BR112018068820B1

BR112018068820B1 - Método para isolar células-tronco do tecido adiposo e dispositivo para realizar o dito método

Info

Publication number: BR112018068820B1
Application number: BR112018068820-7A
Authority: BR
Inventors: John CHI; Raymond Raven; Mark Richman; Ben-Chen Chi
Original assignee: Synova Life Sciences, Inc
Priority date: 2016-03-17
Filing date: 2017-03-17
Publication date: 2022-11-16
Also published as: KR20190016937A; CN115011555A; AU2023226696A1; WO2017161343A1; CN109415675A; KR20220103186A; JP2023116738A; KR102625925B1; AU2022201872A1; AU2017235653A1; EP3430122A1; EP3872164B1; CA3056209A1; US20240076622A1; AU2022201872B2; JP2022002532A; KR102313628B1; EP4324915A2; EP3872164C0; ES2884348T3

Abstract

Os métodos fornecidos pela presente divulgação utilizam ondas de choque extracorpóreas, impactos mecânicos e/ou princípios de litotripsia para quebrar uma amostra de tecido em fragmentos menores - agrupamentos de células e/ou células únicas - depois do que uma fração celular desejada pode ser isolada da amostra. Os dispositivos fornecidos pela presente divulgação aplicam ondas de choque focadas e/ou dirigidas, e/ou impactos mecânicos focados e/ou dirigidos, para decompor uma amostra de tecido. Os dispositivos mantêm a amostra em um ambiente fechado, estéril durante a exposição às ondas de choque ou impactos mecânicos. Portanto, as ondas de choque e/ou impactos mecânicos são gerados for a de um dispositivo fechado e são transmitidos através de uma ou mais paredes do dispositivo em seu interior, onde a amostra é localizada.

Description

FUNDAMENTOS

[001] O bioprocessamento celular é uma forma de fabricação biofarmacêutica, o objetivo do qual é estabelecer processos de fabricação reproduzíveis e robustos para o isolamento e/ou produção de células terapêuticas.

[002] Processos de fabricação celular correntes são altamente dependentes do usuário, requerendo intervenção humana em numerosos pontos. Por causa desta dependência, processos correntes são tediosos, altamente variáveis, caros, e produzem rendimentos baixos.

[003] Por via de exemplo, muitos processos de fabricação correntes ocorrem como segue: uma amostra de tecido (lipoaspirado, sangue total, medula óssea, sangue do cordão, etc.) é obtida de um paciente. A amostra biológica obtida é transferida para o laboratório para bioprocessamento. No laboratório, uma técnica de separação de células é utilizada de modo a obter uma fração celular desejada. A fração celular depois é isolada e transferida de volta para a instalação de ponto de atendimento para uso do paciente, ou processada ainda por introdução em um biorreator para expansão celular. Alguns métodos conhecidos de separação de células incluem o uso de separação mecânica por intermédio de cavitação ultra- sônica, digestão enzimática, ou outros meios mecânicos que envolvem contatar a amostra com objetos estranhos (por exemplo, pérolas) de modo a obter uma fração celular desejada. O uso de enzimas resulta em uma carga de complacência reguladora aumentada, visto que as enzimas devem entrar em contato direto com a amostra de modo a produzir o resultado desejado. Enzimas também podem prejudicar a integridade das células colhidas e potencialmente mudar suas propriedades. O uso de sonicação de alta potência é similarmente falho. A ponta do sonicador é fixada em frequência e deve ser introduzida na suspensão de célula ou tecido, que tem o potencial de impactar negativamente a esterilidade. Adicionalmente, o uso de tais ondas sonoras de alta energia introduz uma grande quantidade de energia na amostra, o que se manifesta como calor. Isto pode danificar as células, o que reduz o rendimento de células utilizáveis.

[004] Uma vez obtido, o produto celular expandido depois é movido do biorreator onde ele é purificado e concentrado. As amostras de teste são removidas do produto celular lavado e concentrado para o teste de qualidade e, se os resultados do teste mostram um produto aceitável, o produto celular engendrado final é preparado para armazenamento a longo prazo, criopreservação, administrado ao paciente do qual a amostra foi derivada, ou alguma combinação do precedente.

[005] Como pode ser avaliado, várias destas etapas requerem mover a amostra de um recipiente para um outro, requerendo intervenção pesada do usuário, o que não apenas aumenta os riscos de rotular ou manejar impropriamente a amostra ou amostras durante o processamento, mas também potencialmente impacta negativamente a esterilidade, identidade, pureza ou potência da amostra. Adicionalmente, o tempo necessário para processar uma amostra desta maneira significa que a fração celular desejada não está pronta para liberação ao paciente por horas, se não dias, o que pode ter um impacto negativo sobre a saúde de um paciente. O potencial para esterilidade comprometida e os períodos de tempo excessivamente longos necessários para processar amostras celulares são inaceitáveis para os pacientes, particularmente aqueles que são imunocomprometidos ou que requerem cuidado imediata, e também são inaceitáveis aos fornecedores, que precisam fornecer em tempo, cuidado de alta qualidade para muitos pacientes.

SUMÁRIO

[006] Assim, um método otimizado e escalonável de obter uma fração celular desejada em um período de tempo curto diretamente no ponto de atendimento, e sem a necessidade de intervenção de usuários múltiplos, é necessário. Dispositivos capazes de praticar este método também são necessários. Tais métodos e dispositivos são fornecidos pela presente divulgação. Os métodos e dispositivos divulgados eliminam a necessidade de transferir amostras celulares para um laboratório para processamento e não contatam a amostra celular com objetos estranhos durante a separação, resultando em uma amostra processada que fornece uma amostra celular desejada em um período de tempo muito curto, com menos contatos do usuário, permitindo desse modo a otimização de recursos técnicos caros.

[007] Os dispositivos e métodos divulgados aqui têm várias características, nenhuma das quais é somente responsável por seus atributos desejáveis. Sem limitar o escopo das reivindicações que seguem, certas características dos dispositivos e métodos divulgados serão debatidas brevemente. Depois de considerar este debate, e particularmente depois de ler a seção intitulada “Descrição detalhada” uma pessoa tendo habilidade comum na técnica entenderá como as características dos dispositivos e métodos fornecem várias vantagens sobre sistemas e métodos tradicionais.

[008] Em um aspecto, a presente divulgação fornece sistemas completamente fechados adequados para o bioprocessamento de amostras celulares, por exemplo, amostras de tecido adiposo que são processadas para terapia de célula-tronco autóloga. Os sistemas não são abertos ao ar, considerando assim processamento de amostra estéril e transferência da amostra por toda a totalidade do bioprocessamento.

[009] Em um primeiro aspecto, métodos de isolar uma fração celular de uma amostra de tecido são fornecidos, os métodos compreendendo: obter uma amostra de tecido de um sujeito; contatar a amostra de tecido com ondas de choque, força a partir de impactos mecânicos, ou ambos; e isolar uma fração celular da amostra de tecido; em que a fonte das ondas de choque e/ou a força a partir de impactos mecânicos não faz contato físico com a amostra de tecido.

[010] Em algumas modalidades, o tecido é selecionado de tecido adiposo, tecido cerebral, tecido faríngeo, tecido laríngeo, tecido cardíaco, tecido arterial, tecido muscular, tecido hepático, tecido da vesícula biliar, tecido renal, tecido do intestino delgado, tecido do intestino grosso, tecido de linfonodo, tecido pulmonar, tecido do baço, tecido da medula óssea, tecido estomacal, tecido venoso, tecido pancreático, tecido da bexiga urinária, osso, dentes, tecido da dentina, tecido da gengiva, tecido da pele, tecido da glândula pineal, tecido da glândula pituitária, tecido da glândula tireoide, tecido da glândula adrenal, tecido pancreático, tecido ovariano e tecido testicular.

[011] Em algumas modalidades, o tecido é tecido adiposo.

[012] Em algumas modalidades, a amostra de tecido é contatada com ondas de choque e a fonte das ondas de choque é um aplicador de onda de choque que é alimentado por um gerador de onda de choque.

[013] Em algumas modalidades, a amostra de tecido é contatada com força a partir de impactos mecânicos e a fonte da força a partir dos impactos mecânicos é um braço de impacto que é alimentado por um motor.

[014] Em algumas modalidades, a amostra de tecido é lavada uma ou mais vezes antes do contato com as ondas de choque e/ou a força a partir dos impactos mecânicos.

[015] Em algumas modalidades, as ondas de choque quebram a amostra de tecido em uma pluralidade de pequenos agrupamentos de células, uma pluralidade de células individuais, ou ambos.

[016] Em algumas modalidades, a força a partir dos impactos mecânicos quebra a amostra de tecido em uma pluralidade de pequenos agrupamentos de células, uma pluralidade de células individuais, ou ambos.

[017] Em algumas modalidades, a fração celular compreende a pluralidade de pequenos agrupamentos de células, pluralidade de células individuais, ou ambos, e o isolamento da fração celular ocorre por centrifugação.

[018] Em algumas modalidades, a centrifugação ocorre por 3 a 30 minutos em uma velocidade de 500 g a 2.000 g.

[019] Em algumas modalidades, a centrifugação ocorre por 10 minutos em 1.200 g.

[020] Em algumas modalidades, a fração celular isolada é recolocada em suspensão depois da centrifugação.

[021] Em algumas modalidades, a fração celular é isolada em 30 minutos ou menos.

[022] Em um segundo aspecto, métodos de isolar células-tronco do tecido adiposo são fornecidos, os métodos compreendendo: obter uma amostra de tecido adiposo de um sujeito; colocar a amostra de tecido em um recipiente ou cartucho; submeter a amostra de tecido à força a partir de impactos mecânicos para liberar as células-tronco; separar uma fração de célula-tronco do tecido adiposo; e centrifugar a fração de célula-tronco; em que a fonte da força dos impactos mecânicos não contata fisicamente o tecido adiposo.

[023] Em algumas modalidades, o tecido adiposo é lavado uma ou mais vezes antes de ser submetido à força a partir dos impactos mecânicos.

[024] Em algumas modalidades, a fonte da força dos impactos mecânicos é um braço de impacto que é alimentado por um motor, o motor compreendendo engrenagem capaz de reduzir a velocidade do braço de impacto quando o motor estiver operando em velocidade máxima.

[025] Em algumas modalidades, a força a partir dos impactos mecânicos é liberada ao tecido adiposo através de uma parede do recipiente ou cartucho.

[026] Em algumas modalidades, a engrenagem leva em consideração uma redução de 10 a 1 da velocidade no braço de impacto.

[027] Em algumas modalidades, o motor compreende um diâmetro de engrenagem de 0,75 polegadas (1,90 cm) e em uma velocidade de motor de 3.000 rpm, o braço de impacto tem uma velocidade de 117,8 polegadas (299,1 cm) por segundo.

[028] Em algumas modalidades, separar uma fração de célula-tronco compreende deixar o tecido adiposo separar de uma camada aquosa, a camada aquosa compreendendo as células-tronco.

[029] Em algumas modalidades, as células-tronco são isoladas do tecido adiposo em 30 minutos ou menos.

[030] Em algumas modalidades, a centrifugação ocorre de 500 g a 1.600 g por 3 a 10 minutos.

[031] Em um terceiro aspecto, métodos de isolar as células-tronco do tecido adiposo são fornecidos, os métodos compreendendo: obter uma amostra de tecido adiposo de um sujeito; colocar a amostra de tecido em um recipiente ou cartucho; submeter a amostra de tecido às ondas de choque para liberar as células-tronco; separar uma fração de célula-tronco do tecido adiposo; e centrifugar a fração de célula-tronco; em que a fonte das ondas de choque não contata fisicamente o tecido adiposo.

[032] Em algumas modalidades, o tecido adiposo é lavado uma ou mais vezes antes de ser submetido às ondas de choque.

[033] Em algumas modalidades, a fonte das ondas de choque é um aplicador de onda de choque que é alimentado por um gerador de onda de choque.

[034] Em algumas modalidades, as ondas de choque são liberadas ao tecido adiposo através da parede do recipiente ou cartucho.

[035] Em algumas modalidades, o tecido adiposo é submetido às ondas de choque tendo uma potência de 0,5 a 5,0 bars.

[036] Em algumas modalidades, o recipiente é uma bolsa de vinil tendo paredes que têm 0,25 mm de espessura e o tecido adiposo é submetido às ondas de choque tendo uma potência de 2,0 a 2,5 bars.

[037] Em algumas modalidades, a área total do tecido adiposo submetido às ondas de choque em qualquer ponto no tempo varia de 1 cm2 a 100 cm2.

[038] Em algumas modalidades, em que o recipiente é uma bolsa de vinil de 19 oz. (562 ml) tendo paredes com 0,25 mm de espessura, a quantidade total da amostra de tecido adiposo é de 30 cc, e a área total do tecido adiposo submetido às ondas de choque em qualquer ponto de tempo é de 5 cm2.

[039] Em algumas modalidades, o tecido adiposo é submetido à várias ondas de choque variando de 5.000 a 100.000.

[040] Em algumas modalidades, separar uma fração de célula-tronco compreende deixar o tecido adiposo separar de uma camada aquosa, a camada aquosa compreendendo as células-tronco.

[041] Em algumas modalidades, a centrifugação ocorre de 500 g a 1.600 g por 3 a 10 minutos.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[042] As características e vantagens da presente divulgação podem ser mais explicadas com referência à seguinte descrição detalhada e desenhos anexos que apresentam as modalidades ilustrativas.

[043] A FIG. 1 fornece uma visão geral de um método de isolar uma fração celular de uma amostra de tecido de acordo com as modalidades fornecidas pela presente divulgação.

[044] A FIG. 2 descreve um exemplo representativo de um dispositivo de onda de choque extracorporal adequado para o uso nos sistemas e métodos fornecidos pela presente divulgação.

[045] A FIG. 3 descreve um exemplo representativo de um dispositivo de impacto mecânico adequado para o uso nos sistemas e métodos fornecidos pela presente divulgação.

[046] A FIG. 4 descreve um primeiro exemplo representativo de um cartucho autônomo rígido adequado para o uso com o dispositivo de onda de choque extracorporal e/ou de impacto mecânico fornecido pela presente divulgação. Na modalidade descrita, vários componentes internos são recipientes flexíveis.

[047] A FIG. 5 descreve o exemplo representativo de um cartucho autônomo rígido adequado para o uso com o dispositivo de onda de choque extracorporal e/ou de impacto mecânico fornecido pela presente divulgação.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[048] Antes das modalidades da divulgação serem descritas, deve ser entendido que tais modalidades são fornecidas apenas por via de exemplo, e que várias alternativas às modalidades da divulgação aqui descritas podem ser utilizadas na prática da divulgação. Muitas variações, mudanças e substituições ocorrerão àqueles habilitados na técnica sem romper com a divulgação.

[049] A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científico aqui usados têm o mesmo significado como comumente entendido por alguém de habilidade comum na técnica à qual esta divulgação pertence. Embora métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles aqui descritos possam ser usados na prática ou teste da presente divulgação, os métodos e materiais adequados são descritos abaixo. Em caso de conflito, o pedido de patente, incluindo suas definições, predominarão. Além disso, os materiais, métodos, e exemplos são apenas ilustrativos e não são intencionados ser limitantes. Muitas variações, mudanças, e substituições ocorrerão àqueles habilitados na técnica sem romper com a divulgação.

[050] Como usado no relatório descritivo e reivindicações, as formas singulares “a”, “o” e “um” incluem as referências plurais a menos que o contexto claramente declare de outro modo. Por exemplo, o termo “uma célula” inclui uma pluralidade de células, incluindo misturas destas.

[051] Como aqui usado, “onda de choque extracorporal,” ondas de choque extracorporais” e/ou “ESW” significam pulsos abruptos de alta amplitude de energia mecânica, similares às ondas sonoras, que são gerados externamente a uma amostra de interesse e depois transmitidos àquela amostra. Neste aspecto, a fonte geradora de ESW não faz contato físico com a amostra; as ondas de choque por si só entram em contato com a amostra, mas a fonte geradora, não. As ondas de choque extracorporais são assim geradas por uma fonte em certa distância da amostra e são depois transmitidas à amostra. A transmissão pode ocorrer através do ar e/ou através da parede de um recipiente no qual a amostra está localizada. A ESW pode ser focada e/ou dirigida, de modo a, por exemplo, concentrar a ESW em uma área de interesse que pode cobrir a amostra inteira, ou apenas uma porção desta.

[052] Como usado aqui, “sujeito” ou “paciente” se referem a um mamífero, por exemplo, um ser humano.

[053] Os métodos fornecidos pela presente divulgação utilizam as ondas de choque extracorporais, impactos mecânicos, vibrações e/ou princípios de litotripsia para quebrar uma amostra de tecido em fragmentos menores - agrupamentos de células e/ou células únicas - depois que uma fração celular desejada possa ser isolada da amostra. Em vários aspectos, os métodos compreendem isolar uma amostra de um sujeito, a amostra compreendendo um tipo de célula de interesse, comunicando esta amostra com ondas de choque extracorporais, mas não com o dispositivo usado para gerar a ESW, para quebrar a amostra em pequenos agrupamentos de células e/ou células individuais, e depois isolar o tipo celular de interesse da amostra quebrada.

[054] Os dispositivos fornecidos pela presente divulgação utilizam ondas de choque focadas e/ou dirigidas, e/ou impactos mecânicos focados e dirigidos para quebrar uma amostra de interesse. Em vários aspectos, os dispositivos fornecidos pela presente divulgação mantêm a amostra em um ambiente estéril fechado durante a exposição às ondas de choque ou impactos mecânicos. Portanto, as ondas de choque e/ou impactos mecânicos são gerados fora do recipiente fechado estéril e são transmitidos através de uma ou mais paredes do recipiente no seu interior, onde a amostra está localizada.

[055] Mantendo-se a fonte da ESW em uma distância da amostra de interesse, a fonte de ESW (o dispositivo que as geram) não faz contato físico com a amostra. Isto melhora muito a esterilidade da amostra e qualquer fração celular que for isolada da amostra. Do ponto de vista de um prestador de cuidados de saúde, isto também melhora muito os requerimentos para esterilidade e ajuda a garantir que a fração celular de interesse derivada da amostra é estéril para o uso do paciente. Adicionalmente, manter a fonte que gera ESW da amostra de interesse garante que o gerador não adicionará energia ou calor na amostra de interesse, que pode danificar ou matar as células, danificar o DNA e reduzir dramaticamente o rendimento. A este respeito, os dispositivos fornecidos pela presente divulgação são uma melhoria aos outros sistemas conhecidos, tal como o ultrassom.

[056] Os métodos e dispositivos fornecidos pela presente divulgação são capazes de isolar uma fração celular desejada de uma amostra de tecido prontamente, em algumas modalidades em 30 minutos ou menos. A velocidade na qual os métodos e dispositivos divulgados podem ser usado fornecem uma vantagem significante em que a fração celular desejada que é isolada da amostra pode ser imediatamente disponível para o uso.

MÉTODOS

[057] A Figura 1 apresenta um método de isolar uma fração celular de interesse de uma amostra de tecido de acordo com as modalidades fornecidas pela presente divulgação.

[058] Na modalidade descrita, o método começa primeiro extraindo-se o tecido de um sujeito (100). O tecido pode ser de qualquer tipo, contanto que o tecido quebrará quando submetido às ondas de choque extracorporais. Em algumas modalidades, o tecido é tecido adiposo ou gordura. Em algumas modalidades, o tecido é de um órgão interno, por exemplo, o cérebro, faringe, laringe, coração, artérias, músculos, fígado, vesícula biliar, rins, intestino delgado, intestino grosso, linfonodos, pulmões, baço, medula óssea, estômago, veias, pâncreas, bexiga urinária, ossos, dentes, dentina, gengiva ou pele. Em algumas modalidades o tecido é de um componente do sistema endócrino, por exemplo, a glândula pineal, glândula pituitária, glândula tireoide, glândula adrenal, pâncreas, ovário ou testículos.

[059] A extração pode ocorrer por intermédio de qualquer número de métodos conhecidos. Em algumas modalidades, a extração tissular ocorre por intermédio de uma seringa. Em algumas modalidades, a extração tissular ocorre cirurgicamente tal que a amostra de tecido é colocada em um primeiro recipiente na remoção de um sujeito.

[060] O tecido é então transferido a um recipiente ou cartucho de processamento 105. Os dispositivos fornecidos pela presente divulgação fornecem todos os componentes necessários para o bioprocessamento celular por ESW rápido e fácil de usar. Ainda que alguns dos componentes dos métodos e/ou dispositivos divulgados sejam separáveis uns dos outros, estes são configurados para conectar a um outro em de uma maneira completamente estéril, permitindo desse modo a transferência da amostra de um componente para o outro durante o processamento. A este respeito, a totalidade da amostra é processada em um sistema único, garantindo desse modo a esterilidade.

[061] A transferência estéril é realizada sem expor a amostra ao ambiente externo. A este respeito, a transferência pode ocorrer por intermédio de qualquer número de maneiras que manterão o ambiente estéril fechado. Em algumas modalidades, a transferência é realizada acoplando-se conectores luer lock macho e fêmea uns aos outros entre o primeiro recipiente que contém a amostra extraída do sujeito, e o recipiente ou cartucho de processamento. Em algumas modalidades, a transferência é realizada através da acoplagem estéril do primeiro recipiente e o recipiente ou cartucho de processamento usando um dispositivo de conexão estéril. A amostra é transferida, mecanicamente ou por fluxo gravitacional, do primeiro recipiente ao recipiente ou cartucho de processamento.

[062] Em algumas modalidades, o primeiro recipiente é inserido no cartucho e acoplado de modo estéril usando um dispositivo de conexão estéril para assentar o recipiente de processamento dentro do cartucho. O primeiro recipiente como a câmara de processamento já contém a amostra.

[063] A este respeito, nesta divulgação, toda vez que um tecido e/ou amostra celular são divulgados como sendo movidos de um recipiente para um outro, tal movimento pode ocorrer de modo a manter a integridade do sistema fechado, não expondo deste modo a amostra ao ambiente externo.

[064] Uma vez que a amostra é transferida para o recipiente ou cartucho de processamento, a amostra de tecido é lavada uma ou mais vezes 110. A lavagem pode ocorrer como aqui descrito, por intermédio do uso de solução salina estéril. A lavagem garante que a amostra é livre de tantas impurezas quanto possível antes do processamento, aumentando assim o nível de pureza da fração celular a ser isolada desta.

[065] Em algumas modalidades, a lavagem é realizada pela agitação mecânica do recipiente ou cartucho de processamento. Se múltiplas etapas de lavagem são desejadas e/ou necessárias, a solução salina estéril é drenada do recipiente ou cartucho de processamento depois de uma lavagem única ser terminada, e uma nova solução salina estéril é introduzida no recipiente ou cartucho para cada lavagem subsequente. A este respeito, toda vez que a solução salina estéril é drenada e uma nova solução salina estéril é introduzida no recipiente ou cartucho, isto é feito de modo a manter o ambiente estéril fechado como aqui descrito.

[066] Depois de lavar, a amostra de tecido é processada 115. Como indicado, o processamento pode ocorrer por intermédio do uso de ESW, impacto mecânico, vibração e cisalhamento, ou combinações destes.

[067] Em algumas modalidades, o processamento ocorre por intermédio de ESW e a amostra de tecido é quebrada em uma pluralidade de pequenos agrupamentos celulares. Em algumas modalidades, o processamento ocorre por intermédio de ESW e a amostra de tecido é quebrada em uma pluralidade de pequenos agrupamentos celulares e uma pluralidade de células individuais. Em algumas modalidades, o processamento ocorre por intermédio de ESW e a amostra de tecido é completamente quebrada em uma pluralidade de células individuais.

[068] Em algumas modalidades, o processamento ocorre por intermédio de impacto mecânico e cisalhamento e a amostra de tecido é quebrada em uma pluralidade de pequenos agrupamentos celulares. Em algumas modalidades, o processamento ocorre por intermédio de impacto mecânico e cisalhamento e a amostra de tecido é quebrada em uma pluralidade de pequenos agrupamentos celulares e uma pluralidade de células individuais. Em algumas modalidades, o processamento ocorre por intermédio de impacto mecânico e cisalhamento e a amostra de tecido é completamente quebrada em uma pluralidade de células individuais.

[069] Em algumas modalidades, o processamento ocorre por intermédio de uma combinação de ESW, impacto mecânico e cisalhamento e a amostra de tecido é quebrada em uma pluralidade de pequenos agrupamentos celulares. Em algumas modalidades, o processamento ocorre por intermédio de uma combinação de ESW, impacto mecânico e cisalhamento e a amostra de tecido é quebrada em uma pluralidade de pequenos agrupamentos celulares e uma pluralidade de células individuais. Em algumas modalidades, o processamento ocorre por intermédio de uma combinação de ESW, impacto mecânico e cisalhamento e a amostra de tecido é completamente quebrada em uma pluralidade de células individuais.

[070] Depois do processamento, a suspensão celular representando o que é deixado da amostra, que pode ser uma pluralidade de pequenos agrupamentos celulares, uma pluralidade de células individuais, ou ambos, é filtrada e centrifugada 120. A filtração pode ocorrer em um dispositivo separado do recipiente ou cartucho de processamento, ou dentro do recipiente ou cartucho de processamento em si. Em algumas modalidades, a filtração ocorre em um dispositivo separado, caso este em que a suspensão celular é transferida para o filtro por intermédio de meios estéril, como aqui descrito. Em algumas modalidades, a filtração ocorre conforme a suspensão celular está sendo movida do recipiente ou cartucho em um ou mais tubos de centrífuga.

[071] Em algumas modalidades, a transferência para o dispositivo de filtração é realizada acoplando-se conectores luer lock macho e fêmea uns aos outros entre o recipiente ou cartucho de processamento e o dispositivo de filtração. Em algumas modalidades, a transferência é realizada por acoplamento estéril do recipiente ou cartucho de processamento e do dispositivo de filtração usando um dispositivo de conexão estéril. A amostra é transferida, mecanicamente ou através do fluxo gravitacional, do recipiente ou cartucho de processamento ao dispositivo de filtração.

[072] Em algumas modalidades, a filtração ocorre dentro do recipiente ou cartucho de processamento, como aqui descrito.

[073] Em vários aspectos, a centrifugação ocorre fora do recipiente ou cartucho de processamento. Em algumas modalidades, a suspensão celular é transferida para um ou mais tubos de centrífuga localizados dentro do recipiente ou cartucho de processamento. Quando enchidos, os tubos de centrífuga são movidos do recipiente ou cartucho de processamento a uma centrífuga por intermédio de meios estéreis, como aqui descrito.

[074] Em algumas modalidades, a suspensão celular é transferida para um ou mais tubos de centrífuga localizados fora do recipiente ou cartucho de processamento por intermédio de meios estéreis, como aqui descrito. Quando enchidos, os tubos de centrífuga são movidos do recipiente ou cartucho de processamento a uma centrífuga por intermédio de meios estéreis, como aqui descrito.

[075] A duração e velocidade da centrifugação podem variar, dependendo do tipo de tecido sendo processado. Em algumas modalidades, a suspensão celular é centrifugada por um período de 3 a 30 minutos e em uma velocidade de 500 g a 2.000 g. Em algumas modalidades, a suspensão celular é centrifugada por 10 a 25 minutos em uma velocidade de 1.000 g a 1.800 g. Em algumas modalidades, a suspensão celular é centrifugada por 10 minutos a 1.200 g. Em algumas modalidades, a suspensão celular é centrifugada por 7 minutos a 1.200 g. Em algumas modalidades, a suspensão celular é centrifugada por 5 minutos a 1.200 g. Em algumas modalidades, a suspensão celular é centrifugada por 3 minutos a 1.200 g. Em algumas modalidades, a suspensão celular é centrifugada por 10 minutos a 900 g. Em algumas modalidades, a suspensão celular é centrifugada por 7 minutos a 900 g. Em algumas modalidades, a suspensão celular é centrifugada por 5 minutos a 900 g. Em algumas modalidades, a suspensão celular é centrifugada por 3 minutos a 900 g. Em algumas modalidades, a suspensão celular é centrifugada por 10 minutos a 600 g. Em algumas modalidades, a suspensão celular é centrifugada por 7 minutos a 600 g. Em algumas modalidades, a suspensão celular é centrifugada por 5 minutos a 600 g. Em algumas modalidades, a suspensão celular é centrifugada por 3 minutos a 600 g.

[076] Existem vários meios através dos quais múltiplos tipos de células presentes na suspensão celular podem ser separados um dos outros por intermédio de centrifugação. Por exemplo, um gradiente de densidade pode ser utilizado tal que, durante a centrifugação, as células se separarão em faixas de acordo com suas densidades específicas. Adicionalmente, os protocolos de exclusão por tamanho podem ser usados para separar as células por intermédio do seu tamanho. Adicionalmente, a separação pode começar antes da centrifugação, por exemplo, deixando a amostra processada de tecido decantar e separando os fragmentos celulares indesejados da fração celular desejada antes da centrifugação. O tipo de separação técnica usado pode variar com base na fração celular desejada a ser isolada.

[077] Uma vez que a fração celular desejada é isolada, esta pode ser recolocada em suspensão para a administração ao sujeito do qual esta foi derivada 125. Em algumas modalidades, a fração celular desejada é recolocada em suspensão em um pequeno volume de fluido obtido do tubo de centrífuga. Em algumas modalidades a fração celular desejada é recolocada em suspensão em solução salina estéril.

[078] Em um aspecto, a fração celular desejada é células-tronco e o tecido a partir do qual as células-tronco são derivadas é gordura.

[079] Uma primeira modalidade de um método de processamento de células- tronco da gordura segue:

[080] A gordura é obtida de um paciente por intermédio de lipoaspiração. A lipoaspiração pode ser realizada por intermédio de uma seringa, onde a gordura é removida do paciente diretamente por intermédio de uma agulha, ou por intermédio de uma máquina de lipoaspiração. A quantidade de gordura removida durante a lipoaspiração pode variar, dependendo do número de células-tronco desejado. Em algumas modalidades, a lipoaspiração é uma mini-lipoaspiração, em que cerca de 30 cc a cerca de 50 cc de gordura são removidos do paciente. Em algumas modalidades, a lipoaspiração é uma micro-lipoaspiração, em que cerca de 5 cc a cerca de 29 cc de gordura são removidos do paciente. Em algumas modalidades, a lipoaspiração é uma lipoaspiração clínica típico, caso este em que 300 cc de gordura ou mais são removidos do paciente.

[081] Uma vez que a gordura é removida do paciente, esta é transferida a um recipiente ou cartucho de processamento estéril. A transferência ocorre por intermédio de meios estéreis, como aqui descrito. Em algumas modalidades, a gordura é removida do paciente por intermédio de uma seringa e é transferida da seringa ao recipiente ou cartucho de processamento acoplando-se conectores luer lock macho e fêmea uns aos outros entre a seringa e o recipiente ou cartucho de processamento. Em algumas modalidades, a gordura é removida do paciente por intermédio de uma seringa e a seringa é acoplada estéril dentro do recipiente ou cartucho de processamento acoplando-se conectores luer lock macho e fêmea uns aos outros entre a seringa e o recipiente ou cartucho. Em algumas modalidades, a gordura é removida do paciente por intermédio de uma seringa e é transferida da seringa ao recipiente ou cartucho de processamento acoplando-se conectores luer lock macho e fêmea uns aos outros entre a seringa e o recipiente ou cartucho de processamento dentro do cartucho. Em algumas modalidades, a gordura é removida do paciente por intermédio de um dispositivo de lipoaspiração e é transferida do dispositivo de lipoaspiração ao recipiente ou cartucho de processamento por acoplagem estéril do dispositivo de lipoaspiração e do recipiente ou cartucho de processamento usando um dispositivo de conexão estéril.

[082] Em algumas modalidades, a transferência pode ocorrer por intermédio do fluxo gravitacional. Em algumas modalidades, a transferência ocorre mecanicamente, por exemplo, pressionando-se fisicamente o êmbolo de uma seringa e forçando a gordura do interior da seringa no interior do recipiente ou cartucho de processamento. Em algumas modalidades, a transferência pode ocorrer por intermédio de um dispositivo, tal como uma bomba.

[083] O volume do recipiente ou cartucho usado para receber a gordura pode variar com a quantidade de gordura obtida do paciente. Em algumas modalidades, 30 cc a 50 cc de gordura, removidos por intermédio de uma mini- lipoaspiração, são transferidos para um recipiente ou cartucho tendo um volume de 9 onças fluidas (fluid ounce) a 19 onças fluidas.

[084] Um volume de solução salina estéril igual à quantidade de gordura removida do paciente é depois transferida para o recipiente ou cartucho de modo a lavar a gordura. Por via de exemplo, se 30 cc de gordura foram removidos do paciente, então 30 ml da solução salina estéril são usados para lavar a amostra. Em algumas modalidades, um volume de solução salina estéril maior do que a quantidade de gordura removida do paciente é depois transferido para o recipiente ou cartucho de modo a lavar a gordura. Por via de exemplo, se 30 cc de gordura foram removidos do paciente, então 35 ml de solução salina estéril são usados para lavar a amostra. Em algumas modalidades, um volume de solução salina estéril menor do que a quantidade de gordura removida do paciente é então transferida para o recipiente ou cartucho de modo a lavar a gordura. Por via de exemplo, se 30 cc de gordura foram removidos do paciente, então 25 ml da solução salina estéril são usados para lavar a amostra. Em algumas modalidades, uma combinação de volumes de solução salina estéril é adicionada à quantidade de gordura de modo a lavar a gordura. A transferência da solução salina ao recipiente ou cartucho é realizada de modo a manter a esterilidade do sistema, como aqui descrito. Em algumas modalidades, a solução salina estéril é transferida para o recipiente ou cartucho acoplando-se conectores luer lock macho e fêmea uns aos outros entre o recipiente contendo a solução salina estéril e o recipiente ou cartucho de processamento. Em algumas modalidades, a solução salina estéril é transferida para o recipiente ou cartucho por acoplamento estéril do recipiente de solução salina estéril e do recipiente ou cartucho de processamento usando um dispositivo de conexão estéril.

[085] A lavagem é realizada agitando-se ou turbilhonando-se suavemente o recipiente ou cartucho contendo a gordura e solução salina estéril.

[086] O recipiente ou cartucho são depois posicionados de tal modo a permitir que a gordura (agora lavada) separe da solução salina estéril. Devido a gordura ser menos densa do que a solução salina, está se elevará e flutuará no topo da solução salina. A quantidade de tempo necessário para a separação ocorrer variará dependendo da composição individual da amostra. Em algumas modalidades, a separação pode ocorrer de 1 a 30 minutos. Em algumas modalidades, a separação pode ocorrer de 1 a 15 minutos. Em algumas modalidades, separação pode ocorrer de 1 a 10 minutos. Em algumas modalidades, separação pode ocorrer de 1 a 5 minutos. Em algumas modalidades, separação pode ocorrer de 10 segundos a 1 minuto.

[087] A solução salina é depois drenada do recipiente ou cartucho tão completamente quanto possível, assim somente a gordura permanece. A drenagem pode ocorrer por intermédio de vários meios, dependendo do tipo de recipiente ou cartucho utilizado no método. Em algumas modalidades, a solução salina é drenada do recipiente ou cartucho por intermédio de um tubo localizado no fundo do recipiente ou cartucho. A drenagem pode ocorrer ativamente, usando uma seringa ou uma bomba, ou passivamente por intermédio de fluxo gravitacional. Em algumas modalidades, a drenagem ocorre de modo a manter a integridade do sistema estéril, como aqui descrito.

[088] A lavagem é repetida até a gordura ter uma cor dourada e a solução salina é apenas levemente turva depois da conclusão de uma lavagem. Em algumas modalidades, a lavagem ocorre de 1 a 5 vezes, em algumas modalidades 1 a 4 vezes, em algumas modalidades 1 a 3 vezes, em algumas modalidades 1 a 2 vezes, e em algumas modalidades 1 vez.

[089] Uma vez a lavagem foi terminada, a gordura está pronta para o processamento.

[090] Opcionalmente, a solução salina estéril é adicionada à bolsa para processamento, embora isto não seja necessário. A adição de solução salina fornecerá espaço para que as células e/ou pequenos agrupamentos celulares se movam livremente um dos outros durante o processamento, desse modo ajudando a quebrar a gordura em células individuais. Se a solução salina for adicionada, esta é adicionada de uma maneira que manterá a integridade do sistema estéril como aqui descrito.

[091] O volume de solução salina opcionalmente adicionada pode variar. Em algumas modalidades, o volume de solução salina adicionado varia de nenhum até 2 vezes o volume de gordura removido do paciente. Em algumas modalidades, uma quantidade igual da solução salina é usada (por exemplo, 30 ml da solução salina para 30 cc de gordura).

[092] O ar em excesso é removido do recipiente ou cartucho usando uma bomba ou seringa. Em algumas modalidades, o ar em excesso é removido do mesmo tubo localizado no fundo do recipiente ou cartucho a partir do qual que a lavagem de solução salina estéril é drenada. Em algumas modalidades, o ar é drenado em uma maneira que mantém a integridade do sistema estéril fechado, como aqui descrito.

[093] O recipiente ou cartucho de processamento é então movido a um aparelho de processamento. Um exemplo de um aparelho de processamento adequado 200 é mostrado na Fig. 2. Na modalidade descrita, o recipiente ou cartucho de processamento 205 é fixado em uma plataforma rígida 210 para processamento. A plataforma 210 controla o movimento do recipiente ou cartucho 205 durante o processamento de ESW.

[094] A plataforma 210 pode ser feita de qualquer material rígido adequado, incluindo madeira, metal, plástico, acrílico e semelhantes. Em algumas modalidades, a plataforma 210 é feita de madeira.

[095] O aparelho de processamento 200 abriga um aplicador de onda de choque 215 capaz de liberar as ondas de choque ao interior do recipiente ou cartucho 205. O aplicador de onda de choque 215 é alojado no aparelho de processamento 200 por intermédio de uma plataforma aplicadora 220. A plataforma aplicadora 220 e o aplicador de onda de choque 215 são mantidos em uma distância longe da gordura contida dentro do recipiente ou cartucho 205 tal que o aplicador de onda de choque 215 nunca é colocado em contato direto com a gordura. Isto garante que as ondas de choque liberadas para a gordura são extracorporais, ou ESW. Em algumas modalidades, o aplicador de onda de choque 215 pode ser colocado em contato direto com o recipiente ou cartucho de processamento 205. Em tais modalidades, as paredes do recipiente ou cartucho 205 garantem que o aplicador de onda de choque 215 nunca faça contato direto com a gordura.

[096] O movimento da plataforma aplicadora 220, e do aplicador de onda de choque 215, podem ocorrem em três planos direcionais, X, Y e Z, cada um sendo controlado por seu motor próprio: um motor de plano X 230, um motor de plano Y 235 e um motor de plano Z 240. Em algumas modalidades, estes motores são motores de passo NEMA 17. Cada um dos motores 230, 235 e 240 é controlado por um controlador de motor 225, que permite o movimento da plataforma aplicadora 220 e aplicador de onda de choque 215 em três dimensões acima e em torno do recipiente ou cartucho 205. Em algumas modalidades, os motores são controlados por uma placa de microprocessador Arduino v6 programada com o firmware Marlin. Em algumas modalidades, os motores são controlados por uma placa Arduino v6 com o firmware Marlin. Em algumas modalidades, apenas o motor do plano X 230 é usado. Em algumas modalidades, apenas o motor do plano Y 235 é usado. Em algumas modalidades, apenas o motor do plano Z 240 é usado. Em algumas modalidades, apenas o motor do plano X 230 é usado. Em algumas modalidades, apenas o motor do plano X 230 e o motor do plano Y 235 são usados. Em algumas modalidades, apenas o motor do plano X 230 e o motor do plano Z 240 são usados. Em algumas modalidades, apenas o motor do plano Y 235 e o motor do plano Z 240 são usados. Em algumas modalidades, o motor do plano X 230, o motor do plano Y 235 e o motor do plano Z 240 são usados.

[097] Este movimento tridimensional da plataforma aplicadora 220 e do aplicador de onda de choque 215 permite que toda a gordura na amostra extraída seja exposta às ondas de choque extracorporais durante o processamento.

[098] As ondas de choque são depois liberadas do aplicador de onda de choque 215 através de um gel ou membrana de transmissão contendo um gel de transmissão, através das paredes do recipiente ou cartucho 205, e para a amostra de gordura de modo a quebrar a gordura, liberando pequenos agrupamentos celulares e células individuais da gordura. Em algumas modalidades, o gel de transmissão é o Gel de Transmissão Condutor REF 4248 fabricado pela Chattanooga by DJO, LLC, 1430 Decision Street, Vista, CA 92081, EUA. Nestas modalidades nas quais a solução salina estéril é adicionada à gordura antes do processamento, os pequenos agrupamentos celulares e/ou células individuais liberados da gordura se moverão na solução salina.

[099] O aplicador de onda de choque 215 é alimentado por um gerador de onda de choque 245, que produz as ESW que são transmitidas para a gordura por intermédio do aplicador de onda de choque 215. Em algumas modalidades, o gerador de onda de choque é um MasterPuls MP100 fabricado pela Storz Medical AG, 8274 Tagerwilen, Suíça. Em algumas modalidades, o gerador de onda de choque é o BS-SWT2X fabricado pela Lumsail Industrial Inc., 4/F, No 9Yi, Lane 2, Suide Road, Shanghai, 200331, China.

[0100] A potência da ESW liberada para a gordura pode variar. Por exemplo, pode ser necessário aumentar a potência da ESW de modo a penetrar as paredes de recipiente ou cartucho 205 com paredes mais espessas. Geralmente, a potência da ESW liberada para a gordura pode variar dependendo da espessura das paredes do recipiente ou cartucho 205 e/ou do material que recipiente ou cartucho 205 são feitos. Em algumas modalidades, a potência da ESW liberada para a gordura varia de 0,5 a 5,0 bars. Em algumas modalidades, a potência da ESW liberada para a gordura varia de 1,0 a 4,5 a bars. Em algumas modalidades, a potência da ESW liberada para a gordura varia de 1,5 a 4,0 bars. Em algumas modalidades, a potência da ESW liberada para a gordura varia de 2,0 a 3,5 bars. Em algumas modalidades, o recipiente 205 é uma bolsa de vinil tendo paredes com espessura de 0,25 mm e o nível de potência da ESW varia de 2,0 a 2,5 bars.

[0101] A área coberta pela ESW liberada pelo aplicador de onda de choque 215 pode variar. Quanto maior a área coberta pelo aplicador de onda de choque 215, maior a área de superfície da gordura que é exposta à ESW. Em algumas modalidades, a área total coberta pelo aplicador de onda de choque 215 varia de 1 cm2 a 100 cm2, em algumas modalidades de 1 cm2 a 90 cm2, em algumas modalidades de 1 cm2 a 80 cm2, em algumas modalidades de 1 cm2 a 70 cm2, em algumas modalidades de 1 cm2 a 60 cm2, em algumas modalidades de 1 cm2 a 50 cm2, em algumas modalidades de 1 cm2 a 40 cm2, em algumas modalidades de 1 cm2 a 30 cm2, em algumas modalidades de 1 cm2 a 20 cm2, em algumas modalidades de 1 cm2 a 10 cm2, e em algumas modalidades de 1 cm2 a 5 cm2. Em algumas modalidades, a área total coberta pelo aplicador de onda de choque 215 é de 5 cm2.

[0102] Em uma modalidade, o recipiente 205 é uma bolsa de vinil de 19 oz (562 ml) tendo paredes com 0,25 mm de espessura, a quantidade total de gordura obtida do paciente é 30 cc, e uma adição opcional de 30 ml da solução salina (um volume igual da amostra de gordura) é adicionada à bolsa de vinil antes do processamento. Nesta modalidade, a área total da bolsa, e então, a quantidade total da amostra de gordura exposta à ESW é de aproximadamente 5 cm2.

[0103] O número de ondas de choque liberadas para a amostra de gordura pode variar. Em algumas modalidades, o número total de ondas de choque varia de 5.000 a 100.000, em algumas modalidades de 10.000 a 50.000, em algumas modalidades de 10.000 a 25.000, e em algumas modalidades de 10.000 a 20.000. Em algumas modalidades, o número total de ondas de choque é de 25.000.

[0104] Nesta modalidade, as células-tronco são separadas da amostra de gordura obtida do paciente. Usando uma ponta de aplicador de 5 cm2 no aplicador de onda de choque 215, uma faixa numérica de onda de choque de 10.000 a 50.000 em uma faixa em bar de 2,0 a 2,5 é suficiente para separar tanto as células-tronco quanto uma fração vascular estrômica da gordura. Como aqui usado, “fração vascular estrômica” significa uma fração celular obtida das amostras tissulares dos processos que compreende as células obtidas da separação e dissociação da fração celular, que em algumas modalidades é gordura. A fração vascular estrômica compreende, sem limitação, células-tronco, fatores de crescimento e células progenitoras, entre outras coisas.

[0105] Depois das ESW serem aplicadas à amostra de gordura, o recipiente ou cartucho é submetido à agitação mecânica por um breve período de tempo. Em algumas modalidades, a agitação mecânica é a agitação. Em algumas modalidades, a agitação mecânica é inverter o recipiente ou cartucho 205 uma ou mais vezes. Em algumas modalidades o período de tempo curto varia de 1 a 30 segundos, em algumas modalidades de 1 a 15 segundos, e em algumas modalidades de 1 a 10 segundos. Em algumas modalidades, o período de tempo curto é aproximadamente de 10 segundos. A agitação permite que as células-tronco e a fração vascular estrômica que foram liberadas da gordura separem dos fragmentos graxos celulares e qualquer tecido adiposo prolongado que ainda pode estar presente no recipiente ou cartucho 205.

[0106] O recipiente ou cartucho 205 é depois posicionado de tal maneira a permitir que a gordura (agora processada) separe da solução salina estéril que agora contém as células-tronco e a fração vascular estrômica que foram separadas da gordura pelo ESW. Devido a gordura ser menos densa do que a solução salina contendo células-tronco, esta se elevará e flutuará no topo da solução salina. A quantidade de tempo necessária para a separação ocorrer variará dependendo da composição individual da amostra de gordura. Em algumas modalidades, a separação pode ocorrer de 1 a 30 minutos. Em algumas modalidades, a separação pode ocorrer de 1 a 15 minutos. Em algumas modalidades, a separação pode ocorrer de 1 a 10 minutos. Em algumas modalidades, a separação pode ocorrer de 1 a 5 minutos. Em algumas modalidades, a separação pode ocorrer de 10 segundos a 1 minuto. Em algumas modalidades, a separação pode ocorrer em menos do que 1 minuto.

[0107] As células-tronco foram agora separadas da amostra gordura e foram agora colocadas em suspensão na camada de solução salina estéril.

[0108] A camada de solução salina contendo célula-tronco é depois removida do recipiente ou cartucho 205 tão completamente como possível, assim somente a gordura permanece. A remoção pode ocorrer por intermédio de vários meios, dependendo do tipo de recipiente ou cartucho 205 utilizado no método. Em algumas modalidades, a solução salina é drenada do recipiente ou cartucho 205 por intermédio de um tubo localizado no fundo do recipiente ou cartucho 205. A drenagem pode ocorrer ativamente, usando uma seringa ou uma bomba, ou passivamente por intermédio do fluxo gravitacional. Em algumas modalidades, a camada contendo célula tronca é removida de uma maneira que manterá a integridade do ambiente estéril fechado, como aqui descrito.

[0109] Em algumas modalidades, a camada de solução salina contendo célula-tronco é passada através de um filtro durante a remoção do recipiente ou cartucho 205. O tamanho do filtro pode variar. Em algumas modalidades, o tamanho do filtro varia de 40 μm a 100 μm. Em algumas modalidades, o tamanho do filtro é de 70 μm. Em várias modalidades, o filtro é náilon.

[0110] Depois de ou durante a remoção do recipiente ou cartucho 205, a solução salina contendo células-tronco é movida em um ou mais tubos de centrífuga. Em algumas modalidades, o movimento ocorre de uma maneira que mantém a integridade do ambiente estéril fechado, como aqui descrito. A centrifugação continua de modo a concentrar as células-tronco em uma pelota no fundo do tubo de centrífuga.

[0111] As células-tronco são concentradas por centrifugação de 500 g a 1.600 g por 3 a 10 minutos. Em algumas modalidades, as células-tronco são concentradas por centrifugação por 10 minutos a 1.200 g.

[0112] O fluido é removido do tubo, deixando apenas as células-tronco no fundo. O fluido pode ser removido através de decantação, aspiração ou meios semelhantes.

[0113] Uma pequena quantidade de fluido é colocada no(s) tubo(s) de centrífuga de modo a recolocar as células-tronco em suspensão. Em algumas modalidades, a quantidade de fluido adicionado aos tubos de centrífuga varia de 1 ml a 5 ml. Em algumas modalidades, o fluido é solução salina, plasma rico em plaquetas, ácido hialurônico, um gel de fixação, hidrogel, armação, fibrina, cola, ou combinações de qualquer um dos precedentes. Em algumas modalidades, as células são recolocadas em suspensão no aspirado de centrifugação.

[0114] Com as células-tronco flutuando na suspensão, estas estão prontas para o uso. Tal uso pode incluir, sem limitação, a reintrodução no paciente a partir do qual estas foram derivadas, criopreservação, expansão e semelhantes. Em algumas modalidades, as células-tronco concentradas, recolocadas em suspensão são movidas em uma seringa, por intermédio de uma agulha hipodérmica, para o uso no paciente. Em algumas modalidades, as células-tronco concentradas, recolocadas em suspensão são semeadas em uma armação de tecido para cultivá-las no tecido cardíaco, muscular, ósseo, cartilaginoso, hepático, renal, ou outros tecidos e estruturas orgânicos. Em algumas modalidades, as células-tronco concentradas recolocadas em suspensão são transformadas em células-tronco pluripotentes induzidas fazendo com que estas expressem fatores de transcrição de pluripotência.

[0115] Uma segunda modalidade de um método de processamento de células-tronco da gordura segue:

[0116] A gordura é obtida de um paciente por intermédio de lipoaspiração. A lipoaspiração pode ser realizada por intermédio de uma seringa, onde a gordura é removida do paciente diretamente por intermédio de uma agulha, ou por intermédio de uma máquina de lipoaspiração. A quantidade de gordura removida durante a lipoaspiração pode variar, dependendo do número desejado de células-tronco. Em algumas modalidades, a gordura é removida do paciente por intermédio de uma seringa e a seringa é acoplada estéril dentro do cartucho acoplando-se conectores luer lock macho e fêmea entre si, entre a seringa e o cartucho. Em algumas modalidades, a gordura é removida do paciente por intermédio de uma seringa e é transferida da seringa para recipiente ou cartucho de processamento acoplando-se conectores luer lock macho e fêmea uns aos outros entre a seringa e o recipiente ou cartucho de processamento dentro do cartucho. Em algumas modalidades, a lipoaspiração é um mini-lipoaspiração, em que cerca de 30 cc a cerca de 50 cc de gordura é removida do paciente. Em algumas modalidades, a lipoaspiração é uma micro-lipoaspiração, em que cerca de 5 cc a cerca de 29 cc de gordura são removidos do paciente. Em algumas modalidades, a lipoaspiração é uma lipoaspiração clínica típica, caso este em que 300 cc de gordura ou mais são removidos do paciente.

[0117] Uma vez que a gordura é removida do paciente, a mesma é transferida em um recipiente ou cartucho de processamento estéril. A transferência ocorre por intermédio de meios estéreis, como aqui descritos. Em algumas modalidades, a gordura é removida do paciente por intermédio de uma seringa e é transferida da seringa para o recipiente ou cartucho de processamento acoplando-se conectores luer lock macho e fêmea entre si entre a seringa e o recipiente ou cartucho de processamento. Em algumas modalidades, a gordura é removida do paciente por intermédio de um dispositivo de lipossucção e é transferida do dispositivo de lipossucção para o recipiente ou cartucho de processamento engatando-se de modo estéril o dispositivo de lipossucção e o recipiente ou cartucho de processamento usando um dispositivo de conexão estéril.

[0118] Em algumas modalidades, a transferência pode ocorrer por intermédio de fluxo por gravidade. Em algumas modalidades, a transferência pode ocorrer mecanicamente, por exemplo apertando-se fisicamente o êmbolo de uma seringa e forçando a gordura do interior da seringa para dentro de uma câmara interna do recipiente ou cartucho de processamento. Em algumas modalidades, a transferência pode ocorrer por intermédio de um dispositivo, tal como uma bomba.

[0119] O volume do recipiente ou cartucho usados para receber a gordura pode variar com a quantidade de gordura obtida do paciente. Em algumas modalidades, 30 cc a 50 cc de gordura, removidos por intermédio de uma mini- lipossucção, é transferida para um recipiente ou cartucho tendo um volume de 9 onças fluidas a 19 onças fluidas.

[0120] Um volume de solução salina estéril igual à quantidade de gordura removida do paciente é depois transferido para o recipiente ou cartucho de modo a lavar a gordura. Por via de exemplo, se 30 cc de gordura foram removidos do paciente, então 30 mL de solução salina estéril são usados para lavar a amostra. Em algumas modalidades, a gordura é removida do paciente por intermédio de uma seringa e a seringa é acoplada de modo estéril dentro do cartucho acoplando-se conectores luer lock machos e fêmeas entre si entre a seringa e o cartucho. Em algumas modalidades, a gordura é removida do paciente por intermédio de uma seringa e é transferida da seringa para o recipiente ou cartucho de processamento acoplando-se conectores luer lock machos e fêmeas entre si entre a seringa e o recipiente ou cartucho de processamento dentro do cartucho. A transferência da solução salina para o recipiente ou cartucho é realizada de modo a manter a esterilidade do sistema, como aqui descrito. Em algumas modalidades, a solução salina estéril é transferida para o recipiente ou cartucho acoplando-se conectores luer lock machos e fêmeas entre si entre o recipiente contendo a solução salina estéril e o recipiente ou cartucho de processamento. Em algumas modalidades, a solução salina estéril é transferida para o recipiente ou cartucho acoplando-se de modo estéril o recipiente de solução salina estéril e o recipiente ou cartucho de processamento usando um dispositivo de conexão estéril.

[0121] A lavagem é realizada agitando-se ou oscilando-se suavemente o recipiente ou cartucho contendo a gordura e solução salina estéril.

[0122] O recipiente ou cartucho depois é posicionado em um tal modo de modo a permitir que a gordura (agora lavada) separe da solução salina estéril. Porque a gordura é menos densa do que a solução salina, a mesma subirá e flutuará no topo da solução salina. A quantidade de tempo requerida para que a separação ocorra variará dependendo da composição individual da amostra de gordura. Em algumas modalidades, a separação pode ocorrer de 1 a 30 minutos. Em algumas modalidades, a separação pode ocorrer de 1 a 15 minutos. Em algumas modalidades, a separação pode ocorrer de 1 a 10 minutos. Em algumas modalidades, a separação pode ocorrer de 1 a 5 minutos.

[0123] A solução salina depois é drenada do recipiente ou cartucho tão completamente quanto possível, de modo que apenas a gordura permaneça. A drenagem pode ocorrer por intermédio de vários meios, dependendo do tipo de recipiente ou cartucho utilizado no método. Em algumas modalidades, a solução salina é drenada do recipiente ou cartucho por intermédio de um tubo localizado no fundo do recipiente ou cartucho. A drenagem pode proceder ativamente, usando uma seringa ou uma bomba, ou passivamente por intermédio de fluxo por gravidade. Em algumas modalidades, a drenagem ocorre de modo a manter a integridade do sistema estéril, como aqui descrito.

[0124] A lavagem é repetida até que a gordura tenha uma cor dourada e a solução salina esteja apenas levemente turva depois da conclusão de uma lavagem. Em algumas modalidades, a lavagem ocorre de 1 a 5 vezes, em algumas modalidades de 1 a 4 vezes, em algumas modalidades de 1 a 3 vezes, em algumas modalidades de 1 a 2 vezes, e em algumas modalidades 1 vez.

[0125] Uma vez que a lavagem esteja completa, a gordura está pronta para o processamento.

[0126] Opcionalmente, a solução salina estéril é adicionada à bolsa para processamento, embora isto não seja requerido. A adição de solução salina fornecerá espaço para que as células e/ou grupos pequenos de células se movam livremente para longe uma da outra durante o processamento, ajudando desse modo a quebrar a gordura em células individuais. Se solução salina é adicionada, a mesma é adicionada em uma maneira que manterá a integridade do sistema estéril, como aqui descrito.

[0127] O volume de solução salina opcionalmente adicionado pode variar. Em algumas modalidades, o volume de solução salina adicionado varia de nenhuma a 2 vezes o volume de gordura removido do paciente. Em algumas modalidades, uma quantidade igual de solução salina é usada (por exemplo, 30 mL de solução salina para 30 cc de gordura).

[0128] O excesso ar é removido do recipiente ou cartucho usando uma bomba ou seringa. Em algumas modalidades, o excesso de ar é removido do mesmo tubo localizado no fundo do recipiente ou cartucho do qual a lavagem de solução salina estéril é drenada. Em algumas modalidades, o ar é drenado em uma maneira que mantenha a integridade do sistema estéril, fechado, como aqui descrito.

[0129] O recipiente ou cartucho de processamento depois é movido para um aparelho de processamento. Um exemplo de um aparelho de processamento adequado 300 é mostrado na Fig. 3. Na modalidade representada, o recipiente ou cartucho de processamento 205 é preso sobre uma plataforma rígida 315 para o processamento. A plataforma 315 controla o movimento do recipiente ou cartucho 205 durante o processamento.

[0130] A plataforma 315 pode ser fabricada de qualquer material adequado, rígido incluindo madeira, plástico, e semelhantes. Em algumas modalidades, a plataforma 315 é fabricada de madeira.

[0131] Nesta modalidade, impactos mecânicos são usados para quebrar o tecido adiposo e liberar as células tronco.

[0132] Os impactos mecânicos são gerados por um motor 305 que aciona um braço de impacto 310 que faz contato físico com o recipiente ou cartucho 205 contendo a gordura a ser processada. Nesta modalidade, o motor 305 aciona o braço de impacto 310 tal que o braço de impacto 310 articule para cima e para baixo, fazendo contato com o recipiente ou cartucho 205 no fundo desta faixa de movimento. Em algumas modalidades, o motor é um motor de 4,5 Amp do modelo BDEJS300C fabricado pela Black and Decker, 1000 Stanley Drive, New Britain, CT 06053, USA.

[0133] Em algumas modalidades, o motor 305 é um motor de velocidade variável que é ajustável para acionar o braço de impacto em uma taxa variando de 0 a 30.000 rpm, em algumas modalidades de 0 a 20.000 rpm, em algumas modalidades de 0 a 10.000 rpm, e em algumas modalidades de 0 a 5.000 rpm.

[0134] Em algumas modalidades, o motor 305 compreende engrenagem capaz de reduzir a velocidade do braço de impacto 310 quando o motor 305 está operando na velocidade máxima (em algumas modalidades, 30.000 rpm) de modo a gerar mais torque. Quando isto é feito, o momento gerado pelo braço de impacto 310 é transferido para o tecido no recipiente ou cartucho 205. Isto aumenta enormemente a taxa na qual o tecido adiposo é quebrado e as células tronco são liberadas do tecido graxo.

[0135] Em uma modalidade, o motor 305 é engrenado para permitir uma redução de 10 a 1 na velocidade de 30.000 rpm para 3.000 rpm. Nesta modalidade, o motor 305 compreende um diâmetro de engrenagem de 0,75 polegadas, que permite esta redução de 10 a 1. A 3.000 rpm, e um diâmetro de engrenagem de 0,75 polegadas, o braço de impacto 310 atinge uma velocidade de 117,8 polegadas por segundo - a velocidade na qual o braço de impacto 310 articula para frente e para trás e, assim, faz contato com o recipiente ou cartucho 205. A velocidade na qual o braço de impacto 310 é capaz de fazer contato com o recipiente ou cartucho 205 permite tempos de processamento enormemente reduzido. Isto confere uma vantagem significante em relação às técnicas de processamento de tecido conhecidas ou existentes, que requerem tempos de processamento muito prolongados.

[0136] O tecido é exposto aos impactos mecânicos até que a gordura seja quebrada a um nível desejado, ou até que a quantidade desejada de células tronco seja liberada da gordura. Em algumas modalidades, a amostra de gordura é processada em 30 minutos ou menos. Em algumas modalidades, a amostra de gordura é processada entre 30 segundos e 30 minutos, em algumas modalidades entre 30 segundos e 20 minutos, em algumas modalidades entre 30 segundos e 10 minutos e em algumas modalidades entre 30 segundos e 5 minutos.

[0137] O movimento da plataforma 315 ocorre em três planos direcionais, X, Y e Z, cada um dos quais é controlado pelo seu próprio motor: um motor do plano X 230, um motor do plano Y 235 e um motor do plano Z 240. Em algumas modalidades, apenas o motor do plano X 230 é usado. Em algumas modalidades, apenas o motor do plano Y 235 é usado. Em algumas modalidades, apenas o motor do plano Z 240 é usado. Em algumas modalidades, apenas o motor do plano X 230 é usado. Em algumas modalidades, apenas o motor do plano X 230 e o motor do plano Y 235 são usados. Em algumas modalidades, apenas o motor do plano X 230 e o motor do plano Z 240 são usados. Em algumas modalidades, apenas o motor do plano Y 235 e o motor do plano Z 240 são usados. Em algumas modalidades, o motor do plano X 230, o motor do plano Y 235 e o motor do plano Z 240 são usados. Cada um dos motores 230, 235 e 240 é controlado por um controlador de motor 225, que permite o movimento da plataforma 315 em três dimensões.

[0138] Este movimento até tridimensional da plataforma 315 permite que toda a gordura na amostra extraída seja exposta aos impactos mecânicos durante o processamento, e posicionamento ótimo da amostra e aparelho de processamento.

[0139] A extensão, área de superfície de impacto, número de superfícies de impacto, e forma do braço de impacto 310 podem variar. Em algumas modalidades, aumentando-se a área total da superfície de impacto e/ou o número total de superfícies de impacto reduz-se a quantidade de tempo requerida para processar uma amostra de gordura.

[0140] O recipiente ou cartucho 205 depois é posicionado em um tal modo de modo a permitir que a gordura (agora processada) separe da solução salina estéril que agora contém células tronco que foram separadas da gordura pelos impactos mecânicos. Porque a gordura é menos densa do que a solução salina, a mesma subirá e flutuará no topo da solução salina. A quantidade de tempo requerida para a separação ocorrer variará dependendo da composição individual da amostra de gordura. Em algumas modalidades, a separação pode ocorrer em 1 a 30 minutos. Em algumas modalidades, a separação pode ocorrer em 1 a 15 minutos. Em algumas modalidades, a separação pode ocorrer em 1 a 10 minutos. Em algumas modalidades, a separação pode ocorrer em 1 a 5 minutos. Em algumas modalidades, a separação pode ocorrer em menos do que 1 minuto. Em algumas modalidades, a separação pode ocorrer em 10 segundos a 1 minuto. Em algumas modalidades, a separação pode ocorrer em menos do que 1 minuto.

[0141] As células tronco e a fração vascular estrômica foram agora separadas da amostra de gordura e são agora colocadas em suspensão na solução salina.

[0142] A camada de solução salina contendo célula tronco depois é removida do recipiente ou cartucho 205 tão completamente quanto possível, de modo que apenas a gordura permaneça. A remoção pode ocorrer por intermédio de vários meios, dependendo do tipo de recipiente ou cartucho 205 utilizado no método. Em algumas modalidades, a solução salina é drenada do recipiente ou cartucho 205 por intermédio de um tubo localizado no fundo do recipiente ou cartucho 205. A drenagem pode se processar ativamente, usando uma seringa ou uma bomba, ou passivamente por intermédio de fluxo por gravidade. Em algumas modalidades, a camada contendo célula tronco é removida em uma maneira que manterá a integridade do ambiente fechado, estéril, como aqui descrito.

[0143] Em algumas modalidades, a solução salina contendo célula tronco é passada através de um filtro durante a remoção do recipiente ou cartucho 205. O tamanho do filtro pode variar. Em algumas modalidades, o tamanho do filtro varia de 40 μm a 100 μm. Em algumas modalidades, o tamanho do filtro é de 70 μm. Em várias modalidades, o filtro é de náilon.

[0144] Depois ou durante a remoção do recipiente ou cartucho 205, a solução salina contendo a célula tronco é movida em um ou mais tubos de centrífuga. Em algumas modalidades, o movimento ocorre em uma maneira que mantém a integridade do ambiente fechado, estéril, como aqui descrito. A centrifugação segue, de modo a concentrar as células tronco em uma pelota no fundo do tubo de centrífuga.

[0145] As células tronco são concentradas pela centrifugação de 500 g a 1.600 g durante 3 a 10 minutos. Em algumas modalidades, as células tronco são concentradas pela centrifugação durante 10 minutos a 1.200 g.

[0146] O fluido é removido do tubo, deixando apenas as células tronco no fundo. O fluido pode ser removido decantando-se, aspirando-se ou meios similares.

[0147] Uma pequena quantidade de fluido é colocada no(s) tubo(s) de centrífuga de modo a recolocar as células tronco em suspensão. Em algumas modalidades, a quantidade de fluido adicionado aos tubos de centrífuga varia de 1 mL a 5 mL. Em algumas modalidades, o fluido é solução salina, plasma rico em plaquetas, ácido hialurônico, um gel fixador, hidrogel, armação, cola de fibrina, cola, ou combinações de qualquer um dos precedentes. Em algumas modalidades, as células são recolocadas em suspensão no aspirado da centrifugação.

[0148] Com as células tronco em suspensão, elas estão prontas para o uso. Tal uso pode incluir, sem limitação, reintrodução no paciente do qual elas foram derivadas, criopreservação, expansão, e semelhantes. Em algumas modalidades, as células tronco concentradas, recolocadas em suspensão são movidas em uma seringa, por intermédio de uma agulha hipodérmica, para o uso no paciente. Em algumas modalidades as células tronco concentradas, recolocadas em suspensão são semeadas em uma armação de tecido para desenvolvimento em, coração, músculo, osso, cartilagem, fígado, rim, ou outro tecido e estruturas de órgão. Em algumas modalidades as células tronco concentradas, recolocadas em suspensão são transformadas em células tronco pluripotente induzidas fazendo-se com que elas expressem fatores transcricionais de pluripotência.

[0149] No primeiro e segundo métodos descritos acima, o recipiente ou cartucho e as fontes de energia mecânica são móveis. Em algumas modalidades, a gordura é bombeada através de uma câmara que é colocada sob ESW ou superfície de impacto. Nestas modalidades, tanto a bolsa quanto as fontes de energia mecânica são fixas no lugar e o tecido é passado através da câmara para ser exposto às ESW e/ou fonte de energia mecânica.

[0150] Uma terceira modalidade de um método de processamento de células tronco a partir de gordura segue:

[0151] A gordura é obtida de um paciente por intermédio de lipossucção. A lipossucção pode ser realizada por intermédio de uma seringa, onde a gordura é removida do paciente diretamente por intermédio de uma agulha, ou por intermédio de uma máquina de lipossucção. A quantidade de gordura removida durante a lipossucção pode variar, dependendo do número de células tronco desejado. Em algumas modalidades, a lipossucção é uma mini-lipossucção, em que cerca de 30 cc a cerca de 50 cc de gordura são removidos do paciente. Em algumas modalidades, a lipossucção é uma micro-lipossucção, em que cerca de 5 cc a cerca de 29 cc de gordura são removidos do paciente. Em algumas modalidades, a lipossucção é uma lipossucção clínica típica, caso este em que 300 cc de gordura ou mais são removidos do paciente.

[0152] Uma vez que a gordura é removida do paciente, a mesma é transferida para um cartucho de processamento estéril. A transferência ocorre por intermédio de meios estéreis, como aqui descritos. Em algumas modalidades, a gordura é removida do paciente por intermédio de uma seringa e é transferida da seringa para o cartucho de processamento acoplando-se conectores luer lock machos e fêmeas entre si entre a seringa e o cartucho de processamento. Em algumas modalidades, a gordura é removida do paciente por intermédio de uma seringa e a seringa é acoplada de modo estéril dentro do cartucho acoplando-se conectores luer lock machos e fêmeas entre si entre a seringa e o cartucho. Em algumas modalidades, a gordura é removida do paciente por intermédio de uma seringa e é transferida da seringa para o recipiente ou cartucho de processamento acoplando-se conectores luer lock machos e fêmeas entre si entre a seringa e o recipiente ou cartucho de processamento dentro do cartucho. Em algumas modalidades, a gordura é removida do paciente por intermédio de um dispositivo de lipossucção e é transferido do dispositivo de lipossucção para o cartucho de processamento acoplando-se de modo estéril o dispositivo de lipossucção e o cartucho de processamento usando um dispositivo de conexão estéril.

[0153] Em algumas modalidades, a transferência pode ocorrer por intermédio de fluxo de gravidade. Em algumas modalidades, a transferência pode ocorrer mecanicamente, por exemplo apertando-se fisicamente o êmbolo de uma seringa e forçando a gordura do interior da seringa em uma câmara interna do cartucho de processamento. Em algumas modalidades, a transferência pode ocorrer por intermédio de um dispositivo, tal como uma bomba.

[0154] O volume da câmara interna do cartucho 400, 500 que recebe a gordura (ver, por exemplo, as modalidades de cartucho fornecidas nas Figs. 4 e 5) pode variar com a quantidade de gordura obtida do paciente. Em algumas modalidades, 30 cc a 50 cc de gordura, removidos por intermédio de uma mini- lipossucção, são transferidos para uma câmara de gordura 405, 505 de um cartucho 400, 500.

[0155] Nesta modalidade, a gordura é injetada em um componente específico 405, 505 de um cartucho autocontido 400, 500, o cartucho 400, 500 designado para acomodar o processamento da amostra de gordura totalmente dentro do cartucho 400, 500, sem expor a amostra ao ambiente externo. Em algumas modalidades, a câmara de gordura 405, 505 localizada dentro do cartucho 400, 500 que recebe a gordura é uma bolsa flexível tendo um volume de 9 onças fluidas a 19 onças fluidas.

[0156] Em vários aspectos, o cartucho 400, 500 é designado para o uso com qualquer um dos dispositivos e métodos de ESW ou impacto mecânico aqui divulgados. Em algumas modalidades, o processamento é realizado por uma máquina que executa várias das etapas de processamento descritas abaixo automaticamente. Em algumas modalidades, o processamento é realizado por um usuário, que manualmente realiza as etapas descritas abaixo. Em ambas as modalidades, o processamento é controlado externamente, tal que o processamento interno do cartucho 400, 500 seja realizado em uma maneira estéril, sem que a amostra de modo algum seja exposta ao ambiente externo.

[0157] Nas modalidades descritas, a amostra de gordura é introduzida na câmara de gordura 405, 505 passando-a através de uma primeira válvula de uma via 410, 510. A direção do fluxo da primeira válvula de uma via 410, 510 é como representada - no interior da câmara de gordura 405, 505. Em algumas modalidades, a gordura é introduzida na câmara interna da câmara de gordura 405, 505 acoplando-se conectores luer lock machos e fêmeas entre si entre o recipiente contendo a gordura depois de extração do paciente e a primeira válvula de uma via 410, 510 do cartucho de processamento 400, 500. Em algumas modalidades, a gordura é removida do paciente por intermédio de um dispositivo de lipossucção e é transferido do dispositivo de lipossucção para o cartucho de processamento acoplando-se de modo estéril o dispositivo de lipossucção e o cartucho de processamento usando um dispositivo de conexão estéril.

[0158] Uma vez dentro da câmara de gordura 405, 505, a gordura é lavada antes do processamento. O cartucho 400, 500 contém um reservatório de fluido 415, 515 cheio com solução salina estéril, em algumas modalidades solução salina 1x tamponada com fosfato estéril, que é usada para lavar o tecido. Para introduzir a solução salina estéril no interior da câmara de gordura 405, 505, a solução salina é passada através de uma segunda válvula de uma via 420, 520 no interior da câmara de gordura 405, 505. A direção do fluxo é como indicada. A solução salina é movida no interior da câmara de gordura 405, 505 por intermédio do uso de um atuador externo 425, 525 que move um primeiro êmbolo 430, 530 de modo a forçar a solução salina através da primeira válvula de uma via 420, 520. Em algumas modalidades, o atuador externo 425, 525 é operado manualmente por um usuário, que aperta o atuador 425, 525 até que uma quantidade desejada de solução salina seja passada através da segunda válvula de uma via 420, 520 no interior da câmara de gordura 405, 505. Em algumas modalidades, o movimento do atuador externo 425, 525 é automatizado e uma máquina externa faz com que o atuador externo 425, 525 se mova na direção mostrada, medindo desse modo uma quantidade desejada de solução salina através da segunda válvula de uma via 420, 520 no interior da câmara de gordura 405, 505.

[0159] A lavagem é realizada agitando-se ou oscilando-se suavemente o cartucho 400, 500 contendo a gordura e solução salina estéril.

[0160] O cartucho 400, 500 depois é posicionado em um tal modo de modo a permitir que a gordura (agora lavada) separe da solução salina estéril. Nesta modalidade, o cartucho 400, 500 tem duas variações. Em algumas modalidades, o cartucho 400, 500 tem uma orientação vertical fixa tal que a gordura e a lavagem de solução salina contidas na câmara de gordura 405, 505 sempre separar-se-ão naturalmente uma da outra por intermédio da gravidade, com a gordura flutuando para o topo da câmara de gordura 405, 505. Em algumas modalidades, o cartucho 400, 500 tem uma orientação horizontal e é girado verticalmente para permitir que a gordura flutue e separe da lavagem de solução salina. Porque a gordura é menos densa do que a solução salina, a mesma subirá e flutuará no topo da solução salina. A quantidade de tempo requerido para que a separação ocorra variará dependendo da composição individual da amostra de gordura. Em algumas modalidades, a separação pode ocorrer em 1 a 30 minutos. Em algumas modalidades, a separação pode ocorrer em 1 a 15 minutos. Em algumas modalidades, a separação pode ocorrer em 1 a 10 minutos. Em algumas modalidades, a separação pode ocorrer em 1 a 5 minutos. Em algumas modalidades, a separação pode ocorrer em 10 segundos a 1 minuto. Em algumas modalidades, a separação pode ocorrer em menos do que 1 minuto.

[0161] A solução salina depois é drenada da câmara de gordura 405, 505 tão completamente quanto possível, de modo que apenas a gordura permaneça. A drenagem pode ocorrer por intermédio de vários meios, dependendo do tipo de cartucho 400, 500 utilizado no método. Em algumas modalidades, a solução salina é drenada da câmara de gordura 405, 505 e para fora do cartucho 400, 500 por intermédio de um tubo localizado no fundo da câmara de gordura 405, 505 que conduz para fora do cartucho 400, 500. A drenagem pode proceder ativamente, usando uma seringa ou uma bomba, ou passivamente por intermédio de fluxo de gravidade. Em algumas modalidades, a drenagem ocorre de modo a manter a integridade do sistema estéril, como aqui descrito.

[0162] A lavagem é repetida até que a gordura esteja de uma cor dourada e a solução salina esteja apenas levemente turva depois da conclusão de uma lavagem. Em algumas modalidades, a lavagem ocorre de 1 a 5 vezes, em algumas modalidades de 1 a 4 vezes, em algumas modalidades de 1 a 3 vezes, em algumas modalidades de 1 a 2 vezes, e em algumas modalidades 1 vez.

[0163] Em algumas modalidades, a lavagem é repetida até que a solução salina estéril seja esgotada do reservatório de fluido 415, 515. Em algumas modalidades, a lavagem é repetida até que a lavagem de solução salina na câmara de gordura 405, 505 esteja clara o suficiente, depois da lavagem, para que 50 % a 100 % da luz passe através da solução salina, indicando um alto grau de clareza. Em algumas modalidades, a lavagem é repetida até que um número ajustado de ciclos de lavagem fosse concluído que, em algumas modalidades, é de 1 a 5, em algumas modalidades de 1 a 4, em algumas modalidades de 1 a 3, em algumas modalidades de 1 a 2, em algumas modalidades 1, em algumas modalidades 2, e em algumas modalidades 3 lavagens.

[0164] Uma vez que a lavagem está completa, a gordura está pronta para o processamento.

[0165] A gordura na câmara de gordura 405, 505 é processada de acordo com um dos métodos descritos acima em métodos 1 e 2, submetendo-se a gordura à ESW e/ou impactos mecânicos, de modo a liberar células tronco da gordura. Em algumas modalidades, o cartucho 400, 500 tem uma abertura sobre a câmara de gordura 405, 505 para levar em consideração processo ótimo, de modo que a ESW e/ou a força dos impactos mecânicos estejam passando ou não através do plástico rígido externo do cartucho 400, 500. Em tais modalidades, a parede da câmara de gordura flexível 405, 505 é exposta ao processamento.

[0166] Depois que o processamento do tecido está completo, a gordura é deixada separar do fluido e levantar para o topo. Como observado acima, nesta modalidade o cartucho 400, 500 tem duas variações. Em algumas modalidades, o cartucho 400, 500 tem uma orientação vertical fixa tal que a gordura processada e a solução salina contida na câmara de gordura 405, 505 sempre separar-se-á naturalmente uma da outra por intermédio da gravidade, com a gordura flutuando para o topo da câmara de gordura 405, 505. Em algumas modalidades, o cartucho 400, 500 tem uma orientação horizontal e é girado verticalmente para permitir que a gordura flutue e separe da solução salina. Porque a gordura é menos densa do que a solução salina, a mesma elevar-se-á e flutuará no topo da solução salina. As células tronco que foram liberadas da gordura estão agora contidas na camada de solução salina.

[0167] A solução salina contendo a célula tronco depois é movida da câmara de gordura 405, 505 para um reservatório de célula 435, 535 localizado dentro do cartucho 400, 500, longe da gordura, através de uma terceira válvula de uma via 440, 540. A solução salina é movida no interior do reservatório de célula 435, 535 por intermédio do uso de um segundo atuador externo 445, 545 que move um segundo êmbolo 450, 550 de modo a forçar a solução salina através da terceira válvula de uma via 440, 540. No reservatório de célula 435, 535, o segundo êmbolo 450, 550 é orientado em uma configuração completamente fechada, tal que o reservatório de célula 435, 535 esteja completamente fechado. Deste modo, mover o segundo atuador 445, 545 move o segundo êmbolo 450, 550 para longe da terceira válvula de uma via 440, 540, criando um vácuo suave dentro do reservatório de célula 435, 535 que puxa a camada de solução salina contendo célula tronco para fora da câmara de gordura 405, 505, através da terceira válvula de uma via 440, 540 e no interior do reservatório de célula 435, 535. Em algumas modalidades, o segundo atuador externo 445, 545 é operado manualmente por um usuário, que puxa o segundo atuador 445, 545 até que a totalidade da solução salina contendo célula tronco seja puxada através da terceira válvula de uma via 440, 540 no interior do reservatório de célula 435, 535. Em algumas modalidades, o movimento do segundo atuador externo 445, 545 é automatizado e uma máquina externa puxa o segundo atuador externo 445, 545 para mover a solução salina contendo célula tronco no reservatório de célula 435, 535.

[0168] Em algumas modalidades, a solução salina contendo célula tronco é puxada através de uma malha de modo a filtrar fragmentos celulares não desejados que sobrou do tecido graxo processado. Em algumas modalidades, a malha está localizada na câmara de gordura 405, 505 onde a mesma cobre a abertura da terceira válvula de uma via 440, 540. Em algumas modalidades, a malha está localizada no interior do reservatório de célula 435, 535 onde a mesma cobre a saída da terceira válvula de uma via 440, 540. Em algumas modalidades, a malha está localizada no interior do reservatório de célula onde a mesma cobre a abertura de uma quarta válvula de uma via 455, 555. Em algumas modalidades, os poros na malha variam em tamanho de 40 μm a 100 μm e em algumas modalidades os pores têm 70 μm em tamanho. Em algumas modalidades, a malha é de náilon.

[0169] Na modalidade descrita na Fig. 4, a fração contendo célula tronco é transferida do interior do reservatório de célula 435, através de uma quarta válvula de uma via 455 em um tubo de centrífuga 460 contido dentro do cartucho 400. A fração de célula tronco é movida no tubo de centrífuga 460 por intermédio do uso do segundo atuador externo 445 que move o segundo êmbolo 450 de modo a forçar a solução salina através da terceira válvula de uma via 440 e no tubo de centrífuga 460. Este movimento pode ser realizado manualmente ou pode ser automatizado, como aqui descrito. O tubo de centrífuga 460 depois é removido do cartucho 400 para centrifugação. A centrifugação procede como descrito em cada uma das duas modalidades descritas acima; uma pelota de células tronco permanece no fundo do tubo de centrífuga 460.

[0170] Na modalidade descrita na Fig. 5, a fração contendo a célula tronco é transferida do interior do reservatório de célula 535, através da quarta válvula de uma via 555 em um componente de centrifugação 560 contido dentro do cartucho 500. O componente de centrifugação 560 é uma câmara triangular que atua como o componente centrífugo; o mesmo gira as células fora da solução salina tal que as células se concentrem em um único ponto na borda externa da câmara. Um orifício de acesso 565 permite que um usuário para ganhar acesso à pelota de célula tronco, de modo a recolocar a pelota em suspensão e/ou remover a mesma do componente de centrifugação 560. Em algumas modalidades, a operação do componente de centrifugação 560 é automatizada e controlada por um aparelho externo, onde o aparelho externo engata com a câmara giratória através de um motor e engrenagem que insere no cartucho no centro da câmara. Neste aspecto, o componente de centrifugação 560 pode ser de acionamento direto ou com engrenagem. A camada contendo célula tronco/infranadante é carregada no componente de centrifugação como descrito acima e o outro lado é equilibrado antes da centrifugação. Uma vez introduzida no componente de centrifugação, as células tronco são centrifugadas em 500 g a 1600 g durante 3 a 10 minutos. Em algumas modalidades, a centrifugação ocorre durante 10 minutos a 1200 g.

[0171] Uma pequena quantidade de fluido é colocada no tubo de modo a recolocar as células em suspensão. Isto é tipicamente 1 mL a 5 mL. O fluido pode ser solução salina, plasma rico em plaquetas, ácido hialurônico, ou um gel fixador, hidrogel, armação, ou fibrina ou cola, ou outro composto.

[0172] Com as células em suspensão, elas são sugadas em uma seringa através de uma agulha hipodérmica para uso posterior. Isto é feito automaticamente pela máquina de processamento, ou manualmente por um operador.

[0173] Uma pequena quantidade de fluido é usada para recolocar as células tronco em suspensão. Em algumas modalidades, a quantidade de fluido adicionado às células recolocadas em suspensão varia de 1 mL a 5 mL. Em algumas modalidades, o fluido é solução salina, plasma rico em plaquetas, ácido hialurônico, um gel fixador, hidrogel, armação, fibrina, cola, ou combinações de qualquer um dos precedentes. Em algumas modalidades, as células são recolocadas em suspensão no aspirado de centrifugação.

[0174] Com as células tronco flutuando em suspensão, elas estão prontas para o uso. Tal uso pode incluir, sem limitação, a reintrodução no paciente do qual elas foram derivadas, criopreservação, expansão, e semelhantes. Em algumas modalidades, as células tronco concentradas, recolocadas em suspensão são movidas em uma seringa, por intermédio de uma agulha hipodérmica, para uso do paciente. Em algumas modalidades as células tronco concentradas, recolocadas em suspensão são semeadas em uma armação de tecido para desenvolver em, coração, músculo, osso, cartilagem, fígado, rim, ou outro tecido e estruturas de órgão. Em algumas modalidades as células tronco concentradas, recolocadas em suspensão são transformadas em células tronco pluripotente induzidas fazendo com que as mesmas expressassem fatores de transcrição de pluripotência.

DISPOSITIVOS

[0175] Como estabelecido acima, a presente divulgação fornece métodos e sistemas para o bioprocessamento de amostras de tecido. Em vários aspectos, a presente divulgação também fornece dispositivos fáceis de usar adequados para o uso com os métodos divulgados, tais dispositivos sendo fechados ao ambiente externo e projetado para o uso simples. Tais dispositivos incluem cartuchos de uso simples que levam em consideração o processamento completo dentro de um dispositivo simples.

Recipientes

[0176] As modalidades descritas acima utilizam um ou mais recipientes como receptáculos de amostras de tecido seco, amostras de gordura, frações contendo frações celulares desejadas, frações contendo célula-tronco ou combinações de qualquer um dos precedentes. Tais recipientes incluem o recipiente utilizado na etapa 105 da Fig. 1; recipiente 205; câmaras de adipose 405, 505; reservatório de fluido 415, 515 e reservatório de célula 435, 535. Estes recipientes, que são adequados para o uso com os sistemas e métodos fornecidos pela presente divulgação, podem ser flexíveis, rígidos ou semirrígidos. Em algumas modalidades, um recipiente é uma seringa.

[0177] Cada um dos recipientes utilizados em etapa 105 da Fig. 1; recipiente 205; câmaras de adipose 405, 505; reservatório de fluido 415, 515; e reservatório de célula 435, 535, é fechado ao ambiente externo, por si só ou como parte de um cartucho fechado e é descartável.

[0178] Em algumas modalidades, cada um os recipientes utilizados na etapa 105 da Fig. 1; recipiente 205; câmaras de adipose 405, 505; reservatório de fluido 415, 515; e reservatório de célula 435, 535 é um recipiente flexível, por exemplo, uma bolsa flexível. Em tais modalidades, cada recipiente pode ser feito de acetato de etileno vinila (EVA), cloreto de poli(vinila) (PVC), acetato de etileno-vinila (EVA), náilon ou outros plásticos.

[0179] Cada um dos recipientes flexíveis pode ser moldado por insuflação. Em algumas modalidades, cada um dos recipientes flexíveis pode ser fundido por rádio frequência, frequência alta ou dielétrico e pode ser moldado por insuflação.

[0180] Em algumas modalidades, cada um dos recipientes flexíveis é uma bolsa tridimensional tendo pelo menos uma saída que está em conexão fluida com a câmara inferior do recipiente flexível. Em algumas modalidades, um recipiente simples pode ter mais do que uma saída que está em conexão fluida com a câmara inferior do recipiente. Tais saídas podem ser usadas, por exemplo, para drenar o fluido da câmara inferior do recipiente ou mover o fluido do interior do recipiente para um outro recipiente.

[0181] Em algumas modalidades, um recipiente pode compreender um ou mais furos localizados no exterior do recipiente, ao longo de uma borda que pode ser usada para pendurar o recipiente no espaço.

[0182] O volume total de um recipiente pode ser de 5 a 50 onças fluidas (147,87 a 1478,68 ml), em algumas modalidades de 9 a 19 onças fluidas (266,16 a 561,90 ml).

[0183] Em algumas modalidades, de modo a receber a entrada, na forma de uma amostra de tecido, solução salina estéril ou de outro modo, um recipiente é configurado para receber uma linha de entrada ou conexão em um ponto distinto, que conecta a uma entrada que está em conexão fluida com o interior do recipiente. De modo a manter a integridade de um ambiente estéril fechado, a linha de entrada ou conexão compreende uma conexão luer fêmea permitindo que o recipiente seja conectado a um dispositivo externo, de modo que uma seringa contendo uma amostra de tecido, um outro recipiente a partir do qual a matéria deve ser transferida ao recipiente em questão ou de outro modo. Em outras modalidades, a linha de entrada ou conexão compreende uma doca estéril para a conexão a um dispositivo externo usando um dispositivo de conexão estéril.

[0184] Em várias modalidades, um recipiente pode ser uma bolsa plana, tendo uma borda de topo, borda de fundo e duas bordas laterais substancialmente similares. A borda de fundo inclui uma saída que está em conexão fluida com o interior da bolsa, para drenar o fluido para fora da bolsa. A bolsa planA também tem uma entrada que permite a introdução estéril de material no interior da bolsa.

[0185] Em várias modalidades, o recipiente é uma bolsa tridimensional que tem forma retangular, tendo uma borda de topo, borda de fundo e duas bordas laterais substancialmente similares. A borda de fundo inclui uma saída que está em conexão fluida com o interior do recipiente, para drenar o fluido para fora do recipiente. A borda de topo inclui uma entrada que está em conexão fluida com o interior do recipiente, para a introdução de material no recipiente.

[0186] Em algumas modalidades, um recipiente é conectado a um ou mais outros recipientes por intermédio de linhas. As linhas são tubulações que podem ser feitas de cloreto de poli(vinila) (PVC), cloreto de etileno-vinila (EVA) ou outros materiais.

[0187] Em algumas modalidades, o recipiente pode ser semirrígido. Em tais modalidades, o recipiente compreende uma camisa de plástico rígido que mantém sua forma e é capaz de manter um recipiente flexível dentro da camisa durante o processamento do tecido. A camisa é configurada tal que esta contém um ponto de ligação à plataforma 210 ou 315.

[0188] A camisa de plástico rígido pode ser feita de qualquer material de plástico rígido adequado, incluindo, por exemplo, polietileno de alta densidade (HDPE) ou polipropileno (PP). O material de plástico rígido não apresenta nenhuma deformação elástica, nem apresenta qualquer um dos comportamentos elásticos tipicamente apresentados por plásticos flexíveis. A camisa de plástico rígido pode ser moldada por injeção ou cortada.

[0189] Em algumas modalidades, um recipiente flexível está contido dentro da camisa de plástico rígido, que pode ou não pode incluir completamente o recipiente flexível. Em algumas modalidades, o recipiente flexível não está completamente incluído dentro da camisa de plástico rígido; em vez disso, a camisa inclui parcialmente o recipiente flexível, mantendo-a no lugar durante o processamento do tecido.

Cartuchos

[0190] Em vários aspectos, os cartuchos adequados para o uso com a presente divulgação são recipientes tridimensionais capazes de alojar um ou mais recipientes dentro de seu interior. Os recipientes internos podem ser conectados por uma ou mais linhas e/ou válvulas. Os exemplos de cartuchos adequados são os cartuchos 400, 500 descritos nas Figs. 4 e 5.

[0191] Em algumas modalidades, os cartuchos são feitos de um material plástico rígido que mantém sua forma e é capaz de manter pelo menos um, e preferivelmente uma pluralidade, de recipientes flexíveis dentro dos cartuchos durante o processamento de tecido. Os recipientes são configurados, tais que contenham um ou mais pontos de ligação à plataforma 210 ou 315.

[0192] O plástico rígido pode ser feito de qualquer material de plástico rígido adequado incluindo, por exemplo, polietileno de alta densidade (HDPE) ou polipropileno (PP). O material de plástico rígido não apresenta nenhuma deformação plástica, nem apresenta qualquer um dos comportamentos elásticos tipicamente apresentados por plásticos flexíveis. Os cartuchos de plástico rígido podem ser moldados por injeção ou cortados.

[0193] Outros aspectos dos recipientes são descritos acima.

Tubos de Centrífuga

[0194] Os tubos de centrífuga adequados para o uso com os métodos e dispositivos da presente divulgação são tubos de alta resistência feitos com precisão de vidro ou plástico projetados para adaptarem-se exatamente a um rotor de centrífuga. A capacidade dos tubos de centrífuga podem variar, dependendo do volume total da amostra de tecido a ser processada. Em algumas modalidades, os tubos de centrífuga têm uma capacidade que varia de 1 mL a 50 mL, em algumas modalidades de 0,5 mL a 20 mL e em algumas modalidades de 250 μL a 2,0 mL.

[0195] Em algumas modalidades, os tubos de centrífuga são tubos Eppendorf®, em algumas modalidades tubos de microcentrífuga e, em algumas modalidades, tubos microcentrifugadores.

[0196] O material dos tubos de centrífuga pode variar. Em algumas modalidades, os tubos de centrífuga são feitos de vidro. Em algumas modalidades, os tubos de centrífuga são plásticos. Em cada modalidade, os tubos de centrífuga são projetados para o uso único e são descartáveis. Em algumas modalidades, os tubos de centrífuga são feitos de um plástico transparente flexível, tal como politeno, são semi-cônicos quanto à forma e compreendem tampas de vedação, dobradas integrais.

Válvulas de sentido único

[0197] Uma válvula de sentido único é uma válvula que permite que o fluido flua através desta em uma direção única apenas.

[0198] Em vários aspectos, as válvulas de sentido único adequado para o uso com os dispositivos e métodos da presente divulgação compreendem válvulas de duas portas, tendo duas aberturas - uma para o fluido entrar, o outro para o fluido sair. As válvulas de sentido único funcionam para fornecer um fluxo unidirecional de fluido automaticamente e não requer qualquer intervenção ou controle do usuário. Em algumas modalidades, as válvulas de sentido único úteis para os métodos e dispositivos da presente divulgação são feitas de um plástico rígido, tal como poli(propileno).

[0199] Em algumas modalidades, as válvulas de sentido único adequadas para o uso com os dispositivos e métodos da presente divulgação são válvulas de verificação com esfera, em que o componente que evita o retrofluxo de fluido é uma bola esférica. Em algumas modalidades, a bola é carregada com mola para manter a válvula de sentido único fechada.

[0200] Em algumas modalidades, válvulas de sentido único adequada para o uso com os dispositivos e métodos da presente divulgação são válvulas de verificação com diafragma compreendendo um diafragma de borracha flexível posicionado para criar o fechamento de válvula. Em tais modalidades, a pressão criada na lateral a montante, pela intervenção do usuário ou por intermédio de um processo automatizado, faz com que o diafragma abra e o fluido flua através da válvula. Na finalização da pressão positiva, o diafragma fecha, terminando o fluxo de fluido.

[0201] Em algumas modalidades, as válvulas de sentido único adequadas para o uso com os dispositivos e métodos da presente divulgação são válvulas de verificação por oscilantes ou válvulas de verificação de disco basculante. Em tais modalidades, um disco é a parte móvel da válvula usada para permitir que o fluido flua em uma direção e o fluido do bloco volta na direção oposta.

EXEMPLOS

[0202] Os materiais, métodos, e modalidades descritos aqui ainda são definidos nos seguintes exemplos. Certas modalidades também são definidas nos Exemplos aqui. Deve ser entendido que estes Exemplos, enquanto indicam certas modalidades, são dados por intermédio de ilustração apenas. A partir da divulgação aqui e destes Exemplos, um habilitado na técnica pode verificar as características essenciais da presente divulgação e sem divergir do espírito e escopo da mesma, pode realizar várias mudanças e modificações da invenção para adaptá-la a vários usos e condições.

Exemplo 1

[0203] Protocolo Geral para Processamento de Tecido ESW

[0204] UM lipoaspirado é obtido de um sujeito, o lipoaspirado tendo aproximadamente 30 cc de volume. Antes do processamento, o lipoaspirado é transferido para uma bolsa flexível estéril de acetato de etileno vinila (EVA), cloreto de poli(vinila) (PVC), acetato de etileno-vinila (EVA) ou náilon tendo paredes laterais de aproximadamente 0,25 polegadas de espessura. Uma bolsa de cateter estéril é suficiente.

[0205] O lipoaspirado é lavado usando um volume igual de solução salina estéril introduzida na bolsa flexível por conexão de um conector luer-lock macho a partir de uma bolsa de solução salina a um conector luer-lock fêmea localizado na bolsa flexível e dispensando manualmente a solução salina na bolsa flexível. O lipoaspirado e a lavagem com solução salina são então agitados mecanicamente por agitação suave da bolsa flexível.

[0206] A amostra de tecido/lavagem com solução salina é deixada sedimentar por pelo menos 10 minutos para deixar o lipoaspirado flutuar até o topo da solução salina.

[0207] O infranadante, ou lavagem com solução salina, é removido da bolsa flexível por intermédio de uma linha de drenagem localizada no fundo da bolsa flexível. A remoção pode ocorrer conectando-se uma seringa à linha e retirando o infranadante da bolsa ou pelo fluxo por gravidade.

[0208] A lavagem é repetida de 3 a 4 vezes, deixando a lavagem de solução salina estéril na bolsa na lavagem final.

[0209] A etapa seguinte é aplicar ondas de choque extracorpóreas ao lipoaspirado usando um gerador de onda de choque extracorpóreo Masterpuls MP100.

[0210] O gerador pode fazer contato com a parede da bolsa flexível, mas cuidado deve ser tomado para garantir que o gerador de onda de choque não entre em contato com o lipoaspirado por si só.

[0211] Se necessário, gel de ultrassom pode ser aplicado à lateral da bolsa flexível antes da aplicação das ondas de choque ao lipoaspirado.

[0212] Aplicar ESW ao lipoaspirado por 1 a 30 minutos.

[0213] A seguir, agitar suavemente a bolsa flexível por agitação ou turbilhonamento leve.

[0214] Permitir que o lipoaspirado processado agora sedimente, de modo que o que permanece do tecido graxo possa flutuar para o topo da solução salina.

[0215] Remover o infranadante da bolsa flexível por ligação de uma seringa estéril ao tubo de drenagem, como descrito acima, e retirando tanto do infranadante quanto possível. Não retirar qualquer tecido adiposo remanescente.

[0216] Durante a remoção, passar o infranadante através de um de três filtros de malha de náilon tendo um tamanho de poro de 40 μm, 70 μm ou 100 μm.

[0217] Distribuir o infranadante em um ou mais tubos de centrífuga estéreis. Se um número ímpar de tubos for usado, garantir que um tubo de equilíbrio, contendo solução salina estéril, é colocado no rotor para equilibrar.

[0218] Centrifugar a 1.200 g por 10 minutos.

[0219] Opcional: recolocar a pelota em suspensão em 1 mL de tampão de lise RBC e incubar em banho de água a 37°C por 10 minutos. Neutralizar o tampão RBC.

[0220] Se nenhum tampão de lise RBC for desejado, recolocar a pelota celular em suspensão em 1 mL de solução salina estéril.

[0221] Contar células.

Exemplo 2

[0222] Comparação de Métodos de Processamento de Lipoaspirado

[0223] Resumo: o propósito do teste realizado para este Exemplo foi comparar o rendimento celular nucleado a partir de células-tronco mesenquimais extraídas de tecido adiposo usando digestão de colagenase vs. interrupção por onda de choque (ESW) extracorpórea.

Materiais:

[0224] 1.500 mL de 1x solução salina tamponada por fosfato (PBS)

[0225] 35 mL de 1x tampão de lise de célula sanguínea vermelha (RBC)

[0226] 200 mL de colagenase tipo I a 0,1 %

[0227] 15 mL de soro fetal bovino (FBS) a 10% em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM)

Métodos: Controle

[0228] Aproximadamente 250 mL de um lipoaspirado foram transferidos em um béquer de 100 mL usando um cateter de 60 mL estéril. Cuidado foi tomado para garantir que pouco ou nenhum fluido em excesso foi introduzido no béquer.

[0229] O lipoaspirado foi lavado quatro vezes com volumes aproximadamente iguais de 1x PBS estéril. Para cada lavagem, 1x PBS estéril foi adicionado ao béquer, os dois foram agitados e a mistura foi deixada sedimentar. O infranadante foi removido do béquer por aspiração. O lipoaspirado foi lavado por um total de quatro vezes.

[0230] Depois da quarta lavagem, a amostra foi deixada sedimentar por 10 minutos.

[0231] Uma pipeta sorológica de 10 ml estéril foi usada para transferir 45 mL do infranadante a partir da quarta lavagem e final em 3 tubos cônicos de 50 mL estéreis através de filtros estéreis de tubo de 40 μm, 70 μm e 100 μm. Um total de 135 mL de infranadante foram transferidos para o uso como um controle.

Digestão de Colagenase

[0232] 200 mL de lipoaspirado foram depositados em uma garrafa de vidro 500 mL estéril. 200 mL de colagenase tipo I a 0,1% foram adicionados à garrafa. A garrafa foi agitada levemente invertendo-a várias vezes, para garantir que o lipoaspirado foi misturado de maneira uniforme com a colagenase.

[0233] A garrafa depois foi colocada em um banho de água a 37°. A cada 10 minutos, a garrafa foi removida do banho de água e invertida várias vezes para redistribuir o lipoaspirado, que sedimentou. Depois de 30 minutos de incubação, a garrafa foi agitada por um tempo final e removida do banho de água.

[0234] O exterior da garrafa foi pulverizado com ETOH a 70% e colocada em um gabinete de fumigação. A mistura de lipoaspirado e colagenase foi deixada sedimentar por 10 minutos.

[0235] Uma pipeta sorológica de 10 ml estéril foi usada para transferir o infranadante em 3 tubos cônicos de 50 ml estéreis através de filtros estéreis de tubos de 40 μm, 70 μm e 100 μm. Um total de 135 mL de infranadante foram transferidos. Os 3 tubos, incluindo um quarto tubo contendo 45 mL de água para equilíbrio, foram centrifugados em 1.200 g, a 37°C, por 10 minutos para obter uma pelota celular digerida por colagenase.

[0236] O exterior dos 3 tubos contendo a suspensão de colagenase foi limpo com ETOH a 70% e colocado em um gabinete de fumigação, deixando o tubo de equilíbrio. O sobrenadante foi aspirado, deixando uma pelota celular em cada tubo em. Usando uma pipeta sorológica de 25 mL, 5 mL de FBS a 10% foram dispensados em cada tubo e cada tubo foi submetido ao turbilhonamento por 5 segundos para recolocar a pelota em suspensão. FBS foi usado para neutralizar qualquer atividade de colagenase remanescente.

[0237] Os 3 tubos foram centrifugados em 1.200 g, a 37°C, por 10 minutos. O exterior dos tubos de centrífuga foi limpo com ETOH a 70% e os tubos foram colocados em um gabinete de fumigação. O sobrenadante foi aspirado, deixando as pelotas celulares.

Processamento ESW

[0238] 200 mL de lipoaspirado foram transferidos em uma bolsa de cateter de perna de 500 ml estéril usando uma seringa de cateter de 60 ml estéril, junto com todo o infranadante remanescente. 1x PBS estéril foi adicionado para obter um volume de fluido total de 200 mL, o volume total sendo de 400 mL incluindo o lipoaspirado. Aproximadamente, 2 mL de gel de ultrassom foram aplicados a bolsa do cateter. Usando a ponta grande, aproximadamente 10.000 pulsos ESW em 2 bar e 21 Hz foram administrados à amostra dentro da bolsa. O processo foi repetido do outro lado da bolsa por um adicional de 10.000 pulsos ESW. O exterior da bolsa de cateter foi limpo com ETOH a 70% e este foi colocado em um gabinete de fumigação.

[0239] A bolsa foi agitada e esvaziada em um béquer de 500 ml e a suspensão foi deixada sedimentar por 10 minutos. Usando uma pipeta sorológica de 10 ml estéril, o infranadante foi transferido em 3 tubos cônicos de 50 ml estéreis através de filtros estéreis de tubos de 40 μm, 70 μm e 100 μm. Um total de 135 mL de infranadante foram transferidos.

Concentração e Lise

[0240] Os 3 tubos contendo a suspensão de controle e 3 tubos contendo a suspensão processada foram centrifugados em 1.200 g e 37°C por 10 minutos. O sobrenadante foi aspirado de todos os tubos, deixando cada pelota e 5 mL de tampão de lise 1x RBC foram adicionados a cada tubo. Cada tubo foi submetido ao turbilhonamento por 5 segundos para recolocar a pelota em suspensão e os tubos foram colocados em um banho de água a 37°C por 10 minutos.

[0241] O exterior de cada tubo foi sanitizado com ETOH a 70% e os tubos foram colocados em um gabinete de fumigação. 25 mL de 1x PBS estéril foi adicionado a cada tubo para diluir ou neutralizar o tampão de lise.

[0242] Contagem Celular

[0243] Usando pontas de micropipeta estéreis, 300 μL de 1x PBS estéril foram transferidos a 6 tubos microcentrifugadores de 0,5 ml estéreis. 75 μL de cada amostra de 50 mL também foram transferidos a cada tubo microcentrifugador para a contagem celular.

[0244] O número de células em cada amostra foi contado usando um contador celular MoxiZ célula com cassetes tanto tipo M quanto tipo S. para a contagem, 100 μL de azul tripano foram adicionados a cada tubo microcentrifugador, 10 μL de cada amostra foram carregados em um reservatório de hemocitômetro e as células foram contadas.

[0245] Resultados:

Contador Celular MoxiZ

[0246] A Tabela 1 mostra os resultados das contagens celulares usando o contador celular automatizado MoxiZ. Dois tipos de cassetes foram usados para a contagem, M e S. na coluna Amostra, ‘c’ significa digestão de colagenase, ‘e’ para processamento ESW e ‘0’ para controle. Apenas contagens com ‘y’ na coluna ‘Completo’ coluna são válidas.

Hemocitômetro

[0247] A Tabela 2 detalhes as contagens obtidas a partir do hemocitômetro visual, com contagens celulares a partir de cada quadrante, a soma dos quadrantes, o fator de diluição e as células calculadas totais. O número de células deve ser adotado em referência à contagem das células na população controle. A razão de células processadas vs. células de controle é um indicador chave de rendimento.

Sumário

[0248] Das contagens válidas usando o contador celular automatizado MoxiZ, as médias agregadas para as contagens celulares para controle, colagenase e ESW são como mostradas na tabela 3:

[0249] A colagenase produziu consistentemente cerca de 3,8E+05 células/mL. ESW variou de 1,67e+05 a 7,08e+05 células/mL.

[0250] Olhando nas razões de células nas contagens de hemocitômetro, o processo ESW produziu as razões mais altas com razões que variam de 1,78 a 9,0 vezes maiores do que o controle. A colagenase produzido apenas razões que variam de 1,29 a 2,84 vezes maior do que o controle.

Debate

[0251] Estes dados indicam que ESW é eficaz para produzir números altos de células-tronco mesenquimais de tecido adiposo. Com base nestes dados, é concluído que ESW é uma alternativa viável a ultrassom ou processamento de colagenase de tecido adiposo para obter células-tronco mesenquimais. Na comparação de picos, ESW produziu rendimentos celulares de 7,08e+05 em comparação com o pico de colagenase de 4,32e+05 - um aumento em rendimento de 164 %.

[0252] Dados os dados apresentados acima, é razoável concluir que uma amostra de 50 cc a 60 cc de lipoaspirado deve produzir cerca de 5 milhões de células de processamento de ESW e cerca de 3 milhões de células da digestão de colagenase.

[0253] Portanto, é evidente que o uso de ESW para liberar células-tronco de tecido adiposo confere uma vantagem significante sobre técnicas conhecidas.

Claims

1. Método para isolar células-tronco do tecido adiposo, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: colocar uma amostra de tecido adiposo em um recipiente ou cartucho (205); submeter a amostra de tecido adiposo à força de impactos mecânicos para quebrar o tecido; e separar uma fração de célula-tronco do tecido adiposo; em que: os impactos mecânicos são gerados por um motor (305) que aciona um braço de impacto (310) que faz contato físico com o recipiente ou cartucho (205) contendo o tecido adiposo; e o braço de impacto (310) não faz contato físico com o tecido adiposo.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a força dos impactos mecânicos é liberada ao tecido adiposo por meio de uma parede do recipiente ou cartucho (205).

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o motor (305) é um motor de velocidade variável que é ajustável para acionar o braço de impacto (310) a uma taxa que varia de 0 a 30.000 rpm.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a separação compreende permitir que o tecido adiposo se separe de uma camada aquosa, a camada aquosa compreendendo as células-tronco.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a fração de célula-tronco é separada do tecido adiposo em 30 minutos ou menos.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o motor (305) compreende engrenagem capaz de reduzir a velocidade do braço de impacto (310) quando o motor (305) está operando em velocidade máxima, em que o momento gerado pelo braço de impacto (310) é transferido para o tecido adiposo no recipiente ou cartucho (205).

7. Dispositivo para realizar o método, como definido na reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: um recipiente ou cartucho de processamento (205) no qual o tecido adiposo é colocado; uma plataforma (315) na qual o recipiente ou cartucho de processamento (205) é fixado; um braço de impacto (310), que faz contato físico com o recipiente de processamento (205); e um motor (305), que é um motor de velocidade variável que aciona o braço de impacto (310) de modo que o braço de impacto (310) se articula para cima e para baixo, fazendo contato físico com o recipiente de processamento (205); em que os impactos mecânicos gerados pela articulação são para quebrar o tecido adiposo e liberar células-tronco.

8. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o motor (305) aciona o braço de impacto (310) a uma taxa entre 0 e 30.000 rpm.

9. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o recipiente de processamento (205) é uma bolsa.

10. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que a bolsa compreende uma saída em conexão fluida com o interior do recipiente (205).

11. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que a bolsa compreende mais de uma saída em conexão fluida com o interior do recipiente (205).

12. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que a bolsa compreende ainda uma entrada em conexão fluída com o interior do recipiente (205).

13. Dispositivo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 12, CARACTERIZADO pelo fato de que o motor (305) compreende engrenagem capaz de reduzir a velocidade do braço de impacto (310) quando o motor está operando em velocidade máxima, em que a engrenagem é para aumentar a taxa na qual o tecido adiposo é quebrado e as células-tronco são separadas do tecido adiposo.