CN102741424A - 分离干细胞的方法 - Google Patents

Abstract

公开了一种分离干细胞的方法。所述方法使用特殊设计的装置，所述装置包括：含有吸出物的容器；具有与该容器的内径相应的外径且具有至少一个通孔的活塞；以及适于通过该通孔将酶或洗涤溶液供给到容器中的连接管，该连接管具有与该通孔相连的头，并且该连接管的另一端与一外部管或者另一含有酶或洗涤溶液的容器相连。所述方法包括回拉活塞以在含有吸出物的容器中形成负压并且使酶或洗涤溶液通过连接管以及活塞的通孔进入含有析出物的容器中。

Description

分离干细胞的方法

技术领域

本发明涉及从脂肪组织分离干细胞的方法，更具体地，本发明涉及在暴露于空气的机会最小的条件下分离干细胞的方法。

背景技术

干细胞具有分化成两种或更多种细胞类型的能力同时干细胞具有自体更新的能力。目前正研究从脂肪细胞以及骨髓中收获干细胞。从脂肪细胞分离的脂肪源性干细胞是多能干细胞，具有分化成包括脂肪细胞、肌细胞、软骨细胞和骨细胞在内的多种细胞类型的能力。

相比于骨髓源性间充质干细胞，脂肪干细胞的优点在于出众的自体更新能力以及易于进行间接体内(ex vivo)培养。脂肪干细胞的其它优点在于能够从充裕的脂肪组织中分离它们并且能够以简单安全的方式收获它们。从功能性的角度讲，发现脂肪干细胞和骨髓源性间充质干细胞几乎具有相同的特性，包括多潜能性、细胞学特性、免疫学特性以及组织再生。也即，脂肪干细胞被认为是间充质干细胞的最可能的替代物并且已证明它们在医学应用上的巨大效用。

相比于间充质干细胞，脂肪干细胞的优点在于简单且安全的组织获取以及无限的组织供求。此外，脂肪干细胞易于进行间接体内培养。由于这些优点，就组织可及性、稳定性、效力和经济效率而言，可认为脂肪干细胞优于骨髓源性间充质干细胞。

已经提出了许多方法来分离并培养脂肪细胞。根据一种典型的方法，在抽出脂肪或切下脂肪并压成块后，用胶原酶消化脂肪的组织，随后离心。然后收集沉淀并从中分离血管基质组分(SVF)。将SVF用于细胞培养。

此外，根据韩国专利No.788632公开的方法，将通过抽脂术从人脂肪组织获得的在生理盐水中的含脂肪悬液在适量生理盐水中均匀地重悬，将适量的所得悬液置于烧瓶或滚瓶中用于细胞培养，随后进行静置培养或滚瓶培养。在静置培养的情形下，使悬液静置至少6至12小时然后用胰蛋白酶处理贴附在烧瓶表面上的细胞层并收集。此时，在少量生理盐水中直接收集悬浮物并使用它而不进行进一步处理。或者，当想要减少细胞层的体积时，将在生理盐水中收集的细胞层以1000rpm离心10分钟并仅仅使用沉淀下来的颗粒层。分离的细胞层含有成体干细胞以及成纤维细胞。将分离的细胞层与脂肪混合以制备用于皮肤护理或整形外科的组合物。该组合物含有成体干细胞、成纤维细胞和脂肪或脂肪细胞。

另一方面，PCT国际公开号No.WO2005/042730提出了一种不用胶原酶处理来制备干细胞的方法，该方法包括：A)通过抽脂术获得吸出物；B)将该吸出物转移到离心管中以获得细胞组分；C)将该细胞组分通过比重进行离心；以及D)收集比重比红血球的比重小的细胞层。

目前在临床应用中使用的用于酶处理和离心的容器是管的形式，它的一端被完全封闭并且在其顶部包括紧固到管的外表面的塞子。当希望移动管的内容物或者将洗涤溶液供给到含有脂肪源性干细胞的容器中时，从该管中除去与该内容物分离开的物质或者洗涤溶液进入管处于打开位置状态的容器中。

如此，通过抽取或切除脂肪，用洗涤溶液释放它，随后离心而获得作为活性成分的脂肪源性干细胞。此外，该活性成分必须与其他成分混合用于二次应用。

这个过程中会产生一些严重的问题。首要问题是很难通过离心而实际分离活性成分。临床上已知能够从约100cc脂肪组织吸出物中分离五十万个细胞。这一数值仅仅相当于总细胞数的百万分之一。因此，使用离心的方法效率很低。也即，通过离心来进行分离花费很长时间并且用于分离的极端条件确实极大地损害有效用的细胞。

在处理脂肪提取物过程中的另一问题是很难将它与其他组分混合。

另一问题可能是致命的。也即，在脂肪获取和分离以及活性成分提取、培养和再输入(reinfusion)期间，细胞可能暴露于外部，造成微生物感染的风险。这一问题负面地影响人类的安全，例如由于二级感染或污染而产生的副作用。

具体地，只要一除去与容器相连的塞子，容器中的活性成分就与大量的空气接触并且可能被落下的污垢及尘埃所污染。为了试图解决这些问题，在1000级或更高级的无尘室中临床分离干细胞。然而，为了确保安全性，需要很大成本及很长时间。大多数情形下，临床医生除去被分离的物质同时利用双眼鉴定层以分离想要的层。这一过程中，不可避免地会损失活性成分。

发明内容

技术问题

为了解决上述问题，进行本发明，并且本发明的目的是提供一种以提高的产量来分离干细胞同时使对脂肪组织的损害最小的方法。

本发明的另一目的是提供一种在环境大气条件下，以提高的稳定性分离干细胞同时阻断污染的可能性的方法。

技术方案

根据本发明的一方面，提供一种使用一装置来分离干细胞的方法，所述装置包括：含有吸出物(aspirate)的容器；具有与该容器的内径相应的外径且具有至少一个通孔的活塞；以及适于通过该通孔将酶或洗涤溶液供给到容器中的连接管，该连接管具有与该通孔相连的头，并且该连接管的另一端与一外部管或者另一含有酶或洗涤溶液的容器相连，其中所述方法包括回拉活塞以在含有吸出物的容器中形成负压并且使酶或洗涤溶液通过连接管以及活塞的通孔进入含有吸出物的容器中。

根据本发明的另一方面，提供一种使用一装置来分离干细胞的方法，所述装置包括：含有吸出物的容器；具有与容器的内径相应的外径且具有至少一个通孔的活塞；以及适于通过该通孔将酶或洗涤溶液供给到容器中的连接管，该连接管具有与该通孔相连的头，并且该连接管的另一端与一外部管或者另一含有酶或洗涤溶液的容器相连，其中所述方法包括前推活塞以在容器中形成正压并且使一流体在活塞中上升以通过通孔和连接管离开到外部。

在进行离心以从吸出物和酶或洗涤溶液混合物中分离作为活性成分的干细胞后，前推活塞以在容器中形成正压并使一流体在活塞中上升以通过通孔和连接管离开到外部。

连接管与另一容器通过管相连。

所述装置进一步包括用于定量控制的机构或者阀，该定量控制的机构或者阀在该连接管或管与另一容器相连的区域中与至少一个容器任选地相连。

阀是单向隔膜阀或具有Luer Lock的三向阀。

三向阀包括：与连接管或管相连的第一阀；与含有洗涤溶液的容器或者适于提取活性成分的容器相连的第二阀；以及与适于提取待被除去的成分的容器或者含有洗涤溶液的容器相连的第三阀。

有益效果

如从上面所显见，根据本发明实施方式的方法阻断了在容器中容纳的、通过抽脂术获得的吸出物与外部接触的机会，使得能够有效地获得脂肪源性干细胞同时确保稳定性。

此外，用于抽脂术的注射器能够用来分离脂肪源性干细胞，使得该细胞能够免于污染，最终造成产量提高。

附图说明

图1是用于实施本发明优选实施方式的方法的装置的透视图。

图2是用于实施本发明优选实施方式的方法的装置的分解透视图。

图3是用于实施本发明另一实施方式的方法的装置的透视图。

图4是用于实施本发明另一实施方式的方法的装置的分解透视图。

具体实施方式

如在此使用，术语“约”、“基本上”等旨在允许数学精确性的一些偏差以考虑在商业上可接受的公差并且防止任何无良的违反者不当地利用为了帮助理解本发明而给出了准确或绝对数值的本公开内容。

下文，将给出关于本发明的方法以及用于实施该方法的装置的说明。在该方法和装置中使用脂肪，但这仅仅是说明性的。可用于本发明的组织类型的实例包括脂肪组织、血液、骨髓、肌肉、皮肤、肝、结缔组织、筋膜以及其他软组织液或组织成分，但不限于此。

如在此使用，术语“吸出物”旨在包括通过抽脂术获得的所有物质。典型地，吸出物包括通过抽脂术抽取的脂肪组织和物质。

首先，本发明的方法使用脂肪作为起始原料，脂肪能够获自抽脂术。脂肪可以源自人类。或者，脂肪可以是能够培养成用于整形外科等的脂肪源性干细胞的自体脂肪。另一方面，抽脂术可以在想要的位点进行。可通过注射器获取脂肪样品。任何能够获取脂肪样品的注射器均可用于本发明的方法，其非限制性的实例包括所有种类的注射器，例如由本发明人提出的韩国专利申请No.2003-5029、2005-61134、2005-34848以及2006-64946，韩国实用新型No.2003-21484、2004-10685以及2006-26454中公开的那些。这些注射器的特征在于通过抽脂术获得的吸出物不与大气接触。

只能通过离心从吸出物中提取活性成分。然后，活性成分能够用胶原酶处理。根据常规方法，含有吸出物的容器的一端必须是打开的，用于酶处理和洗涤溶液供给。这一过程中，吸出物暴露于大气，丧失其稳定性。

相反，本发明的方法使用活塞130，该活塞130的外径对应于含有吸出物的容器110的内径，以使吸出物向大气的暴露最小。活塞具有至少一个通孔131。连接管150适于通过通孔131向容器110中供给酶或洗涤溶液。连接管150具有与通孔131相连的头151，连接管150在另一端与含有酶或洗涤溶液的另一容器相连。

为了便于使用，连接管150可通过另外的管与另一容器相连。在连接管150与另一容器相连的区域中设有任选地与至少一个容器相连的用于定量控制的机构或阀。阀的非限制性实例包括单向隔膜阀或具有Luer Lock190的三向阀。阀可手动或自动操作。

为了使酶或洗涤溶液进入含有吸出物的容器，回拉活塞以在容器中形成负压。这一减压的结果是，可以将酶或洗涤溶液通过连接管和活塞的通孔供给到容器中。

活性成分，例如干细胞，通过离心从吸出物和洗涤溶液等的混合物中分离。必须从容器中除去除了活性成分以外的其它成分。移除步骤可以与供给步骤相反的顺序进行。也即，前推活塞以在容器中形成正压。这一正压使得流体在活塞中升高以通过通孔和连接管释放到外部。所述连接管或所述管的另一端可已经与适于容纳待移除的成分的另一容器相连。

在提供三向阀的情形下，在任选地从容器中除去除了活性成分以外的成分后，只能够将活性成分提取到另一容器(例如注射器)中。三向阀也可与含有洗涤溶液等的容器相连。也即，三向阀包括：与所述连接管或所述管相连的第一阀；与含有洗涤溶液的容器或适于提取活性成分的容器相连的第二阀；以及与适于提取待移除成分的容器或含有洗涤溶液的容器相连的第三阀。这一连接结构仅仅作为说明的目的给出，本发明并不限于此。

当重复洗涤步骤多次以除去干细胞时，能够进一步使活性成分暴露于大气的机会最小。可将用于抽脂术的注射器用作含有吸出物的容器。

尽管在此参照前述实施例以及附图描述了本发明，但是本发明的范围并不限于该实施例和附图。因此，对于本领域技术人员显而易见的是，多种替代、修改和变化是可能的，并不背离所附权利要求书中公开的本发明的精神。

Claims (7)

1.一种使用一装置来分离干细胞的方法，所述装置包括：含有吸出物的容器；具有与该容器的内径相应的外径且具有至少一个通孔的活塞；以及适于通过该通孔将酶或洗涤溶液供给到容器中的连接管，该连接管具有与该通孔相连的头，并且该连接管的另一端与一外部管或者另一含有酶或洗涤溶液的容器相连，

其中所述方法包括回拉活塞以在含有吸出物的容器中形成负压并且使酶或洗涤溶液通过连接管以及活塞的通孔进入含有吸出物的容器中。

2.一种使用一装置来分离干细胞的方法，所述装置包括：含有吸出物的容器；具有与容器的内径相应的外径且具有至少一个通孔的活塞；以及适于通过该通孔将酶或洗涤溶液供给到容器中的连接管，该连接管具有与该通孔相连的头，并且该连接管的另一端与一外部管或者另一含有酶或洗涤溶液的容器相连，

其中所述方法包括前推活塞以在容器中形成正压并且使一流体在活塞中上升以通过通孔和连接管离开到外部。

3.根据权利要求1的方法，其中在进行离心以从吸出物和酶或洗涤溶液混合物中分离作为活性成分的干细胞后，前推活塞以在容器中形成正压并使一流体在活塞中上升以通过通孔和连接管离开到外部。

4.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中所述连接管与另一容器通过管相连。

5.根据权利要求4的方法，其中所述装置进一步包括定量控制的机构或者阀，所述定量控制的机构或者阀在该连接管或管与另一容器相连的区域中与至少一个容器任选地相连。

6.根据权利要求5的方法，其中所述阀是单向隔膜阀或具有Luer Lock的三向阀。

7.根据权利要求6的方法，其中所述三向阀包括：与连接管或管相连的第一阀；与含有洗涤溶液的容器或者适于提取活性成分的容器相连的第二阀；以及与适于提取待被除去的成分的容器或者含有洗涤溶液的容器相连的第三阀。

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