CN102311941B - 一种机械法分离培养猪精原干细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种机械法分离培养猪精原干细胞的方法。本发明所述方法是结合动物睾丸组织的特点，采用机械法分离后将组织块进行培养，丰富了现有精原干细胞的分离纯化方法。本发明所述方法不用通过酶消化就能获得猪精原干细胞，细胞克隆快，状态好，解决了精原干细胞分离难、数量少、培养条件要求高等问题，比起现有的分离技术，本发明方法操作简单，降低了获得细胞的难度，大大降低了实验成本，提高了实验成功率，应该在本领域进行推广。
Description
技术领域
本发明涉及细胞分离培养领域，具体涉及一种机械法分离培养猪精原干细胞的方法。
背景技术
精原干细胞（Spermatogonial stem cells, SSCs）是位于雄性动物睾丸曲细精管基膜上既能自我更新维持自身群体数量恒定，又能定向分化，最终产生精子的一类未分化的A型精原细胞，也是成体内唯一可复制的多潜能双倍体细胞。
体外分离SSCs的方法主要集中在机械法和酶消化法相结合的方法，现在主要通过酶消化的方式获得SSCs，再通过各种纯化手段最终得到单一的SSCs，是否纯化后更有利于SSCs增殖，也说法不一。而目前PSSCs（Porcine spermatogonial stem cells, PSSCs）增殖培养的方案还不成熟，其调节机制尚未清楚解析。PSSCs培养仍然存在着较大困难，更多的问题还有待更深入研究。
胰蛋白酶作为常规的细胞消化试剂，是酶消化法中的主要用酶，广泛应用于多种类型的组织和细胞消化，但是胰蛋白酶消化后，细胞表面的粘附分子或膜蛋白极易受到破坏，对于这类具有立体结构用以维持细胞增殖及自我更新的细胞来说，很难迅速恢复细胞状态。往往伴随着大范围的细胞死亡/凋亡。早期通过使用胰蛋白酶消化成功获得了小鼠胚胎干细胞（Embryonic stem cells, ES细胞），但分离效率却很低。神经干细胞（Neural stem cell , NSC）以及人胚胎干（hES）细胞在胰蛋白酶消化后，极容易死亡，很难获得传代培养，因而多用机械分割法进行传代。组织块培养法是一种常用细胞分离方法，最常见于一些成纤维组织细胞分离培养，其实验操作简单，成功率高，避免了酶消化对细胞影响。
目前研究的纯化方法主要有：流式细胞分选法（Fluorescence activated cell sorting，FACS）、免疫磁珠细胞分选法（Magnetic-activated cell sorting，MACS）、自然重力沉降法、差速贴壁分选法和密度梯度分选法等。但各种方法都存在着不足。在现有研究背景下，我们使用的机械法分离PSSCs，避免了使用酶消化的方式，减少了酶对细胞损伤作用，更符合机体内环境条件，在已筛选的培养体系里较快和较早得到PSSCs的克隆。故机械法分离培养PSSCs的方法是一种简单有效的分离方法。
发明内容
本发明的目的在于根据现有的细胞分离培养方法中存在的不足，提供一种分离容易、培养要求低、操作简单、降低实验成本的机械法分离培养PSSCs的方法。
本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：
一种机械法分离培养猪精原干细胞的方法，包括如下步骤：
（1）将仔猪的睾丸放入盛有PBS的容器中，用PBS洗涤2~3次，除去血污；
（2）去掉睾丸白膜和结缔组织，将剩下的睾丸组织剪碎，转移到离心管中；
（3）加入10倍体积的PBS，用吸管吸打，16 ℃、600 rpm离心5 min，弃上清；
（4）重复步骤（3）2~3次，得到猪睾丸曲细精管；
（5）将猪睾丸曲细精管接种到事先用0.1 %明胶包被的培养瓶，放入培养箱中进行无菌培养。
作为一种优选方案，上述方法中，所述细胞培养箱的培养条件为37 ℃，5% CO2，饱和湿度。
作为一种优选方案，上述方法中，所述细胞培养时所用的细胞培养液主要成分为：DMEM 83 %，L-谷氨酰胺1 %，非必需氨基酸1 %，β-巯基乙醇55 μM，胎牛血清15 %。
通过本实验方法获得大量PSSCs克隆团后，通过机械法挑取切割克隆团，后接种到新的饲养层上，进行传代培养，可进行诱导分化，诱导IPS细胞和转基因动物等方面的研究。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
目前SSCs分离方法要么程序复杂，要么就耗时长、对细胞活力影响较大、或者丢失目的细胞多、或者实验成本很高。而且实验成功率一般不高，一定程度上存在细胞增殖困难和获得目的细胞难等问题。而我们通过直接培养曲细精管的方法，可以快速获取大量的PSSCs增殖。并通过机械法挑取克隆团，来纯化PSSCs。这种方法操作简单，步骤少，大大降低了实验成本，而且成功率高，获得细胞多，效果好，是一种新的有效的获取PSSCs的实验方法，这种方法不仅解决了现实中，PSSCs少，分离难，培养难，纯化复杂的问题。但目前它主要的缺点是大量曲细精管较难被剪成理想片段，以及接种数目很难确定等问题，但是比起优点这种方法是可以获得较好的实验结果，很容易较快速的得到大量的PSSCs增殖的方法，所以比起常用的方法，它是一个创新的，高效的方法，可以应用于PSSCs的科学研究。
附图说明
图1接种曲细精管后，小段的曲细精管开始悬浮在培养瓶中；
图2培养2 d时，曲细精管贴到了培养瓶底部，细胞开始向四周扩散孵出；
图3培养3 d时，曲细精管形态消失，细胞开始快速向四周扩散增殖；
图4培养4 d时，大量PSSCs克隆团产生看，边缘整齐，折光性好；
图5培养4 d时，低倍镜下观察获得的PSSCs克隆团；
图6碱性磷酸酶检测为阳性结果图；
图7免疫荧光检测前的原始图片；
图8免疫荧光检测Hochest染细胞核图；
图9免疫荧光特异表达Oct4结果图；
图10 RT-PCR分子检测，机械法培养得到PSSCs克隆团表达干细胞多能性基因。
具体实施方式
以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
实施例1 猪精原细胞的获取及培养
（1）在超净台上，将仔猪的睾丸放入盛有PBS的培养皿中，并用PBS洗涤2 ~3次，除去血污；
（2）去掉睾丸白膜，用尖镊子去掉睾丸实质中的结缔组织，将剩下的睾丸组织用虹膜剪剪碎碎，直到看不到微小组织块为宜，转移到15 ml离心管中；
（3）加入10倍体积的PBS，用吸管轻轻吸打，然后16 ℃，600 rpm离心5 min，弃掉上清。如此反复洗涤2~3次；
（4）调整曲细精管数量，接种到事先用0.1 %明胶包被的25 cm2培养瓶，在37 °C、5 % CO2、饱和湿度无菌培养箱条件下培养（图1~5）。
实施例2 碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase, AP）阳性检测
将待检测的PSSCs，用PBS洗1遍；4 %多聚甲醛室温下固定20 min，PBS洗三遍，每次5 min；加入1 mL碱性磷酸酶缓冲液，并且加入NBT 6.6 μL和BCIP（vector）各3.3 μl，做个混合管，充分混匀；室温下闭光孵育10~15 min，用PBS清洗，及时终止反应，在显微镜下观察并拍照（如图6）。
通过AP染色可以初步判断一步酶法所得到的克隆团是PSSCs克隆。
实施例3 PSSCs的免疫荧光鉴定检测
（1）细胞爬片制作好以后，取出爬片用37 ℃ PBS洗涤3次，每次3~5 s；
（2）用4 %多聚甲醛固定10~30 min；PBS冲洗2次，每次5 min；
（3）0.5 % Triton穿孔破膜处理15 min；PBS漂洗2次，每次5 min；
（4）1 % BSA封闭30 min（封闭完不用洗）；
（5） 加入1 % BSA稀释的一抗，于4 ℃过夜；PBS漂洗2次，每次5 min；
（6）加入1 % BSA稀释的二抗，于37 ℃/1 h；PBS漂洗2次，每次5 min；
（7）10 μg/mL Hochest染色5 min；抗淬灭封片，拍照。
通过免疫荧光检测机械法所得到克隆团，它特异表达了Oct4重要干细胞标志基因，证明它是PSSCs克隆团（图9）。
实施例4 通过RT-PCR进行分子检测鉴定SSCs
将收集到得PSSCs克隆团，用PBS清洗2次，离心收集细胞。
1.总RNA提取（按照TIANGEN 公司总RNA提取试剂盒说明书）
2总RNA样本的检测
（1） 总RNA完整性通过普通琼脂糖凝胶电泳检测：
制备1.5 %琼脂糖凝胶：称取1.5 g琼脂糖粉，溶于100 mL 1×TAE中，微波炉内煮沸，待溶液冷却到50~60 ℃时加入EB，灌注凝胶，室温放置30 min，使胶凝固；加样电泳：取约4~5 μL总RNA，加入3 μL上样缓冲液，混合后加入点样孔内，5 V/cm电压电泳15~20 min；电泳结束，观察并拍照。
（2） 浓度及纯度检测：
取总RNA样品1 μL，稀释50倍，用紫外分光光度计于260 nm和280 nm波长处测定OD值。
3总RNA反转录方法参考（东洋纺的First strand cDNA合成试剂盒说明书）
4 引物设计与合成
根据NCBI发表的关于基因Oct4、Sox2、C-myc、Klf4、Nanog、Prdm14和β-actin的序列，采用genetool软件设计引物，并由上海生工生物技术有限公司合成，引物序列信息见表2。
表2 引物序列信息
| 基因 | 引物序列（5-3’） | 产物（bp） | 退火温度（℃） | Genebank序列号 |
| Oct4 | SEQ ID NO:1 | 521 | 59 | NM_001113060 |
| Sox2 | SEQ ID NO:2 | 604 | 55 | NM_001123197 |
| C-myc | SEQ ID NO:3 | 443 | 58 | NM_001005154 |
| Klf4 | SEQ ID NO:4 | 380 | 58 | NM_001031782 |
| Nanog | SEQ ID NO:5 | 614 | 61 | NM_001129971 |
| Prdm14 | SEQ ID NO:6 | 541 | 58 | XM_003125600 |
| βactin | SEQ ID NO:7 | 612 | 59 | AY550069 |
5 PCR扩增与产物检测
表3 50 μL反应体系
PCR反应程序为94 ℃/5 min预变性；94 ℃/30 s变性、X ℃/30 s退火、72 ℃/45 s延伸，循环34次；72 ℃/10 min再延伸，10 ℃/10 min；
PCR产物检测: PCR结束后，取6 μL PCR产物与2 μL溴酚兰混合点样，并以DNA Marker 2000作为参照，在1×TAE电泳缓冲液中进行1.5 %琼脂糖凝胶（含0.5 μg/mL EB）电泳（5 V/cm），电泳结束后，用凝胶成像系统拍照。
通过RT-PCR检测机械法培养所得到的克隆团特异表达了Oct4、Sox2、C-myc、Klf4、Nanog和Prdm14等重要干细胞标志基因，而且用作饲养层的细胞没有表达，从分子角度进一步证实了这些克隆团是PSSCs克隆团（如图10）。
SEQUENCE LISTING
<110> 华南农业大学
<120> 一种机械法分离培养猪精原干细胞的方法
<130>
<160> 7
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 47
<212> DNA
<213> OCT-4
<400> 1
ggggctcact ttgggggttc tctcagggaa tgggaccgag gagtaca 47
<210> 2
<211> 41
<212> DNA
<213> SOX-2
<400> 2
cggcggtggc aactctactg gggcgagccg ttcatgtagg t 41
<210> 3
<211> 38
<212> DNA
<213> C-MYC
<400> 3
gcgggcacgg cggctactgg ggggcgctgc ataattgt 38
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> KLF-4
<400> 4
cgcgcatgtg ccccaagatc ccggggccac gaccttctc 39
<210> 5
<211> 47
<212> DNA
<213> Nanog
<400> 5
cttattcagg acagccctga ttcttcaaga cggcctccaa atcactg 47
<210> 6
<211> 46
<212> DNA
<213> PRDM-14
<400> 6
cgcccccagt ggatgcttct ctcgggcaca gttgacatag gacatc 46
<210> 7
<211> 50
<212> DNA
<213> βaction
<400> 7
ccgtgagaag atgacccaga tcatgtcgtg atctccttct gcatcctgtc 50
Claims (2)
1.一种机械法分离培养猪精原干细胞的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)无菌获取猪睾丸，放入盛有PBS的培养皿中，用PBS洗涤2～3次，去除血污；
(2)去掉睾丸白膜和结缔组织，将剩下的睾丸组织剪碎，转移到离心管中；
(3)加入10倍体积的PBS，吹打均匀后16℃、600rpm离心5min，弃去上清；
(4)重复步骤(3)2～3次，获得猪睾丸曲细精管；
(5)将猪睾丸曲细精管直接接种到事先用0.1％明胶包被的培养瓶，放入培养箱中进行无菌培养，所述细胞培养时所用的细胞培养液主要成分为：DMEM83％，L-谷氨酰胺1％，非必需氨基酸1％，β-巯基乙醇55μM和胎牛血清15％。
2.根据权利要求1所述的机械法分离培养猪精原干细胞的方法，其特征在于所述细胞培养箱的培养条件为37℃，5％CO2，饱和湿度。
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