auf die Bildung von Chondrozyten-Linien festzulegen. Mit der Zusammensetzung, die gemäß dem Verfahren von Anspruch 1 oder 12 verwendet wird, gelingt es, dieses Ziel zu erreichen. Somit stellt die vorliegende Erfindung einen wichtigen Schritt bei der Entwicklung einer Technologie, d. h. der autologen, auf MSC basierenden Reparatur von Gelenkknorpel dar, deren Anwendungsmöglichkeiten ausgedehnt und von großer Bedeutung sind.
Die Erfinder haben festgestellt, dass humane mesenchymale Stammzellen (hMSCs) ihre Lebensfähigkeit behalten und dazu veranlasst werden können, in verbesserter weise festgelegt und differenziert zu werden, wenn sie in vitro mit bestimmten chondroinduktiven Medienzusammensetzungen in Kontakt gebracht werden, die erhöhte Konzentrationen an einfachen Zuckern oder anderen Faktoren enthalten, die zur Bildung von ATP durch den Citronensäurezyklus beitragen, wobei diese Zusammensetzungen den Angaben in den Ansprüchen 1 oder 12 entsprechen. Die hMSCs sind im Verfahren gemäß Anspruch 10 oder 12 in einem dreidimensionalen Format, z. B. einem Zellpellet, assoziiert. Das dreidimensionale Format trägt zur erfindungsgemäßen in vitro-Chondrogenese bei und die Zellen sind vorzugsweise verdichtet, z. B. als eine gepackte oder pelletisierte Zellmasse. Es wird angenommen, dass dieses in vitro-Verfahren den Vorgang wiederholt, der in vivo abläuft, und zur Definition der molekularen Ereignisse, die im Vorgang der Chondrogenese von Bedeutung sind, herangezogen werden kann.
Somit wird bei einem Aspekt der Erfindung ein verfahren gemäß Anspruch 1 oder 12 bereitgestellt, bei dem eine Zusammensetzung für die in vitro-Chondrogenese von humanen, mesenchymalen Vorläuferzellen und für die von diesen ausgehende in vitro-Bildung von humanen Chondrozyten verwendet, wobei die Zusammensetzung isolierte, humane, mesenchymale Stammzellen (in einem dreidimensionalen Format) und mindestens ein chondroinduktives Mittel in einem Medium mit einer Konzentration an einem einfachen Zucker von mindestens 3 g/Liter, vorzugsweise von etwa 3 g/Liter bis etwa 7 g/Liter, im Kontakt damit umfasst. Bei den mesenchymalen Stammzellen handelt es sich vorzugsweise um isolierte, in Kultur expandierte, humane, mesenchymale Stammzellen in einer chemisch definierten, serumfreien Umgebung, die in enger Nachbarschaft zueinander verdichtet sein können, wie in Form einer dreidimensionalen Zellmasse, z. B. in Form von gepackten Zellen oder eines Zentrifugen-Zellpellets.
Gemäß einem weiteren erfindungsgemäßen Aspekt wurde festgestellt, dass TGF-β3 ein wirksameres chondroinduktives Mittel ist, als die bisher verwendeten Mittel, wie (i) ein Glucocorticoid, z. B. Dexamethason; (ii) weitere Mitglieder der Oberfamilie transformierender Wachstumsfaktor β, z. B. morphogenes Knochenprotein (vorzugsweise BMP-2 oder BMP-4), TGF-β1, Inhibin A oder chondrogener, stimulierender Aktivitätsfaktor; (iii) eine Komponente der kollagenen, extrazellulären Matrix, wie Kollagen I; oder (iv) ein Vitamin A-Analoges, wie Retinoesäure. Das TGF-β3 wird dem Medium in einer Menge zugesetzt, die eine Differenzierung von MSCs vorwiegend in Chondrozyten herbeiführt. Eine derartige Konzentration beträgt mindestens etwa 5 ng/ml Medium und vorzugsweise 5–15 ng/ml Medium.
Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren von Chondrozyten aus mesenchymalen Stammzellen bereit, indem man mesenchymale Stammzellen in vitro mit einem chondroinduktiven Mittel im vorstehend beschriebenen verbesserten Medium gemäß Anspruch 1 in Kontakt bringt, vorzugsweise bei einer Glucose- oder Lactosekonzentration, die höher ist als die bisher bei der Induktion der chondrogenen Differenzierung angewandte Konzentration.
Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Induktion der Chondrogenese in mesenchymalen Stammzellen bereit, indem man mesenchymale Stammzellen in vitro mit der erfindungsgemäßen Zusammensetzung gemäß Anspruch 12 in Kontakt bringt.
Ferner werden in vitro-Züchtungsbedingungen beschrieben, die eine weitere Differenzierung und Reifung von hMSC-abgeleiteten Chondrozyten zu hypertrophen Chondrozyten ermöglichen. Dies ist unter anderem für folgende Zwecke wertvoll: (i) Untersuchungen über Faktoren, die bei der Chondrozytenreifung beteiligt sind, (ii) Untersuchungen von Veränderungen der Genexpression, die während der Chondrogenese ablaufen, (iii) Identifizierung und Untersuchung von Faktoren, die durch reifende Chondrozyten erzeugt werden, (iv) Bewertung der Wirkungen von pharmakologischen Mitteln auf reifende Chondrozyten, (v) Bestimmung der Empfindlichkeit von reifenden Chondrozyten gegenüber Matrix-Metalloproteinasen und andere abbauende Enzyme, die bei Gelenkkrankheiten, wie Osteoarthritis, üblich sind, und (vi) Untersuchungen über die Expression von Genen, die in hMSCs mit dem Ziel zur Besserung von Gelenkkrankheiten eingeführt werden.
Die Fähigkeit von hMSCs, einer hypertrophen Differenzierung zu unterliegen, ist von direkter Bedeutung für die Reparatur von die volle Dicke erreichenden Defekten von Gelenkknorpeln durch implantierte hMSCs. Das Implantat wird im benachbarten Gewebe besser "verankert" und die Reparatur wird dauerhafter, wenn hypertropher Knorpel, mineralisierter Knorpel und Knochen durch das implantierte Material in die tiefen Bereiche des Defekts implantiert werden. Die hier vorgelegten in vitro-Ergebnisse stellen einen wichtigen Hinweis dafür dar, dass ein derartiger Ersatz eine wertvolle klinische Option darstellt. Somit besteht ein Teil dieses Aspekts der Erfindung darin, den chondrogenen Differenzierungsprozess zu modulieren, indem man Bedingungen identifiziert, die einen spezifischen Phänotyp fördern, d. h. die Zellen zu veranlassen, sich zu hypertrophen Chondrozyten zu entwickeln, da dieser Phänotyp ausgeprägt ist und die Reifung der Zellen über das Chondroblastenstadium hinaus anzeigt.
Bei den vorstehenden Verfahren handelt es sich bei den mesenchymalen Stammzellen vorzugsweise um isolierte, in Kultur expandierte, humane, mesenchymale Stammzellen in einer chemisch definierten, serumfreien Umgebung, die in enger Nachbarschaft zueinander kondensiert sind, z. B. in Form einer dreidimensionalen Zellmasse, wie gepackten Zellen oder einem zentrifugalen Zellpellet. Ferner umfasst das Kontaktieren vorzugsweise die Züchtung eines Pellets von humanen, mesenchymalen Vorläuferzellen in einem chemisch definierten, serumfreien Medium gemäß der Definition in Anspruch 1 oder 12. Die vorstehenden Verfahren können vorzugsweise auch Stufen umfassen, bei denen die Zellen mit der chondroinduktiven Zusammensetzung gezüchtet werden und anschließend in ein starres, poröses Gefäß, z. B. ein keramisches Rohr, gebracht werden.
Ferner ist es möglich, ein isoliertes, nicht-gezüchtetes, nicht-homogenes, humanes, mesenchymales Stammzellenpräparat in der Zusammensetzung und den Verfahren der Erfindung einzusetzen. MSCs können als nicht-gezüchtete, nicht-homogene Präparate isoliert werden, z. B. durch Dichtegradientenfraktionierung aus Geweben, wie Knochenmark, Blut (einschließlich peripheres Blut), Periosteum und Dermis, und anderen Geweben, die mesodermalen Ursprungs sind. Diesbezüglich wurde festgestellt, dass diese mesenchymalen Stammzellen zwar normalerweise beispielsweise im Knochenmark in sehr geringen Mengen vorhanden sind, dass diese Mengen im Alter stark abnehmen (d. h. etwa 1/10 000 Zellen bei einem relativ jungen Patienten bis nur 1/2 000 000 bei einem älteren Patienten) und dass jedoch humane mesenchymale Stammzellpräparate aus Gewebe, insbesondere Knochenmark, so isoliert werden können, dass sie im wesentlichen frei von anderen Typen von Zellen im Knochenmark sind. Es kommt in Betracht, dass das isolierte Fraktionierungspräparat Zellen umfasst, von denen mindestens etwa 90 % und vorzugsweise mindestens etwa 95 % humane, mesenchymale Stammzellen sind.
Ferner werden in vitro-Züchtungsbedingungen beschrieben, die die weitere Differenzierung und Reifung von hMSC-abgeleiteten Chondrozyten zu hypertrophen Chondrozyten ermöglichen und fördern. Dies erweist sich als wertvoll bei Untersuchungen von Faktoren, die an der Chondrozytenreifung beteiligt sind, bei Untersuchungen von Veränderungen der Genexpression, die während der Chondrogenese ablaufen, bei der Identifizierung und Untersuchung von Faktoren, die durch reifende Chondrozyten erzeugt werden, bei der Bewertung der Einflüsse von pharmakologischen Mitteln auf reifende Chondrozyten, bei der Bestimmung der Empfindlichkeit von reifenden Chondrozyten gegenüber Matrix-Metalloproteinasen und anderen abbauenden Enzymen, die bei Gelenkkrankheiten, wie Osteoarthritis, üblich sind, und bei Untersuchungen über die Expression von Genen, die in hMSCs mit dem Ziel der Besserung von Gelenkkrankheiten eingeführt werden.
Die Abfolge von Ereignissen, die bei der Induktion der Chondrogenese und bei der Erzeugung von Chondrozyten bei den vorstehenden in vitro-Verfahren auftreten, gleicht den Ereignissen bei der Chondrogenese bei der Bildung von embryonalen Gliedmaßen. Da alle Komponenten des Systems definiert sind, kann das System als wertvolles Forschungswerkzeug für Untersuchungen der Einflüsse von Wachstumsfaktoren und dergl. auf den Fortschritt der Chondrogenese eingesetzt werden. Ferner ist es auch einsetzbar, um die molekulare Steuerung der Säugetier-Chondrogenese aus Progenitorzellen zu untersuchen.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
Nachstehend wird die Erfindung unter Bezugnahme auf eine kurze Beschreibung der einzelnen Figuren näher erläutert, wobei diese Ausführungen aber keinesfalls den Schutzumfang der Erfindung beschränken.
1: Veränderungen der Größe von hMSC-Pellets spiegeln das Ausmaß der Synthese von extrazellulären Matrixkomponenten wider. Die einzelnen Pellets wurden durch Übertragung einer Aliquotmenge von 200 000 Zellen in 1/2 ml chondrogenes Medium mit 1 g/Liter (5,5 mM) Glucose (links) oder 4,5 g/Liter (25 mM) Glucose (rechts) gebildet.
2A: 8 μm-Schnitte von hMSC-Pellets bei Züchtung in chondrogenem Medium mit 1 g/Liter Glucose nach 1-wöchiger Züchtung. Schnitte wurden einer Immunofärbung auf die Anwesenheit von Kollagen vom Typ II unterworfen und entwickelt, zeigten aber nicht das braune Reaktionsprodukt, das im Pellet bei Züchtung mit hohem Glucosegehalt sichtbar ist, wie in 2B dargestellt. Schnitte wurden auch mit Hämatoxylin gefärbt. Vergrößerung: 125×.
2B: 8 μm-Schnitte von hMSC-Pellets bei Züchtung in chondrogenem Medium mit 4,5 g/Liter Glucose nach 1-wöchiger Züchtung. Schnitte wurden einer Immunofärbung auf die Anwesenheit von Kollagen vom Typ II unterzogen und entwickelt. Ein braunes Reaktionsprodukt ist nur im Pellet, das bei hohem Glucosegehalt gezüchtet worden ist, sichtbar. Schnitte wurden auch mit Hämatoxylin gefärbt. Vergrößerung: 125×.
3A: Dünnschnitte von hMSC-Pellets bei 2-wöchiger Züchtung in Medium mit niederem Glucosegehalt. Die Immunofärbung zeigt, dass das Pellet unter Bedingungen mit niedrigem Glucosegehalt weniger Kollagen vom Typ II angereichert hat, als das Pellet unter Bedingungen mit hohem Glucosegehalt gemäß Darstellung in 3B. Vergrößerung: 125×.
3B: Dünnschnitte von hMSC-Pellets bei 2-wöchiger Züchtung in Medium mit hohem Glucosegehalt. Die Immunofärbung zeigt, dass das Pellet unter Bedingungen mit hohem Glucosegehalt mehr Kollagen vom Typ II angereichert hat, als das Pellet unter Bedingungen mit niedrigem Glucosegehalt gemäß Darstellung in 3A. Vergrößerung: 125×.
4A: Dünnschnitte von hMSC-Pellets nach 3-wöchiger Züchtung bei Färbung mit Toluidinblau O. Die purpurfarbene "metachromatische" Färbecharakteristik einer extrazellulären knorpelartigen Matrix ist weniger deutlich als im Pellet mit hohem Glucosegehalt gemäß der Darstellung in 4B. Vergrößerung: 125×.
4B: Dünnschnitte von hMSC-Pellets nach 3-wöchiger Züchtung bei Färbung mit Toluidinblau O. Die purpurfarbene "metachromatische" Färbecharakteristik einer extrazellulären knorpelartigen Matrix ist im Pellet mit hohem Glucosegehalt (B) deutlicher als im Pellet mit geringem Glucosegehalt gemäß 4A. Vergrößerung: 125×.
5A: Lebensfähigkeitsfärbung von 21 Tage alten hMSC-Pellets. Gezüchtete Pellets wurden mit 2 μM homodimerem Ethidium-Farbstoff 72 Stunden inkubiert, anschließend fixiert, geschnitten und mit einem zweiten Farbstoff, nämlich DAPI, nachgefärbt. Die Kerne von nicht-lebensfähigen Zellen nehmen das Ethidium-Homodimere auf und fluoreszieren damit rot. Lebensfähige Zellen fluoreszieren blau, da bei ihnen nach Fixierung und Schnitt DAPI eingebaut ist. Der Zelltod ist ein wichtiges Merkmal von Pellets mit geringem Glucosegehalt, wie hier ersichtlich ist. Vergrößerung: 125×.
5B: Lebensfähigkeitsfärbung von 21 Tage alten hMSC-Pellets. Gezüchtete Pellets wurden mit 2 μM homodimerem Ethidium-Farbstoff 72 Stunden inkubiert, anschließend fixiert, geschnitten und mit einem zweiten Farbstoff, nämlich DAPI, nachgefärbt. Die Kerne von nicht-lebensfähigen Zellen haben Ethidium-Homodimeres aufgenommen und fluoreszieren somit rot. Lebensfähige Zellen fluoreszieren blau, da nach Fixierung und Schnitt DAPI eingebaut ist. Der Zelltod stellt ein wichtiges Merkmal von Pellets mit niedrigem Glucosegehalt dar und ist durch Züchtung unter Bedingungen von hohem Glucosegehalt im Vergleich zu 5A erheblich verringert. Vergrößerung: 125×.
6 zeigt Pellets von hMSCs, die gemäß den Angaben von Beispiel 4 in chondrogener Kultur hergestellt worden sind, die Regionen von Zellen mit einer hypertrophen Morphologie enthielt. Die hMSCs können somit unter Züchtungsbedingungen für eine chondrogene Differenzierung einer Hypertrophie unterliegen. Wie dargestellt, unterlag ein hMSC-Pellet nach 21-tägiger Züchtung einer unvollständigen chondrogenen Differenzierung. DMEM mit hohem Glucosegehalt wurde mit TGF-β3, Dexamethason und anderen Mitteln (wie beschrieben) ergänzt. Der Schnitt wurde einer Immunofärbung auf Kollagen vom Typ II unterzogen. Die unvollständige braune Färbung zeigte, dass nur ein Teil des Pellets Zellen enthielt, die diesen Knorpelmarker sezernierten. Jedoch enthielt diese Typ II-Kollagen-positive Region Zellen innerhalb großer Lakunen. Eine derartige Morphologie ließ darauf schließen, dass hMSCs in Pelletkultur dazu befähigt sind, einer hypertrophen Differenzierung zu unterliegen. Endvergrößerung: 150×.
7A und 7B zeigen ebenfalls Pellets von Zellen, die gemäß Beispiel 5 hergestellt worden sind. Sie zeigten eine größere Hypertrophizität als Zellen von 6. Diese Figuren zeigen, dass die aufeinanderfolgende Behandlung von hMSCs in Pelletkultur mit zwei Medien Hypertrophie induziert. Nach 14-tägiger Züchtung im chondrogenen Medium wurde das Pellet von 7A abgeändert in ein Medium mit Mangel an TGF-β3 und mit einem Gehalt an 10^–9 M Dexamethason, 50 nM Thyroxin und 20 mM β-Glycerinphosphat. Das Pellet von 7B blieb im ursprünglichen Medium. Nach 28 Tagen wurden beide Pellets geerntet, geschnitten und mit Antikörper gegen Kollagen vom Typ II gefärbt. Kollagen vom Typ II ist in beiden Pellets vorherrschend. Die große Anzahl an Zellen mit vergrößerten Lakunen im Pellet von 7A zeigte an, dass eine hypertrophe Differenzierung von hMSCs den vorwiegenden Weg bei diesem 2-stufigen Züchtungsvorgang darstellt. Im Gegensatz dazu wies das Pellet von 7B nur relativ wenige hypertrophe Chondrozyten auf. Endgültige Vergrößerung: 60x.
Ausführliche Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen
Nachstehend wird die Erfindung unter Bezugnahme auf zahlreiche Ausführungsformen und Beispiele näher beschrieben.
Mesenchymale Stammzellen (MSCs) sind die formativen, pluripotenten Blasten oder embryoartigen Zellen, die in Knochenmark, Blut, Dermis und Periosteum auftreten und zur Differenzierung zu speziellen Typen von Mesenchym- oder Bindegeweben, einschließlich adipösen, knochenartigen, knorpelartigen, elastischen, muskelartigen und faserigen Bindegeweben, befähigt sind. Der spezifische Differenzierungsweg, den diese Zellen einschlagen, hängt von verschiedenen Einflüssen ab, und zwar von mechanischen Einflüssen und/oder endogenen, bioaktiven Faktoren, wie Wachstumsfaktoren, Cytokinen und/oder lokalen Mikroumgebungsbedingungen, die sich durch das Wirtsgewebe ergeben. Obgleich diese Zellen normalerweise im Knochenmark nur in sehr geringer Häufigkeit auftreten, wird in den US-Patenten 5 197 985, 5 226 914 und 5 486 359 (Caplan et al.) und in Mesenchymal stem cells, J. Orthoped. Res., Bd. 9 (1991), S. 641–650, über ein Verfahren zur Isolierung, Reinigung und mitotischen Expansion der Population dieser Zellen in Gewebekultur berichtet.
Humane, mesenchymale Stammzellen sind zur Erzeugung mehrfacher Typen von mesenchymalen Zellen und insbesondere von Knorpel befähigt. Dieses Merkmal macht sie zusammen mit zwei weiteren Merkmalen zu attraktiven Kandidaten zum Einsatz in der autologen Zelltherapie zur Reparatur von Gelenkoberflächen. Erstens ist es relativ einfach, humane MSCs aus abgesaugtem Knochenmark zu erhalten. Zweitens weisen diese Zellen eine nachgewiesene Fähigkeit auf, in Kultur einer 1000-fachen Expansion zu unterliegen (S. P. Bruder, N. Jaiswal und S. E. Haynesworth, "Growth kinetics, self-renewal and the osteogenic potential of purified human mesenchymal stem cells during extensive subcultivation and following cryopreservation", Journal of Cellular Biochemistry, 1996, im Druck).
Hier wird eine Verbesserung gegenüber herkömmlichen Verfahren beschrieben, die derzeit zur in vitro-Induktion der chondrogenen Differenzierung von primären und passagierten, humanen, mesenchymalen Stammzellen (hMSCs) herangezogen werden. Diese Verbesserung baut auf dem "Pelletkultur"-Gewebekulturverfahren auf, das zur Förderung der Redifferenzierung von gezüchteten Chondrozyten entwickelt wurde (Y. Kato, M. Iwamoto, T. Koike, F. Suzuki und Y. Takano, "Terminal differentiation and calcification in rabbit chondrocyte cultures grown in centrifuge tubes: regulation by transforming growth factor beta and serum factors", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 85 (1988), S. 9552–9556; R. T. Ballock und A. H. Reddi, "Thyroxine is the serum factor that regulates morphogenesis of columnar cartilage from isolated chondrocytes in chemically defined medium", J. Cell. Biol., Bd. 126 (1994), S. 1311–1318; und C. Xu, B. O. Oyajobi, A. Frazer, L. D. Kozaci, R. G. G. Russell und A. P. Hollander, "Effects of growth factors and interleukin-1α on proteoglycan and type II collagen turnover in bovine nasal and articular chondrocyte pellet cultures", Endocrinology, Bd. 137 (1996), S. 3557–3565). Wir beschreiben ferner einen Test zur Bestimmung der Zelllebensfähigkeit, der die Eignung unseres Züchtungsverfahrens belegt. Diese Verbesserungen ermöglichen weitere Entdeckungen bezüglich der Differenzierung von hMSCs, einschließlich der Identifizierung von Genen, die mit neuen therapeutischen Ansätzen in Beziehung stehen.
Mit den hier wiedergegebenen Versuchen zeigen wir, dass eine Erhöhung der Glucosekonzentration des chondrogenen Mediums von der standardmäßigen Konzentration, die in "DMEM mit niedrigem Glucosegehalt" (1 g/Liter, 5 mM) vorliegt, auf die Menge, die in "DMEM mit hohem Glucosegehalt" (4,5 g/Liter, 25 mM) vorliegt, die Differenzierung von gezüchteten hMSCs drastisch verändert. Der Einfluss von hohen Konzentrationen anderer Zucker auf die Chondrogenese wurde ebenfalls untersucht. Eine Ergänzung von Medium mit geringem Glucosegehalt entweder mit 3,5 g/Liter Fructose oder mit 6 g/Liter Glucose ergibt die gleiche Verbesserung der in vitro-chondrogenen Differenzierung wie Medium mit hohem Glucosegehalt (4,5 g/Liter Glucose).
Die Erfindung weist mehrfache Anwendungsmöglichkeiten und Vorteile auf. Ein derartiger Vorteil liegt in der Fähigkeit, die MSC-Differenzierung vor der Rückimplantation in autologe Wirte zu dirigieren und zu beschleunigen. Beispielsweise synthetisieren MSCs, die in vitro zur Bildung von chondrogenen Zellen dirigiert worden sind, Knorpelmatrix an einer Implantationsstelle rascher und gleichmäßiger als MSCs, die zunächst in die Abstammungslinie gebracht werden müssen und anschließend die Schlüssel-Differenzierungsstufen durchlaufen. Eine derartige ex vivo-Behandlung sorgt auch für eine gleichmäßige und kontrollierte Anwendung von bioaktiven Faktoren auf gereinigte MSCs, was zu einer gleichmäßigen Abstammungslinien-Festlegung und -Differenzierung führt. Eine in vivo-Verfügbarkeit von endogenen, bioaktiven Faktoren kann nicht ebenso leicht gewährleistet oder gesteuert werden. Eine Vorbehandlungsstufe, wie sie hier beschrieben wird, umgeht diesen Sachverhalt. Ferner werden durch Vorbehandlung der MSCs vor ihrer Implantation mögliche schädliche Nebenwirkungen, die mit einer systemischen oder lokalen Verabreichung von exogenen, bioaktiven Faktoren verbunden sind, vermieden. Ein weiteres Einsatzgebiet dieser Technik liegt in ihrer Fähigkeit zum Dirigieren der Geweberegeneration auf der Basis des Stadiums der Differenzierung, in dem sich die Zellen zum Zeitpunkt der Implantation befinden. Dies bedeutet in Bezug auf Knorpel, dass der Zustand der Zellen bei der Implantation den letztendlich gebildeten Gewebetyp steuern kann.
Der hier verwendete Ausdruck "einfacher Zucker" bezieht sich auf Aldosen, wie D-Glucose, D-Mannose und D-Galactose, sowie auf Ketosen, wie D-Fructose.
Die hier verwendeten Ausdrücke "chondroinduktives Mittel" oder "chondroinduktiver Faktor" beziehen sich auf beliebige natürliche oder synthetische, organische oder anorganische, chemische oder biochemische Verbindungen oder Kombinationen oder Gemische von Verbindungen oder beliebige mechanische oder andere physikalische Vorrichtungen, Behälter, Einflüsse oder Kräfte, die auf humane, mesenchymale Stammzellen, die sich in einem dreidimensionalen Format befinden, so einwirken, dass ihre chondrogene in vitro-Induktion herbeigeführt oder Chondrozyten gebildet werden. Zu bekannten chondroinduktiven Mitteln gehören beispielsweise (i) ein Glucocorticoid, wie Dexamethason; (ii) ein Mitglied der Oberfamilie des transformierenden Wachstumsfaktors β, wie ein morphogenes Knochenprotein (vorzugsweise BMP-2 oder BMP-4), TGF-β1, Inhibin A oder der chondrogene, stimulierende Aktivitätsfaktor (CSA); (iii) eine Komponente der kollagenen, extrazellulären Matrix, wie Kollagen I (insbesondere in Form eines Gels); und (iv) ein Vitamin A-Analoges, wie Retinoesäure.
Der hier verwendete Ausdruck "chemisch definiertes Medium" bezieht sich auf ein Aufrechterhaltungs-, Züchtungs- oder Kulturmedium, in dem die erfindungsgemäße Zusammensetzung einer in vitro-Chondrogenese unterliegen kann, insbesondere bei den erfindungsgemäßen Verfahren. Das Medium umfasst ein Minimalmedium (MEM), Ascorbat, eine Eisenquelle, Insulin oder einen insulinartigen Wachstumsfaktor, mindestens ein chondroinduktives Mittel oder Faktor und einen einfachen Zucker, wobei der einfache Zucker im Medium in einer Menge von 3 g/Liter bis 7 g/Liter vorhanden ist.
Der hier verwendete Ausdruck "minimales essentielles Medium" bezieht sich auf ein beliebiges, serumfreies, Tierzellen-Kulturpräparat oder -Medium bekannter Zusammensetzung, das die in vitro-Lebensfähigkeit von humanen, mesenchymalen Stammzellen unterstützt. Zu Beispielen hierfür gehören Medien auf der Basis von Eagle, d. h. Dulbecco-modifiziertes Eagle-Medium (DMEM); Iscove-modifiziertes Eagle-Medium, alpha-modifiziertes Eagle-Medium und ferner McCoy 5A und BGJ_b (Fitton-Jackson-Modifikation).
Der hier verwendete Ausdruck "Eisenquelle" bezieht sich auf beliebige Spezies, die die reduzierte Form von Eisen in das Medium freisetzen, wozu (ohne Beschränkung hierauf) Transferrin, FeSO₄ oder Ferritin gehören.
Der hier verwendete Ausdruck "Insulin" bezieht sich auf beliebige Arten der verschiedenen Insuline, die bekannt sind. Insuline werden je nach Schnelligkeit, Dauer und Intensität der Wirkung im Anschluss an eine subkutane Verabreichung in drei Kategorien eingeteilt, d. h. rasche, mittlere und lang anhaltende Wirkung. Kristallines, normales Insulin wird durch Fällung in Gegenwart von Zinkchlorid hergestellt. Modifizierte Formen wurden zur Veränderung des Wirkungsmusters entwickelt. Protamin-zink-insulin (PZI) ergibt sich durch Umsetzung von Insulin und Zink mit dem basischen Protein Protamin unter Bildung eines Proteinkomplexes, der sich im Vergleich zu kristallinem, normalem Insulin langsamer löst und langsamer resorbiert wird, jedoch sich als hochgradig zuverlässig für die Resorption mit einer stetigen Geschwindigkeit eignet. Isophan ist ein modifiziertes, kristallines Protamin-zink-insulin, dessen Wirkungen vergleichbar mit einem Gemisch aus vorwiegend normalem Insulin mit einem geringeren Anteil an Protamin-zink-insulin ist. Ferner kommen zur erfindungsgemäßen Verwendung auch die Insulin-Zink-Suspensionen mit verlängerter und rascher Wirkung in Frage. Das Insulin kann beispielsweise von Menschen, Rindern, Schafen oder anderen Tieren stammen oder es kann sich um ein rekombinantes Produkt handeln.
Humanes Insulin ist heutzutage in großem Umfang verfügbar, was auf dessen Bildung durch rekombinante DNA-Techniken zurückzuführen ist. In der Theorie sollte es geringfügig weniger immunogen sein als gereinigtes Schweineinsulin, das wiederum weniger stark immunogen als Rinderinsulin sein sollte. Rinderinsulin unterscheidet sich von humanem Insulin durch drei Aminosäurereste, während sich Schweineinsulin von humanem Insulin nur durch einen Aminosäurerest am Carboxylterminus der β-Kette unterscheidet. Jedoch weisen bei hochgradiger Reinigung alle drei Insuline eine relativ niedrige, jedoch messbare Fähigkeit zur Stimulation einer Immunreaktion auf.
Bei kurzzeitig oder rasch wirkenden Insulinen handelt es sich einfach um Lösungen von normalem, kristallinem Zink-Insulin (Insulin-Injektion) in Lösung in einem Puffer von neutralem pH-Wert. Diese Insuline weisen ein besonders rasches Einsetzen ihrer Wirkung auf, zeigen jedoch die kürzeste Wirkungsdauer, d. h. die Glucosespiegel erreichen innerhalb von 20 bis 30 Minuten einen niederen Wert und kehren innerhalb von etwa 2–3 Stunden zur Basislinie zurück.
Insuline mit mittlerer Wirkung werden so zubereitet, dass sie sich bei subkutaner Verabreichung nur allmählich lösen. Ihre Wirkungsdauer ist somit länger. Bei den am häufigsten verwendeten Präparaten handelt es sich um neutrales Protamin-Hagedorn (NPH)-Insulin (Isophan-Insulin-Suspension) und um Lente-Insulin (Insulin-Zink-Suspension). NPH-Insulin ist eine Suspension von Insulin in einem Komplex mit Zink und Protamin in einem Phosphatpuffer. Lente-Insulin ist ein Gemisch aus kristallisiertem (Ultralente) und amorphem (Semilente) Insulin in Acetatpuffer, der die Löslichkeit von Insulin auf ein Minimum bringt. Die Präparate weisen ähnliche pharmakokinetische Profile auf.
Ultralente-Insulin (erweiterte Insulin-Zink-Suspension) und die Protamin-Zink-Insulin-Suspension stellen Insuline mit langer Wirkungsdauer dar. Ihre Wirkung setzt sehr langsam ein und sie zeigen einen längeren ("flachen") Wirkungspeak. Es wird angegeben, dass diese Insuline während des gesamten Tages eine niedere Grundkonzentration an Insulin bereitstellen.
Der hier verwendete Ausdruck "Insulin" soll auch Insulin-Analoge umfassen. Neuere Insulin-Entwicklungen mit veränderten Resorptionsgeschwindigkeiten sind auf Interesse gestoßen. Insulin, bei dem Aspartat und Glutamat in den Positionen B9 bzw. B27 substituiert sind, kristallisiert schlecht und wird als "monomeres Insulin" bezeichnet. Dieses Insulin wird rascher aus subkutanen Depots resorbiert und kann sich somit zur Befriedigung der nach Mahlzeiten bestehenden Bedürfnisse als wertvoll erweisen. Im Gegensatz dazu neigen andere Insulin-Analoge zur Kristallisation an der Injektionsstelle und werden langsamer resorbiert. Insuline mit erhöhter Wirkungsstärke wurden hergestellt, indem man Histidin in Position B10 durch Aspartat ersetzt und die carboxyterminalen Reste der β-Kette modifiziert.
Ein Beispiel für die Komponenten des erfindungsgemäßen chondrogenen Mediums ist in Tabelle 1 aufgeführt.
Tabelle 1 Zusammensetzung des bei diesen Experimenten verwendeten chondrogenen Mediums
Beispiel 1
Medium mit hohem Glucosegehalt verstärkt die Bildung von extrazellulärer Matrix während der chondrogenen Differenzierung
Wenn hMSCs einer Differenzierung entlang der chondrogenen Abstammungslinie unterliegen, verändert sich der Zellmetabolismus und die anabolen Aktivitäten der Zelle werden verändert. Ein Erscheinungsmerkmal hierfür ist der Anstieg der Bildung an extrazellulärer Matrix. Die extrazelluläre Matrix ist für die besonderen Eigenschaften von Chondrozyten verantwortlich und ermöglicht es diesen, als ein gewichtstragendes, schmierendes Gewebe zwischen benachbarten Knochen zu dienen. Diese Oberfläche ist bei Osteoarthritis erkrankt. Die extrazelluläre Matrix ist aus Proteinen und sulfatierten Proteoglycanen zusammengesetzt, die in temporaler Weise während der Entwicklung der Zelle zu einem Chondrozyten exprimiert werden. Die Proteine und Proteoglycane umfassen Aggrecan, Knorpel-Oligomatrix-Protein (COMP), Hyaluronsäure, Keratansulfat, Verknüpfungsprotein und Kollagen vom Typ II sowie andere Bestandteile. Diese Moleküle sind extrazellulär angeordnet und umgeben den Zellkörper.
Die hMSCs in Pelletkultur, die einer chondrogenen Differenzierung unterliegen, exprimieren die vorerwähnten extrazellulären Matrix-Proteoglycane. In der Beschreibung zeigen wir, dass das Medium mit einem Gehalt an 4,5 g/Liter Glucose zu einer stärkeren Lebensfähigkeit der Zelle und zu einer stärkeren Bildung der aufgeführten extrazellulären Matrixkomponenten führt. In 1 ist die Zunahme der Größe des Zellpellets klar ersichtlich, wenn das Medium einen hohen Glucosegehalt aufweist. Veränderungen der Größe von hMSC-Pellets spiegeln das Ausmaß der Synthese von extrazellulären Matrixkomponenten wider. Jedes Pellet wurde gebildet, indem man eine Aliquotmenge von 200 000 Zellen in 1/2 ml chondrogenes Medium mit 1 g/Liter (5,5 mM) Glucose (links) oder 4,5 g/Liter (25 mM) Glucose (rechts) übertrug. Das chondrogene Medium bestand aus DMEM mit der angegebenen Glucosekonzentration und den folgenden Ergänzungen: 100 nM Dexamethason, 10 ng/ml transformierender Wachstumsfaktor β, 1 mM Natriumpyruvat, 5 μg/ml Ascorbinsäure-2-phosphat und 40 μg/ml Prolin. Eine 1:99-Verdünnung von "ITS+" lieferte 6,25 μg/ml Rinderinsulin, 6,25 μg/ml Transferrin, 6,25 μg/ml selenige Säure, 5,33 μg/ml Linolsäure und 1,25 mg/ml Rinderserumalbumin. Endkonzentrationen von 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 250 ng/ml Amphotericin B wurden durch eine 1:99-Verdünnung einer konzentrierten Antibiotikalösung bereitgestellt.
Die Zellen und das Medium wurden in ein 15 ml fassendes Polypropylen-Zentrifugenröhrchen mit konischem Boden gegeben und leicht zentrifugiert (500 × g für 5 Minuten). Anschließend wurden die Röhrchen mit locker aufgesetzten Verschlüssen in einen befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂ von 37 °C gebracht. Während der folgenden 12 Stunden reorganisierten sich die Zellen am Boden des Röhrchens selbst zu einem kugelförmigen Pellet mit einem Durchmesser von etwa 1 mm.
Die "Pelletkulturen" wurden aufrechterhalten, indem man die Zellen mit frischem Medium versorgte. 3-mal wöchentlich wurde das Medium aus den Röhrchen abgesaugt und durch 0,5 ml frisches Medium ersetzt. Das Röhrchen wurde leicht geschüttelt, um zu gewährleisten, dass das Pellet frei schwamm und nicht an der Seite des Röhrchens haftete. Bei 1 wurden die Pellets nach 2-wöchigem Wachstum 60 Minuten in phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit 4 % Paraformaldehyd fixiert und vor dem Einbetten und Einfrieren photographiert. Das durch hMSCs in chondrogenem Medium mit 1 g/Liter Glucose gebildete Pellet wies einen Durchmesser von 0,8 mm auf (links). Das mit 4,5 g/Liter Glucose gezüchtete Pellet wies einen Durchmesser von 1,6 mm auf (rechts). Die Größenzunahme des hMSC-Pellets im Medium mit einem Gehalt an 4,5 g/Liter Glucose ist auf die große Menge an gebildeter extrazellulärer Matrix zurückzuführen und nicht auf die verstärkte Zellproliferation. Die endgültige Vergrößerung beträgt 40×. Zur Prüfung verschiedener chondrogener Zustände wurden die Zellpellets fixiert, auf 5–8 μm geschnitten und einer histologischen und immunohistologischen Färbung unterzogen.
Wie in 2 dargestellt, erfolgte der Expressionsbeginn von Kollagen vom Typ II, das für Knorpel charakteristisch ist, in Zellen, die in chondrogenem Medium mit einem Gehalt an 4,5 g/Liter Glucose (hoher Glucosegehalt) gezüchtet worden waren, um 1 Woche früher. Beispielsweise zeigten hMSCs geringe Anzeichen für die Expression dieses Proteins nach der ersten Züchtungswoche in chondrogenem Medium mit 1 g/Liter Glucose (2A). Im Gegensatz dazu ließ sich der Beginn der Synthese von Kollagen vom Typ II in Pellets leicht nachweisen, die im chondrogenen Medium mit 4,5 g/Liter Glucose gezüchtet wurden (2B). Nach 2 Wochen war Kollagen vom Typ II in beschränkten Bereichen in Pellets, die im Medium mit 1 g/Liter Glucose gezüchtet worden waren, vorhanden (3A), während die Anzeichen für die Synthese von Kollagen vom Typ II in den Pellets, die mit 4,5 g/Liter Glucose gezüchtet wurden, klar überall nachgewiesen wurde (3B).
Die Bildung von extrazellulärer Matrix mit einer hohen Konzentration an sulfatierten Proteoglycanen wurde durch Färbung mit Safranin O (nicht dargestellt) und Toluidinblau O nachgewiesen. Bei Färbung mit Toluidinblau O weisen Pellets mit einer knorpelartigen extrazellulären Matrix Metachromasie auf, d. h. einen purpurstichigen statt eines blauen Farbtons, was die Anwesenheit von negativ geladenen Matrixelementen beweist, wie sie in Knorpel auftreten und vorstehend erwähnt wurden. Während hMSC-Pellets in chondrogenem Medium mit 1 g/Liter Glucose Anzeichen dieser purpurfarbenen metachromatischen Färbung beim Schneiden und Färben nach 2-wöchiger Züchtung zeigten (4A) war das Ausmaß dieser Färbung wesentlich stärker ausgeprägt, wenn das Kulturmedium 4,5 g/Liter Glucose enthielt (4B).
Beispiel 2
Ein hoher Glucosegehalt erhöht die hMSC-Lebensfähigkeit während der Chondrogenese.
Es gibt eine Anzahl von möglichen Erklärungen für die verbesserte chondrogene Differenzierung von hMSCs bei Züchtung in einem Medium mit einem Gehalt an 4,5 g/Liter Glucose. Dieses Beispiel zeigt jedoch, dass dieses Medium mit höherem Glucosegehalt das Überleben der Zelle wesentlich stärker als Medium mit 1 g/Liter Glucose fördert. Eine hochgradige Lebensfähigkeit kann zu einer stärkeren Chondrogenese einfach aufgrund der Tatsache führen, dass eine größere Anzahl an lebenden Zellen dazu befähigt ist, knorpelartige, extrazelluläre Matrixkomponenten zu sezernieren. Ferner scheint der höhere Grad der Überlebensfähigkeit der Zellen eine robustere Zellenpopulation widerzuspiegeln, bei der die einzelnen lebenden Zellen einen Beitrag zu größeren Mengen an extrazellulärem Matrixprotein, Proteoglycan und Kohlenhydraten in ihrer Nachbarschaft leisten. Da es sich beim Knorpel um ein avaskuläres Organ handelt, kann dieses Erfordernis einer relativ hohen Zuckerkonzentration im Kulturmedium die unüblichen metabolischen Eigenschaften von Chondrozyten in vivo widerspiegeln.
Die Lebensfähigkeit von hMSCs in Pelletkultur wurde durch Modifikation des von Poole et al. (C. A. Poole, N. H. Brookes, R. T. Gilbert, B. W. Beaumont, A. Crowther, L. Scott und M. J. Merrilees, "Detection of viable and non-viable cells in connective tissue explants using the fixable fluoroprobes 5-chloromethylfluorescein diacetate and ethidium homodimer-1", Connective Tissue Research, Bd. 33 (1996), S. 233–241) entwickelten Farbstoff-Ausschlusstests zur Prüfung des Überlebens von Zellen in Organkultur getestet. 72 Stunden vor der Zellernte wurde homodimerer Ethidium-Farbstoff (1 mM Vorratslösung in DMSO) dem Medium in einer Endkonzentration von 2 μM zugesetzt. Die Pellets wurden sodann wieder auf übliche Inkubationsbedingungen gebracht. Bei der Ernte wurden die Pellets 4 × 30 Minuten in phosphatgepufferter Kochsalzlösung gespült, sodann 1 Stunde in 4 % Paraformaldehyd fixiert, in Gefrierschnitt-Einbettungslösung eingebettet, in einem Bad mit flüssigem Stickstoff gekühlt und in gefrorenem Zustand geschnitten. 8 μm-Schnitte wurden mit 500 ng/ml 4,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) gegengefärbt, bevor eine Montage unter wässrigen Bedingungen und eine Betrachtung durch Fluoreszenzmikroskopie vorgenommen wurden.
Unter diesen Bedingungen der Inkubation mit homodimerem Ethidium-Farbstoff erlaubten nur Zellen ohne intakte Plasmamembranen den Eintritt von Farbstoff in ihre Kerne. Diese Kerne fluoreszieren bei Anregung mit Licht von 490 nm rot. Eine Inkubation der fixierten Schnitte mit blau fluoreszierendem DAPI (1 μg/ml) erlaubt die Interkalation dieses zweiten Farbstoffes in die DNA sämtlicher übriger Kerne, wo die Intrahelix-Bindungsstellen nicht durch homodimeres Ethidium besetzt sind. Somit leuchten Kerne von Zellen, die bei der Inkubation mit homodimerem Ethidium und bei der Fixierung lebensfähig waren, rot, während lebensfähige Zellen bei Betrachtung mit dem Epifluoreszenzmikroskop blau leuchten.
Eine Prüfung von Schnitten von Pellets, die mit homodimerem Ethidium behandelt worden sind, ergibt, dass die rötlichen Kerne von nicht-lebensfähigen Zellen in Pellets, die mit 1 g/Liter Glucose gezüchtet worden sind, vorherrschen (5A). In ausgeprägtem Gegensatz dazu enthalten gleichwertige Pellets, die mit 4,5 g/Liter Glucose gezüchtet worden sind, nur wenige rötliche Kerne (5B).
Beispiel 3
TGF-β3 stellt ein überlegenes chondrogenes Mittel für MSCs dar.
Mit den hier vorgestellten Experimenten wurde die Chondrogenese von MSCs aus einer relativen großen Anzahl von Kaninchen (etwa 16) unter verschiedenen Bedingungen untersucht.
Es ist seit langem bekannt, dass TGF-β1 ein starker Promotor der Knorpelbildung ist (vergl. beispielsweise den Übersichtsartikel von Kato [2]). Tatsächlich wird TGF-β1 gemäß einer Reihe von Studien in Implantaten verwendet, um eine Knorpelreparatur zu bewirken; vergl. z. B. O'Driscoll [3], wo gezeigt wird, dass eine Chondrogenese in Geweben mesenchymalen Ursprungs (wie Periosteum und Muskeln) ausgelöst wird. Es gibt auch andere Berichte über die Verwendung von TGF-β1 in osteochondralen Implantaten [4, 5]. Kürzlich berichtete Brian Johnstone darüber, dass TGF-β1 bei Zugabe zu primären Zellen in Pelletkultur das Problem der mangelnden Konsistenz überwand und zu besser reproduzierbaren Ergebnissen führte. Dies stellte eine wichtige Entwicklung dar und stützte die ursprünglichen Befunde.
Es wurde festgestellt, dass TGF-β3 einen ausgeprägten Einfluss auf Uterus-Leiomyomzellen ausübt [6]. Leiomyome sind gutartige Tumoren der glatten Muskulatur, die durch die Bildung von großen Mengen an extrazellulärer Matrix durch hypertrophe Zellen mit einem geringen mitotischen Index gekennzeichnet sind. Es gibt mindestens einen Bericht über einen Fall von Leiomyom, das einen Knorpel-Phänotyp aufwies. Auf der Grundlage dieser Beobachtungen untersuchten wir den Einfluss von TGF-β3 auf die chondrogene Differenzierung von mesenchymalen Stammzellen.
Humane, von Knochenmark abgeleitete, mesenchymale Stammzellen wurden unter standardmäßigen Bedingungen in Gegenwart von 10 % FBS bis zur Konfluenz gezüchtet. Die Zellen wurden trypsiniert, 2-mal mit chondrogenem Medium gewaschen und in einer Dichte von 200 000 Zellen/ml in 15 ml fassenden Polypropylen-Röhrchen in chondrogenem Medium mit einem Gehalt an 10 ng/ml TGF-β1, TGF-β3 oder keinem dieser Bestandteile resuspendiert. Die Zellen wurden zur Bildung einer Schicht zentrifugiert und das Medium wurde alle 3 bis 4 Tage ersetzt und Zellen wurden nach 7, 14 und 21 Tagen geerntet. Gefrorene Schnitte (8 μm) wurden mit Toluidinblau gefärbt. Sie wurden ferner unter üblichen immunozytochemischen Verfahren auf die folgenden Bestandteile gefärbt: Kollagen vom Typ II, Kollagen vom Typ I und oligomeres Knorpel-Matrix-Protein (COMP).
Zellen des gleichen Spenders wurden im chondrogenen Medium mit oder ohne TGF-β1 oder TGF-β3 gezüchtet. Am Tag 0 (d. h. vor der Zentrifugation der Zellen zur Bildung einer Schicht) wurde die Expression von Kollagen vom Typ I in enger Nachbarschaft zu den Zellen beobachtet, wobei aber eine Färbung auf Kollagen vom Typ II und COMP unterblieb. Nach 8 Tagen in Pelletkultur in Abwesenheit von zugesetzten Wachstumsfaktoren ergab sich eine reichliche COMP-Expression in der extrazellulären Matrix, wobei aber Kollagen vom Typ II nicht erkennbar war. In Gegenwart von TGF-β1 gab es immer noch keine Expression von Kollagen vom Typ II. Bei Anwesenheit von TGF-β3 wurde ein kleiner Bereich des Pellets azellulär und einige Zellen exprimierten Kollagen vom Typ II. Nach 14 Tagen gab es Anzeichen für eine gewisse chondrogene Differenzierung in Gegenwart von TGF-β1, wie durch die lokalisierte Expression von Kollagen vom Typ II ersichtlich ist. Bei Züchtung in Gegenwart von TGF-β3 zeigten die Pellets jedoch ein drastisch unterschiedliches Erscheinungsbild. In diesem Fall waren die Pellets aufgrund der Anwesenheit einer reichlichen extrazellulären Matrix größer. Ein großer Anteil der Zellen war hypertroph und es erfolgte überall eine Expression von Kollagen vom Typ II, ausgenommen ein zentraler Bereich, in dem die Zellen noch undifferenziert waren. Entlang des Umfangs der Pellets nahmen die Zellen eine längliche Konfiguration unter intensiver Typ II-Färbung ähnlich wie bei Perichondrium an.
Nach 21-tägiger Züchtung in Gegenwart von TGF-β1 erfolgte eine Färbung im gesamten Pellet mit Ausnahme des Umfangs, der negativ war. Mit TGF-β3 ergab sich eine sehr starke Färbung, insbesondere in der interterritorialen Matrix. Die Färbung mit COMP war ähnlich, jedoch mit verringerter perizellulärer Färbung und verstärkter interterritorialer Färbung.
Dies zeigt, dass TGF-β3 in vitro einen drastischen Einfluss auf die chondrogene Differenzierung von humanen MSCs ausübt und die Entwicklung von reichlicher, knorpelartiger, extrazellulärer Matrix stimuliert. Nach 21-tägiger Züchtung wies das Gewebe eine Morphologie auf, die ähnlich der von reifem Gelenkknorpel war. Die spezifische Expression von COMP in der interterritorialen Matrix erinnert besonders stark an reifen Knorpel. Ferner lässt die reichliche Expression von Kollagen vom Typ II darauf schließen, dass bei diesen Zellen eine Differenzierung in einer chondrogenen Abstammunslinie erfolgt ist. Die Wirkung ist in Gegenwart von TGF-β3 ausgeprägter als bei TGF-β1.
Beispiel 4
Pelletkultur-Experiment
hMSC-Haftkultur
Humane MSCs wurden gemäß Literaturangaben isoliert und expandiert (Bruder et al., 1997), Growth kinetics, self-renewal and the osteogenic potential of purified human mesenchymal stem cells during extensive subcultivation and following cryopreservation, Journal of Cellular Biochemistry, Bd. 64 (1997), S. 278–294) und als anhaftende Zellen gezüchtet. Beim Wachstumsmedium handelte es sich um Dulbecco-modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) mit einem Gehalt an 1 g/Liter Glucose unter Zusatz von 10 % fötalem Kälberserum aus ausgewählten Chargen (Lennon et al. (1996), S. E. Haynesworth, S. P. Bruder, N. Jaiswal und A. I. Caplan, Human and animal mesenchymal progenitor cells from bone marrow: identification of serum for optimal selection and proliferation, In Vitro Cell. Dev. Biol.-Animal, Bd. 32 (1996), S. 602–611) und 100 U/ml Penicillin, 100 mg/ml Streptomycin und 250 ng/ml Amphotericin B. Zellen wurden in einer 5 % CO₂-Atmosphäre bei 37 °C gezüchtet. Die Zellen wurden in der Passage 1 entsprechend etwa 13 Populationsverdopplungen verwendet (Bruder et al., (1997), Growth kinetics, self-renewal and the osteogenic potential of purified human mesenchymal stem cells during extensive subcultivation and following cryopreservation, Journal of Cellular Biochemistry, Bd. 64 (1997), 5. 278–294.
hMSC-Pelletkultur
Die Chondrogenese wurde durch Umstellen von hMSCs zu einem dichten, dreidimensionalen Kulturformat gefördert, so dass 250 000 Zellen ein sphäroidales Pellet von 1 mm anfänglichem Durchmesser bildeten. Zur Bildung dieser Pellets wurden die anhaftenden hMSCs trypsiniert, in serumhaltigem Medium gewaschen und sodann in serumfreiem, chondrogenem Medium resuspendiert, wobei man sich standardmäßiger Gewebekulturtechniken bediente. Dieses Medium entsprach den Angaben der Provisional Application Nr. 640100–129 (Osiris) [DMEM mit hohem Glucosegehalt, ergänzt mit 10 ng/ml transformierendem Wachstumsfaktor beta-3 (TGF-β3, Oncogene Research Products, Cambridge, MA), 100 nM Dexamethason (Sigma, St. Louis, MO), 50 μg/ml Ascorbinsäure-2-phosphat (WAKO Pure Chemicals, Tokyo, Japan), 100 μg/ml Natriumpyruvat, 40 μg/ml Prolin und 6,25 μg/ml Rinderinsulin, 6,25 μg/ml Transferrin, 6,25 μg/ml selenige Säure, 5,33 μg/ml Linolsäure, 1,25 mg/ml Rinderserumalbumin (ITS-plus, Collaborative Biomedical Products, Cambridge, MA)).
Chondrogene Pellets von hMSCs wurden auf folgende Weise erzeugt. Aliquotmengen von 250 000 Zellen, die in 0,5 ml serumfreiem, chondrogenem Medium suspendiert waren, wurden auf 15 ml fassende, konische Polypropylen-Zentrifugenröhrchen (VWR) verteilt. Die Zellen wurden 5 Minuten mit 600 × g zentrifugiert und am Boden des Röhrchens belassen. Die Röhrchen wurden sodann in einen Inkubator gestellt, wobei die Verschlüsse gelockert waren, um einen Gasaustausch zu ermöglichen. Die sedimentierten Zellen bildeten innerhalb von 24 Stunden ein sphärisches Pellet am Boden des Röhrchens. Das Medium wurde 3-mal pro Woche ersetzt. Die Zellen wurden auf diese Weise bis zu 4 Wochen gezüchtet.
Induktion von Hypertrophie
Eine hypertrophe Differenzierung wurde eingeleitet, nachdem die Pellets 7 oder 14 Tage unter standardmäßigen chondrogenen Bedingungen gezüchtet worden waren. Zu diesem Zeitpunkt wurde das chondrogene Medium durch ein Reifungsmedium mit einem Gehalt an 50 ng/ml Thyroxin (Sigma) ersetzt. Um die Hypertrophie zusätzlich zu induzieren, wurde die Konzentration an Dexamethason auf 10^–9 M gesenkt (Quarto et al., 1992) und 20 mM β-Glycerinphosphat (Sigma) wurden zugegeben (Dieudonne et al., C. M. Semeins, S. W. Goei, S. Vukicevic, J. K. Nulend, T. K. Sampath, M. Helder und E. H. Burger, Opposite effects of osteogenic protein and transforming growth factor -b on chondrogenesis in cultured long bone rudiments, J. Bone Min. Res., Bd. 9 (1994), S. 771–780.
Weitere vorläufige Experimente zeigen, dass T3 und Thyroxin beide eine Induktion von Hypertrophie bewirken. Mittel, wie Retinoesäure und deren Derivate, können ebenfalls in dieser Weise wirksam sein.
Analyse von Pellets
Zellpellets wurden durch 1-stündige Fixierung mit 4 % Paraformaldehyd in PBS geerntet. Proben wurden sodann in 70 % Ethanol übertragen, in Ethanol und Xylolen dehydratisiert und in Paraffin eingebettet. 5 μm-Schnitte wurden durch das Zentrum eines jeden Pellets ausgeführt.
Monospezifische Antikörper wurden zum Nachweis von extrazellulären Matrixproteinen, die für die chondrogene Differenzierung charakteristisch sind, verwendet. Schnitte wurden 30 Minuten mit 50 mU/ml Chondroitinase ABC (Seikagaku America, Ijamsville, MD) in 100 mM Tris-acetat, pH-Wert 7,6, 0,1 % Rinderserumalbumin, verdaut. Kollagen vom Typ II wurde mit monoklonalem Mäuse-Antikörper C4F6, der in einer Konzentration von 2 mg/ml eingesetzt wurde, identifiziert (Srinivas et al. (1993), G. R. Srinivas, H. J. Barrach und C. O. Chichester, Quantitative immunoassays for type II collagen and its cyanogen bromide peptides, J. Immunol. Methods, Bd. 159 (1993), S. 53–62). Kollagen der Typen X und IX wurde mit monoklonalen Mäuse-Antikörpern X53 nach Pepsinverdau (Quartett, Berlin, Deutschland, Girkontaite et al., (1996), S. Frischholz, P. Lammi, K. Wagner, B. Swoboda, T. Aigner und K. Von der Mark, Immunolocalization of type X collagen in normal fetal and adult osteoarthritic cartilage with monoclonal antibodies, Matrix Biology, Bd. 15 (1996), S. 231–238) bzw. αCIX (C. O. Chichester et al., Manuskript in Vorbereitung) identifiziert. Vor Behandlung mit Chondroitinase wurden Schnitte mit 2 mg/ml Pepsin (Sigma) in 0,5 M Essigsäure 1 Stunde bei 22 °C inkubiert.
Bei sämtlichen Immunofärbungen wurde die Reaktivität durch serielle Inkubation von Schnitten mit biotinylierten Ziegen-anti-Maus- oder -anti-Kaninchen-Antikörpern nachgewiesen, wonach die Zugabe von Streptavidin- Meerrettich-peroxidase gemäß der Angaben des Herstellers folgte (Kirkegaard & Perry Labs, Gaithersburg, MD). Ein Signal entwickelte sich als das Peroxidase-Reaktionsprodukt von 3,3'-Diaminobenzidin (DAB) und H₂O₂.
Anionische, sulfatierte Proteoglycane wurden durch Safranin O-Färbung und Toluidinblau-Metachromasie nachgewiesen. Diese Färbungen charakterisieren die Abscheidung von knorpelartiger Matrix (Sheehan und Hrapchak (1980), D. C. Sheehan und B. B. Hrapchak, Theory and Practice of Histochemistry, 2. Auflg., Battelle Press, Columbus, OH (1980), S. 481ff.
Beispiel 5
Sequenzielle Behandlung von hMSCs in Pelletkultur mit zwei Medien induziert Hypertrophie.
Humane MSCs, die einer chondrogenen Differenzierung unterliegen, können zu hypertrophen Zellen reifen, entweder aufgrund eines internen Programms der Genexpression oder in Reaktion auf Umweltbedingungen. Zur Induktion von Hypertrophie wurden die in vitro-Züchtungsbedingungen nach 2 Wochen der chondrogenen Differenzierung verändert. Durch Entziehen von TGF-β3 (Serra et al. (1997), Johnson, E. H. Filvaroff, J. LaBorde, D. M. Sheehan, R. Derynck und H. L. Moses, Expression of a truncated, kinase-defective TGF-β type II receptor in mouse skeletal tissue promotes terminal chondrocyte differentiation and osteoarthritis, J. Cell Biol., Bd. 139 (1997), S. 541–552) und durch Zugabe von 50 nM Thyroxin (Ballock und Reddi (1994), Thyroxine is the serum factor that regulates morphogenesis of columnar cartilage from isolated chondrocytes in chemically defined medium, J. Cell Biol., Bd. 126 (1994), 5. 1311–1318) zum Medium wird eine ausgeprägte hypertrophe Wirkung nach weiterer 2-wöchiger Züchtung erzielt. Die Hypertrophie war ausgeprägter, wenn diese Bedingungen mit der Zugabe von 20 mM β-Glycerinphosphat und einer Verringerung der Konzentration an Dexamethason auf 10^–9 M kombiniert wurden. Diese Pellets enthielten Bereiche mit hypertrophen Zellen, die von ausgedehnten perizellulären Anreicherungen von ECM umgeben waren (2). Im Vergleich zu Pellets, die 28 Tage in standardmäßigem chondrogenem Medium gehalten wurden, zeigten die behandelten Pellets eine intensive Färbung auf Kollagene vom Typ II und Typ IX sowie eine irreguläre, jedoch ausgeprägte Zunahme der Abscheidung von Kollagen vom Typ X, die durch Antikörper X53 nachgewiesen wurde (2).

Claims

Verfahren zur Herstellung von Chondrozyten aus mesenchymalen Stammzellen durch in vitro-Züchtung von mesenchymalen Stammzellen in einem chemisch definierten, serumfreien Medium, wobei die mesenchymalen Stammzellen in einem dreidimensionalen Format assoziiert sind und wobei das chemisch definierte, serumfreie Medium folgendes umfasst: (1) ein chemisch definiertes Minimalmedium; (2) Ascorbat; (3) eine Eisenquelle; (4) Insulin oder einen insulinartigen Wachstumsfaktor; (5) mindestens ein chondroinduktives Mittel oder Faktor; und (6) einen einfachen Zucker, wobei der einfache Zucker im Medium in einer Menge von 3 g/Liter bis 7 g/Liter vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei den mesenchymalen Stammzellen um isolierte, in Kultur expandierte, humane, mesenchymale Stammzellen handelt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die mesenchymalen Stammzellen zu enger Nachbarschaft verdichtet sind.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die mesenchymalen Stammzellen als gepackte Zellen oder als zentrifugales Zellpellet vorliegen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das mindestens eine chondroinduktive Mittel oder Faktor aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus (i) einem Glucocorticoid; (ii) einem Mitglied der transformierenden Wachstumsfaktor-β-Oberfamilie; (iii) einer Komponente der kollagenen, extrazellulären Matrix; und (iv) einem Vitamin A-Analogen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem mindestens einen chondroinduktiven Mittel um eine Kombination von Dexamethason und TGF-β1 handelt.
Verfahren nach Anspruch 1, ferner umfassend das Platzieren der Zellen in ein starres, poröses Gefäß.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei es sich bei dem starren, porösen Gefäß um einen Keramikwürfel handelt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem einfachen Zucker um Glucose handelt.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Glucose im serumfreien Medium in einer Menge von 4,5 g pro Liter vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das mindestens eine chondroinduktive Mittel oder Faktor TGF-β3 umfasst.
Verfahren zur Induktion der Chondrogenese in mesenchymalen Stammzellen durch in vitro-Züchtung von mesenchymalen Stammzellen in einem chemisch definierten, serumfreien Medium, wobei die mesenchymalen Stammzellen in einem dreidimensionalen Format assoziiert sind und wobei das chemisch definierte, serumfreie Medium folgendes umfasst: (1) ein chemisch definiertes Minimalmedium; (2) Ascorbat; (3) eine Eisenquelle; (4) Insulin oder einen insulinartigen Wachstumsfaktor; (5) mindestens ein chondroinduktives Mittel oder Faktor; und (6) einen einfachen Zucker, wobei der einfache Zucker im Medium in einer Menge von 3 g/Liter bis 7 g/Liter vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei es sich bei den mesenchymalen Stammzellen um isolierte, in Kultur expandierte, humane, mesenchymale Stammzellen handelt.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die mesenchymalen Stammzellen zu enger Nachbarschaft verdichtet sind.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei die mesenchymalen Stammzellen als gepackte Zellen oder als zentrifugales Zellpellet vorliegen.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das mindestens eine chondroinduktive Mittel aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus (i) einem Glucocorticoid; (ii) einem Mitglied der transformierenden Wachstumsfaktor-β-Oberfamilie; (iii) einer Komponente der kollagenen, extrazellulären Matrix; und (iv) einem Vitamin A-Analogen.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei es sich bei dem mindestens einen chondroinduktiven Mittel um eine Kombination von Dexamethason und TGF-β1 handelt.
Verfahren nach Anspruch 12, ferner umfassend das Platzieren der Zellen in ein starres, poröses Gefäß.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei es sich bei dem starren, porösen Gefäß um einen Keramikwürfel handelt.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei es sich bei dem einfachen Zucker um Glucose handelt.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei die Glucose im serumfreien Medium in einer Menge von 4,5 g pro Liter vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das mindestens eine chondroinduktive Mittel oder Faktor TGF-β3 umfasst.