CN106399234A - 脂肪组织的处理方法及间充质干细胞、处理后单个脂肪细胞和细胞外基质 - Google Patents

脂肪组织的处理方法及间充质干细胞、处理后单个脂肪细胞和细胞外基质 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种脂肪组织的处理方法及间充质干细胞、处理后单个脂肪细胞和细胞外基质，所述处理方法包括以下步骤：破碎步骤：将脂肪组织进行机械破碎，得到肉糜状的脂肪组织；消化步骤：采用消化剂对肉糜状的脂肪组织进行消化处理，从所述肉糜状的脂肪组织中释放出细胞，得到间充质干细胞、细胞外基质和/或处理后单个脂肪细胞；其中，所述消化剂含有注射用胶原酶，优选地，所述消化剂中还包括尿激酶。本发明的脂肪组织的处理方法，操作时间短，处理的效率高。进一步地，由于制备过程使用的是CFDA已经批准的临床使用的药物，因此处理过程中不会引入热原、内毒素、异种动物血清等有害物质，可以为以后的临床应用提供安全保障。

Description

脂肪组织的处理方法及间充质干细胞、处理后单个脂肪细胞 和细胞外基质
技术领域
本发明涉及一种脂肪组织的处理方法及间充质干细胞、处理后单个脂肪细胞和细胞外基质，属于脂肪组织研究领域。
背景技术
间充质干细胞是一种具有自我复制能力和多向分化潜能的成体干细胞，具有分化为软骨、骨、脂肪等组织的潜能，同时也具有免疫调节和分泌多种生长因子的功能。
在骨髓、牙髓、脂肪等组织中均含有间充质干细胞(可参见Gir P,Oni G,Brown SAet al.Human adipose stem cells:current clinical applications.Plastic andreconstructive surgery.2012；129:1277-1290.)。其中，脂肪组织容易大量获取，资源较为充足，并且脂肪组织中的间充质干细胞的含量较大，约为1/100-1/500。因此来自脂肪组织的干细胞目前已广泛用于临床治疗。
目前在提取脂肪组织中的间充质干细胞时，一般采用机械或者酶处理方法。尽管机械处理法不引入外源有害物质，便于临床应用，但提取效率低，花费时间长。并且提取少量间充质干细胞需要大量脂肪组织，增加了患者的创伤和手术风险，大大限制了其临床应用。而现有的酶处理法使用研究用试剂而非医用试剂，所提取的间充质干细胞中可能混有热原、内毒素、胎牛血清等，因此，存在着严重安全隐患。
另外，胶原是皮肤的重要细胞外基质组成，对于皮肤光泽、弹性、水分的保持具有重要的作用，目前用于皮肤注射用的胶原蛋白主要是异种动物提取的胶原蛋白，例如牛和猪皮中提取的胶原蛋白，具有一定的异种抗原性，可能会引起机体的排异和过敏反应。而脂肪组织中含有大量的细胞外基质，其主要成分为胶原，但是目前没有较好的方法以提取细胞外基质。
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的是提供一种脂肪组织的处理方法，其能够快速高效地从脂肪组织中提取间充质干细胞、细胞外基质和/或处理后单个脂肪细胞，不仅能够大幅提高从单位脂肪组织中所提取的间充质干细胞、细胞外基质和/或处理后单个脂肪细胞的量，还改善所提取的间充质干细胞、细胞外基质和/或处理后单个脂肪细胞的安全性。
用于解决问题的方案
本发明提供一种脂肪组织的处理方法，其中，包括以下步骤：
破碎步骤：将脂肪组织机械破碎，得到肉糜状的脂肪组织；
消化步骤：采用消化剂对所述肉糜状的脂肪组织进行消化处理，从所述肉糜状的脂肪组织中释放出细胞，得到间充质干细胞、细胞外基质和/或处理后单个脂肪细胞；其中，所述消化剂含有注射用胶原酶，优选地，所述消化剂中还包含有尿激酶。
根据本发明的方法，其中，所述肉糜状的脂肪组织的粒径为1-2mm，优选为1-1.5mm；优选地，所述处理后单个脂肪细胞的粒径为15-40μm，优选为20-30μm。
根据本发明的方法，其中，所述消化步骤之后，还包括：
中和步骤：采用中和剂对所述消化剂进行中和处理；
优选地，所述中和剂包括人血白蛋白、胶原蛋白填充剂中的一种或两种。
根据本发明的方法，其中，所述消化剂和所述中和剂中不含内毒素、热原和/或异种动物血清。
根据本发明的方法，其中，所述消化步骤中，消化处理1g脂肪组织使用的所述注射用胶原酶的加入量为50-250单位，优选为80-200单位。
根据本发明的方法，其中，基于消化处理1g脂肪组织使用的所述中和剂的加入量为0.8-5mL，优选为1.3-4mL。
根据本发明所述的方法，其中，在破碎步骤之前，还包括：洗涤步骤，冲洗所述脂肪组织，以除去所述脂肪组织中的肿胀液及白细胞；
优选地，在消化步骤之后，还包括清洗步骤，更优选地，所述清洗步骤后，还包括将所述间充质干细胞经细胞筛过滤的步骤。
本发明还提供一种间充质干细胞，其通过本发明的方法制备得到。
本发明还提供一种消化剂组合物，其中，包括本发明所述的方法中的注射用胶原酶和尿激酶。
本发明还提供一种根据本发明的间充质干细胞在制备临床用抗免疫排斥制剂、临床用抗心肌梗死药物中的用途。
本发明还提供一种处理后单个脂肪细胞，其通过本发明的方法制备得到。
本发明还提供一种细胞外基质，其通过本发明的方法制备得到。
发明的效果
本发明的脂肪组织的处理方法，操作时间短，制备提取的效率高。进一步地，由于制备过程使用的是CFDA已经批准的临床使用的药物，因此处理过程中不会再引入热原、内毒素、异种动物血清等有害物质。所制备得到的间充质干细胞、细胞外基质和/或处理后单个脂肪细胞的安全性高，能够进行批量制备。
附图说明
图1为本发明实施例1、2及对比例1制备得到的细胞数目的柱状图；
图2为本发明实施例7制备得到的处理后单个脂肪细胞与常规脂肪的照片对比图；
图3为本发明实施例7制备得到的处理后单个脂肪细胞与常规脂肪的显微结构对比图；
图4为本发明实施例8制备得到的细胞外基质和细胞的混合物的显微结构图；
图5为本发明实施例3与对比例2所制备得到的间充质干细胞的活体细胞率的对比图；
图6为本发明实施例3制备的间充质干细胞未加入成骨分化诱导液的体外成骨分化诱导结果图；
图7为本发明实施例3制备的间充质干细胞加入成骨分化诱导液的体外成骨分化诱导结果图；
图8为本发明实施例3制备的间充质干细胞未加入成脂分化诱导液的体外成脂分化诱导结果图；
图9为本发明实施例3制备的间充质干细胞加入成脂分化诱导液的体外成脂分化诱导结果图；
图10为本发明实施例3制备的间充质干细胞进行表面标志的鉴定图；
图11为本发明实施例3制备的间充质干细胞加入到脂肪中后的辅助脂肪充填以及防止脂肪吸收效果对比图；
图12为本发明的脂肪组织的处理方法的流程图。
具体实施方式
如图12所示，本发明提供一种脂肪组织的处理的方法，包括以下步骤：
破碎步骤：将脂肪组织进行机械破碎，从而使所述脂肪组织变小，得到肉糜状的脂肪组织；
消化步骤：采用消化剂对肉糜状的脂肪组织进行消化处理，从所述肉糜状的脂肪组织中释放出细胞，得到间充质干细胞、细胞外基质和/或处理后单个脂肪细胞；其中，所述消化剂含有注射用胶原酶，优选地，所述消化剂中还包括尿激酶。
需要说明的是，本发明所得到的处理后单个脂肪细胞是一种优化的纳米脂肪，颗粒较细，能够均匀分散。
在破碎步骤中，可以采用组织破碎仪(例如：超声破碎仪)对冲洗后的脂肪组织进行机械破碎。或者用剪刀反复剪碎，使脂肪组织块减小，且易于消化。例如可以使经破碎处理的脂肪组织呈肉糜状。本发明对破碎步骤的实现手段没有限制，所属技术领域人员可以根据需要，选择具体的破碎方式，均在本发明的范围之内。
根据本发明的脂肪组织的处理方法，所述肉糜状的脂肪组织的粒径为1-2mm，优选为1-1.5mm。将细胞破碎至1-2mm的粒径范围时，能够有利于后期在消化步骤中释放出间充质干细胞或者将脂肪组织进一步细化，提高消化处理的效率，并且不会损坏细胞，最终提取的细胞存活率高，且花费时间短。
在消化步骤中，用消化剂处理组织，从而释放出间充质干细胞，或者得到细胞外基质和/或处理后单个脂肪细胞。所述消化剂可以为经CFDA批准的，优选不含有热原、内毒素、异种动物血清等有害物质的消化剂，并且在制备过程中不引入热原、内毒素、异种动物血清等有害物质的消化剂。
优选地，根据本发明的脂肪组织的处理的方法，在破碎步骤之前，优选还包括洗涤步骤，冲洗所述脂肪组织，以除去所述脂肪组织中的肿胀液及白细胞。这样，可以使得破碎步骤更容易进行且所得细胞中间充质干细胞含量更高。
在洗涤步骤中，可以采用例如生理盐水等液体，在过滤网上用生理盐水反复冲洗，也可以在盛放有生理盐水的无菌容器中反复摇晃洗涤，从而有效地去除脂肪组织中所含有的肿胀液和脂肪组织的血管破裂所释放出的白细胞。本发明对洗涤步骤的实现手段没有限制，所属技术领域人员可以根据需要，选择具体的洗涤方式，均在本发明的范围之内。
优选地，根据本发明的方法，其中，所述消化步骤和清洗步骤之间，还包括中和步骤：采用中和剂对消化剂进行中和处理。
在中和步骤中，本发明采用安全有效的中和剂，对消化剂进行中和处理，避免残留的消化剂进一步消化脂肪组织细胞，且不会影响细胞活性，并且可以对提取出的间充质干细胞、细胞外基质和/或处理后单个脂肪细胞起到保护作用。
本发明的中和剂均为安全，无异种动物血清的中和剂，不引入任何其它杂质。优选地，所述中和剂包含人血白蛋白、胶原蛋白填充剂中的一种或两种，例如：国药准字S10980016、双美I号(国食药监械(许)字2014第3460092号)、肤美达(国食药监械(准)字2012第3460454号)等。
优选地，根据本发明的脂肪组织的处理的方法，在消化步骤之后，还包括清洗步骤，对消化步骤所得到的间充质干细胞进行冲洗，从而除去残留的消化剂和中和剂。
在清洗步骤中，例如可以在2000-2400r/min的转速下离心5-8min，除去上清液，用生理盐水等重悬细胞沉淀，即为细胞悬液。进一步用细胞筛(例如孔径为70μm的细胞筛)过滤细胞悬液，以得到细胞的细胞悬液。可再次对细胞悬液进行离心-去上清-重悬处理，以进一步清洗除去残留的消化剂。
本发明的注射用胶原酶，可以是国药准字H31022658、国药准字H31022659、国药准字H10960177、国药准字H10960178等，尿激酶可以是国药准字H44020645等。所述注射用胶原酶中还含有赋形剂和稳定剂，所述注射用胶原酶中，活性胶原酶的含量为4％-6％，并且600单位的注射用胶原酶的重量为35mg。
优选地，本发明的所述消化剂中不含有二甲基亚砜，二甲基亚砜通常用于细胞的冻存防止胞浆结晶对细胞的损害，但其具有明显的细胞毒性，并且可能导致其在细胞及溶液中残留，影响间充质干细胞内部运用的安全性，因此，本发明的消化剂中不含有二甲基亚砜。
优选地，本发明所采用的注射用胶原酶的实质效果相当于胶原酶I型和胶原酶III型，适用于上皮、肺、脂肪和肾上腺组织细胞的分离，并且消化性能较温和，对细胞伤害小，从而避免对细胞造成不必要的伤害。
根据本发明的脂肪组织的处理方法，其中，所述消化步骤中，消化处理1g脂肪组织使用的所述注射用胶原酶的加入量为50-250单位，优选为80-200单位。
其中，本发明中，“单位”的定义为注射用胶原酶在37℃，pH7.5条件下作用于胶原蛋白，以每小时从胶原蛋白中释放的多肽相当于茚三酮染色，1微摩尔亮氨酸量为一个活性单位。
当注射用胶原酶的加入量在50-90单位的范围内时，能够释放出少量的间充质干细胞，并获得较多的粒径在15-40μm，优选20-30μm的处理后单个脂肪细胞。
本发明的所述处理后单个脂肪细胞是均匀分散的单个脂肪细胞颗粒，并且可以采用28G或更细的针将所得到的处理后单个脂肪细胞充填皮肤的各个层次。
当注射用胶原酶的加入量在91-120单位的范围内时，当反应时间在10-20min时，更容易获得处理后单个脂肪细胞和少量的间充质干细胞；当反应时间在20min-40min时，更容易获得间充质干细胞和少量的处理后单个脂肪细胞。
当注射用胶原酶的加入量在121-150单位的范围内时，当反应时间在10-20min时，更容易获得较多的间充质干细胞和较少的细胞外基质；当反应时间在20min-40min时，更容易获得较多的细胞外基质和较少的间充质干细胞。
当注射用胶原酶的加入量在151-250单位的范围内时，注射用胶原酶的用量较多，能够获得少量的活体细胞和细胞外基质。
脂肪组织的细胞外基质主要组成成分为胶原，因此通过对脂肪组织进行进一步的消化，从而分离其中的细胞外基质成分能够用于皮肤胶原充填的实验研究和临床应用，同样可以采用28G或更细的针将该细胞外基质充填皮肤的各个层次。
根据本发明的脂肪组织的处理方法，其中所述消化剂还可以包含有尿激酶，优选地，所述消化步骤中，消化处理1g脂肪组织使用的所述尿激酶的加入量可以为3×104-7×104单位，更优选为4×104-6×104单位。但是对尿激酶的含量不做具体限定，均在本发明的范围内。当使用尿激酶时，在中和步骤使用中和剂时，根据尿激酶的含量适当添加相应量的中和剂。
其中，1单位尿激酶是指在37℃，1小时裂解α-乙酰基-L-赖氨酸甲基酯(alpha-N-acetyl-L-lysine methyl ester)释放出46.2×10-3μM甲醇的量。
根据本发明的脂肪组织的处理方法，其中，所述消化处理的反应温度为37-42℃，优选37-39℃；反应时间为10-40min，优选15-35min。当在上述反应温度时，消化剂的活性更强，制备的效率更高。
根据本发明的脂肪组织的处理方法，其中，所述中和步骤中，基于1g脂肪组织使用的所述中和剂的加入量0.8-5mL，优选为1.3-4mL。其中，所述中和剂的质量分数优选为10％-30％，优选为20％。
当中和剂的加入量在0.8-5mL的范围内时，能够将消化剂全部中和，并且还可以对间充质干细胞起到一定的保护作用，当中和剂的加入量低于0.8mL时，会不足以对消化剂全部中和；当中和剂的加入量高于5mL时，会增加清洗细胞悬液的难度，并且在一定程度上增加成本。
另外，本发明在制备间充质干细胞时，所有的步骤均在无菌环境下进行。并且本发明的间充质干细胞不来源于人体胚胎，也不意指胚胎干细胞。
本发明还提供一种间充质干细胞，其通过本发明的脂肪组织的处理方法制备得到。
本发明还提供一种消化剂组合物，其包括本发明的脂肪组织的处理方法中所述的注射用胶原酶和尿激酶。
本发明还提供一种根据本发明所述的间充质干细胞在制备临床药物中的用途。
根据本发明所述的用途，其中，所述间充质干细胞在制备临床用抗免疫排斥制剂、临床用抗心肌梗死药物中的用途。另外，本发明所述的间充质干细胞还可以用于制备临床用抗贫血制品，临床用抗动脉硬化制剂，临床用抗风湿性关节炎制品，临床用抗肿瘤药物等。
本发明还提供一种处理后单个脂肪细胞，其通过本发明的方法制备得到。
本发明还提供一种细胞外基质，其通过本发明的方法制备得到。
实施例
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
用生理盐水对2.4g脂肪组织进行反复冲洗，除去所述脂肪组织中的肿胀液及白细胞。然后用剪刀充分剪碎冲洗后的脂肪组织至呈肉糜状后，且脂肪组织的粒径在1-2mm之间，置于无菌容器中。加入300单位的注射用胶原酶(国药准字H31022658，下同)，37℃震荡消化30min后，加入质量分数为20％的人血白蛋白5mL(国药准字：S10980016，下同)中和注射用胶原酶，经70μm细胞筛过滤得到细胞总数约为2.35×106个。
实施例2
用生理盐水对2.4g脂肪组织进行反复冲洗，除去所述脂肪组织中的肿胀液及白细胞。然后用剪刀充分剪碎冲洗后的脂肪组织至呈肉糜状后，且脂肪组织的粒径在1-2mm之间，置于无菌容器中。加入300单位的注射用胶原酶(国药准字H31022658)和12.5万单位的尿激酶(国药准字H44020645)，37℃震荡消化30min后，然后加入质量分数为20％的10mL人血白蛋白中和注射用胶原酶和尿激酶，经70μm细胞筛过滤得到细胞总数约为2.39×106个。
实施例3
用生理盐水对脂肪组织2.4g进行反复冲洗，除去所述脂肪组织中的肿胀液及白细胞。然后用剪刀充分剪碎，冲洗后的脂肪组织至呈肉糜状后，且脂肪组织的粒径在1-1.5mm之间，置于无菌容器中。加入300单位的注射用胶原酶，37℃震荡消化30min后，加入质量分数为20％的5mL人血白蛋白中和注射用胶原酶。在2400r/min的转速下离心5min后，收集细胞沉淀物。加入生理盐水重悬细胞沉淀物后用70μm孔径的细胞筛过滤，得到单细胞悬液。然后在1200r/min的转速下离心，收集沉淀，除去上清液，去除注射用胶原酶和人血白蛋白，得到细胞总数约为2.16×106个。
实施例4
将实施例3中注射用胶原酶的用量由300单位变为216单位，人血白蛋白的用量由5mL变为3.6mL，将37℃震荡消化30min变为38℃震荡消化40min，其余按与实施例2相同的方法，得到细胞总数约为1.78×106个。
实施例5
将实施例3中注射用胶原酶的用量由300单位变为360单位，人血白蛋白的用量由5mL变为6mL，将37℃震荡消化30min变为39℃震荡消化20min，其余按与实施例2相同的方法，得到细胞总数约为2.67×106个。
实施例6
将实施例3中注射用胶原酶的用量由300单位变为264单位，人血白蛋白的用量由5mL变为4.4mL，将37℃震荡消化30min变为40℃震荡消化30min，其余按与实施例2相同的方法，得到细胞总数约为1.82×106个。
实施例7
用生理盐水对脂肪组织2.4g进行反复冲洗，除去所述脂肪组织中的肿胀液及白细胞。然后用剪刀充分剪碎，冲洗后的脂肪组织至呈肉糜状后，且脂肪组织的粒径在1-1.5mm之间，置于无菌容器中。加入240单位的注射用胶原酶，37℃震荡消化15min后，加入质量分数为20％的4mL人血白蛋白中和注射用胶原酶。在2400r/min的转速下离心5min后，收集上层的处理后单个脂肪细胞为0.8g，如图2和图3所示，本申请制备得到的处理后单个脂肪细胞的粒径更细，并且是均匀分散的单个脂肪细胞颗粒。
实施例8
用生理盐水对脂肪组织2.4g进行反复冲洗，除去所述脂肪组织中的肿胀液及白细胞。然后用剪刀充分剪碎，冲洗后的脂肪组织至呈肉糜状后，且脂肪组织的粒径在1-1.5mm之间，置于无菌容器中。加入420单位的注射用胶原酶，37℃震荡消化35min后，加入质量分数为20％的7mL人血白蛋白中和注射用胶原酶。在2700r/min的转速下离心5min后，收集下层的细胞外基质和细胞的混合物0.6g。如图4所示，本申请制备得到的细胞外基质的10倍物镜下的显微结构图，其中，图4-1为未采用台盼蓝染色，图4-2为采用台盼蓝染料的结果图。
对比例1
将实施例3中注射用胶原酶的用量替换为含有sigma公司的研究型胶原酶(牌号：C0255)的生理盐水溶液，其中，研究型胶原酶的质量分数为0.075％。其余按与实施例3相同的方法，得到细胞总数约为2.79×106个。
对比例2
用生理盐水对2.4g脂肪组织进行反复冲洗，除去所述脂肪组织中的肿胀液及白细胞。然后用剪刀充分剪碎，冲洗后的脂肪组织至呈肉糜状后，且脂肪组织的粒径在1-2mm之间，置于无菌容器中。加入12.5万单位的尿激酶，37℃震荡消化30min，然后加入质量分数为20％的人血白蛋白5mL(国药准字：S10980016)中和尿激酶，得到细胞总数约为0.74×106个。
活体细胞率实验
对实施例3和对比例1消化所得到的细胞通过台盼蓝染色(Beckman Coulter,Inc,Vi-CELL)及自动细胞计数仪，计数比较实施例3和对比例1的活体细胞数目，具体结果如下表1所示，表1中，A1指的是注射用胶原酶，B1指的是sigma公司的研究型胶原酶(牌号：C0255)。
表1
由表1和图5可以看出，采用注射用胶原酶所提取出的间充质干细胞的活体细胞率更高，因此，采用注射用胶原酶提取的间充质干细胞更加安全可靠。
并且，采用曼-惠特尼(Mann-Whitney)检验，计算得到P＝0.019<0.05，因此实施例3提取方法制备得到的活体细胞比例与对比例1的提取方法制备得到的活体细胞具有显著的差异。
体外分化诱导实验
对实施例3中得到的细胞进行体外成脂诱导和成骨诱导
体外成骨分化诱导：将细胞以1×104/孔的密度接种于6孔板中，在体外成骨分化诱导液(所述成骨分化诱导液为：普通生长培养基中含有10nmol的地塞米松、50μg/mL的L-抗坏血酸-2-磷酸、10mmol的β-甘油(Sigma-Aldrich公司)，)中诱导。每3天换一次成骨分化诱导液，在体外成骨分化诱导第21天固定细胞，利用茜素红染色检测钙结节。
体外成脂分化诱导：将细胞以2×104/孔的密度接种于6孔板中，在体外成脂分化诱导液(所述体外成脂分化诱导液为：普通生长培养基中含有1μmol的地塞米松，0.5mmol的3-异丁基甲基黄嘌呤，10μg/mL的胰岛素，0.2mmol的吲哚美辛(Sigma-Aldrich公司))，在体外成脂分化诱导第14天提取RNA，在体外成骨分化诱导第21天固定细胞，利用油红O染色检测细胞内脂滴的形成。
如图6-9所示，在对诱导后的细胞进行茜素红和油红O染色，能够看出实施例3制备得到的细胞在体外具有成脂分化能力和成骨分化的能力，从而证明所得到的细胞为间充质干细胞。
按照上述体外分化诱导实验的具体步骤，对实施例1-2以及实施例4-6制备得到的细胞进行体外分化诱导实验，能够得出在体外具有成脂分化能力和成骨分化的能力，因此实施例1-2以及实施例4-6制备得到的细胞也为间充质干细胞。
表面标志物的鉴定
通过流式细胞仪对实施例3提取的细胞，进行间充质干细胞表面标志物的鉴定。将贴壁培养的细胞，消化处理后，1500r/min离心细胞收集细胞沉淀，采用BD stemflow hMSCanalysis Kit试剂盒(产品编号562245)，利用试剂盒中的缓冲溶液重悬细胞，清洗1遍后离心，得到密度为1×106/mL细胞。并将CD90FITC、CD44PE、CD105PerCP-Cy5.5、CD73APC、仅细胞、阴性+阳性同型对照混合液、阴性+阳性标记物混合液、阳性同型对照混合液+同型对照、阳性标志物混合液+CD44PE共9种溶液分装在9支离心管中，每支离心管中500μL溶液，按要求孵育相应抗体。避光，在冰上分别孵育实验组以及同型对照组的表面标志物抗体40分钟。采用流式细胞缓冲液冲洗、重悬，采用BD C6型号流式细胞仪检测。
其中，同型对照组中所采用的细胞与实验组所采用的细胞均为间充质干细胞，但是同型对照组中所采用的抗体是非特异性的免疫球蛋白。
如图10所示，实施例3制备得到的细胞能够表达CD90、CD105、CD73和CD44等间充质干细胞的表面标志，其不表达CD45、CD34、CD11b、CD19、HLA-DR，从而证明所得到的细胞为间充质干细胞，并且本发明制备得到的间充质干细胞呈阳性，不是非特异性的假阳性结合。
同样的，实施例1-2以及实施例4-6制备得到的细胞能够表达CD90、CD105、CD73和CD44等间充质干细胞的表面标志，其不表达CD45、CD34、CD11b、CD19、HLA-DR，从而证明实施例1-2以及实施例4-6制备得到的细胞为间充质干细胞。
间充质干细胞辅助脂肪充填
采用实施例3制备得到的间充质干细胞1×106个加入到1mL(0.8g)脂肪中，注射到裸鼠背部皮下。如图11所示，本发明所得到的间充质干细胞具有辅助脂肪充填，防止脂肪吸收的能力，在脂肪移植后减少移植脂肪组织的吸收。

Claims (10)

1.一种脂肪组织的处理方法，其特征在于，包括以下步骤：
破碎步骤：将脂肪组织机械破碎，得到肉糜状的脂肪组织；
消化步骤：采用消化剂对所述肉糜状的脂肪组织进行消化处理，从所述肉糜状的脂肪组织中释放出细胞，得到间充质干细胞、细胞外基质和/或处理后单个脂肪细胞；其中，所述消化剂含有注射用胶原酶，优选地，所述消化剂中还包含有尿激酶。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述肉糜状的脂肪组织的粒径为1-2mm，优选为1-1.5mm；优选地，所述处理后单个脂肪细胞的粒径为15-40μm，优选为20-30μm。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述消化步骤之后，还包括：
中和步骤：采用中和剂对所述消化剂进行中和处理；
优选地，所述中和剂包括人血白蛋白、胶原蛋白填充剂中的一种或两种。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述消化剂和所述中和剂中不含内毒素、热原和/或异种动物血清。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述消化步骤中，消化处理1g脂肪组织使用的所述注射用胶原酶的加入量为50-250单位，优选为80-200单位。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，基于消化处理1g脂肪组织使用的所述中和剂的加入量为0.8-5mL，优选为1.3-4mL。
7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，在破碎步骤之前，还包括：洗涤步骤，冲洗所述脂肪组织，以除去所述脂肪组织中的肿胀液及白细胞；
优选地，在消化步骤之后，还包括清洗步骤，更优选地，所述清洗步骤后，还包括将所述间充质干细胞经细胞筛过滤的步骤。
8.一种间充质干细胞，其通过权利要求1-7任一项所述的方法制备得到。
9.一种处理后单个脂肪细胞，其通过权利要求1-7任一项所述的方法制备得到。
10.一种细胞外基质，其通过权利要求1-7任一项所述的方法制备得到。
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