CN115011555A

CN115011555A - 使用冲击波或机械冲击分离、解离和/或裂解细胞的方法

Info

Publication number: CN115011555A
Application number: CN202210711490.0A
Authority: CN
Inventors: 约翰·奇; 雷蒙德·雷文; 马克·里奇曼; 本切恩·奇
Original assignee: Synova Life Sciences Inc
Current assignee: Synova Life Sciences Inc
Priority date: 2016-03-17
Filing date: 2017-03-17
Publication date: 2022-09-06
Also published as: EP3872164B1; BR112018068820B1; MX2018011181A; MX2021006967A; KR102419230B1; AU2023226696A1; CA3056209A1; JP2023116738A; CO2018011074A2; EP3872164A1; EP4324915A2; KR20210126154A; KR20220103186A; JP7300486B2; AU2022201872A1; BR112018068820A2; US20240076622A1; KR20190016937A; US20190071644A1; JP2022002532A

Abstract

本公开提供的方法利用体外冲击波、机械冲击和/或碎石原理将组织样品破碎成更小的细胞片段‑细胞簇和/或单一细胞‑此后可以从样品中分离出所需的细胞级分。由本公开提供的装置利用集中和/或定向的冲击波和/或集中和定向的机械冲击以分离组织样品。在暴露于冲击波或机械冲击期间，所述装置将样品维持在无菌、封闭的环境中。因此，冲击波和/或机械冲击在封闭装置外部产生，并通过装置的一个或多个壁传递到其中样品位于其内部。

Description

使用冲击波或机械冲击分离、解离和/或裂解细胞的方法

本申请是申请日为2017年3月17日、申请号为201780030309.7、发明名称为“使用冲击波或机械冲击分离、解离和/或裂解细胞的方法”的中国专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及使用冲击波或机械冲击分离、解离和/或裂解细胞的方法和装置

背景技术

细胞生物加工是生物制药生产的一种形式，其目的在于建立用于分离和/或生产治疗细胞的可再现且稳定的制造方法。

当前的细胞生产过程高度依赖于用户，需要在许多点进行人为干预。由于这种依赖性，所以当前的方法是繁琐的，高度可变的，昂贵的，并且产生低收率。

作为实例，许多当前的制造方法如下进行：从患者获得组织样本(脂肪抽吸物，全血，骨髓，脐带血等)。将获得的生物样品转移到实验室进行生物加工。在实验室中，采用细胞分离技术以获得所需的细胞级分。然后分离细胞级分并将其转移回护理点设施供患者使用，或通过导入生物反应器进一步加工以进行细胞扩增。一些已知的细胞分离方法包括通过超声空化，酶消化或其它机械方法使用机械分离，所述机械方法包括使样品与外来物(例如珠)接触以获得所需的细胞级分。酶的使用导致增加的调节顺应性负担，因为酶必须与样品直接接触以产生期望的结果。酶还可以破坏收获细胞的完整性并可能改变其性质。使用高功率超声加工同样存在缺陷。超声波仪尖端频率固定，并且必须导入细胞或组织悬液，这可能会对无菌性产生负面影响。另外，使用这类高能声波将大量能量导入样品中，这表现为热量。这会破坏细胞，从而降低可用细胞的收率。

一旦获得，将膨胀的细胞产物然后从生物反应器中移出，在那里它被纯化和浓缩。从洗涤和浓缩的细胞产品中取出测试样品用于质量测试，并且如果测试结果显示可接受的产品，则制备最终工程改造的细胞产品用于长期储存，冷冻保存，施用于样品来源的患者，或者前述的某种组合。

正如可以理解的，这些步骤中的几个需要将样品从一个容器移动到另一个容器，需要大量的用户干预，这不仅增加了加工过程中错误标记或错误加工样品的风险，而且还可能对样品的无菌性、特性、纯度或效力产生负面影响。另外，以这种方式加工样品所需的时间意味着所需的细胞级分未准备好递送给患者数小时，如果不是几天，这可能对患者的健康产生负面影响。加工细胞样本所需的受损的无菌性和不合理的长时间期限的可能性对于患者来说是不可接受的，特别是那些免疫功能低下或需要立即护理的患者，并且对于需要提供定时、高质量护理的许多患者而言也是不可接受的。

发明内容

因此，需要一种直接在护理点在短时间内获得所需细胞级分并且无需多次用户干预的优化和可扩展方法。还需要能够实施该方法的装置。本公开提供了这类的方法和装置。所公开的方法和装置消除了将细胞样品转移到实验室进行加工的需要，并且在分离期间不使细胞样品接触异物，导致加工后的样品在极短的时间期限内提供所需的细胞样品，其中几乎不与用户接触，从而允许优化昂贵的技术资源。

本文公开的装置和方法具有几个特征，其中无一特征单独负责其期望的属性。在不限制随后的权利要求的范围的情况下，将简要地讨论所公开的装置和方法的某些特征。在考虑该讨论之后，特别是在阅读了章节标题“详细描述”之后，本领域普通技术人员将理解所述装置和方法的特征如何提供优于传统系统和方法的几个优点。

在一个方面，本公开内容提供了适合于细胞样品的生物加工的完全封闭的系统，例如加工用于自体干细胞疗法的脂肪组织样品。该系统不对空气开放，因此允许在整个生物加工过程中的无菌样品加工和样品转移。

在第一方面，提供了从组织样品中分离细胞级分的方法，所述方法包括：从受试者获得组织样品；使组织样本与冲击波、机械冲击力或它们两者接触；并从组织样品中分离细胞级分；其中冲击波来源和/或机械冲击力来源不会与组织样品发生物理接触。

在一些实施方案中，所述组织选自脂肪组织，脑组织，咽组织，喉组织，心脏组织，动脉组织，肌肉组织，肝组织，胆囊组织，肾组织，小肠组织，大肠组织，淋巴结组织，肺组织，脾组织，骨髓组织，胃组织，静脉组织，胰腺组织，膀胱组织，骨，牙齿，牙本质组织，牙龈组织，皮肤组织，松果腺组织，脑垂体组织，甲状腺腺体组织，肾上腺组织，胰腺组织，卵巢组织和睾丸组织。

在一些实施方案中，所述组织是脂肪组织。

在一些实施方案中，所述组织与冲击波接触，并且冲击波来源是由冲击波发生器驱动的冲击波施加器。

在一些实施方案中，所述组织样品与机械冲击力接触，并且机械冲击力来源是由电动机驱动的冲击臂。

在一些实施方案中，将组织样品洗涤一次或多次，然后与冲击波和/或机械冲击力接触。

在一些实施方案中，冲击波将组织样品破碎成多个小细胞簇、多个单个细胞或它们两者。

在一些实施方案中，机械冲击力将组织样品破碎成多个小细胞簇、多个单个细胞或它们两者。

在一些实施方案中，所述细胞级分包含多个小细胞簇、多个单个细胞或它们两者，并且分离细胞级分通过离心进行。

在一些实施方案中，离心以500g-2,000g的速度进行3-30分钟。

在一些实施方案中，离心以1,200g进行10分钟。

在一些实施方案中，离心后重新悬浮分离的细胞级分。

在一些实施方案中，在30分钟或更短时间内分离细胞级分。

在第二方面，提供了从脂肪组织分离干细胞的方法，该方法包括：从受试者获得脂肪组织样品；将组织样品放入容器或药筒中；使组织样品经受机械冲击力以释放干细胞；将干细胞级分与脂肪组织分离；并离心干细胞级分；其中机械冲击力来源不与脂肪组织物理接触。

在一些实施方案中，将脂肪组织洗涤一次或多次，然后被施加机械冲击力。

在一些实施方案中，机械冲击力来源是由电动机驱动的冲击臂，该电动机包含能够在电动机全速运转时降低冲击臂的速度的齿轮。

在一些实施方案中，使机械冲击力通过容器或药筒的壁递送至脂肪组织。

在一些实施方案中，所述齿轮允许冲击臂中的速度从10降至1。

在一些实施方案中，电动机包含0.75英寸的齿轮直径并且在3000rpm的电动机速度下，冲击臂具有每秒117.8英寸/秒的速度。

在一些实施方案中，分离干细胞级分包括允许脂肪组织与水层分离，水层包含干细胞。

在一些实施方案中，干细胞在30分钟或更短时间内分离自脂肪组织。

在一些实施方案中，离心以500g-1,600g进行3-10分钟。

在第三方面，提供了从脂肪组织中分离干细胞的方法，所述方法包括：从受试者获得脂肪组织样品；将组织样品放入容器或药筒中；使组织样本受到冲击波以释放干细胞；将干细胞级分与脂肪组织分离；并离心干细胞级分；其中冲击波来源不与脂肪组织物理接触。

在一些实施方案中，在受到冲击波之前将脂肪组织洗涤一次或多次。

在一些实施方案中，冲击波来源是冲击波施加器，其由冲击波发生器驱动。

在一些实施方案中，冲击波通过容器或药筒的壁递送至脂肪组织。

在一些实施方案中，脂肪组织经受具有0.5至5.0巴的力的冲击波。

在一些实施方案中，容器是具有0.25mm厚的壁的乙烯系袋，并且脂肪组织经受具有2.0至2.5巴的力的冲击波。

在一些实施方案中，在任何一个时刻经受冲击波的脂肪组织的总面积为1cm²-100cm²。

在一些实施方案中，其中容器是19盎司、具有0.25mm厚的壁的乙烯系袋，脂肪组织样品的总量为30cc，并且在任何一个时刻受到冲击波的脂肪组织的总面积是5cm²。

在一些实施方案中，脂肪组织经受5,000至100,000的多个冲击波。

在一些实施方案中，离心以500g-1,600g进行3-10分钟。

附图说明

可以通过参考举出示例性实施方案的以下详细描述和附图来进一步解释本公开的特征和优点。

图1提供了根据本公开提供的实施方案从组织样品中分离细胞级分的方法的概述。

图2描绘了适用于本公开提供的系统和方法的体外冲击波装置的代表性实例。

图3描绘了适用于本公开提供的系统和方法的机械冲击装置的代表性实例。

图4描绘了适合与本公开提供的体外冲击波和/或机械冲击装置一起使用的刚性、试验本身内的药筒的第一代表性实例。在所示实施方案中，几个内部部件是柔性容器。

图5描绘了适合与本公开提供的体外冲击波和/或机械冲击装置一起使用的刚性、试验本身内的药筒的代表性实例。

具体实施方式

在描述本公开的实施方案之前，应理解，这些实施方案仅以举例的方式提供，并且本文所述的本公开的实施方案的各种替代方案可用于实施本公开。在不脱离本公开的情况下，本领域技术人员现在将想到许多变化、改变和替换。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的方法和材料可以用于本公开的实践或测试，但是下面描述了适合的方法和材料。如有冲突，专利说明书(包括定义)将加以控制。另外，材料、方法和实施例仅是示例性的而不是限制性的。在不脱离本公开的情况下，本领域技术人员将想到许多变化、改变和替换。

如说明书和权利要求书中所用，单数形式“一”(a)、“一个”(an)和“该”(the)包括复数指代，除非上下文另有明确说明。例如，术语“细胞”包括多个细胞，包括其混合物。

如本文所用，“体外冲击波”和/或“ESW”意指机械能的突然的高振幅脉冲，类似于声波，其在目标样品外部产生然后传输到该样品。在这方面，ESW的发生源不与样品进行物理接触；冲击波本身与样品接触，但发生源不会。因此，体外冲击波由距样品一定距离的源产生，然后传输到样品。传输可以通过空气和/或通过样品所在的容器的壁发生。可以集中和/或引导ESW，以便例如将ESW集中在可以覆盖整个样品或仅覆盖整个样品的一部分的目标区域中。

如本文所用，“受试者”或“患者”是指哺乳动物，例如人。

本公开提供的方法利用体外冲击波，机械冲击，振动和/或碎石原理将组织样品破碎成较小的片段-细胞簇和/或单个细胞-之后可以从样品中分离出所需的细胞级分。在不同的方面，该方法包括从受试者中分离样品，该样品包含目标细胞类型，使该样品与体外冲击波接触，但不与用于产生ESW的装置接触，以将样品破碎成细胞簇和/或单个细胞，然后从破碎的样品中分离目标细胞类型。

由本公开提供的装置利用集中和/或定向冲击波，和/或聚焦和定向机械冲击来破碎目标样品。在不同的方面，本公开提供的装置在暴露于冲击波或机械冲击期间将样品保持在无菌的封闭环境中。因此，冲击波和/或机械冲击在封闭的无菌容器外部产生，并通过容器的一个或多个壁传递到其内部，样品位于其内部。

通过将ESW来源维持在距目标样品一定距离处，ESW来源(产生它们的装置)不与样品物理接触。这极大地改善了样品和从样品中分离的任何细胞级分的无菌性。从医疗保健提供者的角度来看，这也极大地改善了对无菌的要求，并且有助于确保来自样品的目标细胞级分对于患者使用是无菌的。另外，维持ESW产生来源距离目标确保发生器不会将能量或热量添加到目标样品中，所述能量或热量可能损坏或杀死细胞，损害DNA并显著降低产量。在这方面，本公开提供的装置是对诸如超声波的其他已知系统的改进。

本公开提供的方法和装置能够快速地从组织样品中分离所需的细胞级分，在一些实施方案中，在30分钟或更短时间内。一定的速度(在此速度可以使用所公开的方法和装置)给予了显著的优点，其在于从样品中分离的所需细胞级分可以立即使用。

方法

图1呈现了根据本公开提供的实施方案从组织样品中分离目标细胞级分的方法。

在所描绘的实施方案中，该方法首先从受试者(100)提取组织开始。组织可以是任何类型，只要组织在受到体外冲击波时会破碎。在一些实施方案中，组织是脂肪组织或脂肪。在一些实施方案中，组织来自内部器官，例如脑，咽，喉，心脏，动脉，肌肉，肝脏，胆囊，肾，小肠，大肠，淋巴结，肺，脾，骨髓，胃，静脉，胰腺，膀胱，骨骼，牙齿，牙本质，牙龈或皮肤。在一些实施方案中，组织来自内分泌系统的成分，例如松果腺，垂体腺，甲状腺，肾上腺，胰腺，卵巢或睾丸。

提取可以通过许多已知方法进行。在一些实施方案中，组织提取通过注射器进行。在一些实施方案中，组织提取通过外科手术进行，使得组织样品在从受试者移除后被置于第一容器中。

然后将组织转移到加工容器或药筒105中。本公开提供的装置提供快速且易于使用的ESW细胞生物加工所需的所有组件。即使所公开的方法和/或装置的一些组件可彼此分离，它们也被配置成以完全无菌的方式彼此连接，从而允许在加工期间将样品从一个组件转移到另一个组件。在这方面，将样品整体在单一系统中加工，从而确保无菌性。

在不将样品暴露于外部环境的情况下进行无菌转移。在这方面，转移可以通过任何数量的方式进行，这些方式将保持封闭的无菌环境。在一些实施方案中，通过在包含从受试者提取的样品的第一容器与加工容器或药筒之间将公母鲁尔锁连接器(male andfemale luer lock connectors)彼此连接来实现转移。在一些实施方案中，通过使用无菌连接装置对第一容器和加工容器或药筒进行无菌对接来完成转移。将样品从第一容器以机械方式或通过重力流动转移到加工容器或药筒。

在一些实施方案中，将第一容器插入药筒并且使用无菌装置进行无菌对接，以便使得加工容器位于药筒内。作为加工室的第一容器已经包含样品。

在该方面，在本公开中，每次将组织和/或细胞样品公开为从一个容器转移至另一个容器，这类移动可以进行以便维持封闭系统的完整性，由此不使样品暴露于外部环境。

一旦样品被转移至加工容器或药筒，则将组织样品洗涤一次或多次110。洗涤可以如本文所述通过使用无菌盐水溶液进行。洗涤确保样品尽可能多地避免在加工前的杂质，由此增加从其中分离的细胞级分的纯度水平。

在一些实施方案中，通过机械搅拌加工容器或药筒进行洗涤。如果想要和/或需要多个洗涤步骤，则在单次洗涤完成后将无菌盐水从加工容器或药筒中排出，并且为每次后续洗涤将新的无菌盐水引入容器或药筒中。在这方面，每次排出无菌盐水并将新的无菌盐水引入容器或药筒中，如此处所述进行以保持封闭的无菌环境。

在洗涤之后，加工组织样品115。如所指出的，可以通过使用ESW，机械冲击，振动和剪切或其组合进行加工。

在一些实施方案中，通过ESW进行加工，并将组织样品破碎成多个小的细胞簇。在一些实施方案中，通过ESW进行加工，并将组织样品破碎成多个小的细胞簇和多个单个细胞。在一些实施方案中，通过ESW进行加工，并且将组织样品完全破碎成多个单独的细胞。

在一些实施方案中，通过机械冲击和剪切进行加工，并将组织样品破碎成多个小的细胞簇。在一些实施方案中，通过机械冲击和剪切进行加工，并将组织样品破碎成多个小的细胞簇和多个单个细胞。在一些实施方案中，通过机械冲击和剪切进行加工，并且将组织样品完全破碎成多个单独的细胞。

在一些实施方案中，通过ESW和机械冲击和剪切的组合进行加工，并且将组织样品破碎成多个小的细胞簇。在一些实施方案中，通过ESW和机械冲击和剪切的组合进行加工，并且将组织样品破碎成多个小的细胞簇和多个单个细胞。在一些实施方案中，通过ESW和机械冲击和剪切的组合进行加工，并且将组织样品完全破碎成多个单独的细胞。

在加工之后，将表示样品剩余部分的细胞悬浮液(可以是多个小细胞簇，多个单个细胞或两者)过滤并离心120。过滤可以在装置中进行，与加工容器或药筒分开，或在加工容器或药筒本身内。在一些实施方案中，过滤在单独的装置中进行，在这种情况下，细胞悬浮液通过无菌装置转移到过滤器，如本文所述。在一些实施方案中，当细胞悬浮液从容器或药筒移动到一个或多个离心管中时，进行过滤。

在一些实施方案中，通过在加工容器或药筒与过滤装置之间将公母鲁尔锁连接器彼此连接来实现向过滤装置的转移。在一些实施方案中，通过使用无菌连接装置将加工容器或药筒和过滤装置无菌对接来完成转移。将样品机械地或通过重力流动从加工容器或药筒转移到过滤装置。

在一些实施方案中，如本文所述，过滤在加工容器或药筒内部进行。

在不同的方面，在加工容器或药筒的外部进行离心。在一些实施方案中，将细胞悬浮液转移至位于加工容器或药筒内部的一个或多个离心管。当填充时，离心管通过无菌装置从加工容器或药筒移动到离心机，如本文所述。

在一些实施方案中，如本文所述，通过无菌装置将细胞悬浮液转移至位于加工容器或药筒外部的一个或多个离心管。当填充时，离心管通过无菌装置从加工容器或药筒移动到离心机，如本文所述。

离心的持续时间和速度可以根据正在加工的组织类型而变化。在一些实施方案中，将细胞悬浮液离心3至30分钟并且速度为500g至2,000g。在一些实施方案中，将细胞悬浮液以1,000g-1,800g的速度离心10-25分钟。在一些实施方案中，将细胞悬浮液以1,200g离心10分钟。在一些实施方案中，将细胞悬浮液以1,200g离心7分钟。在一些实施方案中，将细胞悬浮液以1,200g离心5分钟。在一些实施方案中，将细胞悬浮液以1,200g离心3分钟。在一些实施方案中，将细胞悬浮液以900g离心10分钟。在一些实施方案中，将细胞悬浮液以900g离心7分钟。在一些实施方案中，将细胞悬浮液以900g离心5分钟。在一些实施方案中，将细胞悬浮液以900g离心3分钟。在一些实施方案中，将细胞悬浮液以600g离心10分钟。在一些实施方案中，将细胞悬浮液以600g离心7分钟。在一些实施方案中，将细胞悬浮液以600g离心5分钟。在一些实施方案中，将细胞悬浮液以600g离心3分钟。

有许多方法可以通过离心将细胞悬浮液中存在的多种细胞类型彼此分离。例如，可以使用密度梯度，使得在离心期间，细胞将根据其特定密度分离成条带。另外，尺寸排阻方案可用于通过尺寸分离细胞。另外，可以在离心之前开始分离，例如通过在离心之前使加工过的组织样品沉淀并从所需的细胞级分中分离出不需要的细胞碎片。所用分离技术的类型可以根据要分离的所期望的细胞级分而变化。

一旦分离出所期望的细胞级分，就可以将其重新悬浮以施用于其来源的受试者125。在一些实施方案中，将所期望的细胞级分重新悬浮在从离心管获得的少量流体中。在一些实施方案中，将所期望的细胞级分重悬于无菌盐水中。

在一个方面，期望的细胞级分是干细胞，并且干细胞所来源的组织是脂肪。

由脂肪加工干细胞的方法的第一个实施方案如下：

通过抽脂法从患者获得脂肪。抽脂可以通过注射器进行，其中通过针或通过抽脂机直接从患者体内除去脂肪。在抽脂过程中除去的脂肪量可以根据所期望干细胞的数量而变化。在一些实施方案中，抽脂术是微型(mini)抽脂术，其中从患者体内除去约30cc至约50cc的脂肪。在一些实施方案中，抽脂术是微(micro)抽脂术，其中从患者体内除去约5cc至约29cc的脂肪。在一些实施方案中，抽脂术是典型的临床抽脂术，在这种情况下，从患者体内除去300cc或更多的脂肪。

一旦从患者体内移除脂肪，就将其转移到无菌加工容器或药筒中。如本文所述，转移通过无菌方式进行。在一些实施方案中，通过注射器从患者体内除去脂肪，并通过在注射器和加工容器或药筒之间将公母鲁尔锁连接器彼此连接而将脂肪从注射器转移到加工容器或药筒。在一些实施方案中，通过注射器从患者体内除去脂肪，并且通过在注射器和容器或药筒之间将公母鲁尔锁连接器彼此连接，将注射器无菌对接在加工容器或药筒内。在一些实施方案中，通过注射器从患者体内除去脂肪，并通过在注射器和药筒内的加工容器或药筒之间将公母鲁尔锁连接器彼此连接而将脂肪从注射器转移到加工容器或药筒。在一些实施方案中，通过抽脂装置从患者体内除去脂肪，并通过使用无菌连接装置将抽脂装置和加工容器或药筒无菌对接将脂肪从脂肪抽吸装置转移到加工容器或药筒。

在一些实施方案中，转移可以通过重力流动进行。在一些实施方案中，转移可以机械地进行，例如通过物理方式压下注射器的柱塞并迫使脂肪从注射器的内部进入加工容器或药筒的内部。在一些实施方案中，转移可以通过诸如泵的装置进行。

用于接收脂肪的容器或药筒的体积可以随着从患者获得的脂肪量而变化。在一些实施方案中，通过微型抽脂术移除的30cc至50cc脂肪被转移至体积为9液量盎司至19液量盎司的容器或药筒。

然后将等于从患者体内除去的脂肪量的一定体积的无菌盐水转移到容器或药筒中以洗涤脂肪。举例来说，如果从患者体内取出30cc脂肪，则使用30mL无菌盐水洗涤样品。在一些实施方案中，然后将大于从患者体内除去的脂肪量的一定体积的无菌盐水转移到容器或药筒中以洗涤脂肪。举例来说，如果从患者体内除去30cc脂肪，则使用35mL无菌盐水洗涤样品。在一些实施方案中，然后将小于从患者体内除去的脂肪量的一定体积的无菌盐水转移到容器或药筒中以洗涤脂肪。举例来说，如果从患者体内除去30cc脂肪，则使用25mL无菌盐水洗涤样品。在一些实施方案中，将无菌盐水体积的组合添加至一定量的脂肪以洗涤脂肪。如本文所述，进行盐水向容器或药筒的转移，以保持系统的无菌性。在一些实施方案中，通过在容纳无菌盐水的容器和加工容器或药筒之间将公母鲁尔锁连接器彼此连接，将无菌盐水转移到容器或药筒中。在一些实施方案中，通过使用无菌连接装置对无菌盐水容器和加工容器或药筒进行无菌对接，将无菌盐水转移到容器或药筒中。

通过适度摇动或旋转含有脂肪和无菌盐水的容器或药筒来进行洗涤。

然后以这样的方式定位容器或药筒，以使(现在洗过的)脂肪与无菌盐水分离。因为脂肪比盐水密度小，所以它会上升并漂浮在盐水的顶部。分离所需的时间量将根据脂肪样品的个体构成而变化。在一些实施方案中，分离可以进行1至30分钟。在一些实施方案中，分离可以进行1至15分钟。在一些实施方案中，分离可以进行1至10分钟。在一些实施方案中，分离可以进行1至5分钟。在一些实施方案中，分离可以进行10秒至1分钟。

然后尽可能完全地从容器或药筒中排出盐水，因此仅剩下脂肪。排出可以通过各种方式进行，这取决于该方法中使用的容器或药筒的类型。在一些实施方案中，通过位于容器或药筒底部的管将盐水排出容器或药筒。排出可以使用注射器或泵主动地进行，或通过重力流动被动地进行。在一些实施方案中，进行排出以便维持无菌系统的完整性，如本文所述。

重复洗涤直至脂肪为金黄色，并且在完成洗涤后盐水仅略微混浊。在一些实施方案中，洗涤进行1-5次，在一些实施方案中为1-4次，在一些实施方案中为1-3次，在一些实施方案中为1-2次，并且在一些实施方案中为1次。

一旦洗涤完毕，则准备脂肪待用于加工。

任选地，将无菌盐水加入袋中进行加工，但这不是必需的。添加盐水将为细胞和/或小细胞簇提供空间，以便在加工过程中自由地彼此远离，从而有助于将脂肪破碎成单个细胞。如果添加盐水，如本文所述，则以保持无菌系统的完整性的方式添加盐水。

任选添加的盐水的体积可以变化。在一些实施方案中，加入的盐水体积为从无至从患者体内除去的脂肪体积的2倍。在一些实施方案中，使用等量的盐水(例如，30mL的盐水用于30cc的脂肪)。

使用泵或注射器从容器或药筒中除去过量空气。在一些实施方案中，从位于容器或药筒底部的相同管中除去过量空气，从所述容器或药筒中排出无菌盐水洗液。在一些实施方案中，如本文所述，以保持无菌封闭系统的完整性的方式排出空气。

然后将加工容器或药筒移动到加工装置。图2中示出了适合的加工装置200的实例。在所示实施方案中，将加工容器或药筒205固定到刚性平台210上以进行加工。平台210在ESW加工期间控制容器或药筒205的移动。

平台210可由任何适合的刚性材料制成，包括木材，金属，塑料，丙烯酸等。在一些实施方案中，平台210由木材制成。

加工装置200容纳能够将冲击波传递到容器或药筒205内部的冲击波施加器215。冲击波施加器215经由施加器平台220容纳在加工装置200上。施加器平台220和冲击波施加器215与容器或药筒205内容纳的脂肪保持一定距离，使得冲击波施加器215从不与脂肪直接接触。这确保了输送到脂肪的冲击波是体外的或ESW。在一些实施方案中，冲击波施加器215可以被放置成与加工容器或药筒205直接接触。在这样的实施方案中，容器或药筒205的壁确保冲击波施加器215不会直接与脂肪接触。

施加器平台220以及冲击波施加器215的移动可以在三个方向平面X、Y和Z中进行，每个平面由其自己的电动机控制：X平面电动机230，Y平面电动机235和Z平面电动机240。在一些实施方案中，这些电动机是NEMA 17步进电动机。电动机230、235和240中的每一个由电动机控制器225控制，电动机控制器225使得施加器平台220和冲击波施加器215能够在容器或药筒205上方和周围以三维方式移动。在一些实施方案中，电动机由具有Marlin固件的Arduino微加工器v6板控制。在一些实施方案中，电动机由具有Marlin固件的Arduino v6板控制。在一些实施方案中，仅使用X平面电动机230。在一些实施方案中，仅使用Y平面电动机235。在一些实施方案中，仅使用Z平面电动机240。在一些实施方案中，仅使用X平面电动机230。在一些实施方案中，仅使用X平面电动机230和Y平面电动机235。在一些实施方案中，仅使用X平面电动机230和Z平面电动机240。在一些实施方案中，仅使用Y平面电动机235和Z平面电动机240。在一些实施方案中，使用X平面电动机230、Y平面电动机235和Z平面电动机240。

施加器平台220和冲击波施加器215的这种三维移动允许所提取的样品中的所有脂肪在加工期间暴露于体外冲击波。

然后，冲击波从冲击波施加器215，通过包含透射凝胶的透射凝胶或膜，通过容器或药筒205的壁，递送至脂肪样品，以破碎脂肪，释放来自脂肪的细胞簇和单个细胞。在一些实施方案中，透射凝胶是由DJO,LLC,1430Decision Street,Vista,CA 92081,USA为Chattanooga制造的REF 4248导体透射凝胶。在其中在加工之前将无菌盐水加入到脂肪中的那些实施方案中，从脂肪中释放的小簇细胞和/或单个细胞将移动到盐水中。

冲击波施加器215由冲击波发生器245驱动，冲击波发生器245产生通过冲击波施加器215传输到脂肪的ESW。在一些实施方案中，冲击波发生器是由Storz Medical AG，8274

len，瑞士制造的MasterPuls MP100。在一些实施方案中，冲击波发生器是由Lumsail Industrial Inc.,4/F,No.9Yi,Lane 2,Suide Road,Shanghai,200331,China制造的BS-SWT2X。

递送至脂肪的ESW的力可以变化。例如，可能需要增加ESW的力以穿透厚壁容器或药筒205的壁。通常，递送到脂肪的ESW的力可以根据容器或药筒205的壁的厚度和/或制成容器或药筒205的材料而变化。在一些实施方案中，递送至脂肪的ESW的力的范围为0.5至5.0巴。在一些实施方案中，递送至脂肪的ESW的力的范围为1.0至4.5巴。在一些实施方案中，递送至脂肪的ESW的力的范围为1.5至4.0巴。在一些实施方案中，递送至脂肪的ESW的力的范围为2.0至3.5巴。在一些实施方案中，容器205是具有0.25mm厚的壁的乙烯系袋，并且ESW的力的水平在2.0到2.5巴的范围内。

由冲击波施加器215递送的ESW覆盖的区域可以变化。冲击波施加器215覆盖的面积越大，暴露于ESW的脂肪的表面积越大。在一些实施方案中，冲击波施加器215覆盖的总面积在1cm²-100cm²，在一些实施方案中为1cm²-90cm²，在一些实施方案中，为1cm²-80cm²，在一些实施方案中，为1cm²-70cm²，在一些实施方案中，为1cm²-60cm²，在一些实施方案中，为1cm²-50cm²，在一些实施方案中，为1cm²-40cm²，在一些实施方案中，为1cm²-30cm²，在一些实施方案中，为1cm²-20cm²，在一些实施方案中，为1cm²-10cm²，在一些实施方案中，为1cm²-5cm²。并且在一些实施方案中，冲击波施加器215覆盖的总面积是5cm²。

在一个实施方案中，容器205是具有0.25mm厚壁的19盎司乙烯系袋，从患者获得的脂肪总量为30cc，并且可选地将30mL盐水(与脂肪样品等体积)在加工之前加入到乙烯系袋中。在该实施方案中，暴露于ESW的袋的总面积以及因此脂肪样品的总量约为5cm²。

递送至脂肪样品的冲击波的数量可以变化。在一些实施方案中，冲击波的总数范围为5,000至100,000，在一些实施方案中为10,000至50,000，在一些实施方案中为10,000至25,000，并且在一些实施方案中为10,000至20,000。在一些实施方案中，冲击波的总数是25,000。

在该实施方案中，将干细胞与从患者获得的脂肪样品分离。在冲击波施加器215上使用5cm²的施加器尖端，在2.0至2.5巴的范围内的冲击波数的范围为10,000至50,000足以将干细胞和基质血管级分与脂肪分离。如本文所用，“基质血管级分”是指从组织样品的过程获得的细胞级分，其包含从分离和解离细胞级分获得的细胞，在一些实施方案中，所述细胞级分是脂肪。基质血管级分包括但不限于干细胞，生长因子和祖细胞等。

在将ESW施加到脂肪样品上之后，将容器或药筒进行机械搅拌一小段时间。在一些实施方案中，机械搅拌是摇动。在一些实施方案中，机械搅拌使容器或药筒205翻转一次或多次。在一些实施方案中，短的时间段为1至30秒，在一些实施方案中为1至15秒，并且在一些实施方案中为1至10秒。在一些实施方案中，短的时间段是大约10秒。搅拌允许已从脂肪中释放的干细胞和基质血管级分与脂肪细胞碎片和可能仍存在于容器或药筒205中的任何残留脂肪组织分离。

然后以这样的方式定位容器或药筒205，以便使得(现在加工的)脂肪可以与现在包含干细胞和基质血管级分的无菌盐水分离，所述干细胞和基质血管级分已经由ESW将其与脂肪分离。因为脂肪比含有干细胞的盐水密度小，所以它会上升并漂浮在盐水的顶部。分离所需的时间量将根据脂肪样品的个体构成而变化。在一些实施方案中，分离可以进行1至30分钟。在一些实施方案中，分离可以进行1至15分钟。在一些实施方案中，分离可以进行1至10分钟。在一些实施方案中，分离可以进行1至5分钟。在一些实施方案中，分离可以进行10秒至1分钟。在一些实施方案中，分离可以进行不到1分钟。

现在已将干细胞与脂肪样品分离，并且现在将其悬浮在无菌盐水层中。

然后尽可能完全地从容器或药筒205中移除含干细胞的盐水层，因此仅剩下脂肪。根据在该方法中使用的容器或药筒205的类型，可以通过各种方式进行移除。在一些实施方案中，盐水通过位于容器或药筒205底部的管子从容器或药筒205中排出。排出可以使用注射器或泵主动进行，或者通过重力流动被动地进行。在一些实施方案中，如本文所述，以保持封闭的无菌环境的完整性的方式除去含有干细胞的层。

在一些实施方案中，在从容器或药筒205移除期间，含干细胞的盐水层通过过滤器。过滤器的尺寸可以变化。在一些实施方案中，过滤器尺寸范围为40μm至100μm。在一些实施方案中，过滤器尺寸为70μm。在不同的实施方案中，过滤器是尼龙。

在从容器或药筒205移除之后或期间，将含干细胞的盐水移入一个或多个离心管中。在一些实施方案中，如本文所述，以保持封闭的无菌环境的完整性的方式进行移动。随后进行离心，以便将干细胞浓缩成离心管底部的团块。

通过以500g至1,600g离心3至10分钟来浓缩干细胞。在一些实施方案中，通过以1,200g离心10分钟来浓缩干细胞。

从管中移除流体，仅在底部留下干细胞。可通过滗析、抽吸或类似方式除去流体。

将少量流体放入离心管中以重悬干细胞。在一些实施方案中，加入离心管的流体量为1mL至5mL。在一些实施方案中，流体为盐水，富含血小板的血浆，透明质烷，固定凝胶，水凝胶，支架，纤维蛋白，胶，或任何前述的组合。在一些实施方案中，将细胞重悬于离心抽吸物中。

随着干细胞漂浮在悬浮液中，将它们准备好待用。这种用途可包括但不限于重新导入它们所来自的患者，冷冻保存，膨胀等。在一些实施方案中，浓缩的重悬的干细胞通过皮下注射针移入注射器中，供患者使用。在一些实施方案中，将浓缩的重悬的干细胞接种到组织支架中以生长成心肌，肌肉，骨，软骨，肝，肾或其他组织和器官结构。在一些实施方案中，通过使浓缩的，重悬的干细胞表达多能性转录因子，将其转化为诱导多能干细胞。

由脂肪加工干细胞的方法的第二个实施方案如下：

通过抽脂术从患者获得脂肪。抽脂可以通过注射器进行，其中脂肪通过针直接从患者体内除去，或者通过抽脂机。在抽脂过程中除去的脂肪量可以根据所期望的干细胞的数量而变化。在一些实施方案中，通过注射器从患者体内除去脂肪，并且通过在注射器和药筒之间将公母鲁尔锁连接器彼此连接，将注射器无菌对接在药筒内。在一些实施方案中，通过注射器从患者体内除去脂肪，并通过在注射器和药筒内的加工容器或药筒之间将公母鲁尔锁连接器彼此连接而将脂肪从注射器转移到加工容器或药筒。在一些实施方案中，抽脂术是微型抽脂术，其中从患者体内除去约30cc至约50cc的脂肪。在一些实施方案中，抽脂术是微抽脂术，其中从患者体内除去约5cc至约29cc的脂肪。在一些实施方案中，抽脂术典型地为临床抽脂术，在这种情况下，从患者体内除去300cc或更多的脂肪。

一旦从患者体内移除脂肪，就将其转移到无菌加工容器或药筒中。如本文所述，转移通过无菌方式进行。在一些实施方案中，通过注射器从患者体内除去脂肪，并通过在注射器和加工容器或药筒之间将公母鲁尔锁连接器彼此连接而将脂肪从注射器转移到加工容器或药筒。在一些实施方案中，通过抽脂装置从患者体内除去脂肪，并通过使用无菌连接装置将抽脂装置和加工容器或药筒无菌对接从脂肪抽吸装置转移到加工容器或药筒。

在一些实施方案中，转移可以通过重力流动进行。在一些实施方案中，转移可以机械地进行，例如通过物理地压下注射器的柱塞并迫使脂肪从注射器的内部进入加工容器或药筒的内部。在一些实施方案中，转移可以通过诸如泵的装置进行。

用于接收脂肪的容器或药筒的体积可以随着从患者获得的脂肪量而变化。在一些实施方案中，通过微型抽脂术移除的30cc至50cc脂肪被转移至体积为9液量盎司至19液量盎司的容器或药筒中。

然后将等于从患者体内除去的脂肪量的体积的无菌盐水转移到容器或药筒中以洗涤脂肪。举例来说，如果从患者体内取出30cc脂肪，则使用30mL无菌盐水洗涤样品。在一些实施方案中，通过注射器从患者体内除去脂肪，并且通过在注射器和药筒之间将公母鲁尔锁连接器彼此连接，将注射器无菌对接在药筒内。在一些实施方案中，通过注射器从患者体内除去脂肪，并通过在注射器和药筒内的加工容器或药筒之间将公母鲁尔锁连接器彼此连接而将脂肪从注射器转移到加工容器或药筒。如本文所述，进行盐水向容器或药筒的转移，以保持系统的无菌性。在一些实施方案中，通过在容纳无菌盐水的容器和加工容器或药筒之间将公母鲁尔锁连接器彼此连接，将无菌盐水转移到容器或药筒中。在一些实施方案中，通过使用无菌连接装置将无菌盐水容器和加工容器或药筒无菌对接，将无菌盐水转移到容器或药筒中。

然后以这样的方式定位容器或药筒，以便使得(现在洗过的)脂肪可以与无菌盐水分离。因为脂肪比盐水密度小，所以它会上升并浮在盐水上面。分离所需的时间量将根据脂肪样品的个体构成而变化。在一些实施方案中，分离可以进行1至30分钟。在一些实施方案中，分离可以进行1至15分钟。在一些实施方案中，分离可以进行1至10分钟。在一些实施方案中，分离可以进行1至5分钟。

然后尽可能完全地从容器或药筒中排出盐水，因此仅剩下脂肪。排出可以通过各种方式进行，这取决于该方法中使用的容器或药筒的类型。在一些实施方案中，通过位于容器或药筒底部的管将盐水排出容器或药筒。排出可以使用注射器或泵主动进行，也可以通过重力流动被动地进行。在一些实施方案中，进行排出以便维持无菌系统的完整性，如本文所述。

一旦洗涤完成，则准备脂肪待用于加工。

任选地，将无菌盐水加入袋中进行加工，但这不是必需的。添加盐水将为细胞和/或小细胞簇提供空间，以便在加工过程中彼此自由地移开，从而有助于将脂肪破碎成单个细胞。如果加入盐水，则以保持无菌系统完整性的方式加入，如本文所述。

任选添加的盐水体积可以变化。在一些实施方案中，加入的盐水体积为从无至从患者体内除去的脂肪体积的2倍。在一些实施方案中，使用等量的盐水(例如，30mL的盐水用于30cc的脂肪)。

使用泵或注射器从容器或药筒中除去过量空气。在一些实施方案中，从与位于容器或药筒底部的用于从中排出无菌盐水洗液的相同管中除去过量空气。在一些实施方案中，如本文所述，以保持无菌封闭系统的完整性的方式排出空气。

然后将加工容器或药筒移动到加工装置。图3中示出了适合的加工装置300的实例。在所示实施方案中，加工容器或药筒205固定到刚性平台315上以进行加工。平台315在加工期间控制容器或药筒205的移动。

平台315可由任何适合的刚性材料制成，包括木材，塑料等。在一些实施方案中，平台315由木材制成。

在该实施方案中，机械冲击用于破碎脂肪组织并且释放干细胞。

机械冲击由电动机305产生，电动机305驱动冲击臂310，冲击臂310与包含待加工脂肪的容器或药筒205物理接触。在该实施方案中，电动机305驱动冲击臂310，使得冲击臂310上下铰接，在其运动范围的底部与容器或药筒205接触。在一些实施方案中，电动机是由Black and Decker,1000Stanley Drive,New Britain,CT 06053,USA制造的型号BDEJS300C的4.5安培电动机。

在一些实施方案中，电动机305是可变速电动机，其可调节以以0至30,000rpm的速率驱动冲击臂，在一些实施方案中为0至20,000rpm，在一些实施方案中为0至10,000rpm。在一些实施方案中，为0至5,000rpm。

在一些实施方案中，电动机305包含齿轮，当电动机305以全速(在一些实施方案中，30,000rpm)操作时，该齿轮能够降低冲击臂310的速度，以便产生更大的扭矩。当这样做时，由冲击臂310产生的动量被传递到容器或药筒205中的组织。这极大地增加了脂肪组织被破碎并且干细胞从脂肪组织中释放的速率。

在一个实施方案中，电动机305适于允许速度从30,000rpm至3,000rpm的10比1降低。在该实施方案中，电动机305包括0.75英寸的齿轮直径，这允许减少10比1。在3,000rpm和0.75英寸的齿轮直径下，冲击臂310达到每秒117.8英寸的速度-冲击臂310来回铰接的速度，并因此与容器或药筒205接触。冲击臂310能够与容器或药筒205接触的速度允许显著减少加工时间。与已知或现有的需要非常长的加工时间的组织加工技术相比，这提供了显著的优点。

使组织暴露于机械冲击直至脂肪破碎至所需水平，或直至所期望量的干细胞已从脂肪中释放出来。在一些实施方案中，脂肪样品在30分钟或更短时间内加工。在一些实施方案中，脂肪样品在30秒至30分钟之间加工，在一些实施方案中在30秒至20分钟之间，在一些实施方案中在30秒至10分钟之间，并且在一些实施方案中在30秒至5分钟之间。

平台315的移动在三个方向平面X、Y和Z中进行，每个方向平面由其自身的电动机控制：X平面电动机230，Y平面电动机235和Z平面电动机240。在一些实施方案中，仅使用X平面电动机230。在一些实施方案中，仅使用Y平面电动机235。在一些实施方案中，仅使用Z平面电动机240。在一些实施方案中，仅使用X平面电动机230。在一些实施方案中，仅使用X平面电动机230和Y平面电动机235。在一些实施方案中，仅使用X平面电动机230和Z平面电动机240。在一些实施方案中，仅使用Y平面电动机235和Z平面电动机240。在一些实施方案中，使用X平面电动机230，Y平面电动机235和Z平面电动机240。电动机230,235和240中的每一个由电动机控制器225控制，电动机控制器225使得平台315能够在三个维度上移动。

平台315的这种至多三维移动允许所提取的样品中的所有脂肪在加工期间暴露于机械冲击，并且用于样品和加工装置的最佳定位。

冲击臂310的长度、冲击表面的面积、冲击表面的数量和冲击臂310的形状可以变化。在一些实施方案中，增加冲击表面的总面积和/或冲击表面的总数减少了加工脂肪样品所需的时间量。

然后以这样的方式定位容器或药筒205，以便允许(现在加工的)脂肪与现在包含已经通过机械冲击与脂肪分离的干细胞的无菌盐水分离。因为脂肪比盐水密度小，所以它会上升并浮在盐水上面。分离所需的时间量将根据脂肪样品的个体构成而变化。在一些实施方案中，分离可以进行1至30分钟。在一些实施方案中，分离可以进行1至15分钟。在一些实施方案中，分离可以进行1至10分钟。在一些实施方案中，分离可以进行1至5分钟。在一些实施方案中，分离可在进行不到1分钟。在一些实施方案中，分离可以进行10秒至1分钟。在一些实施方案中，分离可进行不到1分钟。

现在已将干细胞和基质血管级分与脂肪样品分离，并且现在将其悬浮在盐水中。

然后尽可能完全地从容器或药筒205中取出含干细胞的盐水层，因此仅剩下脂肪。取决于在该方法中使用的容器或药筒205的类型，可以通过各种方式进行移除。在一些实施方案中，盐水通过位于容器或药筒205底部的管从容器或药筒205中排出。排出可以使用注射器或泵主动进行，或者通过重力流动被动地进行。在一些实施方案中，如本文所述，以保持封闭的无菌环境的完整性的方式除去含有干细胞的层。

在一些实施方案中，在从容器或药筒205移除过程中使含干细胞的盐水通过过滤器。过滤器的尺寸可以变化。在一些实施方案中，过滤器尺寸范围为40μm至100μm。在一些实施方案中，过滤器尺寸为70μm。在不同的实施方案中，过滤器是尼龙。

在从容器或药筒205移除之后或期间，将含干细胞的盐水移入一个或多个离心管中。在一些实施方案中，如本文所述，移动以保持封闭的无菌环境的完整性的方式进行。然后进行离心，以便将干细胞浓缩成离心管底部的团块。

将少量流体放入离心管中以重悬干细胞。在一些实施方案中，加入离心管的流体量为1mL至5mL。在一些实施方案中，所述流体是盐水，富含血小板的血浆，透明质烷，固定凝胶，水凝胶，支架，纤维蛋白胶，胶或任何前述物质的组合。在一些实施方案中，将细胞重悬于离心抽吸物中。

在干细胞处于悬浮状态时，它们可以备用。这种用途可包括但不限于重新导入它们所来自的患者，冷冻保存，膨胀等。在一些实施方案中，浓缩的重悬的干细胞通过皮下注射针移入注射器中，供患者使用。在一些实施方案中，将浓缩的重悬的干细胞接种到组织支架中以生长成心肌，肌肉，骨，软骨，肝，肾或其他组织和器官结构。在一些实施方案中，通过使浓缩的，重悬的干细胞表达多能性转录因子，将其转化为诱导的多能干细胞。

在上述第一和第二方法中，容器或药筒和机械能来源是可移动的。在一些实施方案中，将脂肪泵送通过置于ESW或冲击表面下方的腔室。在这些实施方案中，袋和机械能来源都固定在适当位置，并且组织穿过腔室以暴露于ESW和/或机械能来源。

由脂肪加工干细胞的方法的第三个实施方案如下：

通过抽脂术从患者获得脂肪。抽脂可以通过注射器进行，其中脂肪通过针直接从患者体内除去，或者通过抽脂机。在抽脂过程中除去的脂肪量可以根据所需干细胞的量而变化。在一些实施方案中，抽脂术是微型抽脂术，其中从患者体内除去约30cc至约50cc的脂肪。在一些实施方案中，抽脂术是微抽脂术，其中从患者体内除去约5cc至约29cc的脂肪。在一些实施方案中，抽脂术是典型的临床抽脂术，在这种情况下，从患者体内除去300cc或更多的脂肪。

一旦从患者体内移除脂肪，就将其转移到无菌加工药筒中。如本文所述，转移通过无菌方式进行。在一些实施方案中，通过注射器从患者体内除去脂肪，并通过在注射器和加工药筒之间将公母鲁尔锁连接器彼此连接而将脂肪从注射器转移到加工药筒。在一些实施方案中，通过注射器从患者体内除去脂肪，并且通过在注射器和药筒之间将公母鲁尔锁连接器彼此连接，将注射器无菌对接在药筒内。在一些实施方案中，通过注射器从患者体内除去脂肪，并通过在注射器和药筒内的加工容器或药筒之间将公母鲁尔锁连接器彼此连接而将脂肪从注射器转移到加工容器或药筒。在一些实施方案中，通过抽脂装置从患者体内除去脂肪，并通过使用无菌连接装置将抽脂装置和加工药筒无菌对接将脂肪从脂肪抽吸装置转移到加工药筒。

在一些实施方案中，转移可以通过重力流动进行。在一些实施方案中，转移可以机械地进行，例如通过物理地压下注射器的柱塞并迫使脂肪从注射器的内部进入加工药筒的内部腔室。在一些实施方案中，转移可以通过诸如泵的装置进行。

接收脂肪的药筒400,500的内腔的体积(参见，例如，图4和5中提供的药筒实施方案)可以随着从患者获得的脂肪量而变化。在一些实施方案中，通过微型抽脂术移除的30cc至50cc脂肪被转移至药筒400、500的脂肪室405、505。

在该实施方案中，将脂肪注入试验本身内的药筒400、500的特定组件405、505中，药筒400、500设计成容纳脂肪样品完全在药筒400、500内的加工，而无需将样品暴露在外面的环境中。在一些实施方案中，位于接收脂肪的药筒400、500内的脂肪室405、505是具有9液量盎司至19液量盎司的体积的柔性袋。

在不同的方面，药筒400,500被设计用于与本文公开的任何ESW或机械冲击装置和方法一起使用。在一些实施方案中，加工由运行若干下述加工步骤的机器自动执行。在一些实施方案中，加工由用户执行，用户手动执行下面描述的步骤。在两个实施方案中，加工在外部受到控制，使得药筒400、500的内部加工以无菌方式执行，而样品不会暴露于外部环境。

在所描绘的实施方案中，通过使脂肪样品通过第一单向阀410,510将脂肪样品引入脂肪室405、505中。第一单向流动阀410、510的方向如图所示-进入脂肪室405、505内部。在一些实施方案中，通过在从患者和加工药筒400、500的第一单向阀410、510挤出后保留脂肪的容器之间将公母鲁尔锁连接器彼此连接，将脂肪引入脂肪室405、505的内腔中。在一些实施方案中，通过抽脂装置从患者体内移除脂肪，并通过使用无菌连接装置无菌对接脂肪抽吸装置和加工药筒，将脂肪从抽脂装置转移到加工药筒。

一旦进入脂肪室405、505内部，则在加工之前洗涤脂肪。药筒400、500包含充满无菌盐水的流体贮存器415、515，在一些实施方案中，为无菌1x磷酸盐缓冲盐水，其用于洗涤组织。为了将无菌盐水导入脂肪室405、505的内部，盐水通过第二单向阀420、520进入脂肪室405、505的内部。流动方向如图所示。通过使用移动第一柱塞430、530的外部致动器425、525将盐水移动到脂肪室405、505的内部，以迫使盐水通过第一单向阀420、520。在一些实施方案中，外部致动器425、525由使用者手动操作，使用者按下致动器425、525，直到所期望量的盐水通过第二单向阀420、520进入脂肪室405、505的内部。在一些实施方案中，外部致动器425、525的移动是自动的，并且外部机器使外部致动器425、525沿所示方向移动，从而通过第二单向阀420,520计量所期望量的盐水，进入脂肪室405、505的内部。

通过适度摇动或旋转含有脂肪和无菌盐水的药筒400、500来进行洗涤。

然后以这样的方式定位药筒400、500，以便允许(现在洗过的)脂肪与无菌盐水分离。在该实施方案中，药筒400、500具有两种变型。在一些实施方案中，药筒400、500具有固定的垂直取向，使得包含在脂肪室405、505中的脂肪和盐水洗液将总是通过重力自然地彼此分离，其中脂肪漂浮到脂肪室405、505的顶部。在一些实施方案中，药筒400、500具有水平取向并且垂直旋转以允许脂肪漂浮并与盐水洗液分离。因为脂肪比盐水密度小，所以它会上升并浮在盐水上面。分离所需的时间量将根据脂肪样品的个体构成而变化。在一些实施方案中，分离可以进行1至30分钟。在一些实施方案中，分离可以进行1至15分钟。在一些实施方案中，分离可以进行1至10分钟。在一些实施方案中，分离可以进行1至5分钟。在一些实施方案中，分离可以进行10秒至1分钟。在一些实施方案中，分离可进行不到1分钟。

然后尽可能完全地从脂肪室405、505排出盐水，因此仅剩下脂肪。根据在该方法中使用的药筒400、500的类型，可以通过各种方式进行排出。在一些实施方案中，盐水通过位于脂肪室405、505底部的管从脂肪室405、505中排出并远离药筒400、500，该管通向药筒400、500的外部。排出可以使用注射器或泵主动地进行，或通过重力流动被动地进行。在一些实施方案中，进行排出以便维持无菌系统的完整性，如本文所述。

在一些实施方案中，重复洗涤直至无菌盐水从流体贮存器415、515中耗尽。在一些实施方案中，重复洗涤直至脂肪室405、505中的盐水洗液足够清澈，洗涤后，50％-100％的光通过盐水，表明高度清晰。在一些实施方案中，重复洗涤直至完成一定数量的洗涤循环，在一些实施方案中，其为1至5次，在一些实施方案中为1至4次，在一些实施方案中为1至3次，在一些实施方案中为1至2次，一些实施方案1，在一些实施方案为2次，并且在一些实施方案中，洗涤3次。

一旦洗涤完毕，则准备脂肪待用于加工。

通过使脂肪经受ESW和/或机械冲击，根据上述方法1和2中描述的方法之一加工脂肪室405、505中的脂肪，以从脂肪中释放干细胞。在一些实施方案中，药筒400、500在脂肪室405、505上方具有开口以允许最佳过程，使得ESW和/或机械冲击力不通过药筒400、500的刚性塑料外部。在这样的实施方案中，柔性脂肪室405、505的壁被暴露用于加工。

在组织加工完成后，允许脂肪与流体分离并上升到顶部。如上所述，在该实施方案中，药筒400、500具有两种变型。在一些实施方案中，药筒400、500具有固定的垂直取向，使得包含在脂肪室405、505中的经加工的脂肪和盐水将总是通过重力自然地彼此分离，其中脂肪漂浮到脂肪室405、505的顶部。在一些实施方案中，药筒400、500具有水平取向并且垂直旋转以允许脂肪漂浮并与盐水分离。因为脂肪比盐水密度小，所以它会上升并浮在盐水上面。已经从脂肪释放的干细胞现在包含在盐水层中。

然后将含有干细胞的盐水从脂肪室405、505通过第三单向阀440、540移动到位于药筒400、500内的细胞贮存器435、535，远离脂肪。通过使用移动第二柱塞450、550的第二外部致动器445,545将盐水移入细胞贮存器435、535的内部，以迫使盐水通过第三单向阀440、540。在细胞贮存器435、535中，第二柱塞450、550定向成完全闭合的构型，使得细胞贮存器435、535完全闭合。以这种方式，移动第二致动器445、545使第二柱塞450、550远离第三单向阀440、540移动，在细胞贮存器435、535内部产生温和真空，其拉动含有干细胞的盐水层从脂肪室405、505出来，通过第三单向阀440、540进入细胞贮存器435、535的内部。在一些实施方式中，第二外部致动器445、545由用户手动操作，所述用户拉动第二致动器445、545，直到整个含干细胞的盐水被拉过第三单向阀440、540进入细胞贮存器435,535的内部。在一些实施方案中，第二外部致动器的移动445、545是自动化的，并且外部机器拉动第二外部致动器445、545以将含有盐水的干细胞移动到细胞贮存器435、535中。

在一些实施方案中，将含有干细胞的盐水抽吸通过筛网，以过滤掉从加工的脂肪组织遗留下来的不需要的细胞碎片。在一些实施方案中，筛网位于脂肪室405、505中，在其中它覆盖第三单向阀440、540的开口。在一些实施方案中，筛网位于细胞贮存器435、535的内部，在其中它覆盖第三单向阀440、540的出口。在一些实施方案中，筛网位于细胞贮存器的内部，在其中它覆盖第四单向阀455、555的开口。在一些实施方案中，筛网中的孔的尺寸范围为40μm至100μm，并且在一些实施方案中，孔的尺寸为70μm。在一些实施方案中，筛网是尼龙。

在图4所示的实施方案中，含有干细胞的级分从细胞贮存器435的内部通过第四单向阀455转移到包含在药筒400内的离心管460中。通过使用第二外部致动器445将干细胞级分移动到离心管460中，所述第二外部致动器445移动第二柱塞450，以迫使盐水通过第三单向阀440并进入离心管460。如本文所述，该移动可以手动进行，或者它可以是自动化的。然后将离心管460从药筒400中取出用于离心。离心如上述两个实施方案中任一个所述进行；干细胞团块保留在离心管460的底部。

在图5所示的实施方案中，含有干细胞的级分从细胞贮存器535的内部通过第四单向阀555转移到包含在药筒500内的离心组件560中。离心组件560是三角形腔室，用作离心部件；它将细胞从盐水中旋出，使得细胞集中在室的外边缘处的单个点处。进入端口565允许使用者进入干细胞团块，以便重悬团块和/或将其从离心组件560中移除。在一些实施方案中，离心组件560的操作由外部装置自动化和控制。其中外部装置通过电动机和齿轮与旋转腔室接合，该电动机和齿轮插入腔室中心的药筒中。在这方面，离心组件560可以是直接驱动或齿轮传动。将含有干细胞的层/下层(infranatant)如上所述加载到离心组分中，并在离心之前平衡另一侧。一旦导入离心成分，则将干细胞以500g至1600g离心3至10分钟。在一些实施方案中，离心以1200g进行10分钟。

将少量流体放入管中以重悬细胞。这通常为1mL至5mL。流体可以是盐水，富含血小板的血浆，透明质烷或固定凝胶，水凝胶，支架或纤维蛋白或胶，或其他化合物。

在细胞悬浮的情况下，将它们通过皮下注射针吸入注射器中以供进一步使用。这由加工机器自动完成，或由操作员手动完成。

使用少量流体重悬干细胞。在一些实施方案中，重悬细胞所添加的流体量为1mL至5mL。在一些实施方案中，所述流体是盐水，富含血小板的血浆，透明质烷，固定凝胶，水凝胶，支架，纤维蛋白，胶或任何前述物质的组合。在一些实施方案中，将细胞重悬于离心抽吸物中。

随着干细胞漂浮在悬浮液中，将它们准备好待用。这种用途可包括但不限于重新导入它们所来自的患者，冷冻保存，膨胀等。在一些实施方案中，将浓缩的重悬的干细胞通过皮下注射针移入注射器中，供患者使用。在一些实施方案中，将浓缩的重悬的干细胞接种到组织支架中以生长成心肌，肌肉，骨，软骨，肝，肾或其他组织和器官结构。在一些实施方案中，通过使浓缩的，重悬的干细胞表达多能性转录因子，将其转化为诱导多能干细胞。

装置

如上所述，本公开提供了用于生物加工组织样品的方法和系统。在不同的方面，本公开还提供了适用于所公开的方法的易于使用的装置，这种装置对外部环境封闭并且被设计用于单次使用。此类装置包括单次应用药筒，其允许在单个装置中进行完整加工。

容器

上述实施方案利用一个或多个容器作为衰退组织样品，脂肪样品，含有所期望细胞级分的级分，含干细胞的级分或任何前述的组合的贮器。这种容器包括在图1的步骤105中使用的容器；容器205；脂肪室405、505；流体贮存器415、515；细胞贮存器435、535。适用于本公开提供的系统和方法的这些容器可以是柔性的、刚性的或半刚性的。在一些实施方案中，容器是注射器。

在图1的步骤105中使用的容器；容器205；脂肪室405、505；流体贮存器415、515；细胞贮存器435、535，以上中的每个通过其自身或作为封闭药筒的一部分而对外部环境封闭，并且是一次性的。

在一些实施方案中，图1的步骤105中使用的容器；容器205；脂肪室405、505；流体贮存器415、515；细胞贮存器435、535，以上中的每个是柔性容器，例如柔性袋。在这样的实施方案中，每个容器可以由乙烯醋酸乙烯酯(EVA)，聚(乙烯基)氯化物(PVC)，乙烯-乙酸乙烯酯(EVA)，尼龙或其他塑料制成。

每个柔性容器可以吹塑成型。在一些实施方案中，每个柔性容器可以是射频、高频或介电焊接的并且可以是吹塑的。

在一些实施方案中，每个柔性容器是三维袋，其具有至少一个出口，该出口与柔性容器的内腔流体连接。在一些实施方案中，单个容器可具有多于一个出口，该出口与容器的内腔流体连通。这种出口可用于例如从容器的内腔排出流体，或将流体从容器的内部移动到另一个容器。

在一些实施方案中，容器可以包含沿着边缘位于容器外侧的一个或多个孔，其可用于将容器悬挂在空间中。

容器的总体积可以是5至50液量盎司，在一些实施方案中是9至19液量盎司。

在一些实施方案中，为了以组织样品、无菌盐水或其他形式接收输入，容器配置成在离散点处接收入口管线或连接，其连接到与容器内部的流体连接的入口。为了保持封闭的无菌环境的完整性，入口管线或连接件包括允许容器连接到外部装置的母鲁尔连接件，为包含组织样品的注射器，从其中材料转移到所述容器或其他方面的另一个容器。在其他实施方案中，入口管线或连接包含用于使用无菌连接装置连接到外部装置的无菌对接物。

在几个实施方案中，容器可以是扁平袋，具有顶部边缘，底部边缘和两个基本相似的侧边缘。底部边缘包括出口，该出口与袋的内部流体连接，用于将流体排出袋外。扁平袋还具有入口，该入口允许将材料无菌地引入袋的内部。

在几个实施方案中，容器是三维袋，其为矩形形状，具有顶部边缘、底部边缘和两个基本相似的侧边缘。底部边缘包括出口，该出口与容器的内部流体连接，用于将流体排出容器。顶部边缘包括入口，该入口与容器的内部流体连接，用于将材料引入容器中。

在一些实施方案中，容器经由线路连接到一个或多个其他容器。管线是可以由聚(乙烯基)氯化物(PVC)，乙烯-乙酸乙烯酯(EVA)或其他材料制成的管。

在一些实施方案中，容器可以是半刚性的。在这样的实施方案中，容器包括刚性塑料外壳，其保持其形状并且能够在组织加工期间将柔性容器保持在外壳内部。壳体被配置成使得其包含与平台210或315的连接点。

刚性塑料壳体可由任何适合的刚性-塑料材料制成，包括例如高密度聚乙烯(HDPE)或聚丙烯(PP)。刚性塑料材料没有弹性变形，也没有显示出柔性塑料典型地显示的任何弹性性能。刚性塑料壳体可以是注塑或模切的。

在一些实施方案中，柔性容器包含在刚性塑料壳体内，其可以或不可以完全包围柔性容器。在一些实施方案中，柔性容器未完全封闭在刚性塑料外壳内；相反，壳体部分地包围柔性容器，在组织加工期间将其保持在适当位置。

药筒

在不同的方面，适用于本公开的药筒是三维容器，其能够在其内部容纳一个或多个容器。内部容器可以通过一个或多个管线和/或阀门连接。适合的药筒的实例是图4和5中所示的药筒400、500。

在一些实施方案中，药筒由刚性塑料材料制成，该塑料材料保持其形状并且能够在组织加工期间将至少一个，优选多个柔性容器保持在药筒内。容器被配置成使得它们包含与平台210或315的一个或多个连接。

刚性塑料可由任何适合的刚性-塑料材料制成，包括例如高密度聚乙烯(HDPE)或聚丙烯(PP)。刚性塑料材料没有弹性变形，也没有显示出柔性塑料典型地显示的任何弹性性能。刚性塑料药筒可以是注塑或模切的。

容器的另外的方面如上所述。

离心管

适合用于本公开的方法和装置的离心管是精确制造的高强度玻璃或塑料管，其设计成精确地配合在离心机转子中。离心管的容量可以根据待加工的组织样品的总体积而变化。在一些实施方案中，离心管的容量范围为1mL至50mL，在一些实施方案中为0.5mL至20mL，并且在一些实施方案中为250μL至2.0mL。

在一些实施方案中，离心管是

管，在一些实施方案中是微离心管(microfuge tube)，并且在一些实施方案中是微量离心管(microcentrifuge tube)。

离心管的材料可以变化。在一些实施方案中，离心管由玻璃制成。在一些实施方案中，离心管是塑料的。在每个实施方案中，离心管设计为一次性使用并且是用后可弃的。在一些实施方案中，离心管由柔性透明塑料(例如聚乙烯)制成，呈半圆锥形，并包含整体的铰接密封盖。

单向阀

单向阀是允许流体仅在单个方向上流过它的阀。

在不同的方面，适用于本公开的装置和方法的单向阀包括双端口阀，其具有两个开口-一个用于流体进入，另一个用于流体离开。单向阀用于自动提供单向流体流动，无需任何用户干预或控制。在一些实施方案中，可用于本公开的方法和装置的单向阀由刚性塑料制成，例如聚(丙烯)。

在一些实施方案中，适用于本公开的装置和方法的单向阀是球形止回阀，其中防止流体回流的部件是球形球。在一些实施方案中，球是弹簧加载的，以帮助保持单向阀关闭。

在一些实施方案中，适用于本公开的装置和方法的单向阀是隔膜止回阀，其包括定位成产生阀闭合的弯曲橡胶隔膜。在这样的实施方案中，通过用户干预或通过自动过程在上游侧产生的压力导致隔膜打开并且流体流过阀。在正压停止时，隔膜关闭，终止流体流动。

在一些实施方案中，适用于本公开的装置和方法的单向阀是旋启式止回阀或倾斜盘式止回阀。在这样的实施方案中，盘是阀的可移动部分，用于允许流体沿一个方向流动，并阻止流体沿相反方向回流。

实施例

本文所述的材料、方法和实施方案在以下实施例中进一步定义。某些实施方案也在本文的实施例中定义。应当理解，这些实施例虽然表明某些实施方案，但仅以示例的方式给出。根据本文的公开内容和这些实施例，本领域技术人员可以确定本公开的基本特征，并且在不脱离其精神和范围的情况下，可以对本发明进行各种改变和变型以使其适应各种用途和条件。

实施例1

用于ESW组织加工的一般方案

从受试者获得脂肪抽吸物，该脂肪抽吸物的体积约为30cc。在加工之前，将脂肪抽吸物转移到柔性的无菌乙烯醋酸乙烯酯(EVA)，聚(乙烯基)氯化物(PVC)，乙烯-乙酸乙烯酯(EVA)或具有约0.25英寸厚的侧壁的尼龙袋中。无菌导管袋是足够的。

通过将来自盐水袋的公鲁尔锁连接器连接到位于柔性袋上的母鲁尔锁连接器并手动将盐水分配到柔性袋中，使用引入柔性袋中的等体积无菌盐水洗涤脂肪抽吸物。然后通过轻轻摇动柔性袋机械搅拌脂肪抽吸物和盐水洗液。

使组织样品/盐水洗液混合物沉降至少10分钟以使脂肪抽吸物漂浮至盐水上部。

通过位于柔性袋底部的排出管线从柔性袋中取出下层或盐水洗液。通过将注射器连接到管线并将下层物质从袋中抽出或通过重力流动可以进行移除。

洗涤重复3-4次，在最终的洗涤中将无菌盐水洗液留在袋中。

下一步是使用Masterpuls MP100体外冲击波发生器将体外冲击波施加到脂肪抽吸物上。

发生器可以与柔性袋的壁接触，但是应该注意确保冲击波发生器不接触脂肪抽吸物本身。

如果必要，可以在将冲击波施加到脂肪抽吸物之前将超声凝胶施加到柔性袋的侧面。

将ESW施加到脂肪抽吸物上1-30分钟。

此后，通过摇动或轻度涡旋适度搅拌柔性袋。

允许目前加工的脂肪抽吸物沉降，使得剩余的脂肪组织可漂浮到盐水的上部。

如上所述，通过将无菌注射器连接到排出管来从柔性袋中移除下层，并尽可能多地抽出下层。不要取出任何剩余的脂肪组织。

在去除期间，使下层通过具有40μm、70μm或100μm的孔径的三个尼龙筛网过滤器中的一个。

将下层分配到一个或多个无菌离心管中。如果使用奇数个管，则确保将含有无菌盐水的平衡管放入旋转器中以保持平衡。

以1,200g离心10min。

任选的：将团块重悬于1mL RBC裂解缓冲液中，并在37℃的水浴中温育10min。中和RBC缓冲液。

如果不想要RBC裂解缓冲液，则将细胞团块重新混悬于1mL无菌盐水。

计数细胞

实施例2

脂肪抽吸加工方法比较

摘要：对该实施例进行的测试的目的在于比较使用胶原酶消化与体外冲击波(ESW)破坏从脂肪组织提取的间充质干细胞的有核细胞收率。

材料：

1,500mL 1x磷酸缓冲盐水(PBS)

35mL 1x红细胞(RBC)裂解缓冲液

200mL 0.1％I型胶原酶

15mL 10％在Dulbecco改良eagle培养基(DMEM)中的胎牛血清(FBS)

方法：

对照

使用无菌60mL导管将约250mL的脂肪抽吸物转移到100mL烧杯中。注意确保将少量至不多余的流体引入烧杯中。

用大约等体积的无菌1x PBS洗涤脂肪抽吸物四次。对于每次洗涤，将无菌1x PBS加入烧杯中，搅拌两者，使混合物沉降。通过抽吸从烧杯中除去下层。将脂肪抽吸物洗涤总共4次。

第四次洗涤后，允许样品沉降10分钟。

使用无菌10mL血清移液管将45mL来自第四次和最后一次洗涤的下层试剂转移到3个无菌50mL锥形管中，通过40μm、70μm和100μm管无菌过滤器。转移总共135mL的下层作为对照。

胶原酶消化

将200mL脂肪抽吸物沉积到无菌的500mL玻璃瓶中。将200mL的0.1％I型胶原酶加入瓶中。通过倒置几次适度搅拌瓶，以确保脂肪抽吸物与胶原酶均匀混合。

然后将瓶放入37℃的水浴中。每隔10分钟，将瓶从水浴中取出并倒置几次以重新分配已经沉降的脂肪抽吸物。温育30分钟后，最后一次搅拌瓶并从水浴中取出。

用70％ETOH喷洒瓶的外部，并置于通风橱中。使脂肪抽吸物和胶原酶混合物沉降10分钟。

使用无菌10mL血清移液管将下层通过40μm、70μm和100μm管无菌过滤器转移到3个无菌50mL锥形管中。转移总共135mL的下层。将3个试管(包括含有45mL水用于平衡的第四管)在1,200g，37℃下离心10分钟，以获得胶原酶消化的细胞团块。

将含有胶原酶悬浮液的3个管的外部用70％ETOH清洁，并置于通风橱中，使平衡管离开。吸去上清液，在每个管中留下细胞团块。使用25mL血清移液管，将5mL 10％FBS分配到每个管中，并将每个管涡旋5秒以重悬团块。FBS用于中和任何剩余的胶原酶活性。

将3支管以1,200g、在37℃下离心10min。离心管的外部用70％ETOH清洁，并将管置于通风橱中。吸去上清液，留下细胞团块。

ESW加工

使用无菌60mL导管注射器将200mL脂肪抽吸物以及所有剩余的下层转移到无菌的500mL腿形导管袋中。加入无菌1x PBS以达到200mL的总流体体积，总体积为400mL，包括脂肪抽吸物。将约2mL的超声凝胶施加于导管袋。使用大尖端，在袋内的样品上施加大约10,000个2巴和21Hz的ESW脉冲。在袋的另一侧重复该过程，再进行10,000次ESW脉冲。导管袋的外部用70％ETOH清洁，并将其置于通风橱中。

将袋搅拌并全部倒入500mL烧杯中，使悬浮液沉降10分钟。使用无菌10mL血清移液管，将下层转移到3个无菌50mL锥形管中，通过40μm、70μm和100μm管无菌过滤器。转移总共135mL的下层。

浓缩和裂解

将含有对照悬浮液的3个试管和含有加工过的悬浮液的3个试管以1,200g和在37℃下离心10分钟。将上清液从所有管中吸出，将剩下的每个团块和5mL 1x RBC裂解缓冲液加入每个管中。将每个管涡旋5秒以重新悬浮团块，并将管置于37℃水浴中10分钟。

用70％ETOH对每个管的外部进行消毒，并将管置于通风橱中。向每个管中加入25mL无菌1x PBS以稀释并中和裂解缓冲液。

细胞计数

使用无菌微量移液管尖端，将300μL无菌1x PBS转移到6个无菌0.5mL微量离心管中。还将75μL的每个50mL样品管转移到每个微量离心管中用于细胞计数。

使用具有M型和S型药筒的MoxiZ细胞计数器计数每个样品中的细胞数。为了计数，向每个微量离心管中加入100μL锥虫蓝，使10μL每种样品上载于血细胞计数器并计数细胞。

结果：

MoxiZ细胞计数器

表1显示了使用MoxiZ自动细胞计数器的细胞计数结果。两种类型的药筒用于计数，即M和S型。在样品栏中，'c'表示胶原酶消化，'e'表示ESW加工，'0'表示对照。只有“完成”栏中的“y”计数才有效。

表1

血细胞计数器

表2详述了从视觉血细胞计数器获得的计数，具有来自每个象限的细胞计数、象限的总和、稀释因子和总计算细胞。应参考对照群体中细胞的数量来获取细胞数量。加工细胞与对照细胞之比是收率的关键指标。

表2

概述

在使用MoxiZ自动细胞计数器的有效计数中，对照、胶原酶和ESW的细胞计数的聚集平均值如表3所示：

表3

样品	平均值	SD
			0	2.24E+05	1.18E+05
C	3.81E+05	5.11E+04
			E	3.15E+05	2.08E+05

胶原酶始终产生约3.8E+05细胞/mL。ESW范围为1.67e+05至7.08e+05细胞/mL。

观察血细胞计数器中细胞的比率，ESW过程产生最高比率，比率为对照的1.78至9.0倍高。胶原酶仅产生为对照1.29至2.84倍高的比率。

讨论

这些数据表明ESW有效地由脂肪组织生产大量间充质干细胞。基于这些数据，可以得出结论，ESW是超声或胶原酶加工脂肪组织以获得间充质干细胞的富有活力的替代方案。在比较峰时，与4.32e+05的胶原酶峰相比，ESW产生7.08e+05的细胞产量-收率增加为164％。

鉴于上文提供的数据，可以合理地得出结论，50cc至60cc的脂肪抽吸物样品将从ESW加工中产生约5百万个细胞，从胶原酶消化产生约3百万个细胞。

因此，显而易见，ESW在从脂肪组织中释放干细胞中的应用赋予相比已知技术的显著优点。

特别地，本发明还涉及以下各项目：

项目1.从组织样品分离细胞级分的方法，包括：

从受试者得到组织样品；

使组织样品接触冲击波、机械冲击力或它们两者；和

从组织样品分离细胞级分；

其中冲击波来源和/或机械冲击力来源不与组织样品发生物理接触。

项目2.项目1的方法，其中所述组织选自脂肪组织，脑组织，咽组织，喉组织，心脏组织，动脉组织，肌肉组织，肝组织，胆囊组织，肾组织，小肠组织，大肠组织，淋巴结组织，肺组织，脾组织，骨髓组织，胃组织，静脉组织，胰腺组织，膀胱组织，骨，牙齿，牙本质组织，牙龈组织，皮肤组织，松果腺组织，脑垂体组织，甲状腺组织，肾上腺组织，胰腺组织，卵巢组织和睾丸组织。

项目3.项目1或项目2的方法，其中所述组织是脂肪组织。

项目4.项目1-3任一项的方法，其中所述组织样品与冲击波接触，并且所述冲击波来源是由冲击波发生器驱动的冲击波施加器。

项目5.项目1-3任一项的方法，其中所述组织样品与机械冲击力接触，并且所述机械冲击力来源是由电动机驱动的冲击臂。

项目6.项目1-5任一项的方法，其中在与所述冲击波和/或机械冲击力接触之前，将所述组织样品洗涤一次或多次。

项目7.项目1-4或6任一项的方法，其中所述冲击波将所述组织样品破碎成多个小的细胞簇、多个单个细胞或它们两者。

项目8.项目1-3、5或6任一项的方法，其中机械冲击力将组织样本破碎成多个小的细胞簇、多个单个细胞或它们两者。

项目9.项目7或项目8的方法，其中所述细胞级分包含多个小细胞簇、多个单个细胞或它们两者，并且通过离心进行细胞级分的分离。

项目10.项目9的方法，其中离心以500g-2,000g的速度进行3-30分钟。

项目11.项目10的方法，其中离心以1,200g进行10分钟。

项目12.项目9-11任一项的方法，其中离心后重新混悬分离的细胞级分。

项目13.项目1-3、5、6或8-12任一项的方法，其中细胞级分在30分钟或更短时间内得以分离。

项目14.从脂肪组织分离干细胞的方法，包括：

从受试者得到脂肪组织样品；

将组织样品放入容器或药筒；

使组织样品经受机械冲击力以释放干细胞；

从脂肪组织分离干细胞级分；和

离心干细胞级分；

其中机械冲击力来源不以物理方式接触脂肪组织。

项目15.项目14的方法，其中在经受机械冲击力之前将脂肪组织洗涤一次或多次。

项目16.项目14或项目15的方法，其中所述机械冲击力来源是由电动机驱动的冲击臂，所述电动机包含能够在该电动机全速运行时降低所述冲击臂的速度的齿轮。

项目17.项目14或项目15的方法，其中机械冲击力通过容器或药筒的壁传递到脂肪组织。

项目18.项目15-17任一项的方法，其中所述齿轮允许所述冲击臂中的速度由10降至1。

项目19.项目16-18任一项的方法，其中所述电动机包含0.75英寸的齿轮直径，并且在3000rpm的电动机速度下，所述冲击臂具有每秒117.8英寸的速度。

项目20.项目14-19任一项的方法，其中分离干细胞级分包括允许所述脂肪组织与水层分离，所述水层包含所述干细胞。

项目21.项目14-20任一项的方法，其中所述干细胞在30分钟或更短时间内从所述脂肪组织中分离。

项目22.项目14-21任一项的方法，其中离心以500g-1,600g进行3-10分钟。

项目23.从脂肪组织分离干细胞的方法，包括：

从受试者得到脂肪组织样品；

将组织样品放入容器或药筒；

使组织样品经受冲击波以释放干细胞；

从脂肪组织分离干细胞级分；和

离心干细胞级分；

其中冲击波来源不以物理方式接触脂肪组织。

项目24.项目23的方法，其中在经受冲击波前将脂肪组织洗涤一次或多次。

项目25.项目23或项目24的方法，其中冲击波来源是由冲击波发生器驱动的冲击波施加器。

项目26.项目23-25任一项的方法，其中将冲击波通过容器或药筒的壁递送至脂肪组织。

项目27.项目23-26任一项的方法，其中使脂肪组织经受具有0.5-5.0巴的力的冲击波。

项目28.项目23-27任一项的方法，其中所述容器是具有0.25mm厚的壁的乙烯系袋，并且所述脂肪组织经受具有2.0-2.5巴的力的冲击波。

项目29.项目23-28任一项的方法，其中在任何一个时刻受到冲击波的脂肪组织的总面积为1cm²-100cm²。

项目30.项目23的方法，其中所述容器是19盎司、具有0.25mm厚的壁的乙烯系袋，脂肪组织样品的总量为30cc，并且在任何一个时刻受到冲击波的脂肪组织的总面积是5cm²。

项目31.项目23-30任一项的方法，其中所述脂肪组织经受5,000-100,000个冲击波。

项目32.项目23-31任一项的方法，其中分离干细胞级分包括允许所述脂肪组织与水层分离，所述水层包含所述干细胞。

项目33.项目23-32任一项的方法，其中离心以500g-1,600g进行3-10分钟。

Claims

1.一种从组织分离基质血管级分的方法，包括：

将组织样品放入组织处理装置的处理容器中；

使组织样品经受来自机械冲击的力以分解所述组织；和

从组织分离基质血管级分；

其中：

所述机械冲击由冲击臂产生，冲击臂通过以至多30000rpm的速度上下铰接与所述容器物理接触；和

所述撞击臂不与所述组织物理接触。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述处理装置包括：

将所述处理容器连接到其上的平台；和

驱动所述冲击臂上下铰接的变速电动机。

3.根据权利要求2所述的方法，其中电动机是变速电动机，所述变速电动机可调节以3000rpm至30000rpm的速度驱动所述冲击臂的上下铰接。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述分离通过以下中的一种或多种发生：

过滤；

离心分离；和/或

使所述组织与水层分离，所述水层包括基质血管级分。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述基质血管级分在30分钟或更短内从所述组织分离。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中：

所述处理容器为袋；和

所述袋包括一个或多个与所述袋的内部流体连接的出口；和/或

所述袋包括与所述袋的内部流体连接的入口。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述基质血管级分包含干细胞、生长因子和祖细胞。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述组织选自脂肪组织、脑组织、咽组织、喉组织、心脏组织、动脉组织、肌肉组织、肝组织、胆囊组织、肾组织、小肠组织、大肠组织、淋巴结组织、肺组织、脾组织、骨髓组织、胃组织、静脉组织，胰腺组织、膀胱组织、骨、牙齿、牙本质组织、牙龈组织、皮肤组织、松果腺组织、脑垂体组织、甲状腺组织、肾上腺组织、胰腺组织、卵巢组织和睾丸组织。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述组织为脂肪组织，所述基质血管级分包含脂肪干细胞，并且所述分离在小于1分钟内发生。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其进一步包括使所述组织经受剪切力以及机械冲击，以分解所述组织。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中，分离后，过滤和/或离心所述基质血管级分。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述平台能够在三个方向平面上移动。

13.一种分解组织的方法，包括：

将组织样品放入组织处理装置的处理容器中；和

使组织样品经受来自机械冲击的力和剪切力的组合，以将所述组织分解为：

多个小细胞簇；

多个小细胞簇和多个单个细胞；或

多个单个细胞；

其中：

所述机械冲击由冲击臂产生，所述冲击臂通过以至多30000rpm的速度上下铰接与所述容器物理接触；和

所述撞击臂不与组织物理接触。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述处理装置包括：

将所述处理容器连接到其上的平台；和

驱动所述冲击臂上下铰接的变速电动机。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述电动机是变速电动机，所述变速电动机可调节以3000rpm至30000rpm的速度驱动所述冲击臂的上下铰接。

16.根据权利要求13-15中任一项所述的方法，其中：

所述机械冲击和所述剪切力将所述组织分解为多个小细胞簇和多个单个细胞；和

所述方法还包括将所述多个单个细胞与所述多个小细胞簇分离。

17.根据权利要求16所述的方法，其中通过过滤和/或离心进行分离。

18.根据权利要求16或17中任一项所述的方法，其中所述分离在30分钟或更短内发生。

19.根据权利要求13-18中任一项所述的方法，其中所述组织选自脂肪组织、脑组织、咽组织、喉组织、心脏组织、动脉组织、肌肉组织、肝组织、胆囊组织、肾组织、小肠组织、大肠组织、淋巴结组织、肺组织、脾组织、骨髓组织、胃组织、静脉组织，胰腺组织、膀胱组织、骨、牙齿、牙本质组织、牙龈组织、皮肤组织、松果腺组织脑垂体组织、甲状腺组织、肾上腺组织、胰腺组织、卵巢组织和睾丸组织。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述组织为脂肪组织，所述多个小细胞簇包括脂肪组织和细胞，所述多个单个细胞包括脂肪细胞。

21.根据权利要求13-21中任一项所述的方法，其中所述平台能够在三个方向平面上移动。

22.根据权利要求13-21中任一项所述的方法，其中：

所述处理容器为袋；和

所述袋包括与所述袋的内部流体连接的入口。

23.从第一组织分离细胞的方法，包括：

将所述第一组织的样品放入组织处理装置的处理容器中；和

使所述第一组织的样品经受来自机械冲击的力和剪切力的组合以将组织分解为：

多个小细胞簇；

多个小细胞簇和多个单个细胞；或

多个单个细胞；

其中：

所述撞击臂不与所述第一组织物理接触。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述处理装置包括：

将所述处理容器连接到其上的平台；和

驱动所述冲击臂上下铰接的变速电动机。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述电动机是变速电动机，所述变速电动机可调节以3000rpm至30000rpm的速度驱动所述冲击臂的上下铰接。

26.根据权利要求23-25中任一项所述的方法，还包括通过以下分离所述细胞：

过滤；

离心分离；

使所述组织与水层分离，所述水层包括细胞；或

上述任何一者的组合。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所述分离在30分钟或更短内发生。

28.根据权利要求23-27中任一项所述的方法，其中所述第一组织选自脂肪组织、脑组织、咽组织、喉组织、心脏组织、动脉组织、肌肉组织、肝组织、胆囊组织、肾组织、小肠组织、大肠组织、淋巴结组织、肺组织、脾组织、骨髓组织、胃组织、静脉组织，胰腺组织、膀胱组织、骨、牙齿、牙本质组织、牙龈组织、皮肤组织、松果腺组织、脑垂体组织、甲状腺组织、肾上腺组织、胰腺组织、卵巢组织和睾丸组织。

29.根据权利要求26或27所述的方法，其中所述细胞为干细胞，所述方法还包括将所述干细胞接种到组织支架中，以生长为第二组织结构和/或器官结构。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述第二组织选自心肌、肌肉、骨、软骨、肝、肾及其组合。

31.根据权利要求29所述的方法，其中所述器官选自心脏、肌肉、骨、软骨、肝和肾。

32.根据权利要求26或27所述的方法，其中所述细胞为干细胞，所述方法还包括将所述干细胞转化为诱导多能干细胞。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述转化通过引起所述干细胞表达一个或多个多能性转录因子来发生。