JP2009539546A - ヒト脂肪組織由来成体幹細胞、繊維芽細胞、及び脂肪又は脂肪細胞を含有する皮膚美容又は形成用の組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明の目的は、ヒト脂肪組織由来成体幹細胞、繊維芽細胞及び脂肪又は脂肪細胞を含有する美容又は形成用の組成物及びその製造方法を提供するところにある。
製造例1
ヒト脂肪組織の脂肪吸入術により付随して得られる生理食塩水に浮遊された脂肪含有浮遊物を適正量の生理食塩水により満遍なく再浮遊させて細胞培養用のフラスコ又はローラーボトルに適当量入れた後、静置培養又は回転培養を行った。静置培養の場合、少なくとも6時間から12時間かけて静置した。その後、フラスコの表面に付着される細胞層(脂肪由来MSC、線維芽細胞)をトリプシンにより処理して回収した(図1)。このとき、少量の生理食塩水に浮遊されたものを直接的に回収して直ちに使用するか、あるいは、細胞層の体積を低減しようとする場合、前記生理食塩水により回収した細胞層を1000rpmにおいて10分間遠心分離して、沈下したペレット層だけを使用した。前記分離された細胞層には成体幹細胞と繊維芽細胞が含有されている。前記分離された細胞層を脂肪と混合して本発明による成体幹細胞、繊維芽細胞及び脂肪又は脂肪細胞を含有する皮膚美容又は形成用の組成物を製造した。
ヒト脂肪組織から多分化能性幹細胞を分離及び精製した。すなわち、分離されたヒト脂肪組織をPBSにより3回に亘って洗浄した後、組織を細かく切断した後、コラゲナーゼタイプ1(1mg/ml)を添加したDMEM−LG(低グルコース)培地を用いて脂肪とDMEMを1:3の割合にて混合し、37℃の温度下において1時間かけて分解させた。PBSにより洗浄後、1000rpmにおいて5分間遠心分離した。上澄み液は吸入し、底面に残留しているペレットは1:1で混合した10%FBSとDMEM−LG(低グルコース)により洗浄した後、1000rpmで5分間遠心分離した。残留ペレットは100μm網目に通させてフィルターリングして破片を除去した後、PBSにより洗浄した。その後、DMEM(10%FBS、2mMNAC、0.2mMアスコルビン酸)培地にインキュベーションした。一晩経過後、未付着細胞はPBSにより洗浄し、K−NAC培地(ケラチノサイト−SFM培地+2mM NAC+0.2mMアスコルビン酸+0.09mMカルシウム+5ng/ml rEGF+50μg/ml BPE+5μg/mlインシュリン+74ng/mlヒドロコルチゾン)を2日置きに交換しながら培養してヒト脂肪組織由来多分化能性幹細胞及び繊維芽細胞液を得た。前記得られた細胞に脂肪を混合して、本発明による成体幹細胞、繊維芽細胞及び脂肪又は脂肪細胞を含有する皮膚美容外科又は形成用の組成物を製造した。
実施例1において得られた脂肪組織由来成体幹細胞をPBSにより洗浄し、トリプシン処理した後に細胞を回収して5分間1000rpm、4℃の条件下において遠心分離した。上澄み液を除去した後、2%FBS及びPBSの混合液を入れて洗浄し、その後、1000rpm、5分間及び4℃の条件下において遠心分離を行った。上澄み液を除去した後、細胞をPBSに浮遊させてサンプル数だけ1×105個の細胞を分注し、その後、1000rpm、5分間及び4℃の条件下において遠心分離を行った。次いで、上澄み液を除去し、150μlのブロッキング溶液(PBS中の5%FBS)を入れた後、よく混合して1000rpm、5分間及び4℃の条件下において遠心分離した。さらに上澄み液を除去し、100μlのブロッキング溶液(PBS中の5%FBS)を入れた後、よく混合して4℃の温度条件下において30分間反応させた。さらに、1000rpm、5分間及び4℃の条件下において遠心分離した後、上澄み液を除去し、150μlのブロッキング溶液(PBS中の5%FBS)を入れた後によく混合し、各ウェルに抗体(R-phycoerythrin-conjugated mouse anti-human monoclonal antibody)を入れ、4℃の温度条件下において30分間反応させた。反応後に1000rpm、5分間及び4℃の条件下において遠心分離した。上澄み液を除去した後にPBSにより洗浄し、1000rpm、5分間及び4℃の条件下において遠心分離した。さらに前記上澄み液を除去した後にPBSにより洗浄し、1000rpm、5分間及び4℃の条件下において遠心分離する過程を繰り返し行った。上澄み液を除去した後、200μlのPBSによく混合した後、1%パラホルムアルデヒドを入れて固定し、フローサイトメータを用いて分析した。
前記実施例1において得られた脂肪組織由来幹細胞をPBSにより3回に亘って洗浄し、4%パラホルムアルデヒドを含有するPBSにより30分間固定した。PBSにより3回に亘って洗浄した後、0.1%トリトン−X100を含有するPBSに10分間透過させた。PBSにより3回に亘って洗浄した後、10%NGSにより1時間かけて反応させ、1次抗体を含有するPBSで一晩、反応させた。PBSにより3回に亘って洗浄し、2次抗体により暗室中において1時間かけて反応させた。PBSにより3回に亘って洗浄した後、マウントした。
実施例1において得られた脂肪組織由来多分化能成体幹細胞を5%FBS、1μMデキサメタソン、200μMインドメタシン、10μg/mlインシュリン、0.5mMIBMX(3−イソブチル−1−メチルキサンチン)を含有するα−MEM培地中において2週間培養して多分化能性幹細胞の脂肪生成性の細胞への分化を誘導し、オイルレッドO染色法を用いて分析した。その結果、図3に示すように、本発明によるヒト脂肪組織由来多分化能性幹細胞が脂肪生成性の細胞に分化されていることを確認することができた。
マウスを用いて、脂肪組織由来幹細胞の脂肪体積保存能を確認した。マウスは実験群12匹と対照群12匹を使用し、実験群には脂肪1mlと実施例1において分離された脂肪組織由来多分化能性成体幹細胞及び繊維芽細胞(5×105/200μl生理食塩水)をマウスのうち皮下脂肪のない部位である頭部皮下に注入し、対照群には脂肪1ml+ビヒクル(200μl生理食塩水)を注入した。
Claims (6)
- (i)ヒト脂肪組織由来成体幹細胞、(ii)繊維芽細胞及び(iii)脂肪又は脂肪細胞を含有する皮膚美容又は形成用の組成物。
- 前記組成物は、乳房組織の形成用又はシワ除去用であることを特徴とする請求項1に記載の組成物。
- 次のステップを含む、(i)ヒト脂肪組織由来成体幹細胞、(ii)繊維芽細胞及び(iii)脂肪又は脂肪細胞を含有する皮膚美容又は形成用の組成物の製造方法:
(a)ヒト脂肪組織の脂肪吸入術により得られた脂肪含有浮遊物を培養容器において培養した後、前記培養容器に付着された脂肪由来成体幹細胞及び繊維芽細胞含有細胞層を回収するステップと、
(b)前記回収された脂肪由来成体幹細胞及び繊維芽細胞含有細胞層を脂肪又は脂肪細胞と混合するステップ。 - 前記成体幹細胞は、中胚葉由来細胞であることを特徴とする請求項3に記載の方法。
- 前記成体幹細胞はデキサメサソン、インドメタシン、インシュリン及びIBMXを含有するα−MEM培地で培養して脂肪細胞に分化されることを特徴とする請求項3に記載の方法。
- 次のステップを含む、(i)ヒト脂肪組織由来成体幹細胞、(ii)繊維芽細胞及び(iii)脂肪又は脂肪細胞を含有する皮膚美容又は形成用の組成物の製造方法:
(a)ヒト脂肪組織由来ペレットをNAC(N−アセチル−L−システイン)含有培地において培養して脂肪由来成体幹細胞を製造した後、脂肪由来成体幹細胞と繊維芽細胞を回収するステップと、
(b)前記回収された脂肪由来成体幹細胞及び繊維芽細胞を脂肪又は脂肪細胞と混合するステップ。
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