CN110684724A - 一种3d培养中华乌塘鳢精巢细胞产生精子的方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种3D培养中华乌塘鳢精巢细胞产生精子的方法，包括以下步骤：取出中华乌塘鳢雄鱼精巢，清洗、消毒和剪碎，将精巢碎块置于消化液中，在恒温水平摇床上进行消化，制备成精巢细胞悬液；经细胞网筛过滤去除未完全消化的组织或大的细胞团，将过滤后的细胞经Percoll梯度低速离心，收集低速离心纯化后的中华乌塘鳢精巢细胞；加入中华乌塘鳢精子培养基和添加蛋白质添加剂进行重悬，接种到3D细胞培养皿中培养；在3D培养过程中，利用免疫荧光检测其中的生殖细胞；每2‑5天更换一半新鲜精子培养基，统计精子数量，曙红Y染色检测培养精子的存活率；将3D培养产生的中华乌塘鳢精子与中华乌塘鳢成熟卵子进行体外受精，统计胚胎的受精率。

Description

一种3D培养中华乌塘鳢精巢细胞产生精子的方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是一种3D培养中华乌塘鳢精巢细胞产生精子的方法和应用。
背景技术
生殖细胞是动物体内唯一能够将携带的遗传物质传递给下一代的细胞。生殖细胞培养和体外诱导技术是生命科学的重要科学命题。近年来，在哺乳动物中，已经成功建立生殖细胞培养、诱导和分化的模型。通过体外培养和诱导，胚胎干细胞可以分化形成原始生殖细胞(PGC)。在特定条件下，PGC能够最终分化形成具备功能的单倍体配子细胞，即精子和卵子。建立生殖细胞体外培养诱导技术和方法，是一种研究生殖细胞形成、发育和分化的重要途径。而且，该技术诱导产生的功能性配子，对于具有生殖障碍和繁殖困难的个体或者群体的繁衍，例如：濒危动物和地理生殖隔离的群体等，具有重大意义。
鱼类是脊椎动物数量最多、种类最庞大的种群。鱼类养殖对世界食品特别是动物蛋白的持续供给做出了至关重要的贡献。我国是世界上最大的鱼类消费国家，伴随人民生活条件的改善，人民对优良的鱼产品需求急剧增加，现有的优良鱼产品的产量已逐渐无法满足需求，因此亟需进行优良鱼产品新品种的选育。然而，许多养殖鱼类存在性成熟时间长和配子获取困难等瓶颈。因此，建立生殖细胞体外培养体系，诱导产生功能性单倍体配子，是突破该瓶颈的一种重要手段。
中华乌塘鳢(Bostrychus sinensis，Chinese black sleeper)属塘鳢科乌塘鳢属，是东南亚和我国东南沿海分布较多的咸淡水鱼类。中华乌塘鳢具备成熟周期较短、生命力强、生长快、肉质鲜嫩、活体运输方便等特点，是值得我国大力发展的优良养殖对象。近年来，中华乌塘鳢的人工催产和育种技术逐渐完善。但是，在人工繁殖过程中，发现乌塘鳢的精液难以挤出，必须通过解剖雄鱼取出精巢，碾磨才能精液。该方法存在一些缺点，例如导致大量珍贵雄性亲本死亡、精子质量难以保证、中华乌塘鳢胚胎质量参差不齐。因此，建立中华乌塘鳢精巢细胞体外培养的方法和技术，产生具有功能的精子具有重要意义，并且该技术能够为其他鱼类生殖细胞培养提供重要借鉴。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种3D培养中华乌塘鳢精巢细胞产生精子的方法，该方法通过体外分离、消化、纯化、收集中华乌塘鳢精巢细胞，并且经过3D连续培养，最终产生大量具有功能性精子。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：一种3D培养中华乌塘鳢精巢细胞产生精子的方法，包括以下步骤：
(1)解剖中华乌塘鳢雄鱼，取出精巢，清洗、消毒和剪碎，将精巢碎块置于消化液中，在恒温水平摇床上进行消化，制备成精巢细胞悬液；
(2)将精巢细胞悬液经细胞网筛过滤去除未完全消化的组织或大的细胞团，将过滤后的细胞经Percoll梯度低速离心，收集低速离心纯化后的中华乌塘鳢精巢细胞；
(3)向低速离心纯化后的中华乌塘鳢精巢细胞中加入中华乌塘鳢精子培养基和添加蛋白质添加剂进行重悬，接种到3D细胞培养皿中培养；所述的3D培养使用3D嵌入式培养皿(Costar 3496)；
(4)在3D培养过程中，利用免疫荧光检测其中的生殖细胞；每2-5天更换一半新鲜精子培养基，统计总细胞和精子数量，曙红Y染色检测培养精子的存活率；
(5)将3D培养产生的中华乌塘鳢精子与中华乌塘鳢成熟卵子进行体外受精，统计胚胎的受精率。
步骤(1)中所述精巢碎块的体积约为0.5-1mm3。
步骤(1)中所述消化液为1-3mg/ml IV型胶原酶Hank’s溶液。
步骤(1)消化的条件是在恒温水平摇床上，在35-38℃摇床中以180-220转/分钟消化30-60分钟。
步骤(2)中所述细胞网筛直径为200目。
步骤(2)中所述的Percoll的两个梯度为20％和50％。
所述步骤(3)中3D细胞培养皿为12孔。
所述步骤(3)中的培养条件为：28℃下连续培养30天以上。
步骤(3)中所述蛋白质添加剂为中华乌塘鳢胚胎提取物、碱性成纤维细胞生长因子和鲈鱼血清。
本发明的目的之二在于将上述3D培养中华乌塘鳢精巢细胞产生精子的方法应用于中华乌塘鳢遗传育种。
本发明与现有技术相比，具有以下优点：
本发明通过解剖中华乌塘鳢精巢，剪碎、消化获得精巢细胞。经细胞网筛过滤获得单细胞悬液，进一步通过percoll密度梯度离心，纯化和富集精巢生殖细胞。与传统贴壁(2D)细胞培养不同，本发明将纯化的精巢细胞在精子培养基中28℃连续3D培养，并且每隔2-5天更换一半新鲜培养基，来维持3D培养足够的营养和生长因子。在连续3D培养的过程中，生殖细胞将聚集成细胞团，并且逐渐经过减数分裂产生大量成熟的精子，3D培养的精子具备活性能够应用于体外受精。综上所述，通过中华乌塘鳢精巢细胞3D培养，成功产生具有功能的精子，这为进一步阐明生殖细胞发育分化的分子机制提供了重要基础，为突破经济鱼类成熟周期长和配子获取困难的瓶颈提供重要途径。
附图说明
图1为中华乌塘鳢的精巢结构图片(A)以及精巢细胞消化后，经200目细胞网筛过滤后的细胞图片(B)；
图2为中华乌塘鳢精巢细胞经过Percoll梯度离心后，细胞在Percoll中分层的图片(A)以及在20％和50％Percoll交界处的细胞图片(B)；
图3为中华乌塘鳢精巢细胞在3D培养7天后形成的细胞团图片(A)以及培养28天形成的细胞团图片(B)；
图4为Vasa抗体染色检测3D培养产生的中华乌塘鳢精巢细胞团的白光图片(A)、利用Vasa抗体进行免疫荧光检测3D培养产生细胞团中生殖细胞图片(B)、DAPI染色培养细胞的细胞核图片(C)以及A、B、C三者叠加的图片(D)；
图5为新鲜中华乌塘鳢精子图(A)、体外3D培养产生的典型中华乌塘鳢精子图(B)、曙红Y染色体外培养产生的中华乌塘鳢精子图(C)以及白光和曙红Y染色叠加的图片(D)；
图6为3D培养不同时间产生的中华乌塘鳢精子数量统计结果；
图7为用3D培养产生的中华乌塘鳢精子进行人工授精，胚胎的受精率统计结果图(A)、采用新鲜精子进行人工授精产生的胚胎图片(B)以及3D培养产生的精子进行人工授精的胚胎图片(C)。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明的权利要求做进一步的详细说明，但不构成任何限定。
下述实施例中，中华乌塘鳢来自福建省漳州市东山县的养殖场；消毒液：1mg/ml二氯异氰尿酸钠(NaDcc)溶于PBS；精子培养基，是以DMEM(Dulbecco’s Modified EagleMedium)为基础培养基，添加多种非必须氨基酸，FBS等，辅以生长因子、中华乌塘鳢胚胎抽提物和鱼血清配制而成(见表1)；曙红Y，0.4mg/ml溶于水；Vasa抗体购置于abcam公司；细胞培养所需的培养基，非必需氨基酸等，均来自于invitrogen品牌；HEPES(Aisabio)；bFGF(Peprotech)；DAPI(Sigma)。
相关试剂配方：
1、磷酸盐缓冲液(PBS)：
磷酸二氢钾(KH2PO4)：0.24g，磷酸氢二钠(Na2HPO4)：1.44g，氯化钠(NaCl)：8g，氯化钾(KCl)：0.2g，溶于1L纯水，调pH至7.4。
2、消化液的配制：
50mL Hank’s平衡盐溶液中加入IV型胶原酶(BioFRox)100mg；Hank’s平衡盐溶液的配制：8g NaCl、0.126g Na2HPO4·12H2O、0.4g KCl、0.06g KH2PO4、0.098g MgSO4、0.14gCaCl2及0.35g NaHCO3，溶于1L水，0.22μm滤器过滤除菌；
3、Percoll分离液的配制：
100％Percoll储存液：9体积Percoll原液(GE公司)与1体积10×PBS充分混匀；50％Percoll工作液：100％Percoll储存液与等体积PBS混匀；20％Percoll工作液：1体积100％Percoll储存液与4体积PBS混匀；
表1精子培养基配方如下：
Figure BDA0002205649320000051
实施例1
1、中华乌塘鳢精巢的处理。
(1)选取成熟的中华乌塘鳢雄鱼，解剖取出精巢，置于无菌PBS中。
(2)清除精巢组织上的血块和其他杂质，并将精巢转入新的无菌PBS中，清洗2次。
(3)将上述精巢转移至消毒液中，浸泡消毒60秒。
(4)将消毒后的精巢转入无菌PBS中，清洗2分钟2次，去除残留消毒液。
(5)利用眼科剪刀将精巢剪碎，成为1mm3大小的精巢碎块。
(6)在1mm3大小的精巢碎块中，加入1mL无菌PBS，轻轻吹打重悬，静置2min后，待精巢组织块沉底将上层悬浊液弃掉。重复该步骤3-5次，直至液体清澈。
2、中华乌塘鳢精巢单细胞悬液制备：
(1)在上述精巢组织块中加入1mL消化液，轻轻吹打混匀，在37℃摇床中(200转/分钟)消化30-60分钟，消化液变浑浊且无明显组织块，即可停止消化。
(2)将精巢细胞消化液经过200目细胞网筛过滤，除去大型细胞团和残余的组织，收集滤下的细胞悬浊液，转入新的无菌1mL的EP管中。
(3)将收集的细胞悬浊液室温低速离心，2000转/分钟，10分钟，离心管底部可见明显沉淀，且溶液变清澈，弃掉大部分上清溶液。重复该步骤2次。
3、中华乌塘鳢精巢细胞梯度分离和收集：
(1)在步骤2管底中的精巢细胞中，加入1mL精子培养基轻轻吹打重悬，成为单细胞悬液。
(2)分别配制3mL 20％和50％Percoll溶液，小心加入15ml离心管中，形成Percoll梯度溶液；将精巢单细胞悬液，沿管壁缓慢加到Percoll梯度溶液的表层，将其在水平离心机中低速离心(1500转/分钟)20分钟。
(3)吸取20％和50％Percoll交界处的精巢细胞层，加入适当精子细胞培养基重悬，低速(2000转/分钟)离心5分钟，将精巢细胞沉淀至管底，弃掉大部分上清溶液。
4、中华乌塘鳢精巢细胞体外培养：
(1)在步骤3中收集到的中华乌塘鳢精巢细胞团中，加入适量体积的精子细胞培养基，轻轻吹打重悬，成单细胞溶液。
(2)取10微升精巢细胞悬液，利用血细胞计数板镜检，统计精巢细胞的数量。
(3)将中华乌塘鳢精巢细胞以3*105/孔的量，接种到12孔的3D嵌入式培养皿(Costar 3496)中，在28℃细胞培养箱中培养30天以上。
(4)在连续3D培养中华乌塘鳢精巢细胞的过程中，每隔3天，用新鲜的培养基更换一半培养基。
(5)在3D培养过程中，用生殖细胞特异基因Vasa的抗体进行免疫荧光染色，检测培养细胞中生殖细胞的状况；并且每隔3天，将细胞吹打成单细胞，统计精子细胞的数量。
5、体外培养中华乌塘鳢精子活性和体外受精能力检测：
(1)将连续3D培养30天的中华乌塘鳢细胞，轻轻吹打均匀，形成单细胞悬液，吸出部分细胞，用曙红Y染色，镜检，统计活细胞所占比例。
(2)收集3D培养的中华乌塘鳢精子，同时以碾磨中华乌塘鳢精巢获得的新鲜精子作为对照，将二者分别与成熟卵子进行体外受精，在受精后6小时统计正常发育胚胎的比例，计算受精率。
细胞生物学分析
1、中华乌塘鳢成熟精巢组织形态分析
在中华乌塘鳢繁殖季节，选取生殖乳突修长的雄鱼个体，解剖获得精巢，放置在4％多聚甲醛中，4℃固定过夜。然后精巢组织块经过乙醇梯度脱水，石蜡包埋切片，厚度为4微米。石蜡切片经过二甲苯脱蜡，乙醇梯度复水后，利用苏木精-伊红染色，镜检。成熟中华乌塘鳢精巢的结构如图1A所示，该时期的精巢以精子为主，但是依然有较多的精原细胞、初级精母细胞和次级精母细胞等精巢生殖细胞。将成熟中华乌塘鳢精巢经过消毒、剪碎、消化、细胞网筛过滤等步骤(见上步骤1和2)，取10微升过滤后的精巢细胞，镜检。结果如图1B所示，精巢细胞悬液中基本为单细胞，并且以精子为主(黑色指头指示)，但是依然有少部分精巢生殖细胞等其他细胞(白色箭头指示)。
2、体外培养中华乌塘鳢精巢细胞生殖细胞特性分析
将上述初步消化和过滤获得的精巢细胞，进一步通过Percoll梯度离心，将不同大小和沉降系数的细胞进行进一步分离和富集，具体操作就步骤3。结果如图2A所示，经过低速离心后，精巢细胞主要分为四个部分，培养基层，20％Percoll，50％Percoll以及管底的细胞或碎片沉淀。我们收集了20％和50％Percoll交界处的细胞层，如图2B所以，该细胞层主要为的生精细胞和体细胞。
经过细胞计数后，我们将纯化获得的精巢细胞用适量的精子培养基稀释，按照3*105个细胞/孔的量接种到嵌入式3D培养皿(12孔板)中，在恒温细胞培养箱中28℃培养。我们发现在3D培养7天后，细胞会逐渐聚集形成细胞团(图3A)，并且细胞团会随着培养时间的延长逐渐增大(图3B)。这种细胞聚集成细胞团增殖的方式，是生殖干细胞的典型的特征之一。接下来，为了检验这些细胞团是否具备生殖细胞的特征，我们利用生殖细胞特异标记基因Vasa的抗体来进行免疫荧光检测。结果如图4所示，细胞团中有非常多Vasa阳性的细胞(图4B绿色标记)，这表明培养的精巢细胞中有很多生殖细胞。
免疫荧光的步骤如下：
(1)PBS清洗中华乌塘鳢精巢细胞团用5分钟2次；
(2)4％多聚甲醛室温固定细胞团10分钟；
(3)PBS清洗5分钟3次，去除残余的多聚甲醛；
(4)5％脱脂奶粉室温封闭细胞团1小时；
(5)VASA抗体按1:400稀释到1％脱脂牛奶溶液，4℃一抗结合过夜；
(6)第二天，用0.1％Tween-20 PBS溶液清洗10分钟3次；
(7)PBS清洗10分钟3次；
(8)用2％羊血清PBS溶液，室温封闭20分钟；
(9)荧光二抗显色和细胞核复染显色，将荧光二抗[羊抗兔IgG(H+L)Alex488]按照1:400稀释，同时DAPI按照1:1000稀释至2％羊血清PBS溶液中，避光室温显色60分钟；
(10)PBS清洗10分钟4次；
(11)抗荧光淬灭机封片，镜检，用ZESIS880激光共聚焦拍照。
3、3D培养产生精子的数量分析
在3D连续培养中华乌塘鳢精巢细胞的过程中，我们每隔3天用新鲜的培养基替换旧的培养基来维持中华乌塘鳢精巢细胞的生长。在每次更换培养基的过程中，我们会将细胞团吹打形成单细胞，镜检和统计细胞数量。如图5B所示，3D培养能够产生具有鞭毛的精子，说明培养的细胞已经完成了变态发育。与正常乌塘鳢的精子相比(图5A)，3D培养产生的精子鞭毛较短。曙红Y是一种只能让死细胞着红色荧光的荧光染料。我们利用曙红Y染色分析3D培养产生中华乌塘鳢精子的存活比例。结果如图5C所示，3D培养的精巢细胞中极少数非精子的细胞能够被曙红Y染色，表明3D培养产生的精子细胞的存活率很高。
接下来，我们统计了在3D连续培养中华乌塘鳢精巢细胞过程中，中华乌塘鳢精子细胞从什么时候开始出现及其数量变化。结果如图6所示，在3D培养的前6天，仅有少量的精子，但是从培养9天后，精子细胞的数量开始增加，从培养12天后，精子细胞的数量快速增加。在3D培养过程中，中华乌塘鳢精子细胞开始增加的时间(培养9天后)与培养细胞成团的时间(培养7天后)较为一致。因此，我们可以推断，在细胞成团之后，才开始减数分裂产生精子。
4、3D培养产生的中华乌塘鳢精子的体外受精活性检测
3D培养中华乌塘鳢精巢细胞能够诱导产生精子，那么这些精子是否具有功能，即他们能否在体外与成熟的卵子结合产生新的个体呢？为了证实这一点，我们将正常的新鲜精子和3D培养精巢细胞30天产生的精子，分别与成熟的中华乌塘鳢卵子进行体外受精，随后统计受精率以及胚胎发育是否正常。结果如图7A所示，新鲜中华乌塘鳢精子的受精率71.2％(1023/1437)，而3D培养产生的中华乌塘鳢精子的受精率仅为25.6％(102/400)。但是，与由新鲜精子受精产生的胚胎相比(图7B)，由3D培养产生的精子受精产生的胚胎发育(图7C)没有明显异常。因此，3D培养产生的中华乌塘鳢精子能够用于体外受精，尽管3D培养产生的精子受精率低一些。这表明，3D培养中华乌塘鳢精巢细胞产生的精子具有完整的生物学功能和活性。
鱼类生殖细胞培养和诱导属于世界前沿科学问题，在海水养殖鱼类中，体外培养诱导产生具备功能的精子的成功案例极少。我们成功利用3D连续培养中华乌塘鳢精巢细胞，产生具有功能的精子。我们的方法在其他成熟周期长和配子获取困难的经济鱼类中具有良好的应用前景。该技术有可能突破鱼类生殖细胞培养和诱导的技术瓶颈，并且为鱼类优良种质创制和遗传育种提供必要的理论和技术依据。

Claims (10)

1.一种3D培养中华乌塘鳢精巢细胞产生精子的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)解剖中华乌塘鳢雄鱼，取出精巢，清洗、消毒和剪碎，将精巢碎块置于消化液中，在恒温水平摇床上进行消化，制备成精巢细胞悬液；
(2)将精巢细胞悬液经细胞网筛过滤去除未完全消化的组织或大的细胞团，将过滤后的细胞经Percoll梯度低速离心，收集低速离心纯化后的中华乌塘鳢精巢细胞；
(3)向低速离心纯化后的中华乌塘鳢精巢细胞中加入中华乌塘鳢精子培养基和添加蛋白质添加剂进行重悬，接种到3D细胞培养皿中培养；
(4)在3D培养过程中，利用免疫荧光检测其中的生殖细胞；每2-5天更换一半新鲜精子培养基，统计精子数量，曙红Y染色检测培养精子的存活率；
(5)将3D培养产生的中华乌塘鳢精子与中华乌塘鳢成熟卵子进行体外受精，统计胚胎的受精率。
2.根据权利要求1所述的3D培养中华乌塘鳢精巢细胞产生精子的方法，其特征在于，步骤(1)中所述精巢碎块的体积约为0.5-1.5mm3。
3.根据权利要求1所述的3D培养中华乌塘鳢精巢细胞产生精子的方法，其特征在于，步骤(1)中所述消化液为1-3mg/ml IV型胶原酶Hank’s溶液。
4.根据权利要求1所述的3D培养中华乌塘鳢精巢细胞产生精子的方法，其特征在于，步骤(1)消化的条件是在恒温水平摇床上，在37℃摇床中以180-220转/分钟消化30-60分钟。
5.根据权利要求1所述的3D培养中华乌塘鳢精巢细胞产生精子的方法，其特征在于，步骤(2)中所述细胞网筛直径为200目。
6.根据权利要求1所述的3D培养中华乌塘鳢精巢细胞产生精子的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的Percoll的两个梯度为20％和50％。
7.根据权利要求1所述的3D培养中华乌塘鳢精巢细胞产生精子的方法，其特征在于，所述步骤(3)中3D细胞培养皿为12孔。
8.根据权利要求1所述的3D培养中华乌塘鳢精巢细胞产生精子的方法，其特征在于，所述步骤(3)中的培养条件为：28℃下连续培养30天以上。
9.根据权利要求1所述的3D培养中华乌塘鳢精巢细胞产生精子的方法，其特征在于，步骤(3)中所述蛋白质添加剂为中华乌塘鳢胚胎提取物、碱性成纤维细胞生长因子和鲈鱼血清。
10.一种如权利要求1-9中任一所述3D培养中华乌塘鳢精巢细胞产生精子的方法应用于中华乌塘鳢遗传育种。
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