CN109554339A - 一种从脂肪抽吸物中高效分离脂肪间充质干细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种从脂肪抽吸物中高效分离脂肪间充质干细胞的方法，包括以下步骤：步骤1：前脂肪细胞获取，在脂肪组织中加入胶原酶溶液，震荡得到混合液，在所述混合液中加入培养基，得到二次混合液，对所述二次混合液进行离心，收集底部细胞得到前脂肪细胞；步骤2：脂肪间充质干细胞的获得，使用培养基对所述步骤1得到的所述前脂肪细胞进行重新悬浮得到细胞重悬液，对所述细胞重悬液进行过滤去除杂质，得到含有脂肪间充质干细胞溶液，并对单位体积的所述含有脂肪间充质干细胞溶液中的细胞个数进行测定。提供了一种取材简便，步骤量化，具有较高重复性的从脂肪中分离脂肪间充质干细胞的方法。

Description

一种从脂肪抽吸物中高效分离脂肪间充质干细胞的方法
技术领域
本发明涉及生物细胞分离技术领域，具体涉及一种从脂肪抽吸物中高效分离脂肪间充质干细胞的方法。
背景技术
吸脂手术后的脂肪抽吸物是医疗废弃物。术后需要作为医疗垃圾统一处理。然而其内具有大量的脂肪干细胞被一同丢弃。脂肪抽吸物中储备了大量的脂肪来源干细胞(ADSC)，和骨髓间充质干细胞等人体其它组织来源干细胞一样，ADSC在组织再生和组织修复过程中发挥了重要功能。ADSC的角色既可以是种子细胞，由干细胞分化为组织再生和修复所需的成熟细胞(例如分化为脂肪细胞)，也可以是诱导剂，通过旁分泌功能抑制周围炎症反应、促进组织血管再生。利用ADSC的上述功能，有望为修复软组织缺损提供一种新的治疗途径。
脂肪间充质干细胞获取过程目前主要还是通过胶原酶酶消化,裂解法裂解红细胞等手段来进行。分离过程复杂繁琐、成本高，且并无统一操作标准，造成脂肪间充质干细胞获取效率低，可重复性差，所得脂肪间充质干细胞状态性差。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种取材简便，步骤量化，具有较高重复性的从脂肪中分离脂肪间充质干细胞的方法。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种从脂肪抽吸物中高效分离脂肪间充质干细胞的方法，包括以下步骤：
步骤1：前脂肪细胞获取，在脂肪组织中加入胶原酶溶液，震荡得到混合液，在所述混合液中加入培养基，得到二次混合液，对所述二次混合液进行离心，收集底部细胞得到前脂肪细胞；
步骤2：脂肪间充质干细胞的获得，使用培养基对所述步骤1得到的所述前脂肪细胞进行重新悬浮得到细胞重悬液，对所述细胞重悬液进行过滤去除杂质，得到含有脂肪间充质干细胞溶液，并对单位体积的所述细胞溶液中的细胞个数进行测定。
本发明的有益效果是：在于脂肪间充质干细胞获取率高；脂肪间充质干细胞状态良好、稳定性良好,具有多向分化能力；操作方法简单易行、可重复性强。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进：
进一步，所述步骤1中所述胶原酶溶液的加入体积与所述脂肪组织的体积相同，所述步骤1加入的培养基体积与所述脂肪组织的体积相同。
采用上述进一步方案的有益效果是利用胶原酶对细胞进行消化，用培养基对细胞进行中和胶原酶，防止消化过度，合适的胶原酶和培养基的用量在保证消化作用和中和作用的前提下，不会造成试剂的浪费。
进一步，所述步骤1中通过摇床进行震荡混合，所述摇床设定温度为37℃，设定速率为100rmp，震荡时间为60min，所述步骤1中的离心的离心速率为1200rmp，离心时间为10min。
采用上述进一步方案的有益效果是设置合适的温度使细胞在适宜的温度条件下繁殖，保持细胞活性，震荡速率过大则使细胞不稳定，速率过小则起不到震荡的效果，合适的震荡速率既能保证震荡效果，又能保证细胞的稳定性，合适的离心速率既能达到分离的效果，又能保证细胞活性不受损害，离心速率太小达不到分离的效果，离心速率太大，使得细胞由于离心力过大而造成细胞的死亡，合适的离心速率既能保证细胞活性，又能保证离心效果，合适的离心和震荡时间在保证离心和震荡效果的前提下，节约时间和设备。
进一步，所述步骤1中所述胶原酶溶液为浓度为质量分数为0.2％的I型胶原酶。
采用上述进一步方案的有益效果是该酶分离效果好，即使有钙、镁离子和血清成分存在仍有活性，既操作简便又可提高细胞成活率，且此酶消化作用缓和对细胞无影响。
进一步，所述步骤2中加入的所述培养基的体积与所述脂肪组织的体积相同，所述步骤2中所述过滤孔径为100μm，所述细胞个数的测定利用Muse细胞仪。
采用上述进一步方案的有益效果是利用培养基进行重悬，合适的培养基的用量在保证重悬作用的前提下，不会造成试剂的浪费，合适的过滤孔径，能够过滤杂质保留细胞，利用Muse细胞仪进行计数，准确快捷。
进一步，所述步骤1和所述步骤2中所述培养基中均包括：体积分数为89％的低糖DMEM、体积分数为10％的胎牛血清和体积分数为1％的青链霉素。
采用上述进一步方案的有益效果是该培养基具有很好的中和和重悬作用。
进一步，所述脂肪组织的获取包括如下步骤，
步骤0-1：脂肪抽吸物的获取，具备资质的专业整形外科医院在无菌条件下通过脂肪抽吸术获得脂肪抽吸物，对所述脂肪抽吸物进行包装并保存；
步骤0-2：脂肪组织的获取，对所述步骤1获取的所述脂肪抽吸物进行PBS冲洗，将冲洗后的抽吸物进行离心,去除上层油层及下层非脂肪层，吸取中层脂肪组织备用,并记录所得脂肪组织体积。
采用上述进一步方案的有益效果是采用合适的步骤获取脂肪组织，能够保证获取脂肪组织的细胞质量。
进一步，所述脂肪组织的获取中所述步骤0-1所述包装为无菌密闭注射器包装，所述保存温度为4℃，所述保存时间不超过24h，所述步骤0-2中的离心速率为1200rmp，离心时间为5min。
采用上述进一步方案的有益效果是进行无菌密闭注射器包装，防止杂菌污染影响实验结果，保存温度为4℃使得细胞处于良好的代谢状态，方便后续操作，保存时间不超过24h使得细胞处于分裂旺盛时期，分离得到的脂肪充质干细胞的活力状态，合适的离心速率既能达到分离的效果，又能保证细胞活性不受损害，离心速率太小达不到分离的效果，离心速率太大，使得细胞由于离心力过大而造成细胞的死亡，合适的离心速率既能保证细胞活性，又能保证离心效果。
进一步，所述脂肪组织的获取中所述步骤0-1所述包装为无菌密闭注射器包装，所述保存温度为4℃，所述保存时间不超过24h，所述步骤0-2中的离心速率为1200rmp，离心时间为5min。
采用上述进一步方案的有益效果是通过孵育得到所需量的脂肪间充质干细胞。
进一步，所述孵育过程中的接种密度为5×104/cm2，所述培养瓶为75cm2培养瓶，所述培养箱设置温度为37℃，二氧化碳体积分数为5％。
采用上述进一步方案的有益效果是合适的接种密度和培养瓶的大小保证细胞的生长空间及营养来源，设置合适的培养箱温度和二氧化碳浓度使得细胞有适宜的生长环境，有利于细胞成长。
附图说明
图1为本发明提取的脂肪间充质干细胞示意图；
图2为本发明提取的脂肪间充质干细胞表型示意图；
图3为本发明与传统方法的增殖曲线示意图；
图4为本发明提取的脂肪间充质干细胞成脂成骨分化能力示意图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
根据国际美容外科医学会统计，全球每年有超过140余万例吸脂手术。所吸除的大量脂肪抽吸物作为医疗废弃物被处理。然而，脂肪抽吸物中储备了大量的脂肪来源干细胞(ADSC)，ADSC在组织再生和组织修复过程中发挥了重要功能。ADSC的角色既可以是种子细胞，由干细胞分化为组织再生和修复所需的成熟细胞，也可以是诱导剂，通过旁分泌功能抑制周围炎症反应、促进组织血管再生。其具有重要的医疗及研究价值。
吸脂产生的大量脂肪抽吸物被废弃，除了增加了医疗废弃物处理的成本，更造成脂肪干细胞资源的严重浪费。因此建立脂肪来源干细胞库可充分发挥对废弃物的利用，既减少废物处理成本，又可将其二次利用发挥其中ADSC的价值，具有其重要意义。
本发明中的DMEM培养基为低糖DMEM培养基：dulbecco's modified eaglemedium。
0.2％的I型胶原酶溶液的配制方法：将1gI型胶原酶加入到500ml低糖DMEM培养基中溶解，制备成质量浓度为0.2％的I型胶原酶溶液，过滤后备用，配制后1h内使用，若不使用放于-20℃保存。
培养基配制方法：445ml低糖DMEM培养基+50ml胎牛血清+5ml青链霉素。
实施例
一种从脂肪抽吸物中高效分离脂肪间充质干细胞的方法，包括以下步骤：
步骤1：脂肪抽吸物的获取，具备资质的医院在无菌条件下通过脂肪抽吸术获得脂肪抽吸物，对所述脂肪抽吸物进行无菌密闭注射器包装，以4℃保存，储存时间不超过24h；
步骤2：脂肪组织的获取，对所述步骤1获取的所述脂肪抽吸物进行PBS冲洗，将冲洗后的抽吸物进行离心,离心速率为1200rmp，所述离心时间为5min，离心后去除上层油层及下层非脂肪层，吸取中层脂肪组织备用,并记录所得脂肪组织体积；
步骤3：前脂肪细胞获取，将所述步骤2获得的所述脂肪组织10ml中加入0.2％I型胶原酶溶液，0.1％I型胶原酶溶液的体积与脂肪组织相同为10ml，之后放入摇床震荡，摇床设置为37℃，震荡速率为100rmp，震荡时间为60min，得到混合液，在所述震荡后消化液中加入低糖DMEM、10％胎牛血清和1％青链霉素组成的培养基10ml中和，得到二次混合液，对所述二次混合液进行离心，离心速率为1200rmp，离心时间为10min，收集底部细胞得到前脂肪细胞；
步骤4：脂肪间充质干细胞的获得，利用低糖DMEM、10％胎牛血清和1％青链霉素组成的培养基10ml对所述步骤2得到的所述前脂肪细胞进行重新悬浮得到细胞重悬液，对所述细胞重悬液进行过滤去除杂质，过滤孔径为100μm，得到含有脂肪间充质干细胞溶液，利用Muse细胞仪对所述含有脂肪间充质干细胞溶液单位体积(1ml)内细胞个数进行计算；
步骤5：孵育，将所述步骤4得到的所述过滤细胞液按照5×104/cm2的密度接种于75cm2培养瓶中，然后放入培养箱进行孵育，所述培养箱设置温度为37℃，二氧化碳浓度为5％。
对比例
脂肪抽吸物的获取：脂肪抽吸物为具备资质的专业整形外科医院在无菌条件下通过脂肪抽吸术获得的脂肪抽吸物组织，抽取之后无菌密闭注射器包装，以4℃保存，储存时间不超过24h。
脂肪组织的获取：对所获取的脂肪抽吸物10ml进行PBS冲洗，将冲洗后的抽吸物进行1200rpm,5min离心，去除上层油层及下层非脂肪层，吸取中层脂肪备用。
前脂肪细胞获取：在所获得的脂肪中加入Ⅰ型胶原酶，确保终浓度为0.075-0.1％的，37℃恒温摇床100rmp震荡消化40-60min，所得消化液加入低糖DMEM培养基中和，中和后的混合液1200rpm离心10min，收集底部细胞，得到前脂肪细胞。
加入20ml裂解液，轻微Votex后室温放置15min，100目过滤器过滤去除杂质，1200rpm离心5min，加入20ml低糖DMEM培养基，1200rmp离心5min获得细胞沉淀。
脂肪间充质干细胞的获得：所得的细胞沉淀利用10ml低糖DMEM培养基重悬，100目过滤器过滤去除杂质，之后进行接种于T75培养瓶中，放入培养箱培养，培养温度37℃，二氧化碳浓度5％。
实验测定
细胞免疫表型检测利用流式细胞仪检测，细胞数目及细胞活性利用MUSE cellanalyzer进行检测。
CCK8细胞增殖检测方法：根据培养周期,选取第2代细胞进行消化、收集。取96孔培养板,于每孔内加入细胞悬液100ul,每孔细胞1500个。依据培养时长(d)设24个复孔,另外再设置8个空白调零孔(无细胞,只加入等量完全培养基),培养板放入细胞培养箱内预培养。配置CCK-8(Biyuntian Biotech Co.，Ltd，Shanghai，China)、培养基混合液，体积比为1：10，分别于第0d至7d轻轻吸取设定孔内上清液100ul,向孔内加入混有CCK-8培养基110ul,轻柔水平振荡混匀,放回培养箱孵育4h:用酶标仪(EnSpire 2300MultilabelReader,PerkinElmer,Singapore)测定波长450nm处各孔吸光度,复孔读数(平均值)与调零孔读数(平均值)的差值即为最终吸光度值；根据每个计量点的最终吸光度值绘制细胞增殖曲线。
茜素红染色步骤：(1).成骨诱导分化结束后，吸走六孔板中的成骨诱导分化完全培养基，用1×PBS冲洗1-2次。每孔加入2mL4％中性甲醛溶液，固定30min。(2).吸走中性甲醛溶液，用1×PBS冲洗2次。每孔中加入1mL茜素红染液染3-5min。(3).吸走茜素红染液，用1×PBS冲洗2-3次。(4).将培养板置于显微镜下观察成骨染色效果。
实验结果
1.图1为本发明实施例提取的2代脂肪间充质干细胞，细胞呈长梭形。
2.图2为流式细胞学显示采用本发明实施例的方法提取的脂肪间充质干细胞免疫表型CD73、CD90和CD105均大于90％，呈阳性，阴性表型小于2％，符合人间充质干细胞表型。
3.图3为利用CCK8细胞增殖检测方法测得的增值曲线，结果显示采用本发明专利提取的脂肪间充质干细胞增殖能力高于传统方法提取的脂肪间充质干细胞。
4.图4：茜素红染色显示采用本发明专利提取的脂肪间充质干细胞具有很好的成脂成骨分化能力。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种从脂肪抽吸物中高效分离脂肪间充质干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：前脂肪细胞获取，在脂肪组织中加入胶原酶溶液，震荡得到混合液，在所述混合液中加入培养基，得到二次混合液，对所述二次混合液进行离心，收集底部细胞得到前脂肪细胞；
步骤2：脂肪间充质干细胞的获得，使用培养基对所述步骤1得到的所述前脂肪细胞进行重新悬浮得到细胞重悬液，对所述细胞重悬液进行过滤去除杂质，得到含有脂肪间充质干细胞溶液，并对单位体积的所述含有脂肪间充质干细胞溶液中的细胞个数进行测定。
2.根据权利要求1所述一种从脂肪抽吸物中高效分离脂肪间充质干细胞的方法，其特征在于，所述步骤1中所述胶原酶溶液的加入体积与所述脂肪组织的体积相同，所述步骤1加入的所述培养基体积与所述脂肪组织的体积相同。
3.根据权利要求1所述一种从脂肪抽吸物中高效分离脂肪间充质干细胞的方法，其特征在于，所述步骤1中通过摇床进行震荡混合，所述摇床设定温度为37℃，设定速率为100rmp，震荡时间为60min，所述步骤1中的离心的离心速率为1200rmp，离心时间为10min。
4.根据权利要求1所述一种从脂肪抽吸物中高效分离脂肪间充质干细胞的方法，其特征在于，所述步骤1中所述胶原酶溶液为浓度为质量分数为0.2％的I型胶原酶溶液。
5.根据权利要求1所述一种从脂肪抽吸物中高效分离脂肪间充质干细胞的方法，其特征在于，所述步骤2中加入的所述培养基的体积与所述脂肪组织的体积相同，所述步骤2中所述过滤孔径为100μm，所述细胞个数的测定利用Muse细胞仪。
6.根据权利要求1所述一种从脂肪抽吸物中高效分离脂肪间充质干细胞的方法，其特征在于，所述步骤1和所述步骤2中所述培养基中均包括：体积分数为89％的低糖DMEM、体积分数为10％的胎牛血清和体积分数为1％的青链霉素。
7.根据权利要求1所述一种从脂肪抽吸物中高效分离脂肪间充质干细胞的方法，其特征在于，所述脂肪组织的获取包括如下步骤，
步骤0-1：脂肪抽吸物的获取，具备资质的医院在无菌条件下通过脂肪抽吸术获得脂肪抽吸物，对所述脂肪抽吸物进行包装并保存；
步骤0-2：脂肪组织的获取，对所述步骤1获取的所述脂肪抽吸物进行PBS冲洗，将冲洗后的抽吸物进行离心,去除上层油层及下层非脂肪层，吸取中层脂肪组织备用,并记录所得脂肪组织体积。
8.根据权利要求7所述一种从脂肪抽吸物中高效分离脂肪间充质干细胞的方法，其特征在于，所述脂肪组织的获取中所述步骤0-1所述包装为无菌密闭注射器包装，所述保存温度为4℃，所述保存时间不超过24h，所述步骤0-2中的离心速率为1200rmp，离心时间为5min。
9.根据权利要求1所述一种从脂肪抽吸物中高效分离脂肪间充质干细胞的方法，其特征在于，还包括孵育过程，将所述步骤2得到的所述含有脂肪间充质干细胞溶液接种于培养瓶中，然后放入培养箱进行孵育，得到具有一定数量的脂肪间充质干细胞溶液。
10.根据权利要求9所述一种从脂肪抽吸物中高效分离脂肪间充质干细胞的方法，其特征在于，所述孵育过程中的接种密度为5×104/cm2，所述培养瓶为75cm2培养瓶，所述培养箱设置温度为37℃，二氧化碳体积分数为5％。
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Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102433299A (zh) * 2011-11-17 2012-05-02 安徽农业大学 小鼠脂肪干细胞的分离、培养及纯化方法
CN104164403A (zh) * 2014-07-25 2014-11-26 大连大学 一种提取及培养脂肪干细胞的方法
CN105779395A (zh) * 2016-03-22 2016-07-20 西北农林科技大学 一种永生化的犬脂肪间充质干细胞系及其构建方法
CN106222134A (zh) * 2016-07-29 2016-12-14 中卫华医（北京）生物科技有限公司 高效获取脂肪间充质干细胞的培养方法
CN107287156A (zh) * 2016-04-07 2017-10-24 湖州赛托森生物科技发展有限公司 一种脂肪间充质干细胞的分离培养方法及其应用
CN107828725A (zh) * 2017-12-15 2018-03-23 北京焕生汇生物技术研究院 一种脂肪干细胞分离和体外培养的方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102433299A (zh) * 2011-11-17 2012-05-02 安徽农业大学 小鼠脂肪干细胞的分离、培养及纯化方法
CN104164403A (zh) * 2014-07-25 2014-11-26 大连大学 一种提取及培养脂肪干细胞的方法
CN105779395A (zh) * 2016-03-22 2016-07-20 西北农林科技大学 一种永生化的犬脂肪间充质干细胞系及其构建方法
CN107287156A (zh) * 2016-04-07 2017-10-24 湖州赛托森生物科技发展有限公司 一种脂肪间充质干细胞的分离培养方法及其应用
CN106222134A (zh) * 2016-07-29 2016-12-14 中卫华医（北京）生物科技有限公司 高效获取脂肪间充质干细胞的培养方法
CN107828725A (zh) * 2017-12-15 2018-03-23 北京焕生汇生物技术研究院 一种脂肪干细胞分离和体外培养的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LI ET AL.: "Evaluation of 2 Purification Methods for Isolation of Human Adipose-Derived Stem Cells Based on Red Blood Cell Lysis With Ammonium Chloride and Hypotonic Sodium Chloride Solution", 《ANNALS OF PLASTIC SURGERY》 *
李梓菲 等: "氯化铵裂解法与非裂解法提取人脂肪干细胞生物学特性的差异", 《中国组织工程研究》 *

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