CN103443272A

CN103443272A - 从脂肪组织获得的源自超声空化的基质或间充质血管提取物和源自其的细胞以及其用途

Info

Publication number: CN103443272A
Application number: CN2011800686078A
Authority: CN
Inventors: 斯蒂文·维克多
Original assignee: INTELLICELL BIOSCIENCES Inc
Current assignee: INTELLICELL BIOSCIENCES Inc
Priority date: 2010-12-27
Filing date: 2011-12-12
Publication date: 2013-12-11
Also published as: KR20140048840A; WO2012091911A1; EP2658969A4; EP2658969A1; US20130189234A1; US20120164113A1; AU2011352928A1; NZ612801A; CA2823123A1; US8440440B2; AU2011352928B2

Abstract

本发明提供处理方法，其使用脂肪组织使用超声空化解离脂肪组织内所含有的脂肪细胞和血管且由此获得用于人类个体的间充质或基质血管部分。这些方法优选不包括使用任何外源解离酶(例如胶原酶)，且与使用胶原酶分离构成所述间充质或基质血管部分的细胞的方法相比使得这些细胞的数量增加(约为10倍)。

Description

从脂肪组织获得的源自超声空化的基质或间充质血管提取物和源自其的细胞以及其用途

相关申请案

本申请案主张2010年12月27日提出申请的美国临时申请案第61／427,221号的优先权，所述案件的全部内容以引用的方式并入本文中。

技术领域

背景技术

在最近10年内，脂肪组织作为多能干细胞的来源已引起注意(参见朱科P A(Zuk P A)等人，细胞分子生物学(Mol Biol Cell).2002；13：4279-4295)。脂肪组织由成熟的脂肪细胞和脂肪基质细胞组成，且后者可分化成多种细胞谱系(朱科P A等人，组织工程学(Tissue Eng).2001；7：211-228；希科克K C(Hicok K C)等人，组织工程学.2004；10：371-380；艾瑞克森G R(Erickson G R)等人，生物化学与生物物理学研究通讯(BiochemBiophys Res Commun).2002；290：763-769；库辛B(Cousin B)等人，生物化学与生物物理学研究通讯.2003；301：1016-1022；萨福德K M(Safford K M)等人，生物化学与生物物理学研究通讯.2002；294：371-379；米朗维尔A(Miranville A)等人，循环(Circulation).2004；110：349-355；普兰特-贝纳德V(Planat-Benard V)等人，循环研究(Circ Res).2004；94：223-229；和普兰特-贝纳德V等人，循环.2004；109：656-663)。脂肪基质细胞是粘附性的且可在培养物中增殖。因此，可容易地借助培养从小片脂肪组织获得大量脂肪基质细胞。

目前，为从脂肪组织产生基质血管部分，通常使用例如胶原酶等酶。胶原酶溶解胶原中使组织结合在一起的键。(参见例如，朱科P A等人，细胞分子生物学.2002；13：4279-4295；朱科P A等人，组织工程学.2001；7：211-228等，以及上文引用的参考文献)。

胶原酶是消化三重螺旋区中的天然胶原的内肽酶。胶原是动物细胞外结缔组织的重要纤维性组份。胶原酶存在于不同的生物体中，包括脊椎动物和细菌。细菌胶原酶比脊椎动物胶原酶具有广泛的底物特异性(参见布鲁门克兰兹(Blumenkrantz)等人，生物化学杂志(J Biol Chem).1984年1月25日；259(2)：854-9；伯克达-汉森(Birkedal-Hansen)，酶学方法(Methods Enzymol).1987；144：140-71.1987)。另外，不像细菌源性胶原酶将胶原分裂成其天然三重螺旋构象那样(参见伍雷(Wooley)等人，欧洲生物化学杂志(Eur JBiochem)50(2)：437-444，1975；格罗斯(Gross)等人，动物胶原酶：作用特异性和底物裂解位点的结构(Animal Collagenases：Specificity of Action，and Structures of the SubstrateCleavage Site)，生物化学与生物物理学研究通讯.61，605，1974)。细菌胶原酶的不同之处在于，它们能够分解水不溶性天然胶原和水溶性变性胶原二者。细菌胶原酶能够分解几乎所有类型的胶原且可实现三重螺旋区内的多重裂解(参见穆克替尔(Mookhtiar)和范瓦特(Van Wart)，溶组织梭菌胶原酶：对一些先前酶的新观点(Clostridium histolyticumCollagenases：A New Look at some Old Enzymes)，基质增刊(Matrix Suppl).1，116，1992)。

最近的专利申请案20070148766(2007年6月28日公布，吉村(Yoshimura)；孝太郎(Kotaro)；(日本涩谷区(Shibuya-ku))；松本(Matsumoto)；大辅(Daisuke)且颁予生物玛斯特(Biomaster)公司)教示从脂肪抽吸源性吸出物分离干细胞。

发明内容

本发明提供从脂肪组织获得间充质或基质血管部分的新颖方法，所述方法不包括使用胶原酶或其它消化使组织结合在一起的胶原键的酶。尽管胶原酶用于此目的作用较好且所属领域的技术人员确实方便地用来降解胶原且使组织分离成分立的细胞，但使用此酶可不利于打算用于人类中的细胞产物，例如打算用于组织重建或再生(例如，乳房重建程序、美容皮肤回春)或用于在整形手术期间使用的美容组织填充物中的细胞或细胞部分。具体来说，FDA可认为使用此酶(来获得所需细胞)导致“极大限度地处理(maximallymanipulated)”的细胞产物。这是不利的，因为使用胶原酶将可能使源自脂肪组织的基质或间充质血管细胞属于需要药物批准的类别，即使所述细胞部分打算在美容上而不是在临床上使用。而且，使用例如胶原酶等酶另有不利之处，因为这些酶导致更多细胞死亡，从而降低可分离的所需细胞的数量，且另外此导致更多细胞碎片，从而导致产生较少的可用细胞产物，尤其如果细胞打算在治疗上使用。因此，期望提供产生基质或间充质血管部分(含有间充质或基质干细胞、内皮细胞和其它脂肪组织中发现的细胞)的替代方法(例如机械方法)，所述基质或间充质血管部分适于经由局部或全身投与(例如经由注射、输注、局部投与)来投与患者，或与植入物、基质、组织填充物结合投与，其中脂肪组织源性组合物不包括胶原酶且根据FDA未经“极大限度地处理”。

如上文所讨论，本发明的发明者已发现，例如源自手术切除或经由脂肪抽吸而吸出的脂肪组织可离体通过超声空化处理足够时间，以便爆破或溶解其中含有的脂肪细胞和血管，由此释放脂肪组织中含有的血管壁的外层内含有的基质血管部分细胞，包括基质和间充质干细胞、内皮前体细胞和其它构成“间充质血管部分”或“基质血管部分”的细胞类型。本发明的发明者已发现，通过在合适的条件下使用超声空化处理脂肪组织(例如工作实例中所例示)不仅爆破或溶解脂肪细胞，而且爆破或溶解其中含有的血管，而不会不利地影响基质和间充质干细胞的生存力，从而释放高数量的可存活基质和间充质干细胞、内皮前体细胞和其它构成“间充质血管部分”或“基质血管部分”的细胞类型，所述基质和间充质干细胞可回收且用于所需美容或治疗方法中，在所述方法中这些细胞具有有益的价值。

就本发明的发明者所知，在不存在蛋白酶下成功使用此机械方式从脂肪组织获得适于投与人类个体的间充质或基质血管部分先前并未成功地使用。尽管已公布的专利申请案US20060051865(在实质审查之前放弃)声称描述使用超声方法从脂肪组织释放成体干细胞(尤其在实例2中)，但当本发明的发明者重复其方法时揭示操作条件无效，即其获得较少的基质血管部分细胞。相比之下，本发明可再现地产生极高数量的可存活基质血管部分细胞，所述细胞非常适于用于细胞疗法或美容程序中。

相比之下，使用超声空化或脂肪空化(lipocavitation)作为有助于减少局部化脂肪沉积的非侵袭性处理而为人熟知。不满意某一部位脂肪沉积但不愿意经历任何侵袭性手术治疗(例如脂肪抽吸)的人使用此方法。其作为随来随走(walk in，walk out)治疗实施且没有手术脂肪移除那样的漫长恢复期。

脂肪空化的优良候选人是期待从特定部位(例如髋部、大腿、臀部、腹部或臂)移除脂肪的人。所述治疗通常不导致总体重损失，但局部化治疗部位的轮廓得以改善。

在治疗中，机头(handpiece)将低频率的超声波向下递送到皮肤的皮下或脂肪层中，从而靶向脂肪细胞(adipocyte或fat cell)。微小的振动在脂肪细胞内产生细小的气泡，其扰乱外部膜且容许脂肪的细小聚集物排到周围部位中，随后经由身体的自然能量和废弃物移除过程而移除。脂肪细胞的此选择性破坏不干扰邻近的结构(例如血管和神经)且因此是非常安全的治疗。脂肪空化是无痛程序，但对于一些人，可能存在与治疗期间的噪声有关的少许不适，这在机头不再与皮肤接触时停止。

相比之下，在本发明中，使用超声空化以机械方式在不存在胶原酶下离体处理脂肪组织以便溶解其中含有的脂肪细胞和血细胞，且所得经超声处理的组合物(从其中移除脂肪)随后用于获得间充质或基质血管部分，所述部分可直接输注于有需要的患者中，或其可进一步经处理以便纯化(且如果需要在培养物中扩增)所需细胞类型，例如间充质或基质干细胞、内皮细胞和其它在脂肪组织中发现的细胞。这些部分和细胞可用于患者中，例如用于组织重建、组织再生、伤口愈合、隆乳术或重建术，用于例如经由衰老或由于疾病已损失丰满度的饱满部位(例如，面部、唇、臀部等)的组织填充物中。具体来说，这些细胞的涵盖用途包括与组织填充物一起使用或代替组织填充物，例如用于治疗龈退缩、骨损失(包括例如颌)、治疗矫形问题、治疗关节炎、治疗偏头痛、治疗多发性硬化、治疗孤独症、治疗糖尿病、治疗伤口、治疗溃疡、治疗COPD、治疗足底筋膜炎、治疗回旋肌套和治疗网球肘。

附图说明

图1A-E、2A-E、3A-E、4A-E和5A-E含有密理博(Milipore)研究的结果，所述研究比较根据本发明超声处理方法对使用胶原酶的方法分离的基质血管部分细胞。其中的结果显示，标的超声处理方案产生的可存活细胞是用分解胶原的酶(胶原酶)处理的相当脂肪试样的约10倍(相同量的脂肪组织)。其中的结果进一步显示，本发明方法产生与胶原酶分离程序相同的细胞群体和细胞类型，从而表明本发明方法保持全部所需基质血管部分细胞且尤其图中所鉴定的细胞类型的完整性。

发明目的

本发明的目的是不使用胶原酶或另一裂解胶原键的酶从脂肪组织中含有的血管组织产生间充质或基质血管部分，其含有血管组织源性干细胞和血管壁中发现的其它细胞。

本发明的特定目的是从脂肪组织产生间充质或基质血管部分，所述方法包含在试样中的脂肪细胞经爆破或溶解的条件下且另外在脂肪中发现的血管进一步溶解而不会不利地影响其中含有的基质和间充质干细胞的生存力的超声处理条件下用超声空化处理脂肪组织。已发现，通过如本文所述谨慎优化超声处理条件，所述超声处理方法可在不存在蛋白酶处理下用以从脂肪组织中发现的血管释放所需基质血管或间充质血管细胞，而不会不利地影响基质和间充质干细胞，实质上溶解或降解基质和间充质干细胞。优选地，所述方法不包括添加分解胶原的酶，例如胶原酶或其它内肽酶。

本发明的更特定目的是从脂肪组织产生间充质或基质血管部分和其中含有的特定细胞类型，所述脂肪组织是以手术方式从供体身体的基质或间充质室获得或源自脂肪抽吸源性吸出物。

在优选实施例中，所述方法包括使用具有与脂肪组织接触放置的探针的超声空化装置，且其中所述接触是充分的(例如，1分钟到约8小时，更优选约5分钟到约1小时)，以便在一定条件下爆破或溶解脂肪组织中的大多数脂肪细胞和血细胞，在所述条件下从不同试样释放含有基质和间充质干细胞、内皮前体和其它其中含有的细胞类型的基质血管部分，而不会不利地影响这些细胞的生存力和数量。事实上，如本文中所揭示，相对于使用胶原酶或其它酶的现有技术方法，本发明从脂肪试样回收到增加数量的可存活基质和间充质干细胞(约为10倍)。

在另一优选实施例中，在超声空化之后，移除爆破的脂肪(在组合物的顶部)，且针对所需细胞类型的存在对剩余的部分进行进一步纯化或分析(例如通过流式细胞术)，所述所需细胞类型包括干细胞和内皮前体细胞、免疫细胞、破骨细胞、造血干细胞和本文中揭示的其它细胞类型。

在另一优选实施例中，在超声空化之后，通过例如流式细胞术从试样分离间充质或基质干细胞，或可使用荧光活化的细胞分选(FACS)基于对脂肪组织中含有的脂肪源性干细胞或其它细胞谱系具有特异性的细胞表面抗原而分级分离成不同的细胞类型。

在另一优选实施例中，在超声空化之后，将分离的间充质或基质干细胞或源自其的其它细胞输注或投与到患者中以便用于特定的美容或治疗程序。

在另一优选实施例中，将分离的间充质或基质干细胞或源自其的其它细胞用于促进伤口愈合、隆乳术或重建术、组织工程或其它应用。

在另一优选实施例中，本发明提供源自脂肪组织的不包含任何外源胶原酶的基质或间充质血管部分。

在另一优选实施例中，所述血管部分包含表达至少一种选自由下列组成的群组的蛋白质且不表达CD56的干细胞和其它细胞：CD13、CD14、CD29、CD31、CD34、CD36、CD44、CD45、CD49d、CD54、CD58、CD71、CD73、CD90、CD105、CD106、CD151和SH3，或CD13、CD29、CD34、CD36、CD44、CD49d、CD54、CD58、CD71、CD73、CD90、CD105、CD106、CD151和SH3，和／或CD31、CD45、CD117和CD146。

在另一优选实施例中，所述血管部分包含表达至少一种选自由CD3、CD4、CD14、CD15、CD16、CD19、CD33、CD38、CD56、CD61、CD62e、CD62p、CD69、CD104、CD135和CD144组成的群组的蛋白质且不表达CD3、CD4、CD14、CD15、CD16、CD19、CD33、CD38、CD56、CD61、CD62e、CD62p、CD69、CD104、CD135和CD144或表达CD49d且不表达CD56的干细胞和其它细胞。

具体实施方式

在详细描述本发明之前，提供以下通篇本申请案中所使用词语的缩写和定义。

ASC或ADSC，脂肪源性干细胞；在本文中，此指源自脂肪组织中发现的血管的间充质干细胞，例如，表达CD34的造血干细胞。

BMI，体重指数。

冠词“一”(“a”和“an”)在本文中用以指一个或一个以上(即指至少一个)的所述冠词的文法受词。举例来说，“一元件(an element)”意指一个元件或一个以上的元件。

术语“约”将为所属领域的技术人员所了解且将基于其使用背景在一定程度上变化。

术语“脂肪组织源性细胞”在本文中指源自脂肪组织、优选源自其中含有的血管的细胞。从脂肪组织分离的初始细胞群体是异种细胞群体，包括(但不限于)基质或间充质血管部分(SVF)或(MVF)细胞。

“脂肪”指任何脂肪组织。脂肪组织可为褐色或白色脂肪组织。脂肪可为间充质或基质。优选地，脂肪组织是皮下白色脂肪组织。脂肪组织可来自任何具有脂肪组织的生物体。优选地，脂肪组织是哺乳动物的，最优选地，脂肪组织是人类的。人类脂肪组织的便利来源是源自脂肪抽吸手术或其它手术。然而，脂肪组织的来源或脂肪组织的分离方法对于本发明来说并不关键。

如本文所用的术语“脂肪源性干细胞(ADSC或ASC)”指源自脂肪组织中发现的血管的基质或间充质细胞，其可作为多种不同细胞类型的干细胞样前体，例如但不限于脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、肌细胞和神经元／神经胶质细胞谱系。脂肪源性干细胞组成源自脂肪组织的子集群体，可使用标准培养程序或本文中揭示的其它方法将其与脂肪组织的其它组分分离。另外，可使用本文中揭示的细胞表面标记从细胞的混合物分离脂肪源性成体干细胞。

如本文所用的术语“脂肪细胞”用以指任何类型的脂肪组织，包括未分化的脂肪源性成体干细胞和分化的脂肪源性成体干细胞。

如本文所用的短语“间充质或基质血管部分”指源自脂肪组织中发现的血管的细胞部分，其包含不同的细胞类型，包括(作为实例)间充质干细胞、造血细胞、造血干细胞、血小板、库普弗细胞(Kupffer cell)、破骨细胞、巨核细胞、粒细胞、NK细胞、内皮前体或祖细胞、CD34+细胞或间充质干细胞(通常在脐带中发现)、CD29+细胞、CD166+细胞、Thy-1+或CD90+干细胞、CD44+细胞、免疫细胞，例如单核细胞、白细胞、淋巴细胞、B和T细胞、NK细胞、巨噬细胞、嗜中性白细胞、嗜中性细胞、嗜中性粒细胞等，包括免疫细胞和其它表达以下标记中的一者或一者以上的细胞：CD3、CD14(巨噬细胞标记)、CD19、CD20(B细胞标记)、CD29(整联蛋白单元)、CD31(内皮、血小板、巨噬细胞、库普弗细胞、树突细胞、粒细胞、T／NK细胞、淋巴细胞、巨核细胞、破骨细胞、嗜中性细胞等)、CD44(透明质酸受体)、CD45(B和T细胞标记)、C56、CD73(淋巴细胞分化标记)、CD105等。此外，所述细胞部分还包括表达本申请案中所揭示的任一种标记或其任一组合的细胞。

如本文所用的术语“同种异体的”意指源自相同物种的不同哺乳动物的任何材料。

如本文所用的术语“自体的”意指源自相同个体的任何材料，稍后将其再引入所述相同个体中。

如本文所用的术语“表型特征”应理解为意指以下特征中的至少一者：形态外观、特定蛋白质的表达、染色图案或用物质染色的能力。

术语“施加器”如所述术语在本文中所使用意指用于投与本发明化合物和组合物的任何装置，包括(但不限于)皮下注射器、移液管等。

如本文所用的“中枢神经系统”应理解为包括哺乳动物的脑和／或脊髓。所述术语在一些情况下还可包括眼睛和视神经。

“分化的”在本文中用以指已达到成熟的终末态的细胞，由此所述细胞已发育完全且对特定环境和／或功能展示生物特化和／或适应。通常，分化的细胞的特征在于在所述细胞中表达编码与分化有关的蛋白质的基因。例如，在白细胞中表达GALC是终末分化白细胞的典型实例。

“分化培养基”在本文中用以指包含添加剂或缺少添加剂的细胞生长培养基，由此干细胞、脂肪组织源性基质细胞、胚胎干细胞、ES样细胞、MSC、神经球、NSC或其它未完全分化的所述祖细胞当在培养基中孵育时发育成具有分化细胞的一些或所有特征的细胞。

当将细胞称为“正在分化(differentiating)”(如所述术语在本文中所使用)时，所述细胞在分化过程中。

“分化的脂肪源性成体干细胞”是已如本文中所定义分化的从任何脂肪组织分离的脂肪源性成体干细胞。

“未分化的脂肪源性成体干细胞”是从脂肪组织分离且经培养以促进增殖但不具有以可检测方式表达的蛋白质或其它指示生物特化和／或适应的表型特征的细胞。

“疾病”是动物不能保持内稳态且如果疾病未改善那么动物的健康继续恶化的动物的健康状态。相比之下，动物的“病症”是动物能够保持内稳态但与不存在病症下相比动物的健康状态较不有利的健康状态。在不予治疗下，病症不一定造成动物健康状态的进一步下降。

如本文所用的术语“中枢神经系统的疾病、病症或病况”意指由中枢神经系统细胞或影响中枢神经系统的细胞表达的基因的基因突变引起的疾病、病症或病况，由此所述突变的一种效应表现为中枢神经系统的异常结构和／或功能，例如，有缺陷的髓磷脂。所述遗传缺陷可为中枢神经系统细胞中突变的、无功能的或欠表达的基因的结果。

如本文所用的“内源的”指来自生物体、细胞或系统或在所述生物体、细胞或系统内部产生的任何材料。

“外源的”指从生物体、细胞或系统引入或在所述生物体、细胞或系统外部产生的任何材料。具体来说，外源可指不存在于所处理脂肪组织中的材料。

“分离的细胞”指已与在组织或哺乳动物中天然伴随所述分离的细胞的其它组份和／或细胞分离的细胞。

如本文所用的“移植物”指植入个体中通常以便替代、矫正或以其它方式克服缺陷的细胞、组织或器官。移植物可进一步包含骨架。所述组织或器官可由源自相同个体的细胞组成；此移植物在本文中由以下可互换术语提及：“自体移植物(autograft)”、“自体移植物(autologous transplant)”、“自体植入物(autologous implant)”和“自体移植物(autologousgraft)”。包含来自相同物种的遗传上不同个体的细胞的移植物在本文中由以下可互换术语提及：“同种异体移植物(allograft)”、“同种异体移植物(allogeneic transplant)”、“同种异体植入物(allogeneic implant)”和“同种异体移植物(allogeneic graft)”。从一个体到其同卵双生的移植物在本文中称为“同基因移植物(isograft)”、“同基因移植物(syngeneictransplant)”、“同基因植入物(syngeneic implant)”或“同基因移植物(syngeneic graft)”。“异种移植物(xenograft)”、“异种移植物(xenogeneic transplant)”或“异种植入物(xenogeneicimplant)”指从一个个体到不同物种的另一个体的移植物。

细胞的“免疫表型”在本文中用以指就细胞的表面蛋白质概况(profile)来说的细胞表型。

“多肽”指由氨基酸残基构成的聚合物、相关的天然存在结构变体和其经由肽键连接的合成的非天然存在的类似物、相关的天然存在结构变体和其合成的非天然存在的类似物。合成的多肽可例如使用自动化多肽合成仪来合成。

术语“前体细胞”、“祖细胞”和“干细胞”在本领域和本文中可互换使用，且指多能或谱系未定型的祖细胞，其潜在地能够无限次地有丝分裂以便自我更新或产生将分化成所需细胞类型的后代细胞。与多能干细胞相比，谱系定型的祖细胞通常被认为不能够产生在表型上彼此不同的多种细胞类型。相反，祖细胞产生一种或可能两种谱系定型的细胞类型。

如本文所用的术语“多能的”或“多能性”意指干细胞分化成一种以上细胞类型的能力。

如本文所用的术语“传代后期的脂肪组织源性基质细胞”指与传代早期的细胞相比呈现较少免疫原性特征的细胞。脂肪组织源性基质细胞的免疫原性对应于传代数。优选地，细胞已传代到至少第二代，更优选地，细胞已传代到至少第三代，且最优选地，细胞已传代到至少第四代。

术语“蛋白质”通常指大的多肽，通常高于100个氨基酸。

术语“肽”通常指短的多肽，通常低于100个氨基酸。

“治疗性”治疗是出于减轻或消除病状体征和/或降低或减小所述体征的频率、持续时间和强度的目的而投与呈现所述体征的患者的治疗。

化合物的“治疗有效量”是足以向投与化合物的个体提供有益效应的化合物或细胞的量。此外，如本文所用的“治疗有效量”是足以向投与细胞的个体提供有益效应的细胞的量。

化合物或细胞的“美容或美学有效量”是足以向投与化合物或细胞的个体提供美容或美学上的有益效应(例如皮肤回春、所治疗组织(例如颊、唇、臀部或乳房组织)的饱满度或体积或外观增强)的化合物或细胞的量。此外，如本文所用的“美容有效量”是足以向投与细胞的个体提供有益效应的细胞的量。

“治疗”疾病如所述术语在本文中所使用意指降低疾病或病症的频率，从而降低动物所遭受的疾病或病症的一种或一种以上症状中的症状的频率。

“异种的”指源自不同物种的哺乳动物的任何材料。

本发明提供从脂肪组织获得基质血管部分的新颖方法，所述方法优选不包括或需要使用胶原酶或其它消化使组织结合在一起的胶原键的酶。尽管胶原酶用于此目的作用较好且所属领域的技术人员确实方便地用来降解胶原且使组织分离成分立的细胞，但使用此酶可不利于打算用于人类中的细胞产物，例如打算用于组织重建或组织再生(例如，乳房重建程序，例如用于皮肤回春)或用于在整形手术期间便利地使用的美容组织填充物中的细胞或细胞部分。如先前所提及，FDA可认为使用此酶来获得所需细胞导致“极大限度地处理”的产物。这是不利的，因为使用胶原酶将可能使源自脂肪组织的基质血管细胞属于需要药物批准的类别，即使所述细胞部分在美容上而不是在临床上使用。而且，所述酶导致更多细胞死亡和细胞碎片。因此，期望提供产生基质血管部分(含有间充质或基质干细胞、内皮细胞和其它在脂肪组织中的血管中发现的细胞)的替代方法(例如机械方法)，所述基质血管部分适于经由局部或全身投与(例如经由注射、输注、局部投与)或与植入物、基质、组织填充物结合来投与患者，其中脂肪细胞源性组合物不包括胶原酶且根据FDA所述组合物未经“极大限度地处理”。

如上文进一步讨论，本发明的发明者已发现，例如源自手术切除或经由脂肪抽吸而吸出的脂肪组织可通过超声空化处理足够时间，以便爆破或溶解其中含有的脂肪细胞和血管，且由此释放脂肪组织中的血管内所含有的基质血管部分细胞，包括基质和间充质干细胞、内皮前体细胞和其它构成间充质或基质血管部分的细胞类型。

在本发明中，使用超声空化以机械方式优选在不存在外源胶原酶下离体处理脂肪组织以便溶解脂肪细胞，且所得经超声处理的组合物(从其中移除脂肪)随后用于获得间充质或基质血管部分，所述部分可直接输注于有需要的患者中，或其可进一步经处理以便纯化(且如果需要在培养物中扩增)所需细胞类型，例如间充质或基质干细胞、内皮细胞和其它在脂肪组织中发现的细胞。这些部分和细胞可用于患者中，例如用于组织重建、组织再生、伤口愈合、隆乳术或重建术，用于例如经由衰老或由于疾病已损失丰满度的饱满部位(例如，面部、唇、臀部等)的组织填充物中。

通常，本发明通过在一定条件下用超声空化处理脂肪组织从脂肪组织产生间充质或基质血管部分，在所述条件下试样中的脂肪细胞经爆破或溶解，由此从脂肪组织释放基质血管或间充质血管细胞，且优选不包括添加分解胶原的酶，例如胶原酶或其它内肽酶。脂肪组织可源自任何哺乳动物，但优选地来自活供体或非活供体。脂肪组织可经由脂肪抽吸手术，在这些程序之后吸出脂肪而获得，或通过其它手术方法加以分离。供体优选与打算用获得的基质或间充质血管部分或细胞治疗的患者为同一患者，或为与所治疗个体免疫相容的同种异体供体。

在优选实施例中，所述方法使用具有与脂肪组织接触放置的探针的超声空化装置，且其中所述接触保持足够时间(例如，1分钟到约8小时，更优选约5分钟到约1小时)，以便爆破或溶解脂肪组织中的大多数脂肪细胞并释放含有基质和间充质干细胞、内皮前体及其它细胞类型的基质血管部分。

使用的特定超声空化装置对于本发明来说并不关键。一种适宜的选择是Vibra-Cell^TM装置，它是技术先进的高强度超声处理器。此装置可安全地处理宽范围的有机和无机材料-从数微升到数升。可使用的其它装置包括HIELSCHER SONIC200和SONIC200。

在使用超声空化装置处理含有血管的脂肪组织之后，优选移除爆破的脂肪(在组合物的顶部)，且针对所需细胞类型(包括干细胞和内皮前体细胞)的存在对来自溶解或爆破的血管的剩余的基质或间充质血管部分进行进一步纯化或分析(例如通过流式细胞术)。此可通过已知方法来实现，所述已知方法包括流式细胞术或例如基于对脂肪组织中含有的脂肪源性干细胞或其它细胞谱系具有特异性的细胞表面抗原使用荧光活化的细胞分选(FACS)分级分离成不同的细胞类型。适宜的抗原和标记在本文中揭示。可根据本发明从脂肪组织分离的其中含有的细胞和标记包括(作为实例)间充质干细胞、造血细胞、造血干细胞、血小板、库普弗细胞、破骨细胞、巨核细胞、粒细胞、NK细胞、内皮前体或祖细胞、CD34+细胞或间充质干细胞(通常在脐带中发现)、CD29+细胞、CD166+细胞、Thy-1+或CD90+干细胞、CD44+细胞、免疫细胞，例如单核细胞、白细胞、淋巴细胞、B和T细胞、NK细胞、巨噬细胞、嗜中性白细胞、嗜中性细胞、嗜中性粒细胞等，包括免疫细胞和其它表达以下标记中的一者或一者以上的细胞：CD3、CD14(巨噬细胞标记)、CD19、CD20(B细胞标记)、CD29(整联蛋白单元)、CD31(内皮、血小板、巨噬细胞、库普弗细胞、粒细胞、T/NK细胞、淋巴细胞、巨核细胞、破骨细胞、嗜中性细胞等)、CD44(透明质酸受体)、CD45(B和T细胞标记)、C56、CD73(淋巴细胞分化标记)、CD105等。此外，其还包括表达本申请案中所揭示的任一种标记或这些标记的任一组合的细胞。

优选将分离的基质或间充质血管部分或分离的细胞投与到有需要的患者中。例如，使用干细胞来促进伤口愈合、隆乳术或重建术、组织工程或其它应用。

此部分优选包含表达至少一种选自由下列组成的群组的蛋白质且不表达CD56的脂肪源性干细胞：CD13、CD29、CD34、CD36、CD44、CD49d、CD54、CD58、CD71、CD73、CD90、CD105、CD106、CD151和SH3，或CD13、CD29、CD34、CD36、CD44、CD49d、CD54、CD58、CD71、CD73、CD90、CD105、CD106、CD151和SH3，和/或CD31、CD45、CD117和CD146。

在另一优选实施例中，所述血管部分包含表达至少一种选自由CD3、CD4、CD14、CD15、CD16、CD19、CD33、CD38、CD56、CD61、CD62e、CD62p、CD69、CD104、CD135和CD144组成的群组的蛋白质且不表达CD3、CD4、CD14、CD15、CD16、CD19、CD33、CD38、CD56、CD61、CD62e、CD62p、CD69、CD104、CD135和CD144或表达CD49d且不表达CD56的干细胞。

尽管源自脂肪组织的血管部分或分离的细胞可直接用于治疗，但另一选择为，可在培养物中扩增细胞，以使1毫升组织产生超过400,000个细胞(奥斯特(Aust)等人，2004，细胞疗法(Cytotherapy)6：1-8)。基于流式细胞计数分析，未分化的人类脂肪细胞表达独特的免疫表型，且在诱导后产生额外脂肪细胞特异性蛋白质(奥斯特等人，2004，细胞疗法6：1-8；2001，细胞生理学杂志(J.Cell Physio1.)，189：54-63；哈尔沃森(Halvorsen)等人，2001，代谢(Metabolism)50：407-413；森(Sen)，2001，细胞生物化学杂志(J.Cell.Biochem).81：312-319；朱科等人，2002，细胞分子生物学.13：4279-4295)。人类脂肪源性成体干细胞(huASC)展示多能性，且能够向脂肪细胞、软骨细胞、肌细胞、神经元和成骨细胞谱系分化(奥斯特等人，2004，细胞疗法6：1-8；2001，细胞生理学杂志，189：54-63；哈尔沃森等人，2001，代谢50：407-413；森，2001，细胞生物化学杂志81：312-319；朱科等人，2002，细胞分子生物学.13：4279-4295；阿诗基恩(Ashjian)等人，2003，整形与重建外科学(Plast.Reconstr.Surg.)，111：1922-19231；阿瓦德(Awad)等人，2003，组织工程学，9：1301-1312；阿瓦德等人，2004，生物材料(Biomaterials)25：3211-3222；哈尔沃森等人，2001，组织工程学，7：729-741；希科克等人，2004，组织工程学10：371-380；美津浓(Mizuno)等人，2002，整形与重建外科学.109：199-209；萨福德等人，2002，生物化学与生物物理学研究通讯，294：371-379；萨福德等人，2004，实验神经学(Experimental Neurology)，187：319-328；维克汉姆(Wickham)等人，2003，临床矫形学(Clin.Orthop.)，412：196-212；温特(Winter)等人，2003，关节炎与风湿病(Arthritis Rheum.)，48：418-429；朱科等人，2001，组织工程学.7：211-28)。在地塞米松(dexamethasone)、胰岛素、异丁基甲基黄嘌呤和噻唑烷二酮存在下，未分化的人类脂肪细胞经历脂肪生成，如基于流式细胞计数方法介于30％到80％之间的细胞积聚脂质空泡所证实，所述空泡可针对中性脂质用油红O染料染色(哈尔沃森等人，2001，代谢50：407-413；森等人，2001，细胞生物化学杂志，81：312-319)。

在一些实施例中，如上文所述，体细胞组织干细胞可通过分级分离使用荧光活化的细胞分选(FACS)以独特的细胞表面抗原分离用于注射到接受者中的特定干细胞亚型(例如脂肪源性干细胞)从个体的基质或间充质血管部分分离，随后在活体外扩增。如上文所述，细胞可源自打算治疗的个体或相匹配的供体。所属领域的技术人员使用标准技术和准则可容易地鉴别相匹配的供体。

分离和扩增SVFC的方法在本领域中已知且描述于(例如)美国专利第6,391,2971B1号；第6,777,231B1号；贝尔雷斯(Burris)等人.(1999)分子内分泌学(Mol Endocrino1)13：410-7；艾瑞克森等人.(2002)生物化学与生物物理学研究通讯.2002年1月18日；290(2)：763-9；格罗恩索斯(Gronthos)等人.(2001)细胞生理学杂志，189：54-63；哈尔沃森等人.(2001)代谢50：407-413；哈尔沃森等人.(2001)组织工程学.7(6)：729-41；哈珀(Harp)等人.(2001)生物化学与生物物理学研究通讯281：907-912；萨拉丁(Saladin)等人.(1999)细胞的生长与分化(Cell Growth&Diff)10：43-48；森等人.(2001)细胞生物化学杂志81：312-319；周(Zhou)等人.(1999)生物工艺与技术(Biotechno1.Techniques)13：513-517；艾瑞克森等人.(2002)生物化学与生物物理学研究通讯.2002年1月18日；290(2)：763-9；格罗恩索斯等人.(2001)细胞生理学杂志，189：54-63；哈尔沃森等人.(2001)代谢50：407-413；哈尔沃森等人.(2001)组织工程学.2001年12月7日；(6)：729-41；哈珀等人.(2001)生物化学与生物物理学研究通讯281：907-912；萨拉丁等人.(1999)细胞的生长与分化10：43-48；森等人.(2001)细胞生物化学杂志81：312-319；周等人.(1999)生物工艺与技术13：513-517；朱科等人.(2001)组织工程学.7：211-228。

SVFC可从任何动物(活着的或死亡的)获得，只要动物内的脂肪基质细胞可存活。SVFC的适宜组织来源包括(但不限于)任何含有脂肪的组织，例如，褐色或白色脂肪组织，例如皮下白色脂肪组织。通常，使用手术切除或抽吸乳房肿瘤切除术(1umpectomy)从活供体获得人类脂肪组织。在一些实施例中，从个体的预选区域获得脂肪组织，即腹股沟、腹膜后和性腺或其任一组合。

所分离的含有ADSC的组织任选地可用任何适宜的生理学上相容的溶液洗涤，例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)或生理盐水。使用例示方法时，并不需要洗涤，即可仅将超声处理棒放置到脂肪试样或脂肪吸出物中并开启超声处理装置，由此用超声空化装置处理试样。在处理之后，在解离的脂肪组织沉降之后形成三层。顶层是游离的脂质(脂肪)层。中间层包括晶格和脂肪细胞聚集体。在使经处理组合物沉降或离心后产生的底层或细胞集结粒含有基质血管部分细胞(SVFC)。

可将底层的细胞部分输注到个体中，或可通过任何适宜的方法(例如，离心)进一步浓缩成集结粒并保留以便进一步处理。如果需要，可将基质血管部分(SVF)再悬浮并可在生理学上相容的缓冲液中进一步洗涤，离心，并再悬浮一次或连续一次以上以达到较高纯度。还可将经洗涤和再悬浮的集结粒的细胞平铺。

可使用基于形态学、生物化学或分子的方法来鉴别或分离基质血管部分(SVF)中的细胞。一方面，基于细胞大小和颗粒性来分离SVFC，因为SVFC较小且无颗粒。另一选择为，由于干细胞往往比分化的细胞具有较长的端粒，因此可通过分析端粒的长度或通过分析端粒酶活性来分离SVFC。

另一选择为，可以免疫组织化学方式通过选择ADSC特异性细胞标记使用适宜的材料和方法(例如，淘选、使用磁性珠粒或亲和色谱法)将SVFC与集结粒的其它细胞分离。适宜的标记包括本申请案中揭示的任一种标记或其任一组合。

在一个实施例中，干细胞可在未分化下使用标准细胞培养基(在本文中称为对照培养基，例如，DMEM，通常补加有5-15％血清(例如，胎牛血清、马血清等))进行培养。干细胞可在此或类似培养基中在未分化下传代至少5次或甚至多于20次，以获得大体上同质的SVFC群体。SVFC可通过表型鉴别来鉴别。为在表型上分离SVFC，将细胞以任一适宜的密度平铺，所述密度可大概介于约100个细胞/cm2到约100,000个细胞/cm2之间(例如约500个细胞/cm2到约50,000个细胞/cm2，或更尤其介于约1,000个细胞/cm2到约20,000个细胞/cm2之间)。

在传代若干天之后，可使用最初以较低密度(以小于500个细胞/cm2，或另一选择为，小于约300个细胞/cm2，或另一选择为，以小于100个细胞/cm2)平铺的SVFC通过任一适宜的方法(例如通过物理挑选和将细胞接种到单独板(例如多孔板的各孔)中)来获得SVFC的克隆群体。另一选择为，可以统计学比率将干细胞亚克隆到多孔板中，以便促进将单个细胞放置到各孔中(例如，约0.1到约1个细胞/孔或甚至约0.25到约0.5个细胞/孔，例如0.5个细胞/孔)。可通过使用克隆环来促进克隆。参见麦克法兰(MacFarland)，D.C.(2000)细胞科学方法(Methods in Cell Sci.)22：63-66。另一选择为，当可利用辐照源时，可通过以下获得克隆体：容许细胞生长成单层且随后屏蔽一个细胞且辐照单层内的其余细胞。随后存活的细胞将生长成克隆群体。另一选择为，可将平铺的细胞稀释到10个细胞/ml的密度并平铺在能肯(Nunclon)96孔板(纳格南科国际(Nalge NuncInternational))上。仅对在培养阶段开始时含有单个细胞的孔针对集落形成进行分析。在4到5天之后通过显微术可检测到克隆体。

用于克隆干细胞的实例性培养条件包含约213F12培养基+20％血清(优选为胎牛血清)和已用基质细胞条件化的约113标准培养基或15％FBS、1％抗生素/抗霉菌剂于F-12/DMEM[1：1]中(例如，来自脂肪抽吸吸出物的基质血管部分的细胞，相对比例可通过测定体积来测定)。

本发明基质或间充质脂肪组织源性部分和其中含有的细胞的应用

根据本发明产生的基质和间充质血管部分和源自其的细胞具有诸多应用，包括用于重建和美学整形手术以及疗法中，尤其干细胞和源自其的分化的细胞具有临床或美学功效的适应症。由于标的方法避免使用胶原酶或其它对于在人类中输注不合意的物质，所以可直接将标的血管部分和其中含有的细胞输注到有需要的患者中。患者可为自体的，即源自相同的供体，或可将细胞输注到相容的供体中。HLA组织匹配细胞输注到患者中的方法在本领域中已熟知。

例如，所述血管细胞部分可单独或与组织填充物(例如乔雅登(Juvederm))或骨架或基质组合投与，用于促进组织再生或重建，例如，乳房或其它癌症重建手术、足部手术、隆乳术、阴茎植入物、面部填充物、关节或软骨手术、颈部手术等。

另外，标的血管细胞部分和源自其的干细胞可用于美容组合物中，用于局部应用到皮肤以实现回春且改善光泽，减少皱纹等。

另一选择为，可将根据本发明产生的间充质或基质血管部分纯化成所需细胞类型，例如间充质或基质干细胞的纯群体，且使用所属领域的技术人员熟知的细胞培养方法在活体外繁殖这些细胞。如本文中所讨论，所属领域的技术人员传统上通过FACS和其它细胞分选方法基于特征标记的表达将干细胞与其它细胞分离。

可将所得的纯化干细胞注射到所需器官中以实现组织修复，例如在心脏病发作之后注射到心肌中以实现心肌修复；注射到脑或脊髓液中以实现神经(neural或nerve)再生，例如帕金森患者(Parkinson’s patient)或阿兹海默患者(Alzheimer’s patient)；注射到有需要的个体的骨或软骨中，例如患有年龄、劳动或疾病相关的骨或软骨损失的个体。

另一选择为，可在产生所需细胞谱系的条件下培养这些纯化的干细胞。例如，包含在标的部分中的间充质和基质干细胞可分化成所需细胞类型，包括成纤维细胞、神经细胞、造血细胞、肌细胞、软骨细胞和其它细胞类型。另外，可将这些细胞类型(例如，成纤维细胞群体)接种在骨架上，其可用于伤口愈合。

在另一实施例中，本发明可包括用于从脂肪组织分离和浓缩适用于再输注到个体中的临床上安全的再生细胞的自动化系统。用于根据本发明从脂肪组织分离和浓缩细胞的系统可包括以下中的一者或一者以上：收集室、处理室、废弃物室、输出室和试样室。各个室经由一条或一条以上导管耦联在一起，由此含有生物材料的流体可在封闭的或功能上封闭的无菌流体/组织路径中从一个室通到另一个室，这使组织、细胞、生物和非生物材料的污染物暴露降到最低。在某些实施例中，废弃物室、输出室和试样室是可选的。在优选实施例中，所述系统含有临床上不相关的量的内毒素。所述系统还包括多个过滤器。过滤器有效地将干细胞和/或祖细胞与在脂肪组织试样的超声处理空化之后可存在于溶液中的尤其胶原、游离脂质、脂肪细胞分离。在一个实施例中，过滤器组合件可包括中空纤维过滤装置。在另一实施例中，过滤器组合件包括渗透过滤装置，其可或可不与沉降过程一起使用。在另一实施例中，过滤器组合件可包含离心装置，其可或可不与淘洗装置和过程一起使用。在再一实施例中，所述系统可包含这些过滤装置的组合。过滤功能可为双重的，其中一些过滤器用以从最终浓缩物移除例如胶原、游离脂质、游离脂肪细胞等物质且其它过滤器用于浓缩最终产物。

在其它实施例中，系统的一种或一种以上组件是自动化的且包括内部处理装置和可控制许多处理功能的相关软件程序。系统的组件可为可弃式的，由此系统的各部分可在使用一次后丢弃。所述系统还包含可再使用的组件，其包括处理装置(计算机和相关软件程序)和其它组件(例如电动机、泵等)。

在一个实施例中，治疗患者的方法包括以下步骤：a)提供组织移除系统；b)使用组织移除系统从患者移除脂肪组织，所述脂肪组织具有一定浓度的干细胞；c)通过使用超声处理将至少一部分脂肪组织处理足以爆破全部或大部分脂肪细胞且将间充质和基质血管细胞释放到适宜的流体介质(例如磷酸盐缓冲盐水溶液)中的时间；d)使经处理的溶液沉降，由此脂肪上升到溶液的顶部且移除脂肪，以便获得与处理之前脂肪组织的再生细胞的浓度不同的含有再生细胞的浓缩的间充质或基质血管部分，其中所述处理在无菌封闭的或功能上封闭的系统内发生；和e)将浓缩的再生细胞投与患者，由此治疗患者。

在某些实施例中，将活性细胞群体直接投与到患者中。换句话说，将活性细胞群体(例如，间充质或基质血管部分中含有的干细胞和/或内皮前体细胞)在投与患者之前不从系统移除或暴露于系统的外部环境下投与患者。提供封闭系统降低了投与患者的材料受污染的可能性。因此，在封闭系统中处理脂肪组织提供优势，因为活性细胞群体更可能为无菌的。在所述实施例中，干细胞和/或内皮前体细胞暴露于外部环境或从系统移除的唯一时刻是在取出细胞使其进入施加装置中且投与患者时。在一个实施例中，施加装置也可为封闭系统的一部分。因此，在这些实施例中使用的细胞未经处理进行培养或冷冻保存。

已如上文所述经浓缩的活性细胞可不经进一步处理而投与患者，或可在与其它组织或细胞混合之后投与患者。在某些实施例中，将浓缩的活性细胞(例如，干细胞或内皮前体细胞)与一种或一种以上未以类似方式经处理的脂肪组织单元混合。因此，通过实践本发明方法，可将包含活性细胞浓度增强的脂肪组织的组合物投与患者。各种脂肪组织单元的体积可不同。例如，一种体积可比另一脂肪组织单元的体积大至少25％。而且，一种体积可比另一脂肪组织单元的体积大至少50％，例如至少100％，且甚至150％或150％以上。另外，所需组合物可通过将具有浓缩的活性细胞群体(其可为含有活性细胞的细胞集结粒)的第一脂肪组织单元与一种或一种以上其它脂肪组织单元混合来获得。在某些实施例中，这些其它单元将不具有增加浓度的干细胞，或换句话说，其活性细胞的浓度小于第一脂肪组织单元中含有的活性细胞的浓度。在其它实施例中，所述单元中的一者是含有(例如)增加浓度的活性细胞的冷冻保存的材料。

在其它实施例中，将至少一部分活性细胞群体存储用于稍后的植入／输注。可将所述群体分成一份以上等分试样或单元，以使干细胞和／或内皮前体细胞群体的一部分保留用于稍后的应用，而一部分立即应用于患者。全部或一部分细胞在细胞库中存储中等时间到长期也在本发明的范围内。在所述实施例中，可使细胞与一种或一种以上新鲜或保藏脂肪组织的单元混合，以便提供与处理之前的脂肪组织单元相比含有较高浓度干细胞的组合物。

在处理结束时，可将浓缩的细胞装载到递送装置(例如注射器)中，以便通过皮下、静脉内、肌内或腹膜内技术置于接受者中。换句话说，可通过所属领域的技术人员已知的任何方式将细胞置于患者中，例如，可将细胞注射到血管中以便全身或局部递送，注射到组织(例如，心肌或骨骼肌)中，注射到真皮(皮下)中，注射到组织间隙(例如，心包膜或腹膜)中，或注射到组织(例如，尿道周位置)中，或注射到其它位置。优选实施例包括通过针或导管或通过直接手术植入与添加剂(例如预成型基质)结合进行放置。

活性细胞群体可单独或与以下物质组合应用：其它细胞、组织、组织碎片、脱矿物质骨、生长因子(例如胰岛素)或药物(例如噻格列酮(thiaglitazone)家族成员)、生物活性或惰性化合物、可吸收的塑料骨架或其它打算用于增强所述群体的递送、功效、耐受性或功能的添加剂。细胞群体还可通过插入DNA或通过置于细胞培养物中以改变、增强或补充细胞的功能的方式进行改质，以获得美容、结构或治疗目的。例如，干细胞的基因转移技术已为所属领域的技术人员所知，如以下文献中所揭示：莫思卡J.D.(Mosca，J.D.)，J.K.亨德里克斯(J.K.Hendricks)等人，(2000).“间充质干细胞作为基因递送的媒介(Mesenchymal stem cells as vehicles for gene delivery).”临床矫形学(379增刊)：S71-90，且可包括病毒转染技术，且更具体来说，与腺有关的病毒基因转移技术，如以下文献中所揭示：沃尔兹W.(Walther，W.)和U.斯坦(U.Stein)(2000).“用于基因转移的病毒载体：其在治疗人类疾病中的用途的综述(Viral vectors for gene transfer：a review of their use inthe treatment of human diseases).”药物(Drugs)60(2)：249-71，和阿斯纳保罗思T.(Athanasopoulos，T.)，S.法伯(S.Fabb)等人，(2000).“基于与腺有关的病毒的基因疗法载体：获得性疾病和遗传性疾病的特征和应用(综述)(Gene therapy vectors based onadeno—associated virus：characteristics and applications to acquired and inherited diseases(review))”，国际分子医学期刊(Int J Mol Med)6(4)：363—75。还可实施非基于病毒的技术，如以下文献中所揭示：村松T.(Muramatsu，T.)，A.中村(A.Nakamura)等人，(1998).“活体内电穿孔：非病毒基因转移到活动物组织中的有效且便利方式(综述)(In vivoelectroporation：a powerful and convenient means of nonviral gene transfer to tissues ofliving animals(Review)).”国际分子医学期刊1(1)：55—62。

一方面，可将细胞与未经处理的脂肪组织碎片混合并使用非常大的计量注射针或脂肪抽吸套管放置回接受者中。不补充经处理细胞下自体脂肪的转移是整形和重建手术中的常见程序。然而，结果不可预测，因为所转移的材料往往快速重吸收，从而导致移植物不稳定。本发明的脂肪组织源性细胞(例如，大体上耗尽成熟的脂肪细胞)可提供支持移植物长期存活和执行功能的环境。

另一方面，可将细胞群体置于接受者中并由可吸收的塑料套管(例如由大孔生物手术(MacroPore Biosurgery)公司制造，美国专利第6,269,716号和第5,919,234号)围绕。在此背景下，套管将防止肌肉和其它软组织脱垂到骨折部位中，从而容许放置的经处理脂肪组织源性细胞促进骨折修复，在此方面中，可通过补充例如促成骨蛋白生长因子或生物或人工骨架等额外组份来增强有益效应。

另一方面，可将细胞与编码促成骨生长因子的基因组合，这容许细胞作为骨愈合或融合期间生长因子的其自身来源。基因添加可通过所属领域的技术人员已知的任何技术实施，包括但不限于腺病毒转导、“基因枪”、脂质体介导的转导和反转录病毒或慢病毒介导的转导。

具体来说，当将细胞和／或含有细胞的组织投与除从中获得细胞和／或组织的患者以外的患者时，可向接受所述细胞和／或组织的患者投与一种或一种以上免疫抑制剂以降低且优选防止移植物排斥。适于本文所揭示方法的免疫抑制剂的实例包括抑制T细胞／B细胞共刺激路径的药剂，例如经由CTLA4和B7路径干扰T细胞与B细胞的偶合的药剂，如美国专利第20020182211号中所揭示。其它实例包括环孢菌素(cyclosporin)、麦考酚酸吗乙酯(myophenylate mofetil)、雷帕霉素(rapamicin)和抗胸腺细胞球蛋白。

在本发明的某些实施例中，将细胞与一种或一种以上细胞分化剂(例如细胞因子和生长因子)一起投与患者。各种细胞分化剂的实例揭示于以下文献中：吉宝J.M.(Gimble，J.M.)，C.摩根(C.Morgan)等人，(1995).“骨形态形成蛋白通过骨髓基质细胞抑制脂肪细胞分化(Bone morphogenetic proteins inhibit adipocyte differentiation by bone marrow stromalcells).”细胞生物化学杂志58(3)：393—402；列农D.P.(Lennon，D.P.)，S.E.海因斯沃斯(S.E.Haynesworth)等人，(1995).“一种化学界定培养基支持大鼠骨髓源性间充质干细胞的活体外增殖并保持其骨软骨潜力(A chemically defined medium supports in vitroproliferation and maintains the osteochondral potential of rat marrow-derived mesenchymalstem cells).”实验细胞研究(Exp Cell Res)219(1)：211—22；马任达M.K.(Majumdar，M.K.)，M.A.西得(M.A.Thiede)等人，(1998).“骨髓源性间充质干细胞(MSC)和基质细胞的培养物的表型和功能比较(Phenotypic and functional comparison of cultures of marrow-derivedmesenchymal stem cells(MSCs)and stromal cells).”细胞生理学杂志176(1)：57—66；卡边A.I.(Capian，A.I.)和V.M.戈德堡(V.M.Goldberg)(1999).“骨骼组织的组织工程再生的原理(Principles of tissue engineered regeneration of skeletal tissues).”临床矫形学(367增刊)：S12-6；大串H.(Ohgushi，H.)和卡边A.I.(1999).“干细胞技术和生物陶瓷学：从细胞到基因工程(Srem cell technology and bioceramics：from cell to gene engineering).”生物医学材料研究杂志(J Biomed Mater Res)48(6)：913—27；皮腾吉M.F.(Pittenger，M.F.)，A.M.迈克(A.M.Mackay)等人，(1999).“成人间充质干细胞的多谱系潜力(Multilineagepotential of adult human mesenchymal stem cells).”科学(Science)284(5411)：143—7；卡边A.I.和S.P.布鲁德(S.P.Bruder)(2001).“间充质干细胞：2l世纪分子医学的构造单元(Mesenchymal stem cells：building blocks for molecular medicine in the21st century).”分子医学趋势(Trends Mol Med)7(6)：259—64；福田K.(Fukuda，K.)(2001).“从间充质干细胞发育再生心肌细胞以用于心血管组织工程(Development of regenerative cardiomyocytesfrom mesenchymal stem cells for cardiovascular tissue engineering).”人工器官(ArtifOrgans)25(3)：187—93；沃斯特A.A.(Worster，A.A.)，B.D.布朗-托兰(B.D.Brower-Toland)等人，(2001).“依序暴露于单层中的转化生长因子-β1和三维基质中的胰岛素样生长因子-I的间充质干细胞的软骨细胞分化(Chondrocytic differentiation of mesenchymal stem cellssequentially exposed to transforming growth factor-betal in monolayer and insulin-likegrowth factor-I in a three-dimensional matrix).”矫形研究杂志(J Orthop Res)19(4)：738—49；朱科P.A.(Zuk，P.A.)，M.朱(M.Zhu)等人，(2001).“来自人类脂肪组织的多谱系细胞：基于细胞的疗法的暗示(Multilineage cells from human adipose tissue：Implicationsfor cell-based therapies).”组织工程学7(2)：211—28；和美津浓H.(Mizuno，H.)，P.A.朱科(P.A.Zuk)等人，(2002).“人类经处理的脂肪吸出物细胞的肌性分化(Myogenicdifferentiation by human processed lipoaspirate cells).”整形与重建外科学(Plast ReconstrSurg)109(1)：199—209；讨论210-1。

可通过向患者投与干细胞和／或内皮前体细胞来治疗多种疾病，包括(且不限于)骨相关病症、疾病或损伤，包括骨折迟缓连接／不连接、骨质疏松症(年龄相关性或化学疗法诱导的)、遗传性骨疾病(成骨不全)；脂肪相关病症或疾病；肝相关疾病、病症或损伤，包括肝衰竭、乙型肝炎和丙型肝炎；心肌梗塞，包括心脏病发作或慢性心力衰竭；肾疾病或肾损害；视网膜疾病或损害或坏死；伤口愈合(例如，由手术或糖尿病性溃疡引起)；创伤性和遗传性骨骼肌病症；创伤性和自体免疫性软骨和关节修复；肺损伤；糖尿病；肠病症；神经系统病症、疾病或损伤，例如中枢神经系统病症、疾病或损伤，包括脊髓损伤、帕金森氏病(Parkinson’s disease)、阿兹海默氏症(Alzheimer's disease)和中风。

细胞或含有其的组合物可另外进一步含有额外医药或药剂，或另一选择为编码治疗剂或抑制性核酸的多核苷酸。核酸的实例包括核酶、反义寡核苷酸、双链RNA、双链干扰RNA(iRNA)、三螺旋RNA、RNA适体和结合基因产物且抑制其活性的抗体分子的至少一部分。

本发明涵盖标的脂肪源性基质或间充质血管部分或从其纯化或源自其(例如通过诱导的分化)的干细胞和内皮前体细胞的任一已知使用。具体来说，本发明涵盖以下如下文所讨论的专利参考文献中所述的本发明细胞的使用。

例如，比尼特(Binette)等人的美国专利第7,875,296号教示可含有干细胞的用于修复或增大组织缺陷或损伤位点的适合的组织植入物。所述组织植入物含有包含多种生物相容性、生物可吸收颗粒的组织载体基质和至少一种与颗粒结合的组织碎片。

克劳普(Kropp)的美国专利第7,875,276号教示使用基质细胞来修复个体的受损害泌尿道组织。

美国专利第7,625,581号教示在植入身体中时适用于修复和／或再生肌肉骨骼组织的组织骨架中使用干细胞和内皮前体细胞。

比尼特的美国专利第7,316,822号还教示一种组织修复植入物，所述植入物包含：包含多种生物相容性、生物可吸收颗粒的组织载体基质和至少一种与组织载体基质结合的组织碎片，所述至少一种组织碎片具有有效量的可存活细胞，所述细胞可从组织碎片迁移出来并定殖在组织载体基质，其中所述组织载体基质呈可注射悬浮液的形式，且其中所述颗粒的平均最大外径在约150μtm到约600μtm的范围内。

比努替(Benutti)等人的美国专利第7299805号教示将干细胞或内皮前体细胞植入患者身体中的方法，所述方法包含以下步骤：提供支撑结构，从细菌收获基于多糖的经改质生物被膜，用所述基于多糖的经改质生物被膜将用于植入的可存活细胞附着到所述支撑结构，和将患者身体中的血管的一部分与所述支撑结构的第一部分连接，并将患者身体中的血管的另一部分与所述支撑结构的第二部分连接。

布朗(Brown)等人的且颁予爱惜康(Ethicon)的美国专利第7,192,604号教示一种含有纤维性基质的可植入的生物可降解装置，所述纤维性基质是由纤维A和纤维B构造，其中纤维A比纤维B生物降解得快速，纤维A和纤维B以相对量存在且经组织化(organized)，以使纤维性基质具有可用于哺乳动物组织修复和／或再生的性质，且所述纤维性基质可含有间充质或基质干细胞或内皮前体细胞。

威尔金森(Wilkinson)等人的且颁予亚提索(Artecel)公司的美国专利第7,078,230号教示从脂肪组织源性基质细胞生成的多能干细胞的用途，所述基质细胞已经诱导而表达神经元、星形胶质细胞、造血祖细胞或肝细胞中的至少一种表型特征，以及所述干细胞在疗法或组织重建中的用途。

哈尔沃森的且颁予亚提索公司的美国专利第7,033,587号、第6,841,150号和第6,429,013号教示用于引导在活体外培养的脂肪源性基质细胞分化成软骨细胞谱系的细胞的方法和组合物。这些专利还教示使用分化的软骨细胞来治疗性治疗多种人类病况和疾病，包括揭示的活体内软骨修复。

亚伯拉罕(Abraham)等人的且颁予器官形成(Organogenesis)的美国专利6,986,735教示制造生物可重塑移植物假体的方法，所述移植物假体由源自动物来源的清洁的组织材料制备。使用保持经处理组织基质的细胞相容性、强度和生物可重塑性的方法来制备本发明的生物工程移植物假体。所述生物工程移植物假体在哺乳动物宿主中用于植入、修复或使用。这些假体可含有间充质或基质干细胞或内皮前体细胞。

此外，格林堡(Greenberger)的美国专利第6,991,787号教示基质细胞的用途，所述基质细胞用于基因疗法中。

巴罗夫斯基(Barofsky)的美国专利第7011328号教示使用原弹性蛋白、优选交联原弹性蛋白实现身体组织的一部分的修复或替代或支撑所述身体组织的一部分的方法，且具体来说，提供适宜用作支架(例如，血管支架)或用作导管替代、用作动脉、静脉或输尿管替代的原弹性蛋白生物材料。所述原弹性蛋白生物材料本身还可用作支架或导管覆盖物或涂层或衬里，且可包含间充质或基质干细胞或内皮前体细胞。

阿特曼(Altman)等人的且颁予组织再生(Tissue Regeneration)公司和塔夫茨大学理事(Trustees of Tufts College)的美国专利第6,902,932号描述或提供一种新颖的基于丝纤维的基质，其具有钢丝绳几何结构且用于产生韧带或腱，尤其前交叉韧带，以离体植入有需要的接受者中，所述基质可接种有在基质上增殖和分化的多能细胞以离体形成韧带或腱。还揭示包含基于丝纤维的基质的生物工程韧带，所述基质接种有在基质上增殖和分化的多能细胞以形成韧带或腱。

吉宝(Gimble)等人的且颁予亚提索科技(Artecel Sciences)公司的美国专利第6,555,374号教示用于使来自脂肪组织的基质细胞分化成支持造血的基质细胞以及骨骼肌和平滑肌类型的肌细胞的组合物。通过所述方法产生的细胞可用于提供用于移植和研发用以治疗人类疾病和创伤性组织损伤修复的组织工程产物的完全分化的功能细胞的来源。

阿特曼等人的美国专利第6,287,340号教示通过以下方式离体产生的前交叉韧带：在三维基质中接种多能干细胞，通过附着到两个锚状物锚固接种的基质，且在基质内在适合细胞生长和再生的条件下培养细胞，同时经由移动所附着的锚状物中的一者或二者使基质经受一种或一种以上机械力。

瑙顿(Naughton)的美国专利第6,284,284号教示含有天然人类细胞外基质的组合物，所述基质可含有脂肪源性细胞，所述组合物用于使用天然人类细胞外基质通过注射修复皮肤缺陷。

瑞特(Ritter)等人的且颁予柏利康(Polyheal)有限公司的美国专利第6,086,863号教示可包含脂肪源性多能细胞的微球体的治疗性组合物，所述组合物用于施加到伤口和／或损伤以加速伤口愈合和肌肉再生。

巴里安(Balian)等人的且颁予肌肉骨骼研发企业(Musculoskeletal DevelopmentEnterprises)的美国专利第6,082,364号教示脂肪源性多能干细胞样细胞的用途，其用于全身投与来治疗骨质疏松症、骨质溶解，改善骨植入物粘着，增加骨生长或骨修复，增加软骨修复以及增加脂肪产生(例如，用于隆乳术)等。

美国专利第6,022,743号、第5,858,721号、第5,842,477号和第5,785,964号(全部为瑙顿等人的且颁予先进组织科学(Advanced Tissue Sciences)公司)教示一种基于基质细胞的三维细胞培养系统，所述系统可用于在活体外在较长的时间段内培养各种不同的细胞和组织。这些专利教示使用此三维培养来形成管状组织结构，例如胃肠道和泌尿生殖道中的那些，以及血管；用于疝修复的组织和／或腱和韧带等。

普尔基奥(Purchio)等人的美国专利第5,902,741号涉及在三维培养中在活体外使用TGF-β在含有基质细胞的培养基中刺激各种不同的细胞和组织增殖以及合适细胞成熟的方法，包括(但不限于)在TGF—β存在下在三维框架上接种并生长的软骨细胞、软骨细胞祖细胞、成纤维细胞、成纤维细胞样细胞。此三维系统容许增殖细胞成熟且适当地隔离以形成与活体内对应物类似的成体组织组份。

斯利夫卡(Slivka)等人的美国专利第5,478,739号也描述一种三维细胞培养系统，其中使基质细胞在三维基质上生长，同时在代谢有利的条件与代谢不利的(但非细胞毒性)条件之间循环培养且产生更接近地类似天然存在的组织的总体结构。

康(Kang)等人的美国专利第7,807,461号涉及人类脂肪组织源性多能成体干细胞，所述细胞可通过形成球体在未分化的状态保持较长时间段且具有高增殖速率，以及分离和保持成体干细胞的方法，以及使所述多能成体干细胞分化成神经细胞、脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞和释放胰岛素的胰腺β-细胞的方法。而且，他们还教示所述干细胞用于治疗骨关节炎、骨质疏松症和糖尿病以及用于形成乳房组织的用途，其含有分化的细胞或成体干细胞。

美国专利第7,771,716号、第7,651,684号、第7,585,670号、第7,514,075号和第7,470,537号(全部为亨德里克(Hedrick)等人的且颁予塞特瑞治疗(Cytori Therapeutics)公司)描述存在于脂肪组织中的再生细胞治疗患者(包括患有肌肉骨骼疾病或病症的患者)的用途。治疗患者的方法包括处理脂肪组织以将浓缩量的从脂肪组织获得的再生细胞递送给患者。所述方法在封闭系统中实施，由此干细胞在投与患者之前未暴露于外部环境。

美国专利第7,687,059号、第7,501,115号和第7,473,420号(全部为弗雷泽(Fraser)等人的且颁予塞特瑞治疗公司)教示存在于经处理的脂肪吸出物组织中的干细胞和其它细胞治疗患者的用途。揭示治疗患者的方法，所述方法包括处理脂肪组织以将浓缩量的从脂肪组织获得的干细胞递送给患者。

罗德里格斯(Rodriguez)等人的且颁予加利福尼亚大学董事会(The Regents of theUniversity of California)的美国专利第7,531,355号描述经纯化或分离的脂肪源性干细胞(SVFC)群体，其可分化成平滑肌源性(leiomyogenic)谱系(例如，平滑肌或骨骼肌)细胞或分化成选自由下列组成的群组的谱系：成骨谱系、脂肪形成谱系、软骨形成谱系、肌源性谱系和神经元。他们描述使用有效量的细胞，将所述细胞施加到需要治疗的部位或组织(例如，膀胱)。另外，对于总组织取代，教示使用PLGA、PCL或其它材料的三维骨架。这些骨架可接种有SVFC或分化成平滑肌的SVFC或PCL细胞以及重建的组织。

艾尔特(Alt)的且颁予塞克铁克GmbH(SciCoTec GmbH)的美国专利第7,452,532号教示使用干细胞修复患者身体中的选自心脏、脑、肝、胰脏、肾、腺和肌肉的器官的组织的方法，所述干细胞经由指定的天然身体血管经管腔内施加。

康可乐(Konkle)等人的美国专利第7,078,232号教示基于在临床背景下脂肪组织源性成体干细胞修复关节软骨骨折或缺陷且具体来说治疗关节软骨骨折的用途的细胞、方法和组合物。

卡茨(Katz)等人的美国专利第6,777,231号描述脂肪源性干细胞和品格。一方面，他们提供大体上不含脂肪细胞和红细胞的脂肪源性干细胞以及结缔组织干细胞的克隆群体。

具体来说，本发明提供大体上不含脂肪细胞的脂肪源性干细胞，且包括与组织填充物一起使用或代替组织填充物进行治疗，治疗龈退缩、骨损失(包括颌)、治疗矫形问题、治疗关节炎、治疗偏头痛、治疗多发性硬化、治疗孤独症、治疗糖尿病、治疗伤口、治疗溃疡、治疗COPD、治疗足底筋膜炎、治疗回旋肌套和治疗网球肘。

通过以下实例进一步描述本发明。

材料和方法

使用以下实验室方案处理脂肪组织(例如，如实例中所教示从患者收集)并从脂肪组织获得含有干细胞的基质血管部分。应了解，所述方案是例示性的且所属领域的技术人员可修改细节以进一步优化。使用此方案，本发明的发明者已处理数百份试样且具有一贯优良的结果。如本文中所揭示且通过密理博研究证实(参见图1A-E、2A-E、3A-E、4A-E和5A-E)，标的超声处理方案产生的可存活细胞是用胶原酶处理的相当脂肪试样的约10倍。此外，本发明方法产生与胶原酶分离程序相同的细胞群体和细胞类型，从而表明本发明方法保持全部所需基质血管部分细胞且尤其本文中所鉴定的细胞类型的完整性。

用于超声空化和处理来自脂肪的干细胞的本发明方案

组织

在程序之前3分钟开启层流罩。

给层流罩装配无菌的可弃式遮盖物和管。

开启密理博瓜瓦(Millipore Guava)并检查软件。

检查层流罩上的计量器(Gauge)。

将14号探针附接到超声机并用扳手使其紧固以固定就位。

将脂肪登记到瓜瓦流式细胞仪计算机中。

确保所有管都清楚地标记上名称和日期!

计时器以10min预设值来使用。

将探针放置到脂肪中(确保探针不触及塑料)

在将探针浸没到含有脂肪的注射器中之后缓慢增加循环和振幅，直到达到0.9个循环和90％的振幅为止；

5min后，停止超声过程并将探针提高到注射器上40cc的水平；检查试样并确保不溢出；

从超声装置移除样本并将内容物倾倒到红顶无菌圆锥形样本管中用于过滤；

等量分到两个红顶无菌圆锥形样本管中，随后添加等量的0.9％氯化钠；

将两份样本在500rpm下离心3min。

当旋转结束时，将获得分层的且液体在底部(具有集结粒)且脂肪在顶部的样本。

使用20cc注射器和金属输注套管附件(脊髓穿刺针)，浸没到样本管的底部并移除包括集结粒的液体干细胞溶液；(从此试样取出大约2cc液体用于用Fluocitometer进行测试)。

用密理博流式细胞仪测试试样。

将试样SVF吸移到样本管中。

将瓜瓦试剂(Guava reagent)吸移到试样中并混合。

将试样放置到黑暗中保持5-20分钟。

将试样放置到流式细胞仪中。

运行瓜瓦软件程序

记录所有结果

将生物废弃物丢弃到生物废弃物容器中

用抗菌剂清洁层流罩并随后用抗微生物擦拭巾清洁

按照方案清洁所有仪器和高压灭菌器。

当处理所有样本和管时，始终使用优良的层流罩方案

实例

实例1从人类供体制备脂肪组织

方法1：通过脂肪抽吸制备含有脂肪组织的吸出物

将过量(超过在脂肪抽吸操作之前打算吸出的脂肪抽吸量)的肿胀溶液(含有0.0001％肾上腺素的盐水)输注到皮下脂肪层中(肿胀方法)，且然后使用内径为2-3mm的套管(由金属制造，带有吸出器)进行脂肪抽吸操作。脂肪抽吸操作在本领域中已熟知，且例如在Biyo Seikei Shujutsu规范2(美容手术规范2(Cosmetic Operation Practice2))，市田胜成(Masanari ICHIDA)、谷野作太郎(Ryusaburo TANINO)和嘉明保坂(Yoshiaki HOSAKA)编辑，由分光堂(BUNKODO)出版，第429-469页中提及，所述文献的全部内容以引用的方式并入本文中。

用盐水洗涤吸出的脂肪。生成约5-10升经洗涤的吸出物，且使用所得的脂肪组织源性细胞材料获得基质血管部分。

方法2：通过手术制备脂肪组织

通过手术从已给出知情同意的人类个体获得脂肪组织。用本领域中熟知的技术实施分离。简单来说，在无菌条件下从抽吸自己给出知情同意的人类个体的脂肪组织分离人类脂肪组织。使用所得的脂肪组织源性细胞材料获得基质血管部分。

实例2

由脂肪抽吸的吸出物制备干细胞悬浮液

将从脂肪抽吸吸出物获得的或如先前实例中所述以手术方式获得的脂肪组织置于适宜的管和视需要生物溶液(例如，磷酸盐缓冲盐水溶液或生理盐水溶液)中，并将组合物中的脂肪组织与超声空化装置的超声探针接触放置，如上文材料和方法部分中所述。

具体来说，将振幅设定为约50-100％，通常为约100％，循环为1.0，并将约30-60cc脂肪吸出物置于管中，所述管的大小为60cc，直径为28mm且长度为110mm，并通过超声空化处理约10min，且随后在5分钟后使用14mm超声棒向上调整。

对于约45-60cc的脂肪组织，装置可设定为约50-100％强度和约10-100％频率，保持约5-60分钟。此处理爆破脂肪细胞且由此将基质血管部分释放到生物溶液(例如，磷酸盐缓冲盐水或生理盐水)中。如前所述，此处理不包括添加胶原酶或预期分解胶原的等效酶，因为细胞解离会伴随超声处理而完成。

优选地，在超声处理之后，使所得溶液随时间沉降或通过离心进行处理。脂肪将漂浮到顶部。此溶液将在底部含有包括脂肪源性干细胞、内皮细胞前体和其它细胞的基质血管部分，且此部分未被外源酶(例如胶原酶)污染。

可弃除含有脂肪的上清液。另外，因为所需细胞也可漂浮，所以可使用吸出器在不损坏细胞下小心地实施抽吸。

实例3

回收的干细胞的表征

通过已知方法(例如，流式细胞术或FACS)使用(例如)检测间充质和基质脂肪源性干细胞上表达的标记的抗体来表征使用上文方案在实例2中回收的含有干细胞的基质血管部分。这些方法将检测可存活干细胞的存在。

应了解，本文中揭示的方案是例示性的且所属领域的技术人员可修改细节以进一步优化。使用上文材料和方法部分中所报告的具体方案，申请者已处理超过200份试样且具有一贯优良的结果。自此产生的干细胞已用于治疗患者。另外，申请者已比较根据本发明获得的含有干细胞的细胞试样与通过常规程序获得的试样(胶原酶源性试样)。更具体来说，将根据本发明产生的脂肪源性干细胞试样与在由密理博实施的研究中获得的试样进行比较。所述比较表明，本发明的超声空化程序产生相同的细胞群体。出乎意料地，本发明程序更加高效，即，对于相同量的脂肪，其一贯产生的细胞数量约为10倍。

因此，所属领域的技术人员将容易地发现本发明在医药和美容工业等中的工业应用性。

Claims

1.一种从脂肪组织中含有的或邻近所述脂肪组织的血管回收基质或间充质血管部分的方法，所述方法包含在一定条件下用超声空化处理含有脂肪组织的试样，在所述条件下所述试样中的脂肪细胞和血管经爆破或溶解，由此从所述经超声处理的脂肪组织中含有的所述经溶解血管解离或释放大量完整的基质血管或间充质血管细胞，同时大体上维持构成所述基质或间充质部分的所述细胞的生存力。

2.根据权利要求1所述的方法，其不包括添加分解胶原的酶。

3.根据权利要求1所述的方法，其不包括添加胶原酶或其它内肽酶。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述脂肪组织是人类或非人类哺乳动物来源。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述脂肪组织是从供体身体的基质或间充质室或脂肪抽吸源性吸出物获得。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述脂肪组织是从人类尸体或活供体获得的固体脂肪。

7.根据权利要求1所述的方法，其包括使用超声空化装置。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述装置具有放置到所述脂肪组织中的探针。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述脂肪组织包含在磷酸盐缓冲盐水、生理盐水或另一生物学上可接受的液体中。

10.根据权利要求1所述的方法，其中超声空化实施约1分钟到约8小时。

11.根据权利要求1所述的方法，其中用于实施超声处理的所述超声空化装置上的振幅设定为约75％到100％且所述脂肪组织的超声处理实施约1分钟到20分钟。

12.根据权利要求1所述的方法，其中用于实施超声处理的所述超声空化装置上的所述振幅设定为约90％振幅且超声处理实施约5分钟到10分钟。

13.根据权利要求1到12中任一权利要求所述的方法，其中所使用的所述超声空化装置是Vibra-Cell^TM装置、HIELSCHER SONIC200、SONIC200或相当的高强度超声处理器或空化装置。

14.根据权利要求1到13中任一权利要求所述的方法，其中所述脂肪试样包含约5cc到200cc的脂肪组织。

15.根据权利要求1到13中任一权利要求所述的方法，其中所述脂肪试样包含约30cc到60cc的脂肪组织。

16.根据权利要求1到13中任一权利要求所述的方法，其中所述脂肪试样包含约45cc的脂肪组织。

17.根据权利要求11到13中任一权利要求所述的方法，其中对于每45cc的脂肪组织在所述条件下实施超声空化约5分钟到约10分钟。

18.根据权利要求1到17中任一权利要求所述的方法，其中在超声空化之后使所得组合物沉降或离心，从而使脂肪上升到所述试样的顶部。

19.根据权利要求1到18中任一权利要求所述的方法，其中在超声空化之后从所述试样分离间充质或基质干细胞。

20.根据权利要求1到19中任一权利要求所述的方法，其中在超声空化之后针对脂肪源性干细胞的存在分析所述试样，所述干细胞包括表达CD34和/或Thy-1或CD90的干细胞。

21.根据权利要求20所述的方法，其中此举是通过流式细胞术实施。

22.根据权利要求1到19中任一权利要求所述的方法，其中在超声空化之后使用荧光活化的细胞分选FACS基于对脂肪源性干细胞具有特异性的细胞表面抗原对所述试样进行分级分离。

23.根据权利要求21、21或22所述的方法，其中在培养物中扩增所得分离的脂肪源性干细胞。

24.根据权利要求20到23中任一权利要求所述的方法，其中将所述所得分离的脂肪源性干细胞输注到患者中。

25.根据权利要求1到23中任一权利要求所述的方法，其中所回收的细胞包括以下中的任一者或全部：内皮细胞、内皮祖细胞、间充质干细胞、巨噬细胞、树突细胞、库普弗细胞、血小板、粒细胞、B或T细胞、NK细胞、淋巴细胞、巨核细胞、嗜中性粒细胞、破骨细胞、嗜中性细胞。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述基质血管部分或其中含有的或源自其的干细胞或任何细胞用于美容手术应用中，用以促进伤口愈合，用于组织填充物中或与隆乳术或重建术、组织工程或烧伤治疗结合使用。

27.一种源自脂肪组织的基质血管部分，其是通过根据权利要求1到23中任一权利要求所述的方法制备，其不包含任何外源胶原酶。

28.根据权利要求27所述的基质血管部分，其含有表达至少一种选自由下列组成的群组的蛋白质的干细胞或其它细胞：CD13、CD29、CD34、CD36、CD44、CD49d、CD54、CD58、CD71、CD73、Thy-1或CD90、CD105、CD106、CD151和SH3。

29.根据权利要求27所述的基质血管部分，其含有表达以下中的至少一者的干细胞或其它细胞：CD13、CD29、CD34、CD36、CD44、CD49d、CD54、CD58、CD71、CD73、CD90、Thy-1或CD105、CD106、CD151和SH3或其任一组合。

30.根据权利要求27所述的基质血管部分，其含有表达至少一种选自由下列组成的群组的蛋白质的干细胞：CD31、CD45、CD117和CD146。

31.根据权利要求27所述的基质血管部分，其含有不表达CD56的干细胞。

32.根据权利要求27所述的基质血管部分，其含有不表达至少一种选自由下列组成的群组的蛋白质的干细胞：CD3、CD4、CD14、CD15、CD16、CD19、CD33、CD38、CD56、CD61、CD62e、CD62p、CD69、CD104、CD135和CD144。

33.根据权利要求27所述的基质血管部分，其含有不表达CD3、CD4、CD14、CD15、CD16、CD19、CD33、CD38、CD56、CD61、CD62e、CD62p、CD69、CD104、CD135和CD144的干细胞。

34.根据权利要求27所述的基质血管部分，其含有表达CD49d且不表达CD56的干细胞。

35.根据权利要求1到23中任一权利要求所述的方法，其中将超声空化中所使用的探针放置到含有所收集的脂肪组织试样的容器中，且在将所述探针浸没到所述含有脂肪的容器(注射器)中之后通过缓慢增加循环和振幅来实施超声空化，直到其达到0.9个循环和90％的振幅为止。

36.根据权利要求35所述的方法，其中在约5min之后停止所述超声过程。

37.根据权利要求35或36所述的方法，其中在超声处理之后将样本吸移到样本管中用于过滤。

38.根据权利要求36或37所述的方法，其中将所述试样分成两部分，向其中添加等量的0.9％氯化钠。

39.根据权利要求38所述的方法，其中将这些样本离心，从而产生分层的试样，其中液体位于底部(具有集结粒)且脂肪位于顶部。

40.根据权利要求39所述的方法，其中在500RCM下实施离心约3min。

41.根据权利要求39或40所述的方法，其中从所述离心的试样分离所述基质干细胞。

42.根据权利要求39到41中任一权利要求所述的方法，其中此举是使用20cc注射器和金属输注套管附件(脊髓穿刺针)来实施，将其浸没到样本管的底部并移除包括所述集结粒的含有干细胞的液体溶液。

43.根据权利要求40或41所述的方法，其中从此试样移除大约2cc液体。

44.根据权利要求43所述的方法，其中使用所述液体用流式细胞仪进行测试。

45.根据权利要求36到44中任一权利要求所述的方法，其中使用流式细胞仪(例如，密理博流式细胞仪)来分析所述试样。

46.根据权利要求35到45中任一权利要求所述的方法，其中将所述基质血管部分SVF吸移到样本管中。

47.根据权利要求35到46中任一权利要求所述的方法，其中将瓜瓦试剂吸移到所述含有SVF的试样中并在添加之后混合。

48.根据权利要求35到47中任一权利要求所述的方法，其中将所述基质血管部分SVF放置到黑暗中保持约5分钟到20分钟。

49.根据权利要求35到48中任一权利要求所述的方法，其中将所述含有基质血管部分SVF的试样放置到流式细胞仪中。

50.根据权利要求1到49中任一权利要求所述的方法或组合物，其中所述脂肪源性细胞、其后代或源自其的细胞用于美容程序或治疗人类疾病或医学病况的疗法中。

51.根据权利要求50所述的方法，其中所述使用方法包括单独或与组织填充物组合治疗，用于治疗龈退缩、治疗骨损失(包括颌)、治疗矫形问题、治疗关节炎、治疗偏头痛、治疗多发性硬化、治疗孤独症、治疗糖尿病、治疗伤口、治疗溃疡、治疗COPD、治疗足底筋膜炎、治疗回旋肌套和治疗网球肘。