CN101693884B - 一种从胎盘、脐带或脂肪组织中分离提取干细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种从胎盘、脐带或脂肪组织中分离提取干细胞的方法，其工艺步骤为：首先将胎盘、脐带或脂肪组织与细胞保养液按2.5～4∶1的重量比混合放入组织粉碎桶中，粉碎后加入胶原酶混匀，在37℃左右条件下孵育，过滤，加入沉淀剂，静置后吸取上清液，离心，除去上清液，将浓缩的细胞加入到泛影酸钠-聚蔗糖400^#的液体上，再离心，收取中间10-15ml的细胞层，用细胞保养液清洗，将收集的细胞计数，检测细胞存活率≥95％时，即可以供临床使用。本发明不仅实现了从胎盘、脐带或脂肪组织中分离提取所有干细胞，而且实现了工业化生产，使医生在临床上方便、安全、规范地获取成体干细胞，像用药一样地使用成体干细胞治疗病人的疾病，解决临床上很难获取成体干细胞的瓶颈，推广细胞治疗技术。

Description

一种从胎盘、脐带或脂肪组织中分离提取干细胞的方法

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，特别是涉及一种从胎盘、脐带或脂肪组织中分离提取干细胞的方法。

背景技术

目前国际上从人类骨髓、脐带血中分离细胞的方法很多，本申请人也申请了两项专利技术，如《骨髓脐带血干细胞体外分离试剂盒及其应用方法》(申请号200710137781.9)和《一种有核细胞体外分离试剂盒及其应用方法》(申请号200610106875.5)。这些技术为从人体骨髓和胎儿分娩后的脐带血中获取干细胞提供了技术保障，为干细胞的临床应用开辟了广阔的前景。

但是近年来的研究发现人胎盘和脐带不仅仅是血中含有大量的干细胞，而且在实体组织中也含有大量的成体干细胞ACS(adult stem cell)，如间充质干细胞MSC、(mesenchymal stem cell)、多能成体干细胞MAPC(multipotent adult progenitor cell)、多能成体祖细胞USSC(unrestricted somatic stem cell)、内皮祖细胞EPC(endothelialprogenitor cell)、脂肪-衍生干细胞ASC(adipose--derived stern cell)，脂肪干细胞FSC(fat stem cells)、成纤维干细胞(fibroblasts stemcell)、造血干细胞HSC(hematopoietic stem cell)等。一直以来，在胎儿分娩后，胎盘和脐带就成废物。从这些废弃的实体组织中收集提取成体干细胞，将会对成体干细胞的临床应用和研究提供丰富的干细胞来源。

近年来科学家们也发现脂肪组织中除含有丰富的脂肪干细胞(FSC)以外，还含有成纤维干细胞(fibroblasts stem cell)、间充质干细胞(MSC)，造血干细胞HSC(hematopoietic stem cell)等成体干细胞(ACS)。脂肪组织中干细胞的种类与数量仅次于骨髓组织，是人体的第二大储存干细胞的组织。在临床上采集骨髓和采集腹部的脂肪，两者相比，采集脂肪病人更容易接受，相比痛苦也小一点。还有近年来美容和减肥的吸脂手术后可获得大量的脂肪，将这些脂肪中的干细胞分离提取再利用也是一个非常好的途径。

胎盘、脐带及脂肪组织尽管结构不同、组织种类不同，但都是实体组织。虽然两种组织储存的成体干细胞的种类和数量方面有差异，但是存在于组织中细胞池(也叫壁龛、集落)的存在形式是相同的，所以可用同一种获取的方法获得。

目前，尽管已经有从胎盘脐带组织中提取间充质干细胞的方法，也有从胎盘脐带组织中获取营养层干细胞的方法，但都是实验室技术，距离产品的产业化还有很长一段距离；第二，这些方法只能获取单一种类的干细胞，不能有效保留全部的成体干细胞/祖细胞；第三由于是实验室技术没有操作规范的和产品质量要求，在临床推广应用时无法保证生物安全性和质量控制。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种可在临床推广应用，方便可靠，安全有效的从胎盘、脐带或脂肪组织中分离提取干细胞的方法，该方法可获得成体组织中所有的干细胞。

本发明的技术方案为：

本发明不仅实现了从胎盘、脐带或脂肪组织中分离提取所有干细胞，而且实现了工业化生产，使医生在临床上方便、安全、规范地获取成体干细胞，像用药一样地使用成体干细胞治疗病人的疾病，解决临床上很难获取成体干细胞的瓶颈，推广细胞治疗技术。本发明的方法简单可靠，操作规范，安全有效，避免交叉污染，规范操作，能够保证质量控制的产品。

具体实施方式

实施例1

试剂盒组成：

1、沉淀剂5％羟乙基淀粉，0.4％葡萄糖酸钙的水溶液，PH值为7.4±0.2，渗透压279mOsm/kg。

2、泛影酸钠-聚蔗糖400^#：5％聚蔗糖400^#等，12.5％泛影酸钠的混合液，密度1.077-1.080，PH值为7.4±0.2。

3、细胞保养液磷酸缓冲液，PH值为7.4±0.2。

4、胶原酶II或III或IV50-100mg或0.25％胰蛋白酶10ml。

5、试剂盒同时配有一次性灭菌的组织粉碎桶、粉碎机刀头、蔡氏过滤器、50ml硅化离心管，10ml和25ml移液管、细胞转移管组成的一个组合包装。采用吸塑盒密封的一次性使用的包装。采用γ射线消毒或是环氧乙烷消毒。每一套试剂盒配一套一次性用品。

上述的1-3条试剂配制后经过121℃高压灭菌35分钟，分别存放试剂盒中，测试细菌内毒素≤0.5EU/ml，2～8℃保存和运输，胶原酶分装后与上述试剂一起保存。

取新鲜胎盘和脐带一个称量以后，按重量与细胞保养液以4∶1的比例放到组织粉碎桶，以6000转/分4分钟粉碎，加入胶原酶1支混匀后，放置到37℃±0.5℃的水浴箱中30分钟。

用蔡氏漏斗过滤后按体积4∶1加入沉淀剂，混匀后静置20-30分钟，收取上清夜，离心力1100Xg离心5分钟，除去上清夜，加到泛影酸钠-聚蔗糖400^#液体上面(鸡尾酒加法)。用离心力650Xg离心30分钟，吸取细胞层，用细胞保养液清洗3次。进行细胞计数和细胞存活率检测后即可使用。

细胞存活率≥96％；

细胞收集率为200g胎盘脐带组织收集细胞总数应为2.5-4.9×10⁸。

上述浓度为质量浓度，其操作方法为质量规范方法，其产品的包装组合为实用技术组合。

实施例2

试剂盒组成：

1、沉淀剂7％羟乙基淀粉，0.2％葡萄糖酸钙的水溶液，PH值为7.4±0.2，渗透压279mOsm/kg。

2、泛影酸钠-聚蔗糖400^#：6％聚蔗糖400^#等，10％泛影酸钠的混合液，密度1.077-1.080，PH值为7.4±0.2，渗透压279mOsm/kg。

3、细胞保养液、磷酸缓冲液。

4、胶原酶II或III或IV50-100mg或0.25％胰蛋白酶10ml。。

5、试剂盒同时配有一次性灭菌的组织粉碎桶、粉碎力头、蔡氏过滤器、50ml硅化离心管，10ml和25ml移液管、细胞转移管组成的一个组合包装。采用吸塑盒密封的一次性使用的包装。采用γ射线消毒或是环氧乙烷消毒。每一套试剂盒配一套一次性用品。

上述的1-3条试剂配制后经121℃高压灭菌35分钟。测试细菌内毒素≤0.5EU/ml，分别存放试剂盒中，2～8℃保存和运输，胶原酶分装后与上述试剂一起保存。

取新鲜胎盘和脐带一个称量以后，按重量与细胞保养液以3∶1的比例放到组织粉碎桶，以6000转/分4分钟粉碎，加入胶原酶1支混匀后，放置到37℃±0.5℃的水浴箱中30分钟。

具体操作方法同实施例1。

细胞收集率为200g胎盘脐带组织收集细胞总数应为2.5-4.9×10⁸。

上述浓度为质量浓度，其操作方法为质量规范方法，其产品的包装组合为实用技术组合。

实施例3

试剂盒组成：

1、沉淀剂5％羟乙基淀粉，0.4％葡萄糖酸钙的水溶液，PH值为7.4±0.2，渗透压279mOsm/kg。

2、泛影酸钠-聚蔗糖400^#：5％聚蔗糖400^#等，12.5％泛影酸钠的混合液，密度1.077-1.080，PH值为7.4±0.2，渗透压279mOsm/kg。

3、细胞保养液磷酸缓冲液。

4、胶原酶II或III或IV50-100mg或0.25％胰蛋白酶10ml。

5、试剂盒同时配有一次性灭菌的组织粉碎桶、粉碎力头、蔡氏过滤器、50ml硅化离心管，10ml和25ml移液管、细胞转移管组成的一个组合包装。采用吸塑盒密封的一次性使用的包装。采用γ射线消毒或是环氧乙烷消毒。每一套试剂盒配一套一次性用品。

上述的1-3条试剂配制后经过121℃高压灭菌35分钟，分别存放试剂盒中，测试细菌内毒素≤0.5EU/ml，2～8℃保存和运输，胶原酶分装后与上述试剂一起保存。

取新鲜的脂肪组织，按重量与细胞保养液以4∶1的比例放到组织粉碎桶，以3000转/分2分钟粉碎，加入胶原酶1支混匀后，放置到37℃±0.5℃的水浴箱中30分钟。

用蔡氏漏斗过滤后按体积4∶1加入沉淀剂，混匀后静置20-30分钟，收取上清夜，离心力1100Xg离心5分钟，除去上清夜，加到泛影酸钠-聚蔗糖400^#液体上面(鸡尾酒加法)。用离心力650Xg离心20分钟，吸取细胞层，用细胞保养液清洗3次。进行细胞计数和细胞存活率检测后即可使用。

细胞存活率≥96％。

细胞收集率为350g吸取的脂肪组织收集细胞总数应为1×10⁸。

上述浓度为质量浓度，其操作方法为质量规范方法，其产品的包装组合为实用技术组合。

实施例4

试剂盒组成：

1、沉淀剂7％羟乙基淀粉，0.2％葡萄糖酸钙的水溶液，PH值为7.4±0.2，渗透压279mOsm/kg。

2、泛影酸钠-聚蔗糖400^#：6％聚蔗糖400^#等，10％泛影酸钠的混合液，密度1.077-1.080，PH值为7.4±0.2，渗透压279mOsm/kg。

3、细胞保养液：磷酸缓冲液。

4、胶原酶II或III或IV50-100mg或0.25％胰蛋白酶10ml。

5、试剂盒同时配有一次性灭菌的组织粉碎桶、粉碎力头、蔡氏过滤器、50ml硅化离心管，10ml和25ml移液管、细胞转移管组成的一个组合包装。采用吸塑盒密封的一次性使用的包装。采用γ射线消毒或是环氧乙烷消毒。每一套试剂盒配一套一次性用品。

上述的1-3条试剂配制后经121℃高压灭菌35分钟。测试细菌内毒素≤0.5EU/ml，分别存放试剂盒中，2～8℃保存和运输，胶原酶分装后与上述试剂一起保存。

取新鲜的脂肪组织，按重量与细胞保养液以4∶1的比例放到组织粉碎桶中，以3000转/分2分钟粉碎，加入胶原酶1支混匀后，放置到37℃±0.5℃的水浴箱中30分钟。

具体应用方法同实施例1。

细胞存活率≥96％。

细胞收集率为350g吸取的脂肪组织收集细胞总数应为1×10⁸。

上述浓度为质量浓度，其操作方法为质量规范方法，其产品的包装组合为实用技术组合。

实施例5

试剂盒组成：

1、沉淀剂7％羟乙基淀粉，0.2％葡萄糖酸钙的水溶液，PH值为7.4±0.2，渗透压279mOsm/kg。

2、泛影酸钠-聚蔗糖400^#：6％聚蔗糖400^#等，10％泛影酸钠的混合液，密度1.077-1.080，PH值为7.4±0.2，渗透压279mOsm/kg。

3、细胞保养液：磷酸缓冲液。

4、胶原酶II或III或IV50-100mg或0.25％胰蛋白酶10ml。

5、试剂盒同时配有一次性灭菌的组织粉碎桶、粉碎力头、蔡氏过滤器、50ml硅化离心管，10ml和25ml移液管、细胞转移管组成的一个组合包装。采用吸塑盒密封的一次性使用的包装。采用γ射线消毒或是环氧乙烷消毒。每一套试剂盒配一套一次性用品。

上述的1-3条试剂配制后经121℃高压灭菌35分钟。测试细菌内毒素≤0.5EU/ml，分别存放试剂盒中，2～8℃保存和运输，胶原酶分装后与上述试剂一起保存。

取新鲜的脂肪组织，按重量与细胞保养液以2.5∶1的比例放到组织粉碎桶中，以3000转/分2分钟粉碎，加入胶原酶1支混匀后，放置到37℃±0.5℃的水浴箱中30分钟。

具体应用方法同实施例1。

细胞存活率≥96％。

细胞收集率为350g吸取的脂肪组织收集细胞总数应为1×10⁸。

上述浓度为质量浓度，其操作方法为质量规范方法，其产品的包装组合为实用技术组合。

本发明的具体实施方式不限于上述实施例所提供的方式。

Claims (3)

1.一种从胎盘、脐带或脂肪组织中分离提取干细胞的方法，其工艺步骤为：

首先将胎盘、脐带或脂肪组织与细胞保养液按2.5～4：1的重量比混合放入组织粉碎桶中，以3000—6000转∕分的转速粉碎2—4分钟，然后加入胶原酶充分混匀，放置到37℃±0.5℃的水浴箱中孵育20—30分钟，用200目过滤器过滤，按组织悬液量的25%—40%比例加入沉淀剂，混匀后静置10～30分钟，吸取上清液，用1100Xg的离心力离心3～5分钟，除去上清液，将浓缩的细胞加入到泛影酸钠-聚蔗糖400^#的液体上，用离心力650Xg离心10—30分钟，收取中间10—15ml的细胞层，用细胞保养液清洗3—4次，将收集的细胞计数，检测细胞存活率≥95%时，即可以供临床使用；所述的细胞保养液为磷酸缓冲液，PH值为7.4±0.2；所述的胶原酶为胶原酶Ⅱ、胶原酶Ⅲ或胶原酶Ⅳ；所述的沉淀剂是指由5—7%的羟乙基淀粉/甲基纤维素/羧甲基淀粉与0.2—0.4%葡萄糖酸钙组成的水溶液，PH值为7.4±0.2；所述的泛影酸钠-聚蔗糖400^#，其密度为1.077—1.080，PH值为7.4±0.2。

2.一种从胎盘、脐带或脂肪组织中分离提取干细胞的试剂盒，其特征在于其组成包括细胞保养液、胶原酶、沉淀剂和泛影酸钠-聚蔗糖400^#，各试剂分开保存于同一个试剂盒中，每一套试剂盒与一套一次性用品配套作为一次分离提取的器具；所述的细胞保养液为磷酸缓冲液，PH值为7.4±0.2；所述的胶原酶为胶原酶Ⅱ、胶原酶Ⅲ或胶原酶Ⅳ；所述的沉淀剂是指由5—7%的羟乙基淀粉/甲基纤维素/羧甲基淀粉与0.2—0.4%葡萄糖酸钙组成的水溶液，PH值为7.4±0.2；所述的泛影酸钠-聚蔗糖400^#，其密度为1.077—1.080，PH值为7.4±0.2。

3.按照权利要求2所述的从胎盘、脐带或脂肪组织中分离提取干细胞的试剂盒，其特征是：所述一套一次性用品是由一次性灭菌的组织粉碎桶、粉碎力头、蔡氏过滤器、50ml硅化离心管、10ml和25ml移液管和细胞转移管组成的一个组合包装。