CN107921182B - 用于分离基质血管部分的机械仪器和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于在脂肪抽出后分离基质血管部分(SVF)的仪器和方法。

Description

用于分离基质血管部分的机械仪器和方法
技术领域
本发明总体上涉及用于分离具有独特构造的基质血管部分(SVF)的非酶方法和用于实施该方法的仪器。
背景技术
脂肪组织代表了丰富且易得到的成体干细胞来源，成体干细胞能够沿着多条谱系途径进行分化。已经证明获得自脂肪组织的脂肪抽出物可用作不同类型干细胞/祖细胞的易得到且丰富的来源，干细胞/祖细胞具有适合于组织工程和再生医学应用的多潜能特征[1]。
脂肪组织的酶消化最常用于加工脂肪抽出物。例如，先前已经通过切碎大鼠脂肪垫、洗涤以除去受污染的造血细胞以及用胶原酶孵育组织片段以从颗粒状基质血管部分(SVF)中分离成熟脂肪细胞的漂浮群体，来进行用于分离脂肪干细胞/祖细胞的脂肪抽出物的加工[2]。
脂肪抽吸手术的发展已简化了该程序。在脂肪抽吸期间，外科医生经由插管向皮下组织注入含有麻醉剂和/或肾上腺素的盐溶液，并且然后在吸引的情况下去除液体和组织两者，以典型地产生精细切碎的组织片段，这些组织片段的大小取决于插管的尺寸[3]。
因此，可以将人脂肪干细胞/基质细胞容易地从活组织检查和脂肪抽吸样本分离[4]；可以使用粘连柱从脂肪抽吸抽出物的液体部分衍生[5]；并且还可以通过非酶机械解离程序从人脂肪抽出物样品分离[6]。
当定量研究离心对脂肪抽吸抽出物的影响以优化脂肪移植和脂肪干细胞的分离的离心条件时，Kurita M等人建议1200x g作为优化的离心力，以便在脂肪移植中获得好的短期结果和长期结果[7]。
Shah A等人描述了洗涤脂肪组织用于分离人脂肪组织基质干细胞的非酶方法[8]。
最近，已经描述了许多用于从脂肪抽出物分离脂肪祖细胞和/或干细胞的机械装置。
US 2012/264213[9]披露了脂肪抽出物提取装置，该装置有助于从在脂肪抽吸期间获得的流体中机械释放的脂肪祖细胞和/或干细胞的收集和加工。
US 2013/034524[10]披露了用于使用机械破碎和过滤-离心的组合从脂肪组织提取、分离和浓缩临床有用的再生细胞，以获得高度富集的干细胞群体的装置和方法。
Alexander RW[11]报道了使用微插管脂肪抽出物经历机械乳化，以提供成体成熟脂肪细胞裂解、保存可通过小孔针注射的小颗粒形式的组织基质血管部分(tSVF)的差异。
出版物
[1]Gimle J,Circulation Research.[循环研究]2007,100:1249-1260；
[2]Rodbell M和Jones AB,J Biol Chem[生物化学杂志]，1966；241:140-142；
[3]Illouz YG.Plast Reconstr Surg[整形与重建外科杂志]，1983；72:591-597；
[4]Dubois SG等人，Methods Mol Biol[分子生物学方法]，2008；449:69-79；
[5]Kentaro Doi1等人，Cytotherapy[细胞疗法]，第16卷，第3期，2014，第381-391页；
[6]Baptista LS等人，Cytotherapy[细胞疗法]，2009；11(6):706-15；
[7]Kurita M等人，Plast Reconstr Surg.[整形与重建外科杂志]2008,121(3):1033-41；
[8]Shah S等人，Cytotherapy[细胞疗法杂志]，15(8),2013，第979-985页
[9]US 2012/264213
[10]US 2013/034524
[11]Alexander RW,Journal of Prolotherapy.[增生疗法杂志]2016；8:e947-e960.
[12]Lv,F.-J.等人，Stem cells.[干细胞]2014；32:1408-1419。
发明内容
在此披露的本发明总体上涉及用于在脂肪抽出后分离基质血管部分(SVF)的仪器和方法。
更具体地，本发明针对使用机械破碎/解离、洗涤和离心的组合从脂肪组织分离基质细胞部分，用于获得基质血管部分的富集群体的机械方法。该机械方法在闭合的单次使用的器皿(vessel)或容器(container)或仪器(apparatus)(该器皿或容器或仪器适于接收、操纵和允许富集的细胞群体的分离)中进行。该器皿呈“容器组件”(在此与‘容器’可互换)的形式，在一些实施例中呈圆柱形侧壁形状的形式，具有凹形底、上顶棚部和使得该容器能够独立地站立在平坦表面上的平面底座。该器皿被配置为从哺乳动物体内收集脂肪细胞，并且进一步适于在容器的下部促进细胞团粒的保留(例如，在容器的离心后)。
在一些实施例中，该容器组件具有圆形(例如，瞬接的、螺纹的)闭合帽(盖)用来全封闭容器。该闭合帽具有多个可密封的入口以允许将管/插管插入至容器单元中。该可密封的入口适于允许根据使用的具体方法而插入不同的管和插管(例如，插入管以使其进入洗涤溶液中；以附接在此描述的抽吸管和真空泵等)。
该容器组件的闭合帽被配置为允许附接电气驱动器(该电气驱动器可拆卸地连接(例如，通过轴/套筒)到安置于容器组件内的机械组织破碎装置)，该容器组件与该容器的凹形底相邻但是没有接触。
‘机械组织破碎装置’可以是任何适合于组织破碎/解离的装置(例如，闭合的容器)，该装置在整个破碎/解离过程中保持细胞活力。
在一些实施例中，该机械组织破碎装置包括至少一个旋转叶片或转子。
在其他实施例中，该机械组织破碎装置包括磨球或磨珠(例如，0.5mm-2mm直径的玻璃珠或二氧化锆/二氧化硅珠)。
根据本发明，容器组件的灭菌不影响闭合帽和/或安置在其中的入口的密封效果。
“抽吸管”(在此与‘插管’可互换)总体上是指通常用于脂肪抽吸或任何其他涉及从哺乳动物的体组织(例如，脂肪层)提取细胞和/或组织片段(例如，通过在体内脂肪去除部位处的小切口插入以允许经由吸引从体内抽吸脂肪细胞)的医学程序的插管。典型地，插管构成了在尖端钝化并且在其尖端具有至少一个开口(孔)的中空管。该插管可以重复使用(以允许其多次使用)并且可以通过蒸汽高压灭菌器或通过任何其他本领域已知的标准灭菌方法进行灭菌。
该插管的中空管被配置为允许包含从哺乳动物体内吸引的液体和脂肪组织组分(例如，脂肪细胞、切碎的脂肪球状体的片段，破碎的脂肪细胞)的混合物经过以进入插管并且通过容器组件的闭合帽的入口直接进入该容器组件。
根据本发明，真空泵附接至(例如，闭合帽或侧壁)容器，以经由抽吸管来激活脂肪抽吸使脂肪组织进入容器中。
在一些实施例中，该真空泵是脂肪抽吸泵(例如，任何可以根据本发明使用的本领域已知的脂肪抽吸手术抽气泵)。
如在此使用的，术语“脂肪组织”(在此与‘脂肪细胞’可互换)总体上是指任何类型的可以从脂肪组织分离的并且可以用于由此分离基质细胞部分(SVF)的细胞和/或组织片段。
根据本发明，SVF可以衍生自脂肪抽吸抽出物的脂肪部分和流体部分两者，并且典型地包含具有不同程度的成熟度和功能的多种细胞群体的异质混合。因此，该SVF总体上由造血细胞部分(例如，粒细胞、单核细胞和淋巴细胞)与前脂肪细胞、内皮细胞、周细胞、成纤维细胞和干祖细胞一起组成。
在一些实施例中，在本发明的方法中获得的SVF的特征在于以下特征中的至少一个：
-SVF在表型上可鉴定为具有百分比在约40％和约91％之间的CD45+细胞；
-SVF在表型上可鉴定为具有百分比在约5％和约50％之间的CD45(-)CD31(-)CD34(+)和百分比在约3％和约40％之间的CD45(-)CD73(+)CD29(+)细胞；
-SVF在表型上可鉴定为具有百分比在约7％和约40％之间的CD45(-)CD31(-)CD34(+)和百分比在约6％和约30％之间的CD45(-)CD73(+)CD29(+)细胞；
-SVF在表型上可鉴定为具有百分比在约2％和约15％之间的CD45(-)CD31(-)单核细胞门(+)CD34(+)细胞；
-SVF在表型上可鉴定为具有百分比在约4％和约10％之间的CD45(-)CD31(-)单核细胞门(+)CD34(+)细胞；
-有核细胞的SFV产率比在此描述的仅洗涤方法(wash only method)中获得的产率高至少3倍；
-与在仅洗涤方法中获得的相比，在细胞培养持续7到14天之间的时间后，脂肪抽出物的细胞/1ml的量高至少15倍，如下面进一步描述的；
-如通过细胞的分化能力、以及通过特定干细胞标记和物理特性(如通过流式细胞术鉴定的)所测量的，与在仅洗涤方法中获得的相比，SVF含有更高百分比的间充质祖干细胞；
-SVF是可注射的(例如，注射到哺乳动物组织中)，经由具有在33规格到7规格之间的规格号的非常小的针。
在一些实施例中，在本发明的方法中获得的SVF的特征在于具有百分比在约7％和约40％之间的CD45(-)CD31(-)CD34(+)细胞和百分比在约6％和约30％之间的CD45(-)CD73(+)CD29(+)细胞；和/或在于具有百分比在约4％和约10％之间的CD45(-)CD31(-)单核细胞门(+)CD34(+)细胞。
在一些实施例中，SVF在表型上可鉴定为具有百分比在约5％和约50％之间的CD45(-)CD31(-)CD34(+)细胞和百分比在约3％和约40％之间的CD45(-)CD73(+)CD29(+)细胞。在一些实施例中，SVF在表型上可鉴定为具有百分比在约7％和约40％之间的CD45(-)CD31(-)CD34(+)细胞和百分比在约6％和约30％之间的CD45(-)CD73(+)CD29(+)细胞。
在一些实施例中，SVF在表型上可鉴定为具有百分比在约2％和约15％之间的CD45(-)CD31(-)单核细胞门(+)CD34(+)细胞。在一些实施例中，SVF在表型上可鉴定为具有百分比在约4％和约10％之间的CD45(-)CD31(-)单核细胞门(+)CD34(+)细胞。
在一些实施例中，抽吸插管的直径在约0.5mm和约10mm之间。
在其他实施例中，抽吸插管的直径在约2mm和约6mm之间，或在约3mm和约5mm之间。
本发明的插管可以在其远端具有不同类型的尖端，以优化附接和插入到脂肪层，用于收获脂肪细胞。如熟练的技术人员容易地认识到的，插管的最佳大小(例如，直径、长度)和材料类型取决于基于与患者的条件相关的不同参数、进行脂肪抽吸的医师的特定要求、收获的脂肪细胞的预期用途等。
如本领域技术人员所认识到的，由于在吸引和通过抽吸管的期间受到剪切力的影响，抽吸(脂肪抽吸)方法可能部分地使抽吸的脂肪组织破裂(例如，破裂成脂肪球状体)。因此，收集至容器的脂肪细胞可能已经被部分地破碎。一旦脂肪细胞被收集在容器组件中，收获的脂肪细胞的机械破碎是在脂肪抽吸期间抽吸的流体(例如，主要由生理溶液中的脂肪抽出物组成，但是还可以含有局部麻醉剂物质(例如利多卡因和肾上腺素)的残余物)中进行、或在洗涤溶液中或在分离的脂肪抽出物中进行，该分离的脂肪抽出物是使用通过电气驱动器控制的机械组织破碎装置从任何添加的溶液中分离的，该电气驱动器在外部并且可拆卸地连接至容器的闭合帽。该机械组织破碎装置(典型地包含至少一个转子或叶片以影响旋转力)被配置为下降到容器的凹形底部和从容器的凹形底部缩回，并且被配置为锁定在适当位置(例如，在脂肪细胞的机械破碎期间)。
机械组织破碎装置的转子转速(以速率/分钟[RPM]测量)适于保持从体内脂肪层抽吸的基质血管部分细胞的活力(例如，通过产生均质的单细胞悬浮液、保存细胞完整性和防止起泡和蛋白质变性)。
在一些实施例中，该转子以约500RPM和约8000RPM之间旋转。在一些实施例中，该转子以约1000到6000RPM之间旋转。在一些实施例中，该转子以约1100到1500RPM之间旋转。
根据本发明使用的机械破碎不需要在收获和操纵组织和细胞的任何阶段进行酶消化。
在一些实施例中，该机械破碎在不添加洗涤溶液的情况下在脂肪抽出物溶液中进行。根据此类实施例，在完成该机械破碎时，如在此描述的，可以将机械破碎的脂肪抽出物洗涤至少一次。
在其他实施例中，在收获的脂肪抽出物的机械破碎之前，使用洗涤溶液(例如，盐水或任何在约4摄氏度和约37摄氏度之间的温度的其他合适的生理溶液)广泛洗涤脂肪抽出物(例如，以去除受污染的血液)，通过容器的闭合帽的至少一个入口转移该洗涤溶液，其中在每个洗涤步骤后将容器转移到离心机(该离心机适于接收容器)中，并且以足够的力离心并持续足够的时间，以在该容器的底部(凹形)部分形成上清液和(例如，软的)细胞团粒。根据此类实施例，该机械破碎在洗涤溶液中进行，并且可以在每个洗涤步骤后进行一次或至少再重复一次。
如在此描述的，在机械破碎后，可以再次洗涤脂肪抽出物至少一次。
在一些实施例中，在收获的脂肪抽出物的机械破碎期间，使洗涤溶液经过漏斗(例如，连续地)进入容器中。
在其他实施例中，使洗涤溶液在脂肪抽出物被吸引到容器之前经过漏斗进入容器中，并且然后进行每个离心步骤。
如本领域技术人员容易地认识到的，在此描述的每个洗涤步骤之后进行离心，其中在轻轻地抽吸洗涤溶液(即上清液)之后立即进行离心。洗涤可以重复一次或多次，其中在每个洗涤步骤后进行离心，并且其中将洗涤溶液从器皿抽吸出并引入新溶液。
在一些实施例中，洗涤溶液进一步含有(例如，出于富集特定细胞部分和/或以帮助脂肪细胞的分级的目的)至少一种另外的试剂。此类试剂的一些非限制性实例包括：细胞特异性抗体、缓冲剂、糖基密度梯度(例如，蔗糖、甘露糖、聚蔗糖、硫酸葡聚糖)、非糖密度梯度(例如，珀可(percoll)、珀可PLUS(percoll plus)、
Figure BDA0001568249340000051
)、抗体介导的磁性细胞分选溶液、非磁性抗体介导的细胞分选溶液(非磁性)。
根据本发明，离心用来将细胞(例如，基质血管部分)与细胞的漂浮群体(例如，成熟脂肪细胞)分离。
在一些实施例中，容器可以以约200x g和约1500x g之间、或以约250x g和约500xg之间进行离心(例如，以将SVF细胞与漂浮脂肪细胞分离)。
在容器的每次离心后，将该容器从离心机中取出，并且使用抽吸针或适合从器皿内抽出团粒的任何机械手段轻轻地抽吸细胞团粒。
在一些实施例中，在至少一个洗涤步骤后，在相分离发生后轻轻地抽吸细胞团粒，而不进行离心。
在一些实施例中，在计数有核细胞之前，将细胞团粒通过粗滤器(例如，具有在约40μM和约200μM之间的筛孔大小)进行转移。
在一些实施例中，将细胞团粒进一步加工以富集特定的所希望的细胞群体(例如，使用基于荧光激活细胞分选(FACS)的技术或熟练技术人员已知的任何其他合适的细胞富集方法)。
熟练技术人员将容易地认识到，在机械破碎方法(例如，破碎、洗涤、离心)期间进行的任何程序可以在约4摄氏度和约37摄氏度之间(取决于与本发明的方法相关的不同参数(例如，脂肪组织的类型、转子转速、转子类型、溶液与脂肪组织比率等)，这些参数是熟练技术人员已知的)进行。
在一些实施例中，本发明的方法涉及将盐水(例如，预热至约37摄氏度)添加到脂肪抽出物，然后进行脂肪/盐水混合物的机械破碎(例如，室温)，并且将机械破碎的脂肪(与盐水)离心并通过粗滤器(strainer)或过滤器(filter)进行转移。
因此，在一些方面中，本发明提供如在此描述的容器或器皿。
在本发明的另一方面，本发明提供用于从哺乳动物脂肪组织富集细胞群体的方法，该方法包括：
-将脂肪组织抽吸到容器组件中(例如，使用具有可拆卸地连接到容器单元的近端和插入到哺乳动物体内至少一个腔的远端的抽吸管)；
-在容器组件中机械破碎/破裂脂肪组织(例如，使用机械组织破碎装置以获得细胞悬浮液，其中该破碎不使用酶)；
-在容器组件内洗涤该细胞悬浮液；和
-将容器组件转移到离心机并且对该容器组件进行离心，从而获得细胞团粒。
在一些实施例中，该方法进一步包括从容器组件内提取细胞团粒以获得富集的细胞群体的步骤。
在一些实施例中，所获得的富集的细胞群体是SVF细胞部分，该SVF细胞部分的特征在于以下特征中的至少一个：
-SVF在表型上可鉴定为具有百分比在约40％和约91％之间的CD45+细胞；
-SVF在表型上可鉴定为具有百分比在约5％和约50％之间的CD45(-)CD31(-)CD34(+)细胞和百分比在约3％和约40％之间的CD45(-)CD73(+)CD29(+)细胞；
-SVF在表型上可鉴定为具有百分比在约7％和约40％之间的CD45(-)CD31(-)CD34(+)细胞和百分比在约6％和约30％之间的CD45(-)CD73(+)CD29(+)细胞；
-SVF在表型上可鉴定为具有百分比在约2％和约15％之间的CD45(-)CD31(-)单核细胞门(+)CD34(+)细胞；
-SVF在表型上可鉴定为具有百分比在约4％和约10％之间的CD45(-)CD31(-)单核细胞门(+)CD34(+)细胞；
-有核细胞的SFV产率比在此描述的仅洗涤方法中获得的产率高至少3倍；
-与在仅洗涤方法中获得的相比，在细胞培养持续7至14天之间的时间后，脂肪抽出物的细胞/1ml的量高至少15倍，如下面进一步描述的；
-如通过细胞的分化能力、以及通过特定干细胞标记和物理特性(如通过流式细胞术鉴定的)所测量的，与在仅洗涤方法中获得的相比，SVF含有更高百分比的间充质祖干细胞。
-SVF是可注射的(例如，注射到哺乳动物组织中)，经由具有在33规格到7规格之间的规格号的非常小的针。
在其他实施例中，该方法包括从获得SVF部分的脂肪中分离脂肪，并且在美容或治疗功用的方法中使用该脂肪的步骤。
本发明进一步提供SVF部分，该SVF部分的特征在于以下任何一个：
-SVF在表型上可鉴定为具有百分比在约40％和约91％之间的CD45+细胞；
-SVF在表型上可鉴定为具有百分比在约5％和约50％之间的CD45(-)CD31(-)CD34(+)细胞和百分比在约3％和约40％之间CD45(-)CD73(+)CD29(+)细胞；
-SVF在表型上可鉴定为具有百分比在约7％和约40％之间的CD45(-)CD31(-)CD34(+)细胞和百分比在约6％和约30％之间的CD45(-)CD73(+)CD29(+)细胞；
-SVF在表型上可鉴定为具有百分比在约2％和约15％之间的CD45(-)CD31(-)单核细胞门(+)CD34(+)细胞；
-SVF在表型上可鉴定为具有百分比在约4％和约10％之间的CD45(-)CD31(-)单核细胞门(+)CD34(+)细胞；
-有核细胞的SFV产率比在此描述的仅洗涤方法中获得的产率高至少3倍；
-与在仅洗涤方法中获得的相比，在细胞培养持续7到14天之间的时间后，脂肪抽出物的细胞/1ml的量高至少15倍，如下面进一步描述的；
-如通过细胞的分化能力、以及通过特定干细胞标记和物理特性(如通过流式细胞术鉴定的)所测量的，与在仅洗涤方法中获得的相比，SVF含有更高百分比的间充质祖干细胞。
-SVF是可注射的(例如，注射到哺乳动物组织中)，经由具有在33规格到7规格之间的规格号的非常小的针。
在一些实施例中，根据本发明的方法产生SVF部分。
在一些实施例中，SVF部分(无论是否通过本发明的方法产生)可以用于医学。
本发明进一步提供用于通过加压过滤来机械分离基质血管部分(SVF)细胞的方法和装置。该装置包括两个可扩展容器，这两个可扩展容器可以由具有关闭位置和打开位置的闸分隔开。当处于关闭位置时，脂肪抽出物被转移到顶部容器，并且允许沉降。
随后，将闸转到“开”位置，并且允许通过向柱塞施加压力使脂肪通过在两个容器之间进行分隔的金属筛孔或过滤器。
一旦所有的脂肪和流体通过筛孔进入底部容器，就将闸转到关闭位置。在分隔开底部容器后，脂肪保持无菌，因为通过闸关闭了顶端。
将分隔开的底部容器离心，并且将SVF细胞在容器底部浓缩并可以与其分隔开。
本发明进一步提供脂肪组织细胞的分离的SVF部分，该部分的特征在于以下特征中的至少一个：
1.具有类似于通过胶原酶(例如，胶原酶I型)分离获得的SVF细胞产率；
2.在培养7和14天后，具有类似于通过胶原酶分离方法获得的培养扩增能力；
3.具有分化成骨和脂肪两者的能力；
4.在培养1传代后，具有间充质干细胞表面标记表达表型；
5.具有在约4％和约10％之间的CD45(-)单核细胞门(+)CD34(+)细胞。
在本发明的仍另一个方面，本发明提供了通过本发明的方法和装置获得的分离的SVF部分，用于在再生医学和伤口愈合中使用；用于组织(例如，脂肪、骨、软骨、皮肤、心脏、肝、肾、脑)再生和替换(例如，在创伤后或在美容手术中)，以及用于免疫调节目的(例如，在移植物抗宿主病和其他自身免疫病中以及用于预防移植排斥)。
在一些实施例中，该分离的SVF部分可以与自体脂肪组合使用，以改善脂肪存活和血管再生。
根据本发明，在此定义的分离的SVF部分可以在其分离后立即使用或在培养(例如，作为脂肪间充质干细胞)后使用。
在本发明的另一个方面，本发明提供了如在此披露的分离的SVF部分在再生医学或在伤口愈合中的用途；用于组织(例如，脂肪、骨、软骨、皮肤、心脏、肝、肾、脑)再生和替换(例如，在创伤后或在美容手术中)，用于免疫调节目的(例如，在移植物抗宿主病，和其他自身免疫病中以及用于预防移植排斥)，或用于医学专业人员或从业人员可能知道的任何其他医学目的。
本发明进一步提供了根据本发明使用SVF部分的方法，该方法包括获得如在此披露的SVF部分和使用本领域已知的所述部分的步骤。在一些实施例中，该方法选自再生医学的方法、用于诱导伤口愈合的方法；用于组织(例如，脂肪、骨、软骨、皮肤、心脏、肝、肾、脑)再生和替换(例如，在创伤后或在美容手术中)的方法、以及用于免疫调节(例如，在移植物抗宿主病，和其他自身免疫病中，以及用于预防移植排斥)的方法。
附图说明
为了更好地理解在此所披露的主题并例示其在实践中的进行方式，现在将仅通过非限制性实例的方式，参考附图描述实施例，其中：
图1描绘了根据本发明的一些实施例用于收集脂肪细胞的装置；
图2描绘了根据本发明的一些实施例用于分离SVF细胞的装置；
图3描绘了根据本发明的一些实施例用于分离SVF细胞的装置；
图4A-B描绘了机械方式分离和酶分离的SVF细胞，这些细胞显示类似脂肪(图4A)和骨(图4B)分化潜力。将使用酶、机械或洗涤技术从脂肪分离的脂肪干细胞在骨分化培养基中或用脂肪分化培养基或用对照培养基孵育3周。然后将细胞用茜素红染色(对于骨)，或用油红(O.Human)染色(对于脂肪)。显示ASC分化成骨和脂肪。
图5A-B描绘了通过脂肪的酶消化或机械破碎而分离的SVF显示在“单核细胞门(gate of monocyte)”中的CD45(-)细胞的富集群体。图5A描绘了所有有核细胞，而图5B仅描绘了CD45(-)细胞。
图6描绘了用于通过加压过滤来机械分离基质血管部分(SVF)细胞的装置。该装置由两个指定为1和2的可扩展容器构造而成。
图7描绘了用于通过加压过滤来机械分离基质血管部分(SVF)细胞的装置，在该装置中，这两个容器被具有关闭位置和打开位置的闸分隔开。
具体实施方式
本发明涉及使用机械破碎、洗涤和离心的组合从脂肪组织分离脂肪细胞，用于获得基质血管部分的富集群体的机械方法。
为了更好地理解本发明，现在读者可以参考附图。
首先参考图1，该图提供了装置10的示例性实施例，该装置具有入口1(该入口与所述装置的内部连通，并且适于可密封地且可拆卸地接合插管用于将细胞引入到装置中)、可密封的且可拆卸的闭合帽3、针对转子轴5的近端安装座4和转子7(该转子附接到该转子轴)。
该装置10的闭合帽3进一步包括两个另外的入口9和11，以允许洗涤溶液(例如，生理盐水、林格氏溶液、乳酸化林格氏溶液、汉克斯平衡盐溶液、及其任何组合)经由通过这两个入口插入的插管进入。典型地，溶液或液体或脂肪水平保持处于水平13或以下。
再参考如图2所示的装置100，描绘了位于闭合帽16外部的电气驱动器，所述驱动器通过轴21、穿过闭合帽中的可密封的开口16a来可拆卸地连接到转子。特征25、27、15、16和29分别等同于图1所示的特征9、11、1、3和13。
另外参考图3所示的装置200，该图进一步描绘了适配于收集细胞的所述装置的凹形底45。特征39、41、31和43分别等同于图1所示的特征9、11、1和13。
可以理解的是，装置10、100或200可以呈圆柱形、矩形、梯形形状和任何其他本领域已知的合适的几何形状，并且可以由任何惰性的、透明的或不透明的、稳定的和可密封的(例如，在真空下并且使用全封闭的闭合帽)材料(该材料适合于收集细胞和保持其无菌和活力)制成，例如热塑性聚合物(例如，聚丙烯)、合成芳香族聚合物聚苯乙烯)和金属(例如铝)。
无论装置的材料和形状如何，该装置的体积可以在0.05升到2升之间。
该驱动器可以是电动机驱动的(例如电气的)或手动操作的。
该插管可以由任何柔性非反应性材料(例如，硅树脂、聚氯乙烯)制成。
实例1：
通过脂肪抽吸从50岁女性的大腿分离脂肪。先前测量的最高体重指数(BMI)是52.7，并且在5年期间测量到的稳定BMI为33.9。脂肪保持在4摄氏度过夜，并在第二天早上进行处理。
通过胶原酶I从脂肪分离细胞(比较系统)：
通过添加25ml的盐水洗涤脂肪抽出物脂肪(25ml)，然后进行充分混合并以260x g离心5分钟。将洗涤的脂肪(每份10ml)与悬浮于DMEM中的0.75ml的5mg/ml胶原酶I进行混合。将脂肪抽出物/胶原酶混合物在37摄氏度下旋转1小时。在酶消化后，将脂肪/胶原酶混合物用具有10％FCS的1/1体积的DMEM中和，通过100μM粗滤器转移，并且然后以328x g离心15分钟。将沉降的基质血管部分(SVF)细胞与漂浮脂肪细胞分离、通过100μM粗滤器转移，并且使用具有亚甲蓝的3％乙酸(加拿大温哥华干细胞技术公司(Stem cells technologies,Vancouver,Canada))计数有核细胞。
从脂肪机械分离细胞：
通过添加100ml的盐水洗涤脂肪抽出物脂肪(100ml)，然后进行充分混合并以328xg离心10分钟。将洗涤的脂肪(100ml)放入ATL-604食品加工机(Gold-line，以色列)中，并且添加100ml的盐水。将脂肪/盐水混合物在室温以1300RPM机械破碎15秒。将机械破碎的脂肪(含有盐水)以328x g离心10分钟。将沉降的SVF细胞与漂浮脂肪细胞分离，并通过100μM粗滤器转移。使用具有亚甲蓝的3％乙酸(加拿大温哥华干细胞技术公司)计数有核细胞。
通过充分混合和离心从脂肪分离细胞：
通过添加25ml的盐水洗涤脂肪抽出物脂肪(25ml)，然后进行充分混合并以328x g离心10分钟。将沉降的SVF细胞与漂浮脂肪细胞分离。使用具有亚甲蓝的3％乙酸(加拿大温哥华干细胞技术公司)计数有核细胞。
细胞培养：
在进行分离和细胞计数之后，将来自所有3种分离方案(胶原酶、机械和洗涤)的SVF细胞以5x 105个细胞/孔的浓度接种于6孔板中并培养7天。将细胞在补充有10％FCS(新西兰陶朗加市赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific HyClone))、60μg/mL青霉素、100μg/mL链霉素、50μg/mL卡那霉素、丙酮酸钠(1mM)、L-谷氨酰胺(2mM)和非必需氨基酸的高葡萄糖杜氏改良伊格尔氏培养基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)；英国苏格兰佩斯利市Gibco公司)中进行培养。将培养物在37℃在10％CO2气氛中繁殖。在细胞接种后72小时更换培养基。培养七天后，通过胰蛋白酶收获细胞并计数。
结果：
从表1中可以看出，使用胶原酶和机械细胞分离方法从脂肪中分离出相似数量的有核细胞。尽管进行了剧烈的洗涤，但是没有进行酶或机械破碎脂肪的细胞分离导致显著更低的细胞数量。
此外，与通过仅洗涤分离的细胞(表1)相比，当使用胶原酶和机械分离的细胞时，培养7天相同数量的SVF细胞导致显著更高数量的基质细胞。重要的是，与先前的报道[8]类似，与通过仅洗涤分离的细胞相比，在酶分离的细胞中，培养后的每1ml脂肪的细胞产率高30倍(1.08×105个细胞/1ml脂肪(酶)和0.036×105个细胞/1ml脂肪(洗涤))。相反，在机械细胞分离和培养后的细胞产率类似于在酶分离后获得的细胞产率(1.08x 105个细胞/1ml脂肪(酶)和0.656x 105个细胞/1ml脂肪(机械)。
Figure BDA0001568249340000101
表1.
实例2：
通过脂肪抽吸从46岁男性的腹壁、髋和背部分离脂肪。先前测量的最高BMI为62，并且随后在一年多的期间内测量到的稳定BMI＝31。脂肪保持在4摄氏度过夜，并在第二天早上进行处理。
通过胶原酶I从脂肪分离细胞(比较系统)：
通过添加80ml的盐水洗涤脂肪抽出物脂肪(80ml)，然后进行充分混合并以260x g离心5分钟。将洗涤的脂肪(每份10ml)与悬浮于DMEM中的0.75ml的5mg/ml胶原酶I进行混合。将脂肪抽出物/胶原酶混合物在37摄氏度旋转1小时。在酶消化后，将脂肪/胶原酶混合物用具有10％FCS的1/1体积的DMEM中和，并且然后以328x g离心15分钟。将沉降的基质血管部分(SVF)细胞与漂浮脂肪细胞分离、通过100μM粗滤器转移，并且使用具有亚甲蓝的3％乙酸(加拿大温哥华干细胞技术公司)计数有核细胞。
从脂肪机械分离细胞：
通过添加25ml的盐水洗涤脂肪抽出物脂肪(25ml)，然后进行充分混合并以260x g离心5分钟。将洗涤的脂肪(25ml)放入Philips Hr1611食品加工机，并且添加25ml的盐水。将脂肪/盐水混合物在室温以5240RPM机械破碎8秒。将机械破碎的脂肪(含有盐水)以328xg离心10分钟。将沉降的SVF细胞与漂浮脂肪细胞分离，并通过100μM粗滤器转移。使用具有亚甲蓝的3％乙酸(加拿大温哥华干细胞技术公司)计数有核细胞。
细胞培养：
在进行分离和细胞计数后，将来自两个分离方案(胶原酶和机械)的SVF细胞以5x105个细胞/6cm板的浓度接种并培养14天。将细胞在补充有10％FCS(新西兰陶朗加市赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific HyClone))、60μg/1mL青霉素、100μg/1mL链霉素、50μg/1mL卡那霉素、丙酮酸钠(1mM)、L-谷氨酰胺(2mM)和非必需氨基酸的高葡萄糖杜氏改良伊格尔氏培养基(DMEM；英国苏格兰佩斯利市Gibco公司)中进行培养。将培养物在37℃在10％CO2气氛中繁殖。在细胞接种后72小时更换培养基，然后每3天更换一次。培养14天后，通过胰蛋白酶收获细胞并计数。
细胞表面标记染色：
在细胞收获后，通过一组细胞标记对细胞进行染色，这些细胞标记包括：抗人CD45(BD公司(BD horizon))、抗人CD31(eBioscience公司(eBioscience))、抗人CD105、抗人CD34、抗人CD29、抗人CD235α、抗人CD73(美国加利福尼亚州圣地亚哥市Biolegend公司(Biolegend))以及live/dead-vivid染料(美国俄勒冈州尤金市英杰分子探针公司(Invitrogen Molecular Probes))。使用BD FACS Canto II流式细胞仪(美国加利福尼亚州圣何塞市BD公司(Becton Dickinson))分析标记的细胞。数据分析由flow-Jo软件(美国俄勒冈州阿什兰市Tree star公司(Tree star))进行。
结果：
根据实例2，使用胶原酶消化或机械分离从脂肪分离出相似数量的细胞(表2)。
此外，当使用胶原酶分离的细胞和机械分离的细胞时，培养SVF细胞14天导致类似数量的基质细胞的扩增(表2)。
在组织扩增14天后0传代培养的基质细胞的表面标记表达模式的评价揭示了在酶分离的细胞和机械分离的细胞两者中预期的表达模式。在大多数培养的细胞中，该模式包括可忽略的百分比的CD45(+)造血细胞和间质干细胞标记的高表达(100％的CD73表达，以及>90％的CD29和CD105表达)(表3)。
因此，从脂肪机械分离的SVF细胞允许类似于酶提取的大量有核细胞的提取。此外，机械分离的细胞具有与酶分离的细胞相似的特性，因为它们在具有相似表面标记表达模式的培养中繁殖14天后产生相似数量的细胞。
Figure BDA0001568249340000111
表2
Figure BDA0001568249340000112
表3
实例3：
通过脂肪抽吸从60岁女性的腹壁和髋分离脂肪。先前测量的最高BMI为40，并且随后在一年多的期间内测量到的稳定BMI为29。脂肪保持在4摄氏度过夜，并在第二天早上进行处理。
如先前描述于实例2的，通过机械解离或通过洗涤，从脂肪抽出物脂肪分离SVF细胞。用指示的标记对分离的细胞进行染色，并且从排除死细胞和红细胞的总群体中确定对每个标记呈阳性的细胞的比例。
结果：
可以看出，与机械分离的细胞(29％)相比，通过洗涤分离的细胞中的CD45(+)造血细胞的比例高得多(91％)(表4)。通过洗涤分离的细胞中CD45(+)的增加的比例与先前的报道(发现使用类似的提取方案有81％的CD45(+)细胞)一致。尽管通过特异性表面标记很难鉴别间充质干细胞祖细胞[12]，但通常认为这些细胞并非来源于CD45(+)群体。因此，与机械分离的细胞和酶分离的细胞两者相比，通过洗涤分离的细胞中CD45(+)细胞的增加的比例可以解释通过洗涤分离的细胞的差的培养扩增能力(表1)。
Figure BDA0001568249340000121
表4
实例4：
分化潜力：
检测了通过酶、机械和洗涤技术分离的脂肪干细胞多潜能潜力。从图4中可以看出，通过机械分离和酶分离两者分离的培养细胞表现出与脂肪(图4A)和骨(图4B)相似的分化潜力。与机械分离的细胞和酶分离的细胞两者相比，通过洗涤分离的细胞显示出降低的脂肪分化潜力。因此，与通过洗涤分离的细胞相比，机械分离的细胞表现出与酶分离的细胞相当的多潜能特性和优越的多潜能性。
此外，通过脂肪抽吸从58岁女性的胃中分离出皮下脂肪。先前测量的最高体重指数(BMI)是并且来自5年期间测量到的稳定BMI为。脂肪保持在4摄氏度过夜，并在第二天早上进行处理。
通过胶原酶I从脂肪分离细胞(比较系统)：
将脂肪抽出物脂肪(25ml)与悬浮于DMEM中的0.75ml的5mg/ml胶原酶I进行混合。将脂肪抽出物/胶原酶混合物在37摄氏度旋转1小时。在酶消化后，将脂肪/胶原酶混合物用具有10％FCS的1/1体积的DMEM中和，通过100μM粗滤器转移，并且然后以400x g离心15分钟。将沉降的基质血管部分(SVF)细胞与漂浮脂肪细胞分离、通过100μM粗滤器转移，并且使用具有亚甲蓝的3％乙酸(加拿大温哥华干细胞技术公司)计数有核细胞。
从脂肪机械分离细胞：
将温热至37摄氏度的脂肪抽出物脂肪(100ml)放入ATL-604食品加工机(Gold-line，以色列)中，添加预温热至37摄氏度的100ml的盐水。将脂肪/盐水混合物在室温以1300RPM机械破碎15秒。将机械破碎的脂肪(含有盐水)以400x g离心15分钟。将沉降的SVF细胞与漂浮脂肪细胞分离，并通过100μM粗滤器转移。使用具有亚甲蓝的3％乙酸(加拿大温哥华干细胞技术公司)计数有核细胞。
通过充分混合和离心从脂肪分离细胞：
通过添加温热至37摄氏度的25ml的盐水洗涤温热至37摄氏度的脂肪抽出物脂肪(10ml)，然后充分混合并以400x g离心15分钟。将沉降的SVF细胞与漂浮脂肪细胞分离。使用具有亚甲蓝的3％乙酸(加拿大温哥华干细胞技术公司)计数有核细胞。
细胞培养：
在进行分离和细胞计数之后，将来自所有3种分离方案(胶原酶、机械和洗涤)的SVF细胞以0.075X 106个细胞/孔的浓度接种于6孔板中并培养7天。将细胞在补充有10％FCS(新西兰陶朗加市赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific HyClone))、60μg/mL青霉素、100μg/mL链霉素、50μg/mL卡那霉素、丙酮酸钠(1mM)、L-谷氨酰胺(2mM)和非必需氨基酸的高葡萄糖杜氏改良伊格尔氏培养基(DMEM；英国苏格兰佩斯利市Gibco公司)中进行培养。将培养物在37℃在10％CO2气氛中繁殖。在细胞接种后72小时更换培养基。培养七天后，通过胰蛋白酶收获细胞并计数。
细胞表面标记染色：
在细胞收获后，通过一组细胞标记对细胞进行染色，这些细胞标记包括：抗人CD45(BD公司(BD horizon))、抗人CD31(eBioscience公司(eBioscience))、抗人CD105、抗人CD34、抗人CD29、抗人CD235α、抗人CD73(美国加利福尼亚州圣地亚哥市Biolegend公司(Biolegend))以及live/dead-vivid染料(美国俄勒冈州尤金市英杰分子探针公司(Invitrogen Molecular Probes))。使用BD FACS Canto II流式细胞仪(美国加利福尼亚州圣何塞市BD公司(Becton Dickinson))分析标记的细胞。数据分析由flow-Jo软件(美国俄勒冈州阿什兰市Tree star公司(Tree star))进行。渐变的门控策略分离出一个独特的群体，该群体仅含有单线态细胞和活细胞(通过低ViViD染色(胺反应性活力染料)，同时丢弃RBC(RBC特异性染色)确定)。然后进行针对CD45(-)细胞的门控以消除CD45-阳性免疫细胞。进行CD45-阴性细胞的另外的门控以定义对CD31、CD34、CD73和CD29呈阳性的群体。广泛接受的是，绘制前向散射(FSC)数据与侧向散射数据的图可以揭示外周血样本的形态信息。在x轴上绘制的FSC数据允许与出现在最左边的较小的淋巴细胞进行大小区分，而SSC数据(y轴)使得基于细胞粒度区分相当大小的单核细胞和嗜中性粒细胞成为可能。使用相同的参数和全血作为阳性对照，在具有与单核细胞相同的特征的SVF内鉴别不同的群体。这个区域被称为单核细胞门。由于单核细胞的直径大约为15μm至25μm，所以该门内的SVF群体最可能处于相同的尺寸范围。
从表5中可以看出，使用酶和机械细胞分离方法从脂肪中分离出相似数量的有核细胞。尽管进行了剧烈的洗涤，但是没有进行酶或机械破碎脂肪的细胞分离导致显著更低的细胞数量。
此外，与通过仅洗涤分离的细胞相比，在使用酶分离的细胞和机械分离的细胞时，在培养7天后，在第0天接种相同量的SVF细胞导致显著更高数量的脂肪基质细胞(表5)。
Figure BDA0001568249340000131
表5
重要的是，与通过仅洗涤分离的细胞相比，在酶分离的细胞和机械分离的细胞中，培养后的每1ml脂肪的细胞产率高45倍和30倍(表5)。
与通过仅洗涤分离的细胞相比，在使用酶分离的细胞和机械分离的SVF细胞时，在培养7天后，接种相同数量的SVF细胞导致显著更高产率的基质细胞。这指示通过不同的细胞分离技术分离出了不同的细胞群体的组成。
表面标记表达 酶分离 机械分离 洗涤
CD31-CD34- 11 24.4 34.3
CD31-CD34+ 60 74 64
CD31+CD34+ 28 0.4 0.7
CD31+CD34- 0.5 0.5 0.5
CD73+CD29+ 55 64.3 42
CD73-CD29+ 25.5 1.3 0
CD73-CD29- 10 25 37
表6：
为了更好地定义通过不同技术分离的SVF细胞的细胞组成，通过8色流式细胞术组确定其表面标记表达。通过不同技术分离的SVF细胞内的CD45(+)细胞百分比的检测显示，与机械分离的细胞或通过洗涤分离的细胞(分别产生91％和90％的CD45(+)细胞)相比，酶分离的细胞中的CD45(+)细胞的百分比更低(77％)。因为间充质干细胞仅从代表非造血细胞的CD45(-)群体中出现，所以在该群体中检测了另外的表面标记的表达。从表6中可以看出，在酶分离的细胞中观察到显著百分比(28％)的CD31(+)CD34(+)双阳性细胞，而在机械分离的细胞和通过洗涤分离的细胞两者中，该群体实际上不存在。
在机械分离的细胞和洗涤分离的细胞两者中，几乎不明显的另外的群体是CD73(-)CD29(+)细胞。同样，显著百分比(25％)的酶分离的细胞表达的CD73(-)CD29(+)。因此，证实了在酶分离的SVF细胞和机械分离的细胞或通过洗涤分离的细胞之间细胞组成有显著差异。
表6表现了在通过酶消化(胶原酶)、脂肪的机械破碎或通过洗涤脂肪从脂肪分离的SVF细胞之间的CD45(-)细胞的表面标记表达百分比的差异。尽管在机械分离的细胞和洗涤分离的细胞的表面标记表达之间存在明显的相似性，但是这些细胞之间存在显著的差异，这在机械分离的细胞的增加的培养扩增中是明显的。因此，进一步检测了通过这两种技术分离的细胞的表面标记表达。
表7显示了在通过脂肪的机械破碎或通过脂肪洗涤从脂肪分离的SVF细胞之间，CD45(-)的表面标记表达的百分比的差异。从表7中可以看出，与通过洗涤分离的细胞相比，在机械分离的细胞中，CD31(-)CD34(+)(10％增加)和CD73(+)CD29(+)(20％增加)两者群体的大幅度增加是明显的。
表面标记表达 机械分离 洗涤
CD31-CD34- 24.4 34.3
CD31-CD34+ 74 64
CD31+CD34+ 0.4 0.7
CD31+CD34- 0.5 0.5
CD73+CD29+ 64.3 42
CD73-CD29+ 1.3 0
CD73-CD29- 25 37
表7
CD45(-)CD31(-)CD34(+)群体是具有大部分脂肪干细胞祖细胞的群体。从表7中可以看出，与通过洗涤分离的细胞相比，机械分离细胞部分具有较高百分比的CD45(-)CD31(-)CD34(+)，表明它们形成脂肪干细胞(ASC)的能力增加。另外的表面标记表明SVF群体内的代表ASC祖细胞是CD73和CD29。从表7中可以看出，与通过洗涤分离的细胞相比，机械分离的细胞的CD45(-)CD31(-)CD73(+)CD29(+)细胞增加20％。
使用前向光散射面积(FSC-A)和侧向散射面积(SSC-A)参数对整个SVF的细胞分布的检查，揭示了与洗涤相比，在酶分离和机械分离中称为“单核细胞门”的门中细胞的比例增加(图5A)。与通过洗涤分离的细胞相比，在机械分离的细胞中达到5倍增加的更相关的CD45(-)群体中，酶分离的细胞和机械分离的细胞中“单核细胞门”中细胞的优越比例甚至更显著(图5B)。
酶分离的、机械分离的和洗涤分离的细胞的所有有核活细胞(图5A)或CD45(-)细胞(图5B)的SSC-A与FCS-A分布显示于点阵图。
重要的是，从表8中可以看出，“单核细胞门”内的大部分CD45(-)细胞是CD31(-)CD34(+)(具有脂肪干细胞祖细胞)。
因此，本发明提供SVF内的新细胞群体，称为“CD45(-)CD31(-)单核细胞门(+)CD34(+)”。考虑到细胞及其表面标记表达两者的物理特性，这个新群体分别在酶分离的、机械分离的和洗涤分离的细胞中占总有核细胞的6.6％、4.3％和0.88％。这个群体包含大部分脂肪干细胞祖细胞，因为它可以很好地预测在培养7天后由相同数量的SVF细胞产生的ASC产率的比率(表8)。因此，机械分离的和洗涤分离的细胞之间最深刻的区别在于表9所示的其CD45(-)CD31(-)单核细胞门(+)CD34(+)群体。通常认为，治疗相关的细胞群体是能够产生培养的脂肪干细胞(即干细胞祖细胞)的细胞群。本发明定义了使用细胞的物理特性(单核细胞门)定义的SVF内的干细胞祖细胞的亚类。因此，CD45(-)CD31(-)单核细胞门(+)CD34(+)群体定义了SVF内最具治疗相关性的群体干细胞祖细胞。与洗涤分离的细胞(表9)相比，机械分离的SVF细胞中CD45(-)CD31(-)单核细胞门(+)CD34(+)细胞群体的大幅增加表明机械分离的细胞的治疗功效增加。
表面标记表达 酶分离 机械分离 洗涤
CD31-CD34- 3 2.7 12
CD31-CD34+ 82 94 88
CD31+CD34+ 13 0.4 0
CD31+CD34- 0.5 0.5 0.5
表8
Figure BDA0001568249340000151
表9
结论：
与通过洗涤分离的SVF细胞相反，机械分离的细胞表现出与酶分离的细胞类似的改善的特性，这被认为是黄金标准。这在以下特性中得到了证明：
1.从脂肪分离的有核细胞的数目：脂肪的机械破碎导致SVF细胞数量与使用胶原酶分离获得的数量相似。这与通过洗涤分离(没有机械破碎)的SVF细胞(表现出显著较低的数量)形成对比。
2.扩增能力：机械分离的SVF的培养扩增产生的细胞数量与7天和14天两者后使用胶原酶分离的细胞获得的数量相似。这与通过洗涤分离的SVF细胞(表现出显著较低的培养扩增)形成对比。
3.分化潜力：机械分离的细胞表现出分化成骨和脂肪的能力。机械分离的细胞的脂肪分化能力远远优于通过洗涤分离的细胞的脂肪分化能力。
4.培养的SVF细胞的表面标记表达：0传代时，机械分离的细胞表现出预期的间充质干细胞表面标记表达模式。
5.SVF中的CD45(-)CD31(-)单核细胞门(+)CD34(+)细胞的比例：数据表明与洗涤分离的细胞相比，在机械分离的细胞中该群体内的细胞比例大幅增加，这与其产生脂肪干细胞的能力的增加相关。
实例5：
再参考图6和7中描绘的本发明另外的装置。描绘了用于通过加压过滤来机械分离基质血管部分(SVF)细胞的装置。图6中的装置由两个指定为1和2的可扩展容器构造而成。在两个容器被具有关闭位置和打开位置的闸分隔开(图7)。
根据示例性实施例，用于SVF细胞分离的方法包括一个或多个以下步骤：
1.将闸置于关闭位置，并将两个容器连接。
2.将脂肪抽吸装置连接到进真空(vacuum in)。将抽气泵连接到真空1并在容器1中进行脂肪抽吸。
3.在脂肪抽吸程序结束时，将脂肪抽出物静置沉降5分钟。
4.然后将真空泵连接到抽真空2，并将脂肪抽吸流体抽真空。
5.然后将无菌的流体添加到来自进真空的脂肪中，将容器颠倒几次，并使脂肪抽出物再静置沉降5分钟。
6.再次将液体从抽真空2进行抽真空。
7.将无菌流体添加到来自进真空的脂肪中，并将脂肪与流体混合。
8.将容器颠倒几次以便将脂肪和流体混合。
9.将闸立即改变到打开位置，并且通过向柱塞施加压力使脂肪穿过金属筛孔。
10.一旦所有的脂肪和流体通过过滤器进入容器2中，就将闸置于关闭位置。
11.将从闭合的闸上方接触的流体抽真空。
12.将容器2从容器1分离，并且脂肪保持无菌，因为该闭合的闸关闭了顶端。
13.将容器进行离心，并将SVF细胞在容器底部的管状部分浓缩。
14.通过针和注射器将SVF细胞无菌分离。

Claims (16)

1.一种用于从哺乳动物脂肪组织富集细胞群体的方法，该方法包括：
-将经分离的脂肪组织抽吸到容器组件中；
-使用机械组织破碎装置在该容器组件中机械破碎/破裂该脂肪组织，以获得细胞悬浮液，其中该破碎不使用酶，其中该机械组织破碎装置包括至少一个旋转叶片或转子，并且该旋转叶片或转子可拆卸地连接到电气驱动器；
-将该容器组件转移到离心机中并且对该容器组件进行离心以分离相，从而获得细胞团粒；和
-从该容器组件内提取该细胞团粒，从而获得富集的细胞群体，其中该富集的细胞群体为团粒形式的基质细胞部分(SVF)。
2.如权利要求1所述的方法，其中在该破碎/破裂的步骤之后，该提取的步骤之前，所述方法进一步包括：在该容器组件内洗涤该细胞悬浮液。
3.如权利要求1所述的方法，其中在机械破碎/破裂之前，对抽吸到该容器中的脂肪组织进行洗涤。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中在机械破碎/破裂后，在相分离后提取该细胞团粒。
5.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中在机械破碎/破裂后，将该容器组件转移到离心机中并进行离心，从而获得细胞团粒。
6.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中在不添加洗涤溶液的情况下，该机械破碎/破裂在脂肪抽出物溶液中进行。
7.如权利要求6所述的方法，其中在机械破碎/破裂后洗涤该细胞悬浮液。
8.如权利要求6所述的方法，其中在机械破碎/破裂后不洗涤该细胞悬浮液，并且其中在相分离后提取该细胞团粒。
9.如权利要求1-3、7和8中任一项所述的方法，其中在所收获的脂肪抽出物的机械破碎期间，使洗涤溶液经过漏斗进入该容器中。
10.如权利要求1-3、7和8中任一项所述的方法，其中在将该脂肪抽出物吸引到该容器中之前，使洗涤溶液经过漏斗进入该容器中，并且然后进行每个离心步骤。
11.如权利要求1-3、7和8中任一项所述的方法，其中洗涤溶液进一步含有选自以下的至少一种另外的试剂：细胞特异性抗体、缓冲剂、糖基密度梯度、非糖密度梯度、抗体介导的磁性细胞分选溶液和非磁性抗体介导的细胞分选溶液。
12.如权利要求1-3、7和8中任一项所述的方法，其中该富集的细胞群体被进一步加工以富集特定细胞群体。
13.如权利要求1所述的方法，其中该基质细胞部分的特征在于以下中的至少一个：
-具有百分比在7％和40％之间的CD45(-)CD31(-)CD34(+)细胞和百分比在6％和30％之间的CD45(-)CD73(+)CD29(+)细胞；和/或
-具有百分比在4％和10％之间的CD45(-)CD31(-)单核细胞门(+)CD34(+)细胞。
14.如权利要求1所述的方法，其中该基质细胞部分的特征在于：
-具有百分比在7％和40％之间的CD45(-)CD31(-)CD34(+)细胞和百分比在6％和30％之间的CD45(-)CD73(+)CD29(+)细胞；和
-具有百分比在4％和10％之间的CD45(-)CD31(-)单核细胞门(+)CD34(+)细胞。
15.如权利要求1所述的方法，其中该基质细胞部分的特征在于：具有百分比在7％和40％之间的CD45(-)CD31(-)CD34(+)细胞和百分比在6％和30％之间的CD45(-)CD73(+)CD29(+)细胞。
16.如权利要求1所述的方法，其中该基质细胞部分的特征在于具有百分比在4％和10％之间的CD45(-)CD31(-)单核细胞门(+)CD34(+)细胞。
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