CN112251399B - 一种用于黄鳝生殖干细胞的分离方法及培养基 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于黄鳝生殖干细胞的培养基，包括基础培养基和FBS，所述FBS的浓度为5‑8％；还涉及一种用于分离培养黄鳝生殖干细胞的方法，包括使用上述所述的培养基培养所述黄鳝生殖干细胞的步骤。本发明的培养基可提高黄鳝生殖干细胞的贴壁效率，防止黄鳝生殖干细胞分化，不影响黄鳝生殖干细胞的增殖功能。通过本发明的方法，可使用黄鳝的性腺组织在5天内分离获得纯度较高的黄鳝雌性生殖干细胞和雄性生殖干细胞。得到的生殖干细胞具有典型的干细胞形态，可形成典型的干细胞克隆，碱性磷酸酶染色呈阳性，干细胞相关分子标记也高表达。在将本发明的方法获得的生殖干细胞冻存后，可成功复苏。

Description

一种用于黄鳝生殖干细胞的分离方法及培养基

技术领域

本发明涉及经济鱼类育种领域，更特别地，涉及一种用于黄鳝生殖干细胞的分离方法及培养基。

背景技术

生殖干细胞是在动物的种系维持中唯一能将遗传物质传递给后代的种子细胞，具有我更新功能和分化多能性。生殖干细胞的研究对动物遗传育种、珍惜物种保护至关重要。

生殖干细胞的分离、诱导分化及相关操作技术成为干细胞研究领域的热点。鱼类干细胞的研究工作起步虽然较晚，但是已经有了长足。目前，国内外学者已经成功建立了多个鱼类的胚胎干细胞系和生殖干细胞系。体外培养获得的虹鳟和青鱂PGC，能够在同源受体性腺移植并成功发育。随后，又建立了一些国内外主要水产经济鱼类的种内和种间生殖细胞的移植技术。这项技术的突破使鱼类的“借腹生子”成为可能。

黄鳝作为我国重要的经济食用鱼类，野生黄鳝被大量毁灭性捕捞，数量日渐减少。因其特殊的生活方式和产卵习性，黄鳝面临着种质资源衰退和优良苗种短缺的严峻问题。传统的黄鳝育种又是一个极其缓慢的过程，因此，如何获得大量优质的黄鳝种苗一直是目前科研工作者亟待解决的问题。肖亚梅等尝试通过分离组织块的方法，培养黄鳝成体性腺组织干细胞，但是该方法培养周期长，且获得的生殖干细胞是一种混合型的细胞。

因此，如何通过优化分离方法和培养体系，建立较为完善的黄鳝类生殖细胞培养体系，是本领域亟待解决的技术难点。

发明内容

为解决以上问题，本发明提供了一种用于黄鳝生殖干细胞的培养基，包括基础培养基和FBS，所述FBS的浓度为5-8％。使用该浓度的FBS可提高黄鳝生殖干细胞的贴壁后的增殖能力，防止黄鳝生殖干细胞分化，不影响黄鳝生殖干细胞的增殖功能。

在一个具体实施方案中，所述基础培养基为RPMI 1640和/或DMEM/F12。尽管本发明在实施例中列举了RPMI 1640为例子对本发明的原理和效果进行展示，但是实现本发明使用的基础培养基还可以用其他培养基，例如DMEM/F12等，只要满足干细胞的基本培养要求即可。在我们的研究中使用DMEM/F12替代RPMI 1640，得到了类似的结果。

在一个优选实施方案中，所述培养基还包括1-5％的KSR和/或1-5％的黄鳝血清。培养基中添加了KSR和黄鳝血清后，有利于多能干细胞干性的维持，生殖干细胞具有更快的增殖速度，并且呈现典型的干细胞形态。

在一个优选实施方案中，所述培养基还包括生长因子。

优选地，所述生长因子为bFGF和/或EGF。bFGF的浓度可为5-15ng/ml，EGF的浓度可为10-30ng/ml。通过添加生长因子，可促进细胞增殖。

在一个优选实施方案中，所述培养基还包括缓冲剂、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺和β-巯基乙醇中的一种或多种组合。

在一个具体实施方案中，所述培养基中含有0.5-2mM丙酮酸钠，1-4mM L-谷氨酰胺，10-100μMβ-巯基乙醇，10-20mM Hepes。

其中，HEPES主要是起缓冲作用。β-巯基乙醇对细胞生长有很重要的作用，使血清中含硫的化合物还原成谷胱甘肽,能诱导细胞的增殖,为非特异性的激活作用，并且还可以还原细胞代谢时产生的过氧化物，避免过氧化物对培养细胞的损害，让细胞不容易凋亡。丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源,尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源,但是,如果没有葡萄糖的话,细胞也可以代谢丙酮酸钠。L－谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。

本发明还提供了一种用于分离培养黄鳝生殖干细胞的方法，包括上述培养基培养所述黄鳝生殖干细胞的步骤。

在一个优选实施方案中，所述方法包括以下步骤：

S1：从黄鳝分离性腺组织；

S2：消化所述性腺组织，获得游离细胞；

S3：使用所述培养基培养所述游离细胞，使所述游离细胞中的黄鳝生殖干细胞贴壁和扩增，弃去液体即得到分离的所述黄鳝生殖干细胞。

通过本发明的方法，可使用黄鳝的性腺组织在5天内分离获得纯度较高的黄鳝雌性生殖干细胞(fGSCs)和雄性生殖干细胞(mGSCs)。得到的生殖干细胞具有典型的干细胞形态，可形成典型的干细胞克隆，碱性磷酸酶染色呈阳性，干细胞相关分子标记也高表达。在将本发明的方法获得的生殖干细胞冻存后，可成功复苏。

在一个优选实施方案中，S2包括以下步骤：

S21：使用胰蛋白酶消化所述性腺组织，离心取沉淀，为消化产物；

S22：将所述消化产物重悬，用40μm的细胞筛过滤，取滤液，离心沉淀重悬后得到所述游离细胞。

优选地，S21中，消化于室温振荡环境下进行，消化20-30min。

通过消化和过滤，大大提高了分离培养生殖干细胞的成功率，大大降低了干细胞在培养过程中分化的概率。我们推测，该操作可能能够提高游离的生殖干细胞的比率，并且去除了性腺组织中可能存在的能够诱导生殖干细胞分化的因子或细胞。

在一个优选实施方案中，S3包括以下步骤：

S31：将所述游离细胞加入到装有所述培养基的培养容器中，于28±0.5℃下,5％CO₂下静置培养；

S32：培养60-84h后，更换新鲜的所述培养基；

S33：每48h更换一次新鲜的所述培养基，直至适当的细胞汇合度，弃去液体即得到分离的所述黄鳝生殖干细胞。

在一个优选实施方案中，S31中，培养时根据情况补充新鲜的所述培养基。

我们在培养过程中还发现，黄鳝生殖干细胞的贴壁速度较慢，分离24h后，只有少量生殖干细胞贴壁，并且雄性生殖干细胞的贴壁速度比雌性生殖干细胞更慢，贴壁的细胞更少。我们延长了初次更换培养基之前的培养时间，在培养60-84h后才第一次更换新鲜培养基，期间仅仅往细胞培养物中补充新鲜培养基，以弥补营养物损失和蒸发损失。该操作大大提高了黄鳝生殖干细胞的贴壁率，减少了黄鳝生殖干细胞的损失。

附图说明

图1为用含有不同浓度的FBS的培养基培养的黄鳝雄性性腺分离细胞的光学显微镜照片。

图2为黄鳝卵巢(左)和精巢(右)细胞初分离时的细胞形态图。红色箭头表示分离出的生殖干细胞，白色箭头表示红细胞。显微镜200倍。

图3为经过滤和未经过滤的雄性性腺分离细胞培养后的光学显微镜照片。

图4为黄鳝卵巢(上)和精巢(下)细胞分离后培养不同时间的细胞形态图。红色箭头表示分离出的贴壁的精巢干细胞。显微镜100倍。

图5为分离培养5天黄鳝fGSCs(a)和mGSCs(b)形成的克隆形态图。C和d分别为fGSCs和mGSCs碱性磷酸酶染色图。显微镜100倍。

图6为黄鳝卵巢(上)和精巢(下)细胞分离培养7天后免疫荧光检测Vasa结果图。

图7为黄鳝不同组织和培养7天后雌性(fGSCs)和雄性(mGSCs)生殖干细胞RT-PCR鉴定分析结果图。

图8为分离培养15天黄鳝fGSCs冻存3周后复苏的形态图。复苏后24小时(a)、48小时(b)白光图以及72小时(c)吉姆萨染色图。显微镜100倍。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

1、黄鳝生殖干细胞培养基的配制

黄鳝生殖干细胞的分离培养过程中，培养基的优化至关重要。经过反复试验，我们意外地发现，与其他鱼类生殖干细胞不同，黄鳝生殖干细胞对FBS的浓度特别敏感，当FBS浓度较高时，培养的黄鳝生殖干细胞容易发生分化，导致贴壁后增殖能力差。如图1所示，分别使用含有5％和15％FBS的培养基培养相同浓度的黄鳝生殖干细胞，结果显示，黄鳝生殖干细胞对FBS的浓度特别敏感，当FBS浓度为15％时，培养的黄鳝生殖干细胞容易发生分化，导致贴壁后增殖能力差，细胞状态也不健康。当将FBS浓度降到低于8％(浓度为5％效果最佳)，黄鳝生殖干细胞的贴壁率和增殖力都大幅提高，并且，能保持干细胞多能性。

为了保证黄鳝生殖干细胞的增殖能力和多能性，我们优化了FBS浓度，并增加了一些其他成分，以提高成功率。培养基中均加有抗生素以防止感染。

表1培养基组成

2、黄鳝生殖干细胞的分离培养

从水产市场购买活力好的雌性黄鳝和雄性黄鳝，暂养于含双抗(10mg/mL链霉素和10U/mL青霉素)的养殖水中，用于后续实验。实验中用到的所有解剖用具都经高温灭菌消毒。解剖前，解剖台和解剖盘用酒精杀毒灭菌。同时准备好75％的酒精棉球和喷壶。

1)分离性腺：先将黄鳝置于冰水中10-15分钟使其昏迷，取出昏迷的黄鳝，用75％的酒精喷洒体表。酒精棉球擦拭泄殖孔附近皮肤，用直头眼科剪剪开腹腔，用眼科镊和眼科剪分离出性腺，将所有分离的性腺转移到装满DPBS无菌培养皿中，冰上放置。后续实验在超净台上进行。

2)性腺破碎：分离好的性腺用DPBS漂洗1次，除去浮在表面多余的血液和组织，然后将性腺转移到新的培养皿中。在体视显微镜下，用5号瑞士镊子撕掉表面的血液、脂肪和结缔组织。接着继续用镊子撕开性腺，尽可能的撕掉里面的卵细胞。经初步处理的性腺继续转移到新的无菌培养皿中，DPBS漂洗一次之后继续转移到新的培养皿中。接着用5号镊子和维纳斯眼科剪将性腺组织尽可能的剪成1mm³的组织块，用灭菌的玻璃吸管将组织块收集到15ml离心管中，1000g离心2分钟，沉淀用DPBS漂洗2次。最后一次尽可能的除去多余的DPBS。

3)组织消化：向沉淀中加入Tryple Express(Gibco,#12604021)，一般组织与Tryple Express体积比为1：3。充分摇匀后放在水平360°摇床上中速摇晃，室温消化20-30分钟。消化时间根据组织量的多少而定，组织越多，时间相对加长。最后加入10％的FBS(TransGen Biotech,#FS101-02)终止消化。1500g离心3分钟，收集沉淀。

4)细胞过滤与收集：用10mL DPBS或新鲜培养基重悬细胞，消化后的产物用40μm的细胞筛过滤，除去大块的组织，收集所有的滤液。1500g离心3分钟，收集细胞用新鲜的培养基重悬浮。如图2所示，获得的细胞属于混合物，包括成纤维细胞、血细胞和生殖干细胞。

以上过程中，在必要的步骤和溶剂里面加有抗生素以防止污染。

如图3所示，有消化和过滤步骤的细胞在培养6天后，干细胞贴壁率和增殖能力都大大提高，呈现典型的干细胞克隆形态。没有经过消化和过滤步骤的细胞在培养6天后，视野中的绝大部分细胞都分化成为类神经细胞。可见，上述消化和过滤步骤大大提高了干细胞增殖能力，并且保持了干细胞的多能性。

5)铺板：一般用12孔板或者6孔板培养。所有的培养板提前用0.1％Gelatin(Millipore，#ES-006-B)处理至少半小时。去掉Gelatin后，12孔板中每孔加入1ml培养基，6孔板中加入3ml培养基。将细胞悬液分别加入到培养板中，轻轻混匀后，置于细胞培养箱中静置培养，培养条件为28±0.5℃，5％CO₂。

6)细胞原代培养：在培养过程中，我们尝试了不同的培养基(实施例1-3和对比例)之后，发现使用对比例的培养基培养的生殖干细胞极易发生分化，并且在贴壁后增殖能力差。而使用实施例1-3的培养基培养的生殖干细胞能够使分离的黄鳝生殖干细胞保持多能性，并且提高细胞贴壁的效率，以及贴壁后细胞的增殖能力。以下以实施例3的培养基作为举例。需要说明的是，尽管下文列举实施例3的培养基作为举例来说明本发明的原理和效果，但是，本发明的范围不限于实施例3，凡在本发明的精神和原则下做出的任何修改、等同替换和改进，均应落在本发明的保护范围内。

此外，我们在培养过程中还发现，生殖干细胞的贴壁速度较慢，分离24h后，只有少量生殖干细胞贴壁，并且雄性生殖干细胞的贴壁速度比雌性生殖干细胞更慢，贴壁的细胞更少(图4)。因此，为了让更多生殖干细胞贴壁，我们延长了初次更换培养基之前的培养时间，在培养60-84h后才第一次更换新鲜培养基，之前仅仅往细胞培养物中补充新鲜培养基，以弥补营养物损失和蒸发损失。第一次更换培养基后，每48h更换一次培养基。直至细胞丰度达到90％。使用实施例3的培养基，雌性生殖干细胞(fGSC)培养第5天左右汇合度达到90％，雄性生殖干细胞(mGSC)第7天左右汇合度达到90％。在形态上，fGSCs的形态呈卵圆形，核质比大，细胞内可见单核或者双核。而mGSCs的形态呈长梭形，和成纤维细胞形态相近。

如图5所示，与哺乳动物的干细胞类似，我们分离培养的细胞在培养的过程中也是聚集生长，在第5天的时候fGSCs和mGSCs均能形成典型的干细胞克隆。碱性磷酸酶染色结果显示fGSCs和mGSCs形成的克隆呈阳性反应。这个结果初步说明我们获得细胞具有干细胞的特性。

对上述方法获得的fGSCs和mGSCs进行干细胞相关基因检测，结果如图6和7所示，在获得的fGSCs和mGSCs中，Vasa蛋白和干性关键基因klf4均高表达，体现了典型的生殖干细胞特点。

7)传代培养：弃掉培养基，细胞用DPBS冲洗一次，加入0.25％Trypsin(BI)，室温下消化1-2分钟。收集细胞悬液，1500g离心3分钟。一般按照1：3的比例传代。平均4-5天传代一次。

8)细胞冻存：收集细胞之前配制好细胞冻存液A：90％FBS，10％DMSO。用0.25％Trypsin(BI)消化细胞，离心后，尽可能去掉上清，收集细胞沉淀。细胞用冻存液A重悬浮，轻轻吹打均匀后，置于细胞冻存盒，-80℃冻存24小时，随后转移到液氮中保存。

9)细胞复苏：冻存后，取出液氮中的细胞，37℃水浴冻融。离心后的沉淀用培养基重悬浮，轻轻吹打均匀后，加入到6孔板中静置培养。

我们尝试将培养15天的fGSCs进行冻存，并在3周后进行复苏，复苏后的生殖干细胞具有良好的贴壁率和增殖能力，并且保持多能干细胞的干性，获得状态良好的fGSCs(图8)。这个结果说明，我们可以在后期随时将冻存的fGSCs复苏，直接用于移植或诱导分化，这将为打破传统黄鳝育种提供一种更加快捷的方式。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种用于分离培养黄鳝生殖干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：从黄鳝分离性腺组织；

S2：消化所述性腺组织，获得游离细胞；

S3：使用黄鳝生殖干细胞培养基培养所述游离细胞，使所述游离细胞中的黄鳝生殖干细胞贴壁和扩增，弃去液体即得到分离的所述黄鳝生殖干细胞；

所述黄鳝生殖干细胞培养基包括基础培养基和FBS，所述FBS的浓度为5-8%，所述基础培养基为RPMI1640；

所述黄鳝生殖干细胞培养基包还包括1-5%的KSR、1-5%的黄鳝血清、0.5-2 mM丙酮酸钠、1-4 mM L-谷氨酰胺、10-100 μM β-巯基乙醇、10-20 mM Hepes、5-30 ng bFGF和5-20ng EGF；

S2包括以下步骤：

S21：使用胰蛋白酶消化所述性腺组织，离心取沉淀，为消化产物；

S22：将所述消化产物重悬，用40 μm的细胞筛过滤，取滤液，离心沉淀重悬后得到所述游离细胞；

S3包括以下步骤：

S31：将所述游离细胞加入到装有所述培养基的培养容器中，于28±0.5℃下,5% CO₂下静置培养；

S32：培养60-84 h后，更换新鲜的所述培养基；

S33：每48 h更换一次新鲜的所述培养基，直至适当的细胞汇合度，弃去液体即得到分离的所述黄鳝生殖干细胞。

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