CN111893089A - 一种纯化脂肪细胞及其前体细胞的方法及其应用 - Google Patents

一种纯化脂肪细胞及其前体细胞的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种纯化脂肪细胞及其前体细胞的方法，从人体或哺乳动物的脂肪组织块中，通过红细胞裂解液和DMEM F/12的混合溶液清洗后，采用组织消化液进行消化，离心、过滤处理等步骤后，可从微量脂肪组织中，高效分离获得高纯度和高活性的脂肪源前体细胞，分离获得的脂肪源前体细胞培养液，具备较高浓度的不同类型的细胞营养因子，所获得的脂肪源前体细胞及其产物可以用于组织修复。

Description

一种纯化脂肪细胞及其前体细胞的方法及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种纯化脂肪细胞及其前体细胞的方法及其用于组织修复的应用。
背景技术
当前脂肪源前体细胞的分离的方法，主要有剪碎消化法、剪碎贴壁培养法和抽吸法等方法。前述两种方法都是取出脂肪组织后，破碎组织块，进行细胞分离。抽吸法包括负压吸引器抽吸、注射器抽吸；有相关研究表明，采集脂肪时剪碎法对脂肪细胞的损伤最轻，注射器法居中，负压器吸脂法最重，负压越大，脂肪细胞的损伤就越大。剪碎贴壁法，则通过细胞从组织块中迁移出来分离，不能立即分离得到单个细胞，且受供者年龄，健康状况等因素的影响，分离周期长。剪碎消化法，通过消化酶的作用，可以快速得到单个细胞；但是传统的消化法，会影响到脂肪源前体细胞的活性和完整性，造成较低的细胞存活率，细胞得率小，无法满足后续的临床运用。
以上现有的技术方案均存在一点的弊端，无法快速分离得到优质且大量的脂肪源前体细胞，细胞不具备更高的增殖能力和细胞活性，无法满足下游的临床和研究需要，亟待发明一种实现高效分离且能获得较高纯度和活性的脂肪源前体细胞分离技术方案来解决上述技术问题。
发明内容
针对上述提到的问题，本发明提供一种纯化脂肪细胞及其前体细胞的方法及其用于组织修复的应用。
具体技术方案是：一种纯化脂肪细胞及其前体细胞的方法，包括如下步骤：
1）从人体或者哺乳类动物皮下获取0.2cm3~5 cm3的脂肪组织块，重悬于DMEM F/12中，放入4℃冰箱或者冰盒等待处理。
2）脂肪源前体细胞分离前，脂肪组织用75%酒精冲洗1s~30s，擦拭干净外包装。
3）在生物安全柜内进行操作，脂肪组织依次用生理盐水冲洗至少3次。
4）弃干净生理盐水，将脂肪组织移至干净培养皿中，加入1~5mL的红细胞裂解液和DMEM F/12的混合溶液，清洗脂肪组织3遍，每遍5分钟，并剪碎脂肪组织；在剪碎过程中可以使用剪刀、镊子、刀片等尽量剪碎脂肪组织。
5）按照10倍的体积，使用红细胞裂解液和DMEM F/12的混合液，重悬剪碎的脂肪组织，转移到干净的离心管中，取400g，离心10分钟。
6)弃上清，收集下层组织沉淀，按照10倍的体积加入组织消化液，重悬组织，放至摇床消化0.5~12h，37℃，40~90rpm。
7）消化结束后，加入等体积预冷的DMEM F/12培养液到消化溶液中，使用移液管反复吹吸消化乳糜液10~30次。DMEM F/12培养液预冷的温度为0℃至8℃。
8）取400g，离心10分钟后弃上清，使用10倍沉淀体积的DMEMF/12培养液重悬沉淀组织，再次取400g，离心10分钟。
9）重复上述步骤8）。
10）弃上清，使用10倍沉淀体积的DMEMF/12培养液重悬沉淀组织，使用40微米的滤膜过滤，使用预冷的DMEMF/12培养液洗涤滤网1~3次。
11）重悬混匀上述过滤液，使用10~20微米的滤膜再一次进行过滤，用预冷的DMEMF/12培养液洗涤滤网1~3次。DMEM F/12培养液预冷的温度为0℃至8℃。
12）取400g离心上述步骤11）的组织过滤液，3~10分钟，收集离心后的沉淀物，使用细胞培养液吹散重悬细胞，使用0.04%台盼蓝染色5分钟后计数细胞活率，细胞活率不低于80%。
13）所述步骤12）的细胞可直接用生理盐水重悬使用，或者按传统的方法进行冻存备用或者可培养扩增；细胞接种于3~6个T25培养瓶铺板培养，培养条件为37℃，5%CO2的常规细胞培养条件，扩增培养的细胞，在P6代以内使用细胞。
对于扩增培养的脂肪源前体细胞，每隔3天更换一次细胞培养液，并在P6代以内收集和使用培养细胞后的培养液。
进一步，优选的是，所述步骤4）和步骤5）中的红细胞裂解液和DMEM F/12混合比例为体积1：1。
进一步，优选的是，所述步骤6）的组织消化液包括DMEM F/12 +1.5mg/mL透明质酸酶+1.5mg/mL胶原酶+ 0.03%胰酶。
进一步，优选的是，所述步骤1）中的哺乳类动物包括鼠、猴、猪、牛。
一种利用上述纯化脂肪细胞及其前体细胞方法所获得的脂肪细胞及其前体细胞，该脂肪细胞及其前体细胞可用于组织修复，如皮肤组织等。
本发明的有益效果：可从微量脂肪组织中，高效分离获得高纯度和高活性的脂肪源前体细胞，分离获得的脂肪源前体细胞培养液，具备较高浓度的不同类型的细胞营养因子，所获得的脂肪源前体细胞及其产物可以用于组织修复。
附图说明
图1是本发明的实施例中脂肪源前体细胞油红O染色图。
具体实施方式
为了使本发明所解决的技术问题、技术方案更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
准备材料：眼科剪若干，眼科镊若干，PBS，75%酒精，基础培养基，培养皿若干，15mL/50mL离心管若干，移液枪头若干，手术刀片若干。
实施例1：
1）从人体皮下获取0.3cm3的脂肪组织块，对取样进行标记为人源脂肪组织001，重悬于DMEM F/12中，放入4℃冰箱待处理。
2）脂肪源前体细胞分离前，脂肪组织用75%酒精冲洗1s，擦拭干净外包装。
3）在生物安全柜内进行操作，脂肪组织依次用生理盐水冲洗至少3次。
4）弃干净生理盐水，将脂肪组织移至干净培养皿中，加入1mL的红细胞裂解液和DMEM F/12的混合溶液，清洗脂肪组织3遍，每遍5分钟，并剪碎脂肪组织；红细胞裂解液和DMEM F/12混合比例为体积1：1。
5）按照10倍的体积，使用红细胞裂解液和DMEM F/12的混合液，重悬剪碎的脂肪组织，转移到干净的离心管中，取400g，离心10分钟；红细胞裂解液和DMEM F/12混合比例为体积1：1。
6)弃上清，收集下层组织沉淀，按照10倍的体积加入组织消化液，重悬组织，放至摇床消化0.5h，37℃，40rpm；组织消化液包括DMEM F/12 +1.5mg/mL透明质酸酶+1.5mg/mL胶原酶+ 0.03%胰酶。
7）消化结束后，加入等体积预冷的DMEM F/12培养液到消化溶液中，使用移液管反复吹吸消化乳糜液10次。
8）取400g,离心10分钟后弃上清，使用10倍沉淀体积的DMEMF/12培养液重悬沉淀组织，再次取400g,离心10分钟。
9）重复上述步骤8）。
10）弃上清，使用10倍沉淀体积的DMEMF/12培养液重悬沉淀组织，使用40微米的滤膜过滤，使用预冷的DMEMF/12培养液洗涤滤网1次。
11）重悬混匀上述过滤液，使用10微米的滤膜再一次进行过滤，用预冷的DMEMF/12培养液洗涤滤网1次。
12）取400g离心上述步骤11）的组织过滤液，3分钟，收集离心后的沉淀物，使用细胞培养液吹散重悬细胞，使用0.04%台盼蓝染色5分钟后计数细胞活率，细胞活率不低于80%；
13）所述步骤12）的细胞可直接用生理盐水重悬使用，或者按传统的方法进行冻存备用或者可培养扩增；细胞接种于3个T25培养瓶铺板培养，培养条件为37℃，5%CO2的常规细胞培养条件，扩增培养的细胞，在P6代以内使用细胞。
实施例2：
1）从人体皮下获取1 cm3的脂肪组织块，对取样进行标记为人源脂肪组织002，重悬于DMEM F/12中，放入4℃冰盒等待处理。
2）脂肪源前体细胞分离前，脂肪组织用75%酒精冲洗30s，擦拭干净外包装。
3）在生物安全柜内进行操作，脂肪组织依次用生理盐水冲洗至少3次。
4）弃干净生理盐水，将脂肪组织移至干净培养皿中，加入5mL的红细胞裂解液和DMEM F/12的混合溶液，清洗脂肪组织3遍，每遍5分钟，并剪碎脂肪组织；红细胞裂解液和DMEM F/12混合比例为体积1：1。
5）按照10倍的体积，使用红细胞裂解液和DMEM F/12的混合液，重悬剪碎的脂肪组织，转移到干净的离心管中，取400g，离心10分钟；红细胞裂解液和DMEM F/12混合比例为体积1：1。
6)弃上清，收集下层组织沉淀，按照10倍的体积加入组织消化液，重悬组织，放至摇床消化12h，37℃，90rpm；组织消化液包括DMEM F/12 +1.5mg/mL透明质酸酶+1.5mg/mL胶原酶+ 0.03%胰酶。
7）消化结束后，加入等体积预冷的DMEM F/12培养液到消化溶液中，使用移液管反复吹吸消化乳糜液30次。
8）取400g,离心10分钟后弃上清，使用10倍沉淀体积的DMEMF/12培养液重悬沉淀组织，再次取400g,离心10分钟。
9）重复上述步骤8）。
10）弃上清，使用10倍沉淀体积的DMEMF/12培养液重悬沉淀组织，使用40微米的滤膜过滤，使用预冷的DMEMF/12培养液洗涤滤网3次。
11）重悬混匀上述过滤液，使用20微米的滤膜再一次进行过滤，用预冷的DMEMF/12培养液洗涤滤网3次。
12）取400g离心上述步骤11）的组织过滤液，10分钟，收集离心后的沉淀物，使用细胞培养液吹散重悬细胞，使用0.04%台盼蓝染色5分钟后计数细胞活率，细胞活率不低于80%；
13）所述步骤12）的细胞可直接用生理盐水重悬使用，或者按传统的方法进行冻存备用或者可培养扩增；细胞接种于6个T25培养瓶铺板培养，培养条件为37℃，5%CO2的常规细胞培养条件，扩增培养的细胞，在P6代以内使用细胞。
实施例3：
1）从猴皮下获取3 cm3的脂肪组织块，对取样进行标记为猴源脂肪组织001，重悬于DMEM F/12中，放入4℃冰箱等待处理。
2）脂肪源前体细胞分离前，脂肪组织用75%酒精冲洗15s，擦拭干净外包装。
3）在生物安全柜内进行操作，脂肪组织依次用生理盐水冲洗至少3次。
4）弃干净生理盐水，将脂肪组织移至干净培养皿中，加入3mL的红细胞裂解液和DMEM F/12的混合溶液，清洗脂肪组织3遍，每遍5分钟，并剪碎脂肪组织；红细胞裂解液和DMEM F/12混合比例为体积1：1。
5）按照10倍的体积，使用红细胞裂解液和DMEM F/12的混合液，重悬剪碎的脂肪组织，转移到干净的离心管中，取400g，离心10分钟；红细胞裂解液和DMEM F/12混合比例为体积1：1。
6)弃上清，收集下层组织沉淀，按照10倍的体积加入组织消化液，重悬组织，放至摇床消化6h，37℃，60rpm；组织消化液包括DMEM F/12 +1.5mg/mL透明质酸酶+1.5mg/mL胶原酶+ 0.03%胰酶。
7）消化结束后，加入等体积预冷的DMEM F/12培养液到消化溶液中，使用移液管反复吹吸消化乳糜液15次。
8）取400g,离心10分钟后弃上清，使用10倍沉淀体积的DMEMF/12培养液重悬沉淀组织，再次取400g,离心10分钟。
9）重复上述步骤8）。
10）弃上清，使用10倍沉淀体积的DMEMF/12培养液重悬沉淀组织，使用40微米的滤膜过滤，使用预冷的DMEMF/12培养液洗涤滤网2次。
11）重悬混匀上述过滤液，使用15微米的滤膜再一次进行过滤，用预冷的DMEMF/12培养液洗涤滤网2次。
12）取400g离心上述步骤11）的组织过滤液，6分钟，收集离心后的沉淀物，使用细胞培养液吹散重悬细胞，使用0.04%台盼蓝染色5分钟后计数细胞活率，细胞活率不低于80%；
13）所述步骤12）的细胞可直接用生理盐水重悬使用，或者按传统的方法进行冻存备用或者可培养扩增；细胞接种于4个T25培养瓶铺板培养，培养条件为37℃，5%CO2的常规细胞培养条件，扩增培养的细胞，在P6代以内使用细胞。
如图1所示，以上3个实施例通过细胞的鉴定具有以下特征：
1、对于扩增培养的脂肪源前体细胞，在显微镜下观察细胞形态，细胞形态呈梭形。
2、使用台盼蓝染色计数，检测分离后细胞的活率，细胞活率大于80%。
3、通过流式细胞术检测细胞的纯度，分离后脂肪源前体细胞的纯度为：CD29阳性细胞大于90%， 表达CD34的细胞数量不高于2%。
4、对扩增培养的细胞，进行成脂分化，成脂诱导至第14 天，进行油红 O 染色。先用生理盐水洗涤细胞两次，4%多聚甲醛固定 30 分钟，再用生理盐水洗涤两次，加入油红 O溶液染色30 分钟。吸去大部分染液，显微镜下观察拍照。 脂肪源前体细胞在第14天油红O染色后显示红色脂滴。
表一：本发明实施例1-3中脂肪源前体细胞的分离数量，细胞活性，细胞纯度；
Figure DEST_PATH_IMAGE002
以上通过具体的和优选的实施例详细的描述了本发明，但本领域技术人员应该明白，本发明并不局限于以上所述实施例，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种纯化脂肪细胞及其前体细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）从人体或者哺乳类动物皮下获取0.2cm3~5 cm3的脂肪组织块，重悬于DMEM F/12中，放入4℃冰箱或者冰盒等待处理；
2）脂肪源前体细胞分离前，脂肪组织用75%酒精冲洗1s~30s，擦拭干净外包装；
3）在生物安全柜内进行操作，脂肪组织依次用生理盐水冲洗至少3次；
4）弃干净生理盐水，将脂肪组织移至干净培养皿中，加入1~5mL的红细胞裂解液和DMEMF/12的混合溶液，清洗脂肪组织3遍，每遍5分钟，并剪碎脂肪组织；
5）按照10倍的体积，使用红细胞裂解液和DMEM F/12的混合液，重悬剪碎的脂肪组织，转移到干净的离心管中，取400g，离心10分钟；
6)弃上清，收集下层组织沉淀，按照10倍的体积加入组织消化液，重悬组织，放至摇床消化0.5~12h，37℃，40~90rpm；
7）消化结束后，加入等体积预冷的DMEM F/12培养液到消化溶液中，使用移液管反复吹吸消化乳糜液10~30次；
8）取400g，离心10分钟后弃上清，使用10倍沉淀体积的DMEMF/12培养液重悬沉淀组织，再次取400g，离心10分钟；
9）重复上述步骤8）；
10）弃上清，使用10倍沉淀体积的DMEMF/12培养液重悬沉淀组织，使用40微米的滤膜过滤，使用预冷的DMEMF/12培养液洗涤滤网1~3次；
11）重悬混匀上述过滤液，使用10~20微米的滤膜再一次进行过滤，用预冷的DMEMF/12培养液洗涤滤网1~3次；
12）取400g离心上述步骤11）的组织过滤液，3~10分钟，收集离心后的沉淀物，使用细胞培养液吹散重悬细胞，使用0.04%台盼蓝染色5分钟后计数细胞活率，细胞活率不低于80%；
13）所述步骤12）的细胞可直接用生理盐水重悬使用，或者按传统的方法进行冻存备用或者可培养扩增；细胞接种于3~6个T25培养瓶铺板培养，培养条件为37℃，5%CO2的常规细胞培养条件，扩增培养的细胞，在P6代以内使用细胞。
2.根据权利要求1所述的一种纯化脂肪细胞及其前体细胞的方法，其特征在于：所述步骤4）和步骤5）中的红细胞裂解液和DMEM F/12混合比例为体积1：1。
3.根据权利要求1所述的一种纯化脂肪细胞及其前体细胞的方法，其特征在于：所述步骤6）的组织消化液包括DMEM F/12 +1.5mg/mL透明质酸酶+1.5mg/mL胶原酶+ 0.03%胰酶。
4.根据权利要求1所述的一种纯化脂肪细胞及其前体细胞的方法，其特征在于：所述步骤1）中的哺乳类动物包括鼠、猴、猪、牛。
5.一种利用如权利1-4所述的纯化脂肪细胞及其前体细胞的方法所获得的脂肪细胞及其前体细胞，其特征在于，该脂肪细胞及其前体细胞可用于组织修复。
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