JP5668075B2 - 幹細胞の分離方法 - Google Patents

Description

本発明は、脂肪組織から幹細胞を分離する方法に関し、特に、空気中への露出機会を最小化した幹細胞の分離方法に関する。

幹細胞は自己複製能を持ちながら２以上の細胞に分化する能力を持つ細胞であって、近年、骨髄の他に脂肪組織からも幹細胞を得ることができる研究が進められている。脂肪組織から分離した脂肪由来幹細胞は、脂肪細胞、筋肉細胞、軟骨細胞、骨細胞など種々の種類の細胞に分化できる能力を持つ多能性幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）である。

前記脂肪幹細胞は、骨髄由来の間葉幹細胞に比べて自己再生能力に優れ、体外培養が容易であるという利点と、脂肪幹細胞を分離できる脂肪組織が多く、採取方法が簡単であり、且つ安全であるという利点を有しており、機能的な面での脂肪幹細胞は、骨髄由来の間葉幹細胞と比較しても分化能力、細胞学的特性、免疫学的特性、組織再生能力など殆どの特性が同一であることが明らかになった。すなわち、脂肪幹細胞は、骨髄由来の間葉幹細胞を代替できる高い可能性を有した幹細胞として医学的有用性が非常に大きい。

なお、脂肪幹細胞は、間葉幹細胞に比べて組織取得過程が容易で且つ安全であり、組織の受給上に制限がないという利点と、体外培養が容易で組織接近性、安定性、有効性、そして経済的な面で骨髄由来の間葉幹細胞よりも優位にあると言える。

既存の脂肪分離細胞の分離及び培養法は、吸引或いは、切除された脂肪を再び細かく砕いてコラゲナーゼで組織を分解した後、遠心分離過程を経ながら沈殿して分離する血管間質分画（ｓｔｒｏｍａｌ ｖａｓｃｕｌａｒ ｆｒａｃｔｉｏｎ、ＳＶＦ）で細胞を培養する方法が一般的である。

なお、特許文献１には、人間脂肪組織の脂肪吸引で付随的に得られる生理食塩水に浮遊された脂肪含有の懸濁液を適正量の生理食塩水で均一に再浮遊して細胞培養用フラスコ又はローラボトル（ｒｏｌｌｅｒ ｂｏｔｔｌｅ）に適当量を入れた後、静置培養或いは回転培養を施した。静置培養の場合、最小６時間〜１２時間静置し、次に、フラスコ表面に付着する細胞層（脂肪由来ＭＳＣ、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）をトリプシンで処理して回収する。この際、少量の生理食塩水に浮遊されたものを直接回収してすぐに用いるか、細胞層の体積を減らそうとする場合、前記生理食塩水で回収した細胞層を１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して沈殿するペレット層のみを用いる。前記分離した細胞層には成体幹細胞と繊維芽細胞が含まれている。前記分離した細胞層を脂肪と混合して成体幹細胞、繊維芽細胞および脂肪又は脂肪細胞を含有する皮膚美容或いは整形用組成物を製造する方法が提示されている。

一方、特許文献２には、Ａ）脂肪吸引によって吸引物を収得する段階と、Ｂ）脂肪吸引物の細胞分画を得るために遠心分離機に移送する段階と、Ｃ）比重による遠心分離で細胞分画を収得する段階と、Ｄ）赤血球層より低い比重を有する細胞層を収集する段階と、で構成されたコラゲナーゼ処理を行わない幹細胞の製造方法が提示されている。

近年、臨床で用いられる方法は、酵素処理および遠心分離用容器は、一端が完全に遮蔽されたチューブ状であり、上部にチューブの外部面と締結される栓を備える。これにより、チューブの内容物を移動させたり、脂肪由来幹細胞が含まれた容器内に洗浄液などを投入するためには、前記栓を開放させて分離した物質を容器外部に除去するか、洗浄液などを容器内に投入させる。

上述した方法のように脂肪由来幹細胞を製造するためには、吸引或いは、切除された脂肪から有効成分を得るために洗浄液で排液して、これを遠心分離しなければならない。また、整形用途などの２次的用途への展開のために混合物を形成しなければならない。

このような過程で大きな問題となることは、先ず、遠心分離過程で実際有効成分の分離が容易でなく、通常、臨床では約１００ｃｃの吸引脂肪組織から５０万個の細胞を分離できると知られており、これは、全細胞数の百万分の１に該当する細胞のみを獲得できる非効率的な方法であるという点である。すなわち、遠心分離過程において分離に長時間を必要とするばかりではなく、分離時に苛酷な条件のために有効細胞の損傷が多大となる。

また、脂肪抽出物の処理過程において混合する成分の混合が容易でないという問題がある。

なお、他の問題は致命的でありうる。すなわち、脂肪の獲得、分離、有効成分の抽出、培養、再注入の過程において細胞が外部に露出する間、微生物汚染の危険が存在するなど人体に対する安全性が問題となり、２次感染や汚染による副作用が発生する可能性がある。

すなわち、容器に連結された栓を開放する瞬間、容器内部の有効成分は多量の空気と接触し、落塵による汚染がありうる。したがって、従来の臨床ではクラス１０００以上のクリーンルームで幹細胞の分離を行うなどの安定性に多くのコストと時間を要した。また、分離した物質の除去する場合、臨床者が目で層を区分して分離するなど、このような過程で有効成分の損失などの問題があった。

韓国登録特許第７８８，６３２号 国際公開第２００５／０４２７３０号パンフレット

前記のような問題点を解決するために、本発明の目的は、脂肪組織の損傷を最小化しながら収率が向上した幹細胞の分離方法を提供することにある。

本発明の他の目的は、一般的な大気条件下での汚染可能性を遮断することにより、安定性が向上した幹細胞の分離方法を提供することにある。

前記のような目的を達成するために、本発明は、幹細胞の分離方法において、吸引物質が含まれた容器の内径と一致するピストンに１以上の貫通孔が形成され、前記貫通孔を通じて酵素や洗浄液が投入されるように連結管を形成し、前記連結管は、先端部が前記貫通孔と連結され、末端部が外部管や酵素や洗浄液などが含まれた他の容器に連結されており、前記酵素や洗浄液を吸引物質が含まれた容器に投入するために、前記ピストンを引いて容器内に陰圧を形成させて、前記連結管とピストンの貫通孔を通じて酵素や洗浄液が前記容器内に投入される幹細胞の分離方法を提供する。

なお、本発明は、幹細胞の分離方法において、吸引物質が含まれた容器の内径と一致するピストンに１以上の貫通孔が形成され、前記貫通孔を通じて酵素や洗浄液が投入されるように連結管を形成し、前記連結管は、先端部が前記貫通孔と連結され、末端部が外部管や酵素や洗浄液などが含まれた他の容器に連結されており、前記容器のピストンを押して容器内に陽圧が形成されると、ピストン部分の上昇流体が貫通孔と連結管を通じて外部に流出される幹細胞の分離方法を提供する。

なお、本発明は、前記洗浄液などが投入された吸引物質を遠心分離などの過程を経て幹細胞のような有効成分が分離させた後、前記容器のピストンを押して容器内に陽圧が形成されると、ピストン部分の上昇流体が貫通孔と連結管を通じて外部に流出される幹細胞の分離方法を提供する。

なお、本発明は、前記連結管にチューブがさらに連結されて他の容器と連結される幹細胞の分離方法を提供する。

なお、本発明は、前記連結管又はチューブと他の容器が連結される区間に定量制御のための計量手段や１以上の容器と選択的に連結するために弁がさらに形成された幹細胞の分離方法を提供する。

なお、本発明は、前記弁が弁膜型一方向弁又はルアーロック付き三方弁である幹細胞の分離方法を提供する。

なお、本発明は、前記三方弁において第１弁が連結管又はチューブと連結され、第２弁が洗浄液などが含まれた容器又は有効成分抽出容器に連結され、第３弁が除去成分抽出容器又は洗浄液などが含まれた容器に連結される幹細胞の分離方法を提供する。

上述したように、本発明の実施例に係る幹細胞の分離方法は、容器内部に収容された脂肪吸引物質が外部と接触する機会を遮断することにより、安定性が確保された脂肪由来幹細胞を収得できる効果がある。

なお、本発明による方法は、吸引手術時に使った注射器を用いて脂肪由来幹細胞を分離することができ、細胞汚染を防止することにより、収率を向上させることができる特徴がある。

本発明の望ましい一実施例による分離方法を行う装置の斜視図 本発明の望ましい一実施例による分離方法を行う装置の分解斜視図 本発明の他の実施例による分離方法を行う装置の斜視図 本発明の他の実施例による分離方法を行う装置の分解斜視図

本明細書で用いられる程度を示す用語「約」、「実質的に」等は、言及した意味に固有の製造及び物質許容誤差が提示される際には、その数値又はその数値に近接した意味で用いられ、本発明の理解を助けるために正確な数値や絶対的な数値が言及された開示内容を非良心的な侵害者が不当に利用することを防ぐために用いる。

本発明を以下の実施例により詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。

以下、本発明の方法および装置は、脂肪を例として説明するが、その組織の類型は脂肪組織、血液、骨髄、筋肉、皮膚、肝、連結組織、筋膜およびその他やわらかい液状組織又は組織成分を含むが、これらに限定されるのではない。

本明細書に使用される脂肪吸引物質とは、脂肪吸引時に発生する全ての物質を意味する。典型的にこのような脂肪吸引物質は脂肪組織および脂肪吸引による吸引物を含む。

本発明による幹細胞分離において、先ず、出発物質を取得しなければならない。前記出発物質は脂肪であって、脂肪吸引により収得することができる。前記脂肪は例えば人間の脂肪であり、脂肪由来幹細胞で培養されて整形用途などに用いられる場合、自家脂肪でありうる。一方、脂肪吸引は所望の手術部位で行われ、注射器で脂肪を採取することができる。この際、用いられる注射器は脂肪を採取できるものであれば、特に制限されなく、その非制限的な例としては、本発明者が既に出願した韓国特願第２００３−５０２９号、同第２００５−６１１３４号、同第２００５−３４８４８号、同第２００６−６４９４６号、韓国実願第２００３−２１４８４号、同第２００４−１０６８５号、同第２００６−２６４５４号に開示されている注射器がある。前記注射器の特徴は、脂肪吸引と同時に吸引された脂肪吸引物質が大気と遮断されるという特徴がある。

前記吸引された脂肪吸引物質は、遠心分離により有効成分のみを抽出した後、コラゲナーゼのような酵素で処理することができる。このような酵素処理や洗浄液の投入時、従来は脂肪吸引物質が含まれた容器の一端を開放して前記酵素や洗浄液を投入した。この過程で吸引物質は大気に露出して安定性が損傷する問題が生じる。

したがって、本発明は、前記吸引物質が大気に露出する現象を最小化するために、吸引物質が含まれた容器１１０の内径と一致するピストン１３０を用いる。前記ピストンは１以上の貫通孔１３１が形成され、前記貫通孔１３１を通じて酵素や洗浄液が投入されるように連結管１５０を用いることができる。前記連結管１５０は、先端部１５１が前記貫通孔１３１と連結され、末端部１５３がチューブ１７０や酵素や洗浄液などが含まれた他の容器に連結される。

一方、前記連結管１５０は、使用の便宜上、別途のチューブがさらに連結されて他の容器などと連結することができ、他の容器などと連結される任意の区間に定量制御のための計量手段や１以上の容器と選択的に連結されるために、非制限的な例として、弁膜型一方向弁、ルアーロック付き三方弁のような弁を用いることができる。前記弁は手動型又は自動型である。

前記酵素や洗浄液を吸引物質が含まれた容器に投入するために、前記容器のピストンを引いて容器内に陰圧を形成させる。そうすると前記連結管とピストンの貫通孔を通じて酵素や洗浄液が前記容器内に投入される。

前記洗浄液などが投入された吸引物質は、遠心分離などの過程を経て幹細胞のような有効成分が分離される。前記有効成分を除いた他の成分は前記容器内で除去されなければならない。前記除去過程は、投入過程とは正反対に進行することができる。すなわち、前記容器のピストンを押して容器内に陽圧が形成されると、ピストン部分の上昇流体は貫通孔と連結管を通じて外部に流出される。この際、前記連結管やチューブの他末端部は、例えば、前記の除去される成分を収容するための他の容器と連結された状態である。

なお、三方弁が形成された場合、選択的に前記除去成分を容器内で除去した後、また他の容器（例えば、注射器）に有効成分のみを抽出することもでき、前記洗浄液などが含まれた容器に連結することもできる。すなわち、前記三方弁は、第１弁が連結管又はチューブと連結されるか、第２弁が洗浄液などが含まれた容器又は有効成分抽出容器に連結されるか、第３弁が除去成分抽出容器又は洗浄液などが含まれた容器に連結される。但し、前記連結構造は一例示であり、これに制限されるのではない。

通常、幹細胞分離時、洗浄過程は、数回繰り返して実施できるという点で有効成分が大気に露出する機会を最小化することができる。また、前記吸引物質が含まれた容器は例えば吸引手術時に用いられた注射器でありうる。

以上で説明した本発明は、前述の実施例および添付の図面によって限定されるものではなく、本発明の技術的思想から外れない範囲内で様々な置換、変形および変更が可能であることは、本発明が属する技術分野で通常の知識を有する者に明らかである。

１１０ 容器
１３０ ピストン
１３１ 貫通孔
１５０ 連結管
１５１ 先端部
１５３ 末端部
１７０ チューブ
１９０ 弁

Claims (5)

1. 幹細胞の分離方法において、
   脂肪吸引物質が含まれた容器の内径と一致するピストンに１以上の貫通孔が形成され、前記貫通孔を通じて酵素や洗浄液が投入されるように連結管を形成し、前記連結管は、先端部が前記貫通孔と連結され、末端部が外部管や酵素や洗浄液が含まれた他の容器に連結されており、
   前記酵素や洗浄液を脂肪吸引物質が含まれた容器に投入するために、前記ピストンを引いて容器内に陰圧を形成させて、前記連結管とピストンの貫通孔を通じて酵素や洗浄液が前記容器内に投入され、
   前記酵素や洗浄液が投入された脂肪吸引物質を、遠心分離過程を経て、幹細胞が含まれた有効成分を分離した後、前記容器のピストンを押して容器内に陽圧が形成されると、ピストン部分の上昇流体が前記貫通孔と前記連結管を通じて外部に流出することを特徴とする幹細胞の分離方法。
2. 前記連結管はチューブがさらに連結されて他の容器と連結されることを特徴とする請求項１に記載の幹細胞の分離方法。
3. 前記連結管又はチューブと他の容器が連結される区間に定量制御のための計量手段や１以上の容器と選択的に連結されるために弁がさらに形成されることを特徴とする請求項２に記載の幹細胞の分離方法。
4. 前記弁は、弁膜型一方向弁又はルアーロック付き三方向弁であることを特徴とする請求項３に記載の幹細胞の分離方法。
5. 前記三方向弁は、第１弁が連結管又はチューブと連結され、第２弁が洗浄液が含まれた容器又は有効成分抽出容器に連結され、第３弁が除去成分抽出容器又は洗浄液が含まれた容器に連結されることを特徴とする請求項４に記載の幹細胞の分離方法。

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