CN107916251A - 一种大菱鲆精原干细胞的分离方法 - Google Patents

一种大菱鲆精原干细胞的分离方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及海水鱼类精原干细胞的分离方法,具体的说是一种大菱鲆精原干细胞的分离方法。将预处理的1‑1.5龄大菱鲆的完整性腺经含有双抗(青霉素/链霉素)的L‑15培养液洗涤，酶消化，消化后消化液经密度梯度离心，进而获得高纯度和高密度的精原干细胞。本发明提供了一种分离海水鱼类精原干细胞的方法，该方法分离获得的精原干细胞细胞形态结构完整，纯度高，且密度大，可用于精原干细胞的保存以及干细胞移植研究。该方法的为海水鱼类种质资源的保存以及新品种的培育提供了新方法和新思路。

Description

一种大菱鲆精原干细胞的分离方法
技术领域
本发明涉及海水鱼类精原干细胞的分离方法,具体的说是一种大菱鲆精原干细胞的分离方法。
背景技术
大菱鲆是我国经济价值很高的海水养殖鱼类，其肉质细嫩，营养丰富，深受消费者欢迎。大菱鲆是引进品种，由于在国内长期的养殖，近亲交配较为严重，导致病害频发和产量下降。精巢中精原干细胞属于生殖干细胞,既可自我更新,又具有分化的全能型，可以分化形成各阶段的生殖细胞直至成熟配子。日本学者已经成功的在虹鳟鱼实现精原干细胞的移植，并成功获得后代。如果将鱼类的精原干细胞进行分离和保存，在需要的时候将其通过代理母亲或父亲可获得供体的卵子或精子。因此，建立海水鱼类精原干细胞的分离和保存方法对于海洋种植资源的保存保护以及海水养殖鱼类的可持续发展具有重要意义。
发明内容
本发明目的在于提供一种大菱鲆精原干细胞的分离方法。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种大菱鲆精原干细胞的分离方法，将预处理的1-1.5龄大菱鲆的完整性腺经含有双抗(青霉素/链霉素)的L-15培养液洗涤，酶消化，消化后消化液经密度梯度离心，进而获得高纯度和高密度的精原干细胞。
具体是：
将分离获得的1-1.5龄性腺发育未成熟大菱鲆雄鱼性腺放入预冷的过量的0.1MPBS中；而后将性腺剪碎，剪碎后经消化成浆状，所得浆状性腺经含有青霉素/链霉素双抗的L-15培养液洗涤，离心收集沉淀，沉淀经酶消化，消化后经L-15培养液将细胞重悬，细胞重悬液经密度梯度离心，收集沉淀用L-15培养液重悬，即可获得高纯度的精原干细胞。
所述浆状性腺经洗涤后离心所获得的沉淀于过量的含0.25％胰蛋白酶，5％胎牛血清，0.05％DNaseI的L-15培养液中25℃温育2h-2.5h，过程中用吸管轻柔吹打使性腺细胞分散；
分散后性腺细胞用42um孔径的尼龙筛过滤，除去未离解的细胞块，收集滤液；滤液中加入过量的L-15培养液洗涤，用吸管吹打混匀，4℃200g离心5min，弃上清，重复上述洗涤离心过程2-3次，收集沉淀。
所述收集的沉淀经L-15培养液将细胞重悬，用吸管缓慢加到密度梯度细胞分离液(30％percoll分层液：20％percoll分层液＝2：1(V:V))中，4℃800g离心30min；收集20％percoll分层液之间的液层部分，将收集液再用过量L-15培养液洗涤，4℃，200g离心5-10min，弃上清，然后加入L-15培养液重悬，重复2-3次，最后加入L-15培养液将细胞重悬，即可获得高纯度的精原干细胞。
其中，30％percoll分层液和20％percoll分层液的配置将Percoll原液与0.1MPBS PH7.4，9:1(V/V)配成母液，然后用0.01M PBS与母液分别配成35％percoll分层液和20％percoll分层液；
上述L-15培养液购买自life Technologies公司
本发明所具有的优点：
本发明采集1-1.5龄大菱鲆，解剖，分离获得完整性腺，性腺经过培养液洗涤，切块剪碎、酶消化、过滤、密度梯度离心等一系列过程，获得高纯度和高密度的精原干细胞。本发明提供的分离海水鱼类精原干细胞的方法，获得的精原干细胞细胞形态结构完整，纯度高，且密度大，可用于精原干细胞的保存以及干细胞移植研究。该方法的为海水鱼类种质资源的保存以及新品种的培育提供了新方法和新思路。
附图说明
图1为本发明实施例提供的分离获得的大菱鲆精原干细胞的光镜图。其中，黑色箭头标示精原干细胞，白色箭头标示其他细胞。
具体实施方式
以下实施例旨在进一步说明本发明内容，而不是限制本发明的保护范围。
本发明提供了一种分离海水鱼类精原干细胞的方法，该方法分离获得的精原干细胞细胞形态结构完整，纯度高，且密度大，可用于精原干细胞的保存以及干细胞移植研究。该方法的为海水鱼类种质资源的保存以及新品种的培育提供了新方法和新思路。
实施例1
(1)采集1龄左右体重在300-500g大菱鲆2-3尾，在活体中台下分离雄鱼性腺，放入预冷的100ml 0.1M PBS中；
(2)在碎冰上将性腺切成约0.5g每份，并剪碎成浆状；
(3)加1mL含1％双抗(青霉素/链霉素)的L-15培养液洗涤，4℃，200g离心5min，弃上清，重复2次；
(4)放入含1mL 0.2％胰蛋白酶，5％胎牛血清，0.05％NaseI的L-15培养液中25℃温育2h，过程中用移液管轻柔吹打使性腺细胞分散；
(5)用42μm孔径的尼龙网过滤，除去未离解的细胞块，收集滤液；
(6)加3mL-15培养液洗涤，用吸管吹打混匀，4℃，200g离心5min，弃上清，重复2次；
(7)加1mLL-15培养液将细胞重悬，用吸管缓慢加到装有密度梯度细胞分离液(30％percoll分层液：20％percoll液分层＝2：1(V:V)))的15mL离心管中，4℃，800g离心30min；
(8)收集20％percoll液层部分，用5mL L-15培养液洗涤，4℃200g离心5min，弃上清，重复2次，最后加入1mL，L-15培养液将细胞重悬；
(9)取少量上述获得重悬液经台盼蓝拒染法后显微镜观察有A型精原细胞占85％以上，细胞密度5.6×104/ml。

Claims (4)

1.一种大菱鲆精原干细胞的分离方法，其特征在于：将预处理的1-1.5龄大菱鲆的完整性腺经含有双抗(青霉素/链霉素)的L-15培养液洗涤，酶消化，消化后消化液经密度梯度离心，进而获得高纯度和高密度的精原干细胞。
2.按权利要求1所述的大菱鲆精原干细胞的分离方法，其特征在于：将分离获得的1-1.5龄性腺发育未成熟大菱鲆雄鱼性腺放入预冷的过量的0.1M PBS中；而后将性腺剪碎，剪碎后经消化成浆状，所得浆状性腺经含有青霉素/链霉素双抗的L-15培养液洗涤，离心收集沉淀，沉淀经酶消化，消化后经L-15培养液将细胞重悬，细胞重悬液经密度梯度离心，收集沉淀用L-15培养液重悬，即可获得高纯度的精原干细胞。
3.按权利要求1或2所述的大菱鲆精原干细胞的分离方法，其特征在于：所述浆状性腺经洗涤后离心所获得的沉淀于过量的含0.25％胰蛋白酶，5％胎牛血清，0.05％DNaseI的L-15培养液中25℃温育2h-2.5h，过程中用吸管轻柔吹打使性腺细胞分散；
分散后性腺细胞用42um孔径的尼龙筛过滤，除去未离解的细胞块，收集滤液；滤液中加入过量的L-15培养液洗涤，用吸管吹打混匀，4℃200g离心5min，弃上清，重复上述洗涤离心过程2-3次，收集沉淀。
4.按权利要求3所述的大菱鲆精原干细胞的分离方法，其特征在于：所述收集的沉淀经L-15培养液将细胞重悬，用吸管缓慢加到密度梯度细胞分离液(30％percoll分层液：20％percoll分层液＝2：1(V:V))中，4℃800g离心30min；收集20％percoll分层液之间的液层部分，将收集液再用过量L-15培养液洗涤，4℃，200g离心5-10min，弃上清，然后加入L-15培养液重悬，重复2-3次，最后加入L-15培养液将细胞重悬，即可获得高纯度的精原干细胞。
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