CN112300983A - 机械法分离鱼类精原干细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及细胞分离技术领域，特别涉及机械法分离鱼类精原干细胞的方法。该方法包括：1)用剪刀将性腺剪切成组织块，并用缓冲液洗涤；2)将步骤1)洗涤后的组织块用剪刀剪碎成小组织块，用缓冲液洗涤，将洗涤得到的上清液离心取细胞沉淀；3)将步骤2)的细胞沉淀用液体培养基重悬，过滤，得到富含精原干细胞的细胞悬液。本发明使用机械法分离得到了鱼类的精原干细胞，并且细胞损失少，杂细胞少，成功率高。本发明的机械法操作简单，对实验条件要求低，快速、成本低廉，该精原干细胞形态结构完整、纯度高、密度大，可以满足一般实验需求。
Description
技术领域
本发明涉及细胞分离技术领域，特别涉及机械法分离鱼类精原干细胞的方法。
背景技术
生殖干细胞是性腺内的一群特殊生殖细胞，它们既可以无限增殖来维持数目相对稳定，又可以不断分化成配子，进而通过两性生殖，将遗传物质传递给子代。精原干细胞(Spermatogonial stem cells,SSCs)作为一种生殖干细胞，具有高度的自我更新能力和分化潜能，能通过分裂进一步形成精子细胞，是雄性动物体内唯一能将遗传信息传递给下一代的成体干细胞。
精原干细胞体外分离培养技术是研究其生物学特性、诱导分化及在转基因和种质资源保存方面应用的基础。精原干细胞的分离手段主要有酶消化法和机械分离法。机械分离法一般适用于牛、羊和猪等大动物，根据睾丸的组织特点进行分离，操作简单，成本低，但存在杂细胞多、无法得到分散的单细胞等缺陷。例如中国专利申请CN102311941A公开了一种机械法分离培养猪精原干细胞的方法，首先采用机械法将睾丸组织剪碎并用PBS洗涤，得到猪睾丸曲细精管，然后将其在明胶包被的培养瓶中培养。可以看出，该发明通过机械法得到的目的产物是曲细精管；曲细精管包括基膜，与基膜紧密连接的支持细胞，支持细胞内侧的精原干细胞，精原细胞内侧的初级精母细胞，比初级精母细胞较小的次级精母细胞，靠近管腔的精细胞(包括未发育成熟的精细胞和发育成熟的精子)等。也就是说该发明机械法得到的是一个组织，然后通过将该组织在培养液中培养，得到含有精原干细胞的培养液；很明显，该方法最终的培养液中精原干细胞的纯度会较低，实际上得到的是包含多种杂细胞的细胞团。目前还没有直接通过机械法得到纯度较高的精原干细胞的相关报道。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提供了机械法分离鱼类精原干细胞的方法。
本发明的技术方案如下文所示。
本发明一方面提供了一种机械法分离鱼类精原干细胞的方法，包括如下步骤：
1)用剪刀将性腺剪切成组织块，并用缓冲液洗涤；
2)将步骤1)洗涤后的组织块用剪刀剪碎，再用缓冲液洗涤，将洗涤得到的上清液离心取细胞沉淀；
3)将步骤2)的细胞沉淀用液体培养基重悬，过滤，得到富含精原干细胞的细胞悬液。
本发明中采用两步剪碎法，首先将性腺剪至半碎，并用缓冲液冲洗，可以去除大多数的血细胞和精细胞；其次将组织块进一步剪至全碎，此时，使用缓冲液洗涤，可以洗出大量的精原干细胞，将洗涤液离心后，得到细胞沉淀经过多次洗涤后，过滤，可以去除没有分散掉的组织块，进而得到富含精原干细胞的细胞悬液。本发明首次在鱼类中使用机械法得到了富集的精原干细胞，并且细胞悬液中杂细胞少，且精原干细胞密度极高。
在本发明的一些实施方式中，步骤1)中，用剪刀将性腺剪切成长宽高均为0.3～1.0cm的组织块。
在本发明的一些实施方式中，步骤2)中，将步骤1)洗涤后的组织块用剪刀剪成长宽高均不大于0.15cm的小组织块，用缓冲液洗涤，将洗涤得到的上清液离心取细胞沉淀。
本发明中限制组织块的大小可以更好的保证提取效果的均一性，避免组织块大小相差较大，导致的提取效果的差异性；还可以进一步的提高分离效率和分离细胞的质量。例如，将第1)步组织块的大小限定为0.3～1.0cm，是通过大量的科学实验得出的，半碎时组织块太大，会导致血细胞和精子残留过多，即影响下一步的操作效率，也影响最终细胞悬液的纯度；组织块太小，则会使得精原干细胞损失较大，降低得率。
在本发明的一些实施方式中，所述缓冲液选自PBS缓冲液、Hank’s缓冲液和HEPES缓冲液等。
在本发明的一些实施方式中，步骤3)中，液体培养基为含1～10％胎牛血清的DMEM:F-12培养基或含1～10％胎牛血清的L-15培养基。
在本发明的一些实施方式中，步骤1)中，洗涤时，向装有组织块的容器中加入缓冲液，上下颠倒数次混匀，正向放置至组织块沉降，然后吸取上清并丢弃。
在本发明的一些实施方式中，步骤2)中，用缓冲液多次洗涤，合并洗涤得到的上清液，并离心取细胞沉淀。一般洗涤3-6次，当镜检发现上清中只有很少细胞时终止洗涤。
在本发明的一些实施方式中，步骤2)中，得到的细胞沉淀再使用缓冲液多次洗涤并离心后弃上清。细胞沉淀用缓冲液多次洗涤可以去除很多精细胞和小的生殖细胞，而比较大的生殖细胞被离心到底部保留下来。
在本发明的一些实施方式中，步骤2)中，将剪碎后得到的小组织块装入容器中，并加入缓冲液，颠倒混匀数次，正向放置至组织块沉降到底部，吸取上清液，多次洗涤后合并上清液，将合并的上清液离心，去除上清，得到细胞沉淀；细胞沉淀用缓冲液洗涤，每次均离心除上清液，保留细胞沉淀。
在本发明的一些实施方式中，步骤2)中，离心时所用转速为200g。离心所用的转速也是非常重要的，转速过小会导致生殖干细胞的较大损失，转速过大则无法将精细胞和小细胞等物质分离出来。
在本发明的一些实施方式中，步骤3)中，过滤时使用30-70μm滤网。
在本发明的一些实施方式中，还可以将富含精原干细胞的细胞悬液采用DNaseI处理。用机械法剪碎的过程中，会使部分细胞受损，进而释放出DNA，多次洗涤后一般还存在部分DNA不能去除干净；而采用DNaseI消化，可以避免DNA粘性导致的细胞黏连，影响后续的percoll密度梯度分离过程。
在本发明的一些实施方式中，还可以将富含精原干细胞的细胞悬液采用percoll密度梯度法纯化。
在本发明的一些实施方式中，采用percoll密度梯度法纯化的步骤包括：
S1、配制32.5％、30％和25％的percoll溶液，从高浓度到低浓度依次加入到容器中形成percoll密度梯度溶液；
S2、向percoll密度梯度溶液中加入所述富含精原干细胞的细胞悬液，离心，取32.5％percoll溶液以上的溶液(即0～30％percoll溶液)，向其中加入缓冲液，混匀后离心取沉淀，将沉淀重悬，得到纯化后的富集精原干细胞的细胞悬液。
在本发明的一些实施方式中，S1中，将percoll溶液，从高浓度到低浓度以0.3～1mL/min匀速依次加入到容器中形成percoll密度梯度溶液。
在本发明的一些实施方式中，S2中，以0.3～1mL/min匀速加入所述富含精原干细胞的细胞悬液。
在本发明的一些实施方式中，S2中，向percoll密度梯度溶液中加入所述富含精原干细胞的细胞悬液，800g离心30min，取32.5％percoll溶液以上的溶液，向其中加入3～10倍体积缓冲液，混匀后，200g离心取沉淀；将沉淀用缓冲液洗涤后，重悬，得到纯化后的富集精原干细胞的细胞悬液。
在本发明的一些实施方式中，S2中，重悬时使用含1～10％胎牛血清的DMEM:F-12培养基或含1～10％胎牛血清的L-15培养基。
在本发明的一些实施方式中，所述鱼类为罗非鱼。
本发明的有益效果：
本发明首次使用机械法分离得到了鱼类的精原干细胞，并且细胞损失少，杂细胞少，成功率高。本发明的机械法操作简单，对实验条件要求低，快速、成本低廉，在2h内即可得到富集的精原干细胞，该精原干细胞形态结构完整、纯度高、密度大，可以满足一般实验需求。
附图说明
图1为分离的精原干细胞的显微镜图；
图2为DNaseI消化后得到的精原干细胞的显微镜图。
具体实施方式
以下结合具体的实施例对本发明的技术方案和技术效果做进一步说明和阐释，但本发明并不限于这些具体实施方式。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。所有操作处理、试剂保存等，如无特殊说明，均在室温下进行操作和保存。
实施例1
挑选2条6-7月龄、发育良好的雄性罗非鱼，解剖分离性腺并取性腺(共2.06g)。
1)用剪刀把性腺剪切成长宽高为0.3～1.0cm的较大组织块，转移到无菌管中，用冰浴预冷的1×PBS洗涤：按照1g性腺重量加7.5mL 1×PBS的比例，洗涤4次，每次颠倒混匀5次，正向放置3min，小心吸取上清并丢弃，得到沉淀组织块；
对丢弃的上清进行观察，如图1中A图所示，可以看出，上清中含有大量的未成熟精细胞(没有尾巴)、成熟精子(带有小尾巴)和红细胞(白色箭头所示)；
2)将步骤1)洗涤后的组织块转移到培养皿中，继续用剪刀把组织块尽可能剪成长宽高不大于0.15cm的碎小组织块，用冰浴预冷的10mL 1×PBS洗涤3次：每次加1×PBS后颠倒混匀5次，正向放置3min，小心吸取上清并保存。合并3次洗涤上清，200g离心5分钟，去除上清，细胞沉淀用冰浴预冷的1×PBS洗涤3次，每次均200g离心5分钟，保存细胞沉淀；
对小组织块洗涤上清用终浓度为0.2％的台盼蓝染色后进行显微镜观察，如图1中B图所示，可以看出，上清中含有大量小的细胞、未分化成熟的精细胞和分化成熟的精子。
3)将步骤2)的细胞沉淀用冰浴预冷的1×PBS重悬细胞，40μm滤网过滤去除多细胞团，得到富含精原干细胞的细胞悬液。
对过滤前细胞悬液用终浓度为0.2％的台盼蓝染色后进行显微镜观察，如图1中C图所示，可以看出，绝大多数小的细胞、未分化成熟的精细胞和分化成熟的精子被去除，而比较大的生殖细胞基本保留下来。
对过滤后细胞悬液用终浓度为0.2％的台盼蓝染色后进行显微镜观察，如图1中D图所示，可以看出，细胞悬液中几乎为分散的精原干细胞(黑色箭头为体积较大的精原干细胞)，只有极少量杂细胞。
通过血清计数板统计细胞数(统计时不计数体积很小的精细胞和精子)，发现细胞数目为6380万。
将步骤3)的细胞悬液离心后去除上清，沉淀用含1％胎牛血清的DMEM:F-12培养基重悬细胞，调整细胞密度为3000万/mL。
实施例2
挑选2条9-11月龄、发育良好的雄性罗非鱼，解剖分离性腺并取性腺(共4.8g)。
1)用剪刀把性腺剪切成长宽高为0.3～1.0cm的较大组织块，转移到无菌管中，用冰浴预冷的1×PBS洗涤：按照1g性腺重量加8mL 1×PBS的比例，洗涤5次，每次颠倒混匀5次，正向放置3min，小心吸取上清并丢弃，得到沉淀组织块。
2)将步骤1)洗涤后的组织块转移到培养皿中，继续用剪刀把组织块尽可能剪成长宽高不大于0.15cm的碎小组织块，用冰浴预冷的1×PBS洗涤3次：每次加15mL 1×PBS后颠倒混匀5次，正向放置3min，小心吸取上清并保存。合并3次洗涤上清，200g离心，去除上清，细胞沉淀用冰浴预冷的1×PBS洗涤2次，每次均200g离心，保存细胞沉淀；
3)将步骤2)的细胞沉淀用冰浴预冷的1×PBS重悬细胞，40μm滤网过滤去除多细胞团，得到富含精原干细胞的细胞悬液。
通过血清计数板统计细胞数(统计时不计数体积很小的精子细胞)，发现细胞数目为8550万；
将步骤3)的细胞悬液离心后去除上清，沉淀用含1％胎牛血清的DMEM:F-12培养基重悬细胞，调整细胞密度为3000万/mL。
实施例3
1)制备percoll密度梯度溶液：
1份10X PBS加9份100％percoll溶液，得到90％percoll溶液。用90％percoll溶液配合1×PBS配制32.5％、30％、25％Percoll溶液，从高浓度到低浓度以每分钟1mL的速度匀速依次顺序加3mL对应浓度percoll溶液到放置在试管架上的15mL的离心管中，新添加液体要匀速添加到试管溶液的上表面。
2)富集精原干细胞：
取2mL实施例1细胞密度为3000万/mL的细胞悬液，以每分钟1mL的速度匀速添加到上述制备的15mL管装percoll密度梯度溶液上表面，800g、20℃离心30分钟。
离心结束后，把0-30％percoll以上的溶液收集在同一个管中，32.5％percoll组分和沉淀保留在原管中，分别加30mL 1×PBS，颠倒混匀后500g离心10分钟，去除上清。加10mL 1×PBS重悬细胞，随后200g离心5分钟，去除上清。细胞沉淀再用10mL 1×PBS洗涤1次，最后细胞沉淀分别重悬在含1％胎牛血清的DMEM:F-12培养基中。
通过血清计数板统计细胞数(统计时不计数体积很小的精子细胞)，发现0-30％percoll组分细胞数目为5880万。
对各组分的细胞悬液用终浓度为0.2％的台盼蓝染色后进行显微镜观察。如图1中E所示，为percoll密度梯度分离后收集到的0-30％percoll组分细胞；图1中F图所示为32.5％percoll+沉淀组分细胞；可以看出，在0～30％percoll组分中，含有大量的精原干细胞(黑色箭头为体积较大的精原干细胞)，而32.5％percoll+沉淀组分中，几乎没有发现精原干细胞，主要为红细胞(白色箭头)。
实施例4
1)DNaseI消化损伤细胞释放的DNA：
取实施例2细胞密度为3000万/mL的细胞悬液，加入终浓度为50μg/mL的DNaseI，28.5℃消化10分钟，200g离心，去除上清，用1×PBS重悬细胞沉淀；通过血清计数板统计细胞数(统计时不计数体积很小的精子细胞)，调整细胞密度为3000万/mL；
2)制备percoll密度梯度溶液：
1份10X PBS加9份100％percoll溶液，得到90％percoll溶液。用90％percoll溶液配合1×PBS配制32.5％、30％、25％Percoll溶液，从高浓度到低浓度以每分钟1mL的速度匀速依次顺序加3mL对应浓度percoll溶液到放置在试管架上的15mL的离心管中，新添加液体要匀速添加到试管溶液的上表面。
3)富集精原干细胞：
取2mL步骤1)得到的细胞密度为3000万/mL的细胞悬液，以每分钟1mL的速度匀速添加到上述制备的15mL管装percoll密度梯度溶液上表面，800g、20℃离心30分钟。
离心结束后，把0-25％、30％、32.5％percoll组分分别收集在不同管中，沉淀保留在原管中，分别加30mL 1×PBS，颠倒混匀后500g离心10分钟，去除上清。加10mL 1×PBS重悬细胞，随后200g离心5分钟，去除上清。细胞沉淀再用10mL 1×PBS洗涤1次，最后细胞沉淀分别重悬在含1％胎牛血清的DMEM:F-12培养基中。
通过血清计数板统计细胞数(统计时不计数体积很小的精子细胞)，发现0-25％percoll组分细胞数目为2280万，30％percoll组分细胞数目为3370万。
如图2所示，为DNaseI消化后得到的精原干细胞的显微镜图；其中，A图为0-25％percoll组分中的细胞，B图为30％percoll组分中的细胞，C图为32.5％percoll组分中的细胞，D图为沉淀组分中的细胞；可以看出，0-25％percoll组分和30％percoll组分中含有大量的精原干细胞，极少数的杂细胞；而C图中则为未成熟的精细胞(白色虚线圈)和成熟的精细胞(黑色虚线圈)，D图中则主要为红细胞(白色箭头)。
尽管已参照具体实施方式公开了本发明，但是显而易见的是，在不背离本发明的真正精神和范围的情况下，本领域的其他技术人员可以设计本发明的其它实施方式和变化，所附权利要求书目的在于被解释为包括所有这样的实施方式和等价的变化。此外，本文引用的所有参考文献的内容据此引入本文以供参考。
Claims (10)
1.一种机械法分离鱼类精原干细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)用剪刀将性腺剪切成组织块，并用缓冲液洗涤；
2)将步骤1)洗涤后的组织块用剪刀剪碎，再用缓冲液洗涤，将洗涤得到的上清液离心取细胞沉淀；
3)将步骤2)的细胞沉淀用液体培养基重悬，过滤，得到富含精原干细胞的细胞悬液。
2.根据权利要求1所述的机械法分离鱼类精原干细胞的方法，其特征在于，步骤3)中，液体培养基为含1～10％胎牛血清的DMEM:F-12培养基或含1～10％胎牛血清的L-15培养基。
3.根据权利要求1所述的机械法分离鱼类精原干细胞的方法，其特征在于，步骤1)中，洗涤时，向装有组织块的容器中加入缓冲液，上下颠倒数次混匀，正向放置至组织块沉降，然后吸取上清并丢弃。
4.根据权利要求1所述的机械法分离鱼类精原干细胞的方法，其特征在于，步骤2)中，得到的细胞沉淀再使用缓冲液多次洗涤并离心后弃上清。
5.根据权利要求1所述的机械法分离鱼类精原干细胞的方法，其特征在于，步骤2)中，将剪碎后得到的小组织块装入容器中，并加入缓冲液，颠倒混匀数次，正向放置至组织块沉降到底部，吸取上清液，多次洗涤后合并上清液，将合并的上清液离心，去除上清，得到细胞沉淀；细胞沉淀用缓冲液洗涤，每次均离心除上清液，保留细胞沉淀。
6.根据权利要求1所述的机械法分离鱼类精原干细胞的方法，其特征在于，还可以将富含精原干细胞的细胞悬液采用DNaseI处理。
7.根据权利要求1至6任一项所述的机械法分离鱼类精原干细胞的方法，其特征在于，还可以将富含精原干细胞的细胞悬液采用percoll密度梯度法纯化。
8.根据权利要求7所述的机械法分离鱼类精原干细胞的方法，其特征在于，采用percoll密度梯度法纯化的步骤包括：
S1、配制32.5％、30％和25％的percoll溶液，从高浓度到低浓度依次加入到容器中形成percoll密度梯度溶液；
S2、向percoll密度梯度溶液中加入所述富含精原干细胞的细胞悬液，离心，取32.5％percoll溶液以上的溶液，向其中加入缓冲液，混匀后离心取沉淀，将沉淀重悬，得到纯化后的富集精原干细胞的细胞悬液。
9.根据权利要求8所述的机械法分离鱼类精原干细胞的方法，其特征在于，S2中，向percoll密度梯度溶液中加入所述富含精原干细胞的细胞悬液，800g离心30min，取32.5％percoll溶液以上的溶液，向其中加入3～10倍体积缓冲液，混匀后，200g离心取沉淀；将沉淀用缓冲液洗涤后，重悬，得到纯化后的富集精原干细胞的细胞悬液。
10.根据权利要求1至6任一项所述的机械法分离鱼类精原干细胞的方法，其特征在于，所述鱼类为罗非鱼。
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|---|---|---|---|---|
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Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106520681A (zh) * | 2016-11-09 | 2017-03-22 | 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所 | 斑点叉尾鮰精原干细胞的体外培养液、冻存液及体外培养、冻存方法 |
| CN107916251A (zh) * | 2016-10-10 | 2018-04-17 | 中国科学院海洋研究所 | 一种大菱鲆精原干细胞的分离方法 |
| CN110872573A (zh) * | 2018-08-29 | 2020-03-10 | 上海交通大学医学院附属瑞金医院 | 一种斑马鱼原代心肌细胞分离与培养的新方法 |
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2020
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Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107916251A (zh) * | 2016-10-10 | 2018-04-17 | 中国科学院海洋研究所 | 一种大菱鲆精原干细胞的分离方法 |
| CN106520681A (zh) * | 2016-11-09 | 2017-03-22 | 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所 | 斑点叉尾鮰精原干细胞的体外培养液、冻存液及体外培养、冻存方法 |
| CN110872573A (zh) * | 2018-08-29 | 2020-03-10 | 上海交通大学医学院附属瑞金医院 | 一种斑马鱼原代心肌细胞分离与培养的新方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 楼允东主编: "《鱼类育种学》", 31 August 2001, 中国农业出版社 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113025565A (zh) * | 2021-02-08 | 2021-06-25 | 上海海洋大学 | 马口鱼精原干细胞系的建立及其诱导分化方法 |
| CN113025565B (zh) * | 2021-02-08 | 2023-08-01 | 上海海洋大学 | 马口鱼精原干细胞系的建立及其诱导分化方法 |
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