CN114480262A - 一种3d体外培养中华乌塘鳢精原细胞产生功能精子的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种3D体外培养中华乌塘鳢精原细胞产生功能精子的方法，包括以下步骤：（1）对分离的中华乌塘鳢精巢进行消毒、清洗、剪碎，加入精巢消化液进行消化，然后经过滤网过滤去除未消化的细胞碎片或者细胞团，制得精巢单细胞悬液；精巢单细胞悬液加入percoll梯度溶液中进行离心，分离得到精原细胞；percoll梯度溶液由22~30%和35~45%两种浓度组成percoll溶液；（2）精原细胞转移到3D培养皿中，用精子诱导培养基进行培养；精子诱导培养基包括基础精子培养基和性激素，进一步还包括褪黑素。该方法从精原细胞的分离、培养和诱导条件进行了优化和改良，提高体外培养精原细胞产生具有功能的精子的效率。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种3D体外培养中华乌塘鳢精原细胞产生功能精子的方法。
背景技术
鱼类养殖对世界食品特别是动物蛋白的持续供给做出了至关重要的贡献。近十年来，生物技术的创新在鱼类一些重要经济性状的解析和遗传改良取得了重要进展。鱼类遗传育种已从传统选择育种和杂交育种，发展至细胞工程育种、性别控制育种、分子标记辅助选择育种和全基因组选择育种等精准设计育种。鱼类遗传育种基础研究和技术的进步推动中国鱼类种业的形成和蓬勃发展。随着养殖规模的扩大，鱼类养殖面临优良种质资源和苗种短缺等问题，创制养殖鱼类优良种质是水产养殖行业健康持续发展亟待解决的问题。
目前，生殖细胞操作技术，例如生殖干细胞移植和生殖干细胞诱导，是快速获得优良种质的潜在途径，对于缩短鲟、鲑、鳟、草鱼和石斑鱼等繁殖长的鱼类的育种周期具有重要意义。生殖干细胞移植，俗称“借腹怀胎”技术，将供体生殖干细胞移植到不育的受体中，受体成熟后产生供体的配子（即精子或者卵子）。借腹怀胎技术已被成功应用于鲑鱼、虹鳟、牙鲆和大菱鲆等养殖鱼类中，产生具有功能的配子。然而，生殖干细胞培养和体外产生功能的配子尚未在养殖鱼类中报道，其仍然是一个技术领域中的难题。
精子发生（spermatogenesis）是一个复杂而有序的生物学过程。依据精原干细胞（spermatogonia stem cell，SSC）的行为，精子发生划分为三个重要事件：SSC自我更新、SSC转换为分化的精原细胞以及减数分裂产生单倍体精子。精子发生受SSC微环境的精准调控，包括SSC和体细胞的相互作用、内分泌因子以及细胞外基质的黏附等。
在日本青鳉中，洪云汉等建立首个鱼类SSC细胞系—SG3，长期培养SG3可产生游动的精子。然而，现有的细胞培养体系难以在体外长期维持鱼类SSC的增殖能力和生殖干性，因此还没有在其他鱼类中建立SSC细胞系的报道。现有技术中，研究人员主要将含有SSC的精巢消化成单细胞悬液，在不同的体系进行培养和诱导分化；但是发现SSC难以直接黏附在明胶、蛋白等基质包被的培养皿上。因此SSC通常与性腺体细胞共培养，SSC黏附在贴壁的性腺体细胞饲养层上，进而增殖和分化。然而，大多数鱼类性腺体细胞也存在多次传代之后难以继续增殖的瓶颈。目前，仅在斑马鱼和虹鳟中成功建立稳定的性腺体细胞系ZtA6和RTG-2。由于饲养层细胞（性腺体细胞）对精原细胞发育的影响因物种而异，共培养系统也仅推广于斑马鱼、日本青鳉（利用RTG-2）和虹鳟。因此，鱼类生殖细胞培养和诱导系统仍然匮乏，尤其在养殖鱼类的群体中。
此外，虽然2D培养SSC取得了一定进展，但因其缺乏相对立体的空间结构，不能有效地模拟体内SSC微环境（niche）而导致诱导产生精子的效率较低。精巢被认为是一种特殊的3D结构，因而开发3D培养系统模拟SSC的微环境（niche），加深生殖细胞与体细胞和微环境的相互作用，可以促进SSC体外产生精子。近年来，利用人工材料（软琼脂、甲基纤维素、纳米纤维）或者脱细胞生物支架模拟体内SSC微环境的3D培养法，研究人员成功将小鼠SSC、大鼠SSC和无精人类患者的SSC诱导产生精子。然而，至今尚未建立鱼类生殖细胞的3D培养系统。
基于以上技术背景，发明人发明一种3D培养中华乌塘鳢精巢细胞产生精子的方法，即中国公布专利CN110684724A，该方法将中华乌塘鳢成熟精巢的细胞在3D培养系统中培养，能够产生功能的精子。虽然发明人在该方法中成功诱导成熟精巢细胞产生精子，但是该方法仍存在明显不足：经过后续实验发现，将该方法应用于发育中的精巢中的精原细胞，精原细胞不能产生精子。
发明内容
本发明的目的在于提供一种3D体外培养中华乌塘鳢精原细胞产生功能精子的方法，该方法从精原细胞的分离、培养和诱导条件进行了优化和改良，提高体外培养精原细胞产生具有功能的精子的效率。
为实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
一种3D体外培养中华乌塘鳢精原细胞产生功能精子的方法，包括以下步骤：
（1）对分离的中华乌塘鳢精巢进行消毒、清洗、剪碎，然后加入精巢消化液进行消化，消化后的细胞经过滤网过滤去除未消化的细胞团，制得精巢单细胞悬液；然后精巢单细胞悬液加入percoll梯度溶液中，进行离心，分离得到精原细胞；所述percoll梯度溶液为由22~30%和35~45%两种浓度组成 percoll溶液；
（2）将精原细胞转移到3D培养皿中，用精子诱导培养基进行培养；所述精子诱导培养基包括基础精子培养基和性激素；所述性激素包括人绒毛膜促性腺激素（hCG）、妊娠母马血清促性腺激素（PMSG）、11-酮睾酮（11-KT）、睾酮（T）、17β-雌二醇（E2）和17α，20β-二羟基-4-孕3-酮（DHP）。
如前文所述，实验发现，发明人在中国公布专利CN110684724A公开的方法，对于未成熟的精巢中的精原细胞，不能成功使其产生精子，因此，发明人进行了改进。发明人在基础精子培养基中添加性激素，配制了精子诱导培养基，结合3D培养，即3D+Hor培养系统；在3D+Hor培养系统的作用下，中华乌塘鳢减数分裂前的精原细胞能够形成“圆形球块”，进入减数分裂，并产生具有功能的精子。通过组织形态学观察、流式细胞分析和qPCR分析的评估，本发明方法提供的3D+Hor培养系统在培养中华乌塘鳢减数分裂前的精原细胞产生具有功能精子具有极显著的优势。
此外，发明人在利用密度梯度离心的方法分离云斑尖塘鳢精原细胞的方面进行长期的实验，此前试验得出的方案是：使用了15%、25%和40%三个percoll梯度（参见中国公布专利CN112608887A），分离精原细胞。但发明人惊喜地发现，采用22~30%和35~45%的两个percoll梯度，却能更有效分离减数分裂前的中华乌塘鳢精原细胞，为精原细胞的体外培养并产生具有功能精子定下基础，能够提高体外产生具有功能精子的效率。
优选地，本发明在基础培养基中添加的性激素，包括：5~20 U/ml人绒毛膜促性腺激素（hCG）、5~20 IU/ml妊娠母马血清促性腺激素（PMSG）、50~200 ng/ml 11-酮睾酮（11-KT）、50~200 ng/ml睾酮（T）、50~200 ng/ml 17β-雌二醇（E2）和20~70 ng/ml 17α，20β-二羟基-4-孕3-酮（DHP）。
更优选地，在基础培养基中添加的性激素，包括：10 U/ml人绒毛膜促性腺激素（hCG）、10 IU/ml妊娠母马血清促性腺激素（PMSG）、100 ng/ml 11-酮睾酮（11-KT）、100 ng/ml睾酮（T）、100 ng/ml 17β-雌二醇（E2）和50 ng/ml 17α，20β-二羟基-4-孕3-酮（DHP）。
优选地，所述percoll梯度溶液的成分为25%和40% percoll溶液；通过流式细胞分析和一系列基因标记检测的结果证实，利用25%和40%的percoll进行密度梯度离心可高效地分离减数分裂前的中华乌塘鳢精原细胞。
进一步，所述精子诱导培养基还包括褪黑素。
精子发生受到内分泌因子调控。因此，发明人首次尝试在鱼类精子诱导培养基中额外添加褪黑素，发现其有效促进中华乌塘鳢精原细胞的增殖和分化，并显著提高中华乌塘鳢减数分裂前的精原细胞在3D+Hor培养系统中具有功能精子的产生效率。
所述褪黑素的添加量为0.1~10 μM，优选为1 μM。
所述步骤（2）进行精原细胞培养过程中，每隔3天更换一半新鲜的精子诱导培养基。
所述精巢消化液由以下成分组成：L-15培养基、青霉素、链霉素、IV型胶原酶、胎牛血清（FBS）、胰酶和DNA酶。
所述基础精子培养基为在DMEM培养基中添加10%胎牛血清，2%鲈鱼血清，100 ng/ml 表皮生长因子（EGF），10 ng/ml 成纤维生长因子（bFGF），100 ng/ml类胰岛素生长因子1（IFG-I）和0.1 mM β-巯基乙醇。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1.本发明利用两种密度梯度为22~30%和35~45% percoll溶液，分离得到中华乌塘鳢减数分裂前的精原细胞，精原细胞占比高达81%以上；
本发明使用精子诱导培养基对中华乌塘鳢精原细胞进行3D体外培养，精原细胞在3D+Hor培养系统中培养3~4周后产生精子，并且产生的精子能够成功使成熟卵子受精，产生健康的幼苗。
2.本发明在精子诱导培养基中添加褪黑素，可以显著促进精原细胞的增殖和分化，中华乌塘鳢精原细胞在添加了褪黑素的3D+Hor培养系统中培养4周后，精子的得率从9.49%提高到17.13%，即本发明方法有效提高具有功能精子的产生效率。
附图说明
图1为发育中精巢的结构；
图2为实施例1的精巢单细胞悬液图片（A），以及精巢单细胞悬液经过percoll梯度离心后的整体图片（B）和中层细胞图片（C）；
图3为实施例1中免疫荧光检测离心前的精巢单细胞悬液和离心后中层细胞中的vasa表达图片（A和B），以及流式细胞分析两者vasa阳性细胞的比例对比图（C）；
图4为PCR检测离心前的精巢单细胞悬液和离心后上中下层细胞中不同细胞标记基因的表达图；
图5为percoll梯度离心后的中层细胞在2D（A1~A4）、3D（B1~B4）、2D+Hor（C1~C4）和3D+Hor（D1~D4）培养系统中培养1、2、3和4周后的图片；
图6为PCR检测减数分裂标记dmc1和 acrosin在不同培养系统中培养4周后的表达水平对比图（A），以及流式细胞分析在不同培养系统中培养4周后细胞的DNA组成图（B和C）；其中N代表单倍体，2N为二倍体，4N为增殖中的四倍体。
图7为在精子诱导培养基1中分别添加0、0.1、1和10μM褪黑素（Melatonin）3D培养7天后，免疫荧光检测vasa和EdU的图片；
图8为在精子诱导培养基1中分别添加0、0.1、1和10μM褪黑素（Melatonin）3D培养7天后，EdU+细胞、vasa+细胞、EdU+/Vasa+ 细胞以及EdU+/Vasa- 细胞的比例对比图；
图9为qPCR检测在精子诱导培养基1中分别添加0和1μM褪黑素（Melatonin）培养1周后，不同基因的表达对比图；
图10为在添加精子诱导培养基1中分别添加0、1μM褪黑素、1μM褪黑素+ 1μM褪黑素抑制剂Luz进行3D培养7天后，免疫荧光检测vasa的表达图（A），以及vasa+ 细胞的比例示意图（B）和qPCR检测相关基因的表达对比图（C）；
图11为添加精子诱导培养基1中分别添加0、1μM褪黑素、1μM褪黑素+ 1μM褪黑素抑制剂Luz 进行3D培养4周后，qPCR检测减数精子发生相关基因的表达水平对比图（A）和减数分裂相关基因的表达水平对比图（B），以及流式细胞分析细胞DNA组成的对比图（C）。其中N代表单倍体，2N为二倍体，4N为二倍体增殖后形成的四倍体。
具体实施方式
以下实施例仅用于阐述本发明，而本发明的保护范围并非仅仅局限于以下实施例。所述技术领域的普通技术人员依据以上本发明公开的内容和各参数所取范围，均可实现本发明的目的。
本发明实施例采用的检测方法如下：
1.免疫荧光法的主要步骤为：PBS清洗3次，4% PFA室温固定15 min，弃PFA，随后用2 mg/mL的甘氨酸PBS溶液中和。弃甘氨酸，PBS洗涤3次后，加入0.5% Triton X-100室温孵育10 min。PBS洗涤三次后，加入封闭液，室温孵育1 h。封闭结束后，加入VASA抗体稀释液，4℃孵育过夜。弃掉抗体稀释液，PBS洗涤三次后，加入荧光二抗、EdU显色液与DAPI混合染料，室温避光染色45 min。使用活细胞成像仪拍照观测细胞染色情况。
2.流式细胞仪分析细胞DNA组成的步骤为：将培养的细胞消化成单细胞悬液后，2000 rpm离心5 min，弃上清液，加入预冷的70%乙醇，冰浴固定1 h。2000 rpm离心5 min，弃上清液，PBS洗涤2次后，使用含有0.1% BSA的PBS重悬细胞。添加RNase A（终浓度为1 mg/ml）37℃消化30 min。随后，加入10 μg/ml的PI染色液避光冰浴30 min。流式细胞仪上样，检测分析。
3.PCR反应体系的配制和过程：PCR反应采用SYBR green mix，在RocheLightCycle 480 II 上运行，PCR反应体系见下表。
PCR反应体系
PCR反应程序如下：
1）：95℃ 30秒；
2）：95℃ 10秒；60℃ 10秒；72℃ 10秒；循环40次；
3）：40℃ 2分钟。
PCR引物序列
本发明实施例中，精巢消化液的组分为：在L-15培养基中添加4 mg/mL Ⅳ型胶原酶，0.05wt% DNA酶 I，0.25 wt %胰酶和10 wt % FBS，100U/mL 青霉素和100μg/mL链霉素。
基础精子培养基的组分为：在DMEM培养基中添加10%胎牛血清，2%鲈鱼血清，100ng/ml 表皮生长因子（EGF），10 ng/ml 成纤维生长因子（bFGF），100 ng/ml类胰岛素生长因子1（IFG-I）和0.1 mM β-巯基乙醇。
实施例1
（1）中华乌塘鳢精原细胞的分离和鉴定：
a、精巢单细胞悬液的制备：
分离发育期的中华乌塘鳢精巢；如图1所示，图1A为性腺的宏观结构；图1B和图1C为免疫荧光检测精巢中vasa的表达，其中图1C为图1B中方框放大图，Vasa信号为绿色（较亮的颜色），细胞核为红色；图1C中SG为精原细胞，PSP为初级精母细胞，SSP为次级精母细胞，SPD为精细胞，SPZ为精子。
将发育期的中华乌塘鳢精巢，在70%乙醇中消毒30秒后，经过磷酸缓冲液（PBS）清洗3次后，将精巢用医用剪刀剪碎，加入1 ml精巢消化液，于37℃消化1 h，消化后的细胞经过70微米的滤网过滤去除未消化的细胞团，制备精巢单细胞悬液，见图2A（ 图中CS指离心前的精巢单细胞悬液）。
b、中华乌塘鳢精原细胞分离和鉴定：制备percoll梯度溶液1：其成分为1.5 ml25% percoll和1.5 ml 40% percoll溶液。将精巢单细胞悬液加入percoll梯度溶液1中，以1500转/分钟的转速水平离心15分钟后，精巢细胞重新分为上、中、下三层（见图2B，其中Top为上层、mid为中层、bot为下层），并从中层（25％和40％Percoll交界处）获得精原细胞；
比较上中下三层的细胞，发现中层的细胞具有典型的精原细胞的特征（见图2C）：细胞核大，核质界限明显、细胞核/细胞质的比例较大。而且如图3A~C所示，免疫荧光和流式细胞分析结果显示，中层percoll溶液中的vasa+细胞的比例从梯度离心之前的25.7%提升到84.3%。图4的PCR结果显示，生殖干细胞标记基因仅表达在中层的细胞，且中层细胞不表达减数分裂标记基因，同时有和生精细胞标记基因，且有较低的体细胞标记基因的表达。
（2）中华乌塘鳢精原细胞的培养：
a、中华乌塘鳢精原细胞的培养：配制精子诱导培养基1：在基础精子培养基添加10U/ml人绒毛膜促性腺激素（hCG）、10 IU/ml妊娠母马血清促性腺激素（PMSG）、100 ng/ml11-酮睾酮（11-KT）、100 ng/ml睾酮（T）、100 ng/ml 17β-雌二醇（E2）和50 ng/ml 17α，20β-二羟基-4-孕3-酮（DHP）。将步骤（1）分离得到的精原细胞转移到6.5 mm Transwell-COL（3D培养皿）中，在精子诱导培养基1中进行培养，每隔3天用新鲜的诱导培养基1替换一半的培养基。
b、在培养不同时间后，从形态结构、基因表达和DNA组成等方面对培养的精原细胞进行分析：
在培养1周后（1 WAC），这些分离的细胞能较好的附着在3D材料上（见图5D1）；在2WAC，这些细胞逐渐聚集成团，形成直径约为100 μm的细胞团（图5D2）；在3 WAC，这些细胞团长大，直径约300 μm（图5D3）；在4 WAC，细胞团变得更加致密，直径达到约500 μm（图5D4）。
收集培养四周后的细胞用于qPCR检测和流式细胞分析，结果见图6（本实施例对应图中3D+Hor培养系统）；结果显示这些细胞中有9.49%的单倍体细胞。qPCR结果显示培养四周后的细胞中表达较高水平的减数分裂标记基因（dmc1）和精细胞标记基因（acrosin）；以β-actin作为内参，dmc1和acrosin分别是β-actin表达量的32.3倍和31.8倍。
（3）体外培养产生的精子的受精能力检测：
a、成熟中华乌塘鳢卵子的获得：取发育正常、腹部膨大、生殖乳突颜色深红的雌鱼，肌肉注射13 μg/kg促黄体素释放激素（LHRHA2），避光催熟72 h后，肌肉注射5000units/kg人绒毛膜促性腺激素（HCG）和13 μg/kg。在第二次肌肉注射48-60 h后，轻轻挤压雌鱼腹部，收集成熟卵子。
b、培养产生精子的受精能力检测：用生理盐水重悬步骤（2）收集的细胞，然后采用干法体外受精，将中华乌塘鳢卵子挤入干净的平皿中，与精子孵育1分钟后，加入25‰的盐水激活，使卵细胞受精，经统计，进入卵裂期、体节期和孵化期的胚胎的比例分别为48.93± 8.23%、31.23 ± 3.24%和26.88 ± 4.13%（见表1）。
实施例2
（1）中华乌塘鳢精原细胞的分离和鉴定：
a、精巢单细胞悬液的制备：分离发育期的中华乌塘鳢精巢，在70%乙醇中消毒30秒后，经过磷酸缓冲液（PBS）清洗3次后，将精巢用医用剪刀剪碎，加入1 ml精巢消化液，于37℃消化1 h，消化后的细胞经过70微米的滤网过滤去除未消化的细胞团，制备精巢单细胞悬液。
b、中华乌塘鳢精原细胞分离和鉴定：制备percoll梯度溶液2：其成分为1.5 ml22% percoll和1.5 ml 35% percoll溶液。将精巢单细胞悬液加入percoll梯度溶液2中，以1500转/分钟的转速水平离心15分钟后，精巢细胞重新分为上、中、下三层，从中层获得精原细胞；
免疫荧光和流式细胞分析结果显示，中层percoll溶液中的vasa+细胞的比例从梯度离心之前的25.7%提升到81.9%。
（2）中华乌塘鳢精原细胞的培养：
a、中华乌塘鳢精原细胞的培养：配制精子诱导培养基2：在基础精子培养基添加5U/ml人绒毛膜促性腺激素（hCG）、5 IU/ml妊娠母马血清促性腺激素（PMSG）、50 ng/ml 11-酮睾酮（11-KT）、50 ng/ml睾酮（T）、50 ng/ml 17β-雌二醇（E2）和20 ng/ml 17α，20β-二羟基-4-孕3-酮（DHP）。将步骤（1）分离得到的精原细胞转移到6.5 mm Transwell-COL（3D培养皿）中，在精子诱导培养基2中进行培养，每隔3天用新鲜的诱导培养基2替换一半的培养基。
b、在培养不同时间后，从形态结构、基因表达和DNA组成等方面对培养的精原细胞进行分析：
与实施例1的结果类似，本实施例培养的细胞在1 WAC附着在3D材料上；在2 WAC，这些细胞聚集形成直径约为80 μm的细胞团；在3 WAC，这些细胞团长大，直径约240 μm；在4WAC，细胞团变得更加致密，直径达到约400 μm。
收集培养四周后的细胞用于qPCR检测和流式细胞分析；结果显示这些细胞中有8.79%的单倍体细胞。qPCR结果显示培养四周后的细胞中表达较高水平的减数分裂标记基因（dmc1）和精细胞标记基因（acrosin）；以β-actin作为内参，dmc1和acrosin分别是β-actin表达量的28.3倍和29.8倍。
（3）体外培养产生的精子的受精能力检测：
a、成熟中华乌塘鳢卵子的获得：取发育正常、腹部膨大、生殖乳突颜色深红的雌鱼，肌肉注射13 μg/kg促黄体素释放激素（LHRHA2），避光催熟72 h后，肌肉注射5000units/kg人绒毛膜促性腺激素（HCG）和13 μg/kg。在第二次肌肉注射48-60 h后，轻轻挤压雌鱼腹部，收集成熟卵子。
b、培养产生精子的受精能力检测：用生理盐水重悬步骤（2）收集的细胞，然后采用干法体外受精，将中华乌塘鳢卵子挤入干净的平皿中，与精子孵育1分钟后，加入25‰的盐水激活，使卵细胞受精，经统计，进入卵裂期、体节期和孵化期的胚胎的比例分别为41.21± 6.12%、26.23 ± 4.21%和22.21 ± 3.56%（表1）。
实施例3
（1）中华乌塘鳢精原细胞的分离和鉴定：
a、精巢单细胞悬液的制备：分离发育期的中华乌塘鳢精巢，在70%乙醇中消毒30秒后，经过磷酸缓冲液（PBS）清洗3次后，将精巢用医用剪刀剪碎，加入1 ml精巢消化液，于37℃消化1 h，消化后的细胞经过70微米的滤网过滤去除未消化的细胞团，制备精巢单细胞悬液。
b、中华乌塘鳢精原细胞分离和鉴定：制备percoll梯度溶液3：其成分为1.5 ml30% percoll和1.5 ml 45% percoll溶液。将精巢单细胞悬液加入percoll梯度溶液3中，以1500转/分钟的转速水平离心15分钟后，精巢细胞重新分为上、中、下三层，从中层获得精原细胞；
免疫荧光和流式细胞分析结果显示，中层percoll溶液中的vasa+细胞的比例从梯度离心之前的25.7%提升到82.2%。
（2）中华乌塘鳢精原细胞的培养：
a、中华乌塘鳢精原细胞的培养：配制精子诱导培养基3：在基础精子培养基添加20U/ml人绒毛膜促性腺激素（hCG）、20 IU/ml妊娠母马血清促性腺激素（PMSG）、200 ng/ml11-酮睾酮（11-KT）、200 ng/ml睾酮（T）、200 ng/ml 17β-雌二醇（E2）和70 ng/ml 17α，20β-二羟基-4-孕3-酮（DHP）。将步骤（1）分离得到的精原细胞转移到6.5 mm Transwell-COL（3D培养皿）中，在精子诱导培养基3中进行培养，每隔3天用新鲜的诱导培养基3替换一半的培养基。
b、在培养不同时间后，从形态结构、基因表达和DNA组成等方面对培养的精原细胞进行分析：
与实施例1的结果类似，本实施例培养的细胞在1 WAC附着在3D材料上；在2 WAC，这些细胞聚集形成直径约为90μm的细胞团；在3 WAC，这些细胞团长大，直径约280 μm；在4WAC，细胞团变得更加致密，直径达到约450 μm。
收集培养四周后的细胞用于qPCR检测和流式细胞分析；结果显示这些细胞中有9.12%的单倍体细胞。qPCR结果显示培养四周后的细胞中表达较高水平的减数分裂标记基因（dmc1）和精细胞标记基因（acrosin）；以β-actin作为内参，dmc1和acrosin分别是β-actin表达量的29.5倍和30.1倍。
（3）体外培养产生的精子的受精能力检测：
a、成熟中华乌塘鳢卵子的获得：取发育正常、腹部膨大、生殖乳突颜色深红的雌鱼，肌肉注射13 μg/kg促黄体素释放激素（LHRHA2），避光催熟72 h后，肌肉注射5000units/kg人绒毛膜促性腺激素（HCG）和13 μg/kg。在第二次肌肉注射48-60 h后，轻轻挤压雌鱼腹部，收集成熟卵子。
b、培养产生精子的受精能力检测：用生理盐水重悬步骤（2）收集的细胞，然后采用干法体外受精，将中华乌塘鳢卵子挤入干净的平皿中，与精子孵育1分钟后，加入25‰的盐水激活，使卵细胞受精，经统计，进入卵裂期、体节期和孵化期的胚胎的比例分别为43.21±3.58%、28.12 ± 5.34%和24.44 ± 4.33%（表1）。
实施例4
与实施例1不同的是，中华乌塘鳢精原细胞在褪黑素精子诱导培养基1中进行培养；其中褪黑素精子诱导培养基1的组成为精子诱导培养基1+1 μM褪黑素，每隔3天用新鲜的褪黑素诱导培养基1替换一半的培养基；其他步骤和实施例1相同。
此外，对精原细胞培养7天后，掺入EdU标记正在增殖的细胞；EdU掺入48 h后，收集细胞用于免疫荧光和qPCR分析。在免疫荧光结果中，Vasa阳性（vasa+）的细胞代表生殖细胞，EdU阳性（EdU+）的细胞代表正在增殖的细胞，Vasa和EdU双阳性（vasa+/EdU+）的细胞代表增殖的精原细胞（因为雄性生殖细胞中仅有精原细胞具有较强增殖能力），Vasa阴性而EdU阳性（vasa-/EdU+）的细胞代表增殖的体细胞。从图7~8的结果显示，1 μM褪黑素显著提升培养系统EdU阳性细胞的比例，尤其是Vasa和EdU双阳性细胞的比例，因此添加1 μM褪黑素显著提升了精原细胞的增殖。图9的qPCR结果显示检测结果添加1 μM褪黑素，显著提升还提高细胞周期蛋白（cyclin A/B/D/E）和周期素依赖性蛋白激酶（cdk1/2/4）以及有丝分裂标记pcna的mRNA表达（图9中* p < 0.05, ** p < 0.01, ns为没有显著差异），这表明1 μM褪黑素能够加速中华乌塘鳢精原细胞的有丝分裂。
在褪黑素精子诱导培养基1持续培养4周后，收集细胞用于qPCR和流式细胞分析；图4的结果显示，在1 μM褪黑素暴露4周后，精子发生调控基因以及减数分裂标记基因显著上调，单倍体细胞的比例也提升到17.13%。
将培养产生的精子进行体外受精实验，结果发现进入卵裂期、体节期和孵化期的胚胎的比例分别提升至53.44±6.32%、43.19±4.87%和38.56±4.86%（见表1）。
实施例5
与实施例1不同的是，中华乌塘鳢精原细胞在褪黑素精子诱导培养基2中进行培养；其中褪黑素精子诱导培养基2的组成为精子诱导培养基1+ 0.1 μM褪黑素，每隔3天用新鲜的褪黑素诱导培养基2替换一半的培养基；其他步骤和实施例1相同。
此外，对精原细胞培养7天后，掺入EdU标记增殖的细胞；EdU掺入48 h后，收集细胞用于免疫荧光和qPCR分析。图7~8的结果显示，0.1 μM褪黑素也显著提升培养系统精原细胞的增殖。
在褪黑素精子诱导培养基2持续培养4周后，收集细胞用于qPCR和流式细胞分析；在0.1 μM褪黑素暴露下，精子发生调控基因以及减数分裂标记基因显著上调，单倍体细胞的比例也提升到15.20%。
将培养产生的精子进行体外受精实验，结果发现进入卵裂期、体节期和孵化期的胚胎的比例分别为43.53±5.12%、33.24±3.65%和29.34±5.43%（见表1）。
实施例6
与实施例1不同的是，中华乌塘鳢精原细胞在褪黑素精子诱导培养基3中进行培养；其中褪黑素精子诱导培养基3的组成为精子诱导培养基1+10 μM褪黑素，每隔3天用新鲜的褪黑素诱导培养基3替换一半的培养基；其他步骤和实施例1相同。
此外，对精原细胞培养7天后，掺入EdU标记增殖的细胞；EdU掺入48 h后，收集细胞用于免疫荧光和qPCR分析。图7~8的结果显示，10 μM褪黑素不仅显著提升培养系统精原细胞的增殖。
在褪黑素精子诱导培养基3持续培养4周后，收集细胞用于qPCR和流式细胞分析；在10 μM褪黑素暴露下，精子发生调控基因以及减数分裂标记基因显著上调，单倍体细胞的比例也提升到14.20%。
将培养产生的精子进行体外受精实验，结果发现进入卵裂期、体节期和孵化期的胚胎的比例分别为48.33±6.32%、36.44±5.12%和31.21±6.33%（见表1）。
对比例1
与实施例1不同的是，将精原细胞转移到24孔板（即2D）中，在基础精子培养基中进行培养。其他步骤和实施例1相同。
在2D培养不同时间后，从形态结构、基因表达和DNA组成等方面对培养的精原细胞进行分析：如图5（本对比例对应2D培养系统）所示，发现精原细胞难以在2D中贴壁生长，在培养2周后，仅有少量成纤维细胞生长出来，且在培养4周后，这些细胞难以维持增殖而消失。
收集培养四周后的细胞分别进行qPCR检测和流式细胞分析；图6的结果显示这些细胞中有没有单倍体细胞，减数分裂标记基因dmc1和acrosin基本不表达。
对比例2
与实施例1不同的是，将精原细胞转移到6.5 mm Transwell-COL中，在基础精子培养基中进行培养。其他步骤和实施例1相同。
在3D培养不同时间后，从形态结构、基因表达和DNA组成等方面对培养的精原细胞进行分析：如图5（本对比例对应3D培养系统）所示，与对比例1的2D培养相比，精原细胞在3D系统中可以较好的贴壁，并且聚集在一起，但是难以形成“圆形球块”。
收集培养四周后的细胞分别进行qPCR检测和流式细胞分析；图6的结果显示这些细胞中有没有单倍体细胞，减数分裂标记基因dmc1和acrosin基本不表达。
对比例3
与实施例1不同的是，将精原细胞转移到24孔板（即2D）中，在精子诱导培养基1中进行培养。其他步骤和实施例1相同。
在2D+Hor培养不同时间后，从形态结构、基因表达和DNA组成等方面对培养的精原细胞进行分析：如图5（本对比例对应2D+Hor培养系统）所示，与对比例1的2D培养相比，贴壁的细胞会更多；在2 WAC，精巢细胞聚集成团，其底部主要是成纤维状的体细胞；在3、4 WAC，细胞团并没有明显的增大，但是在细胞团的边缘出现较小的细胞。
收集培养四周后的细胞分别进行qPCR检测和流式细胞分析；图6的结果显示这些细胞中有4.08%的单倍体细胞，它们表达较高水平的减数分裂标记基因，dmc1和acrosin相对内参β-actin的水平分别为3.25和2.06。
对比例4
与实施例4不同的是，在褪黑素精子诱导培养基1中加入1 μM褪黑素受体抑制剂Luz得到褪黑素精子诱导培养基4，对中华乌塘鳢精原细胞进行培养；每隔3天用新鲜的褪黑素诱导培养基4替换一半的培养基；其他步骤和实施例4相同。
对精原细胞培养7天后，即在1 μM褪黑素和1 μMLuz共同暴露7天后，收集细胞用于免疫荧光和qPCR分析：图10的结果显示，与实施例4相比，对比例4的1 μM Luz显著降低了由于1 μM褪黑素所增加的vasa+细胞数量，同时也降低了细胞增殖标记基因cdk2、cyclin E和pcna表达水平表达。
在褪黑素精子诱导培养基4培养4周后，收集细胞用于qPCR和流式细胞分析；结果显示，1 μM Luz显著降低了vasa+细胞数量，显著抑制了由1 μM褪黑素导致的精子发生和减数分裂相关基因的上调，同时单倍体的比例也下降到9.46%。
将培养产生的精子进行体外受精实验，结果发现进入卵裂期、体节期和孵化期的胚胎的比例分别为40.51±4.29%、26.57±3.62%和23.26±3.91%（见表1）。
表1 不同精子或者培养细胞体外受精获得不同发育时期胚胎的统计结果
表1中新鲜精子的获得方法：在繁殖季节，选择健康的雄性肌肉注射13 μg/kg促黄体素释放激素（LHRHA2），避光催熟72 h后，肌肉注射5000 units/kg人绒毛膜促性腺激素（HCG）和13 μg/kg。在第二次肌肉注射48-60 h后，取出精巢组织，剪碎，加入2毫升生理盐水获得新鲜精子，避光保存在4℃备用。
从表1的结果来看，在实施例4~6中，添加褪黑素之后，进入卵裂期、体节期和孵化的胚胎的比例显著提升，表明褪黑素诱导产生的精子大大提高了培养精子的受精率和出膜率。在对比例4中，添加了褪黑素的抑制剂之后，显著抑制了褪黑素带来的这种提升效果。在对比例1和2中，没有检测到任何的单倍体（见图6），也就没有功能的精子产生。在对比例3中，由于其产生的单倍体的比例显著低于实施例1中精子诱导培养基1的结果，因此可以得知，其受精率也更低。
从图3可知，本发明的方法可以更高效的分离和鉴定中华乌塘鳢减数分裂前的精原细胞，得到的精原细胞的比例高达84.3%，显著高于此前发明人的公开专利CN112608887A方法所达到的74 .67％。
从图5和6可知，本发明提供的精子诱导培养基，相较于普通精子培养基，可以显著促进中华乌塘鳢减数分裂前的精原细胞形成“圆形球块”，并且进入减数分裂产生游动的精子。此外，本发明精子诱导培养基在2D培养系统中也能够诱导中华乌塘鳢减数分裂前的精原细胞产生精子，虽然其比例明显低于3D培养系统。
从图7和8可知，添加0.1~10μM的褪黑素均能够促进中华乌塘鳢减数分裂前的精原细胞的增殖，其中添加1微摩尔褪黑素的效果最佳。进一步结合对比例4中的添加褪黑素抑制剂的实验，进一步证实该结论。
从图11可知，添加1μM的褪黑素可以显著促进中华乌塘鳢减数分裂前的精原细胞进入精子发生和减数分裂最终产生精子，并且单倍体的精子比例从精子诱导培养1（实施例1）的8.39%提升到17.13%，而同时添加褪黑素抑制剂Luz后，单倍体的比例下降至9.46%。
综上所述，本发明从中华乌塘鳢减数分裂前的精原细胞的分离、培养、诱导产生功能的精子等3个方面进行了改进；特别是在普通精子培养基中添加性激素的基础上，再次增加褪黑素可以有效促进中华乌塘鳢减数分裂前的精原细胞的增殖和分化，进而提高具有功能精子的得率和保证受精率。因此，本发明填补了鱼类精原细胞体外培养产生可育精子领域的空白，有望成为一种新的鱼类种质的创制方法。
本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。本发明的上述实施例都只能认为是对本发明的说明而不是限制。因此凡是依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何细微修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
Claims (9)
1.一种3D体外培养中华乌塘鳢精原细胞产生功能精子的方法，其特征是，包括以下步骤：
（1）对分离的中华乌塘鳢精巢进行消毒、清洗、剪碎，然后加入精巢消化液进行消化，消化后的细胞经过滤网过滤去除未消化的细胞团，制得精巢单细胞悬液；然后精巢单细胞悬液加入percoll梯度溶液中，进行离心，分离得到精原细胞；所述percoll梯度溶液为由22~30%和35~45%两种浓度组成 percoll溶液；
（2）将精原细胞转移到3D培养皿中，用精子诱导培养基进行培养；所述精子诱导培养基包括基础精子培养基和性激素；所述性激素包括人绒毛膜促性腺激素、妊娠母马血清促性腺激素、11-酮睾酮、睾酮、17β-雌二醇和17α，20β-二羟基-4-孕3-酮。
2.根据权利要求1所述的3D体外培养中华乌塘鳢精原细胞产生功能精子的方法，其特征是，在基础培养基中添加的性激素，包括：5~20 U/ml人绒毛膜促性腺激素、5~20 IU/ml妊娠母马血清促性腺激素、50~200 ng/ml 11-酮睾酮、50~200 ng/ml睾酮、50~200 ng/ml 17β-雌二醇和20~70 ng/ml 17α，20β-二羟基-4-孕3-酮。
3.根据权利要求2所述的3D体外培养中华乌塘鳢精原细胞产生功能精子的方法，其特征是，在基础培养基中添加的性激素，包括：10 U/ml人绒毛膜促性腺激素、10 IU/ml妊娠母马血清促性腺激素、100 ng/ml 11-酮睾酮、100 ng/ml睾酮、100 ng/ml 17β-雌二醇和50ng/ml 17α，20β-二羟基-4-孕3-酮。
4.根据权利要求1-3任一项所述的3D体外培养中华乌塘鳢精原细胞产生功能精子的方法，其特征是，所述精子诱导培养基还包括褪黑素。
5.根据权利要求4所述的3D体外培养中华乌塘鳢精原细胞产生功能精子的方法，其特征是，所述褪黑素的添加量为0.1~10 μM。
6.根据权利要求5所述的3D体外培养中华乌塘鳢精原细胞产生功能精子的方法，其特征是，所述褪黑素的添加量为1μM。
7.根据权利要求6所述的3D体外培养中华乌塘鳢精原细胞产生功能精子的方法，其特征是，所述percoll梯度溶液的成分为25%和40% percoll溶液。
8.根据权利要求7所述的3D体外培养中华乌塘鳢精原细胞产生功能精子的方法，其特征是，所述步骤（2）进行精原细胞培养过程中，每隔3天更换一半新鲜的精子诱导培养基。
9.根据权利要求8所述的3D体外培养中华乌塘鳢精原细胞产生功能精子的方法，其特征是，所述精巢消化液由以下成分组成：L-15培养基、青霉素、链霉素、IV型胶原酶、胎牛血清、胰酶和DNA酶；所述基础精子培养基为在DMEM培养基中添加10%胎牛血清，2%鲈鱼血清，100 ng/ml 表皮生长因子，10 ng/ml 成纤维生长因子，100 ng/ml类胰岛素生长因子1和0.1 mM β-巯基乙醇。
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| CN114480262B (zh) | 2022-07-05 |
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