CN103820383A

CN103820383A - 一种巴马小型猪精原干细胞诱导精子细胞的方法

Info

Publication number: CN103820383A
Application number: CN201410024686.8A
Authority: CN
Inventors: 赵会敏; 卢克焕; 卢盛晟; 陆阳清; 杨小淦; 杨欢; 李敏霞; 张飒
Original assignee: Guangxi University
Current assignee: Guangxi University
Priority date: 2014-03-31
Filing date: 2014-03-31
Publication date: 2014-05-28
Anticipated expiration: 2034-03-31
Also published as: CN103820383B

Abstract

本发明涉及一种巴马小型猪精原干细胞诱导精子细胞的方法，属于干细胞生物工程。本发明公开一种巴马小型猪精原干细胞诱导精子细胞的方法，包括配制培养基、制作STO饲养层、精原干细胞诱导精子细胞、精子细胞鉴定四个步骤，所述配制培养基包括配制STO培养液和精原干细胞培养液，STO培养液由基础培养基DMEM/F12、FBS、β-巯基乙醇、丙酮酸钠、青霉素、链霉素组成；精原干细胞培养液由基础培养基DMEM/F12、BSA、丙酮酸钠、B27添加物、GDNF、bFGF、GFRα1、β-巯基乙醇、青霉素、链霉素组成。本发明应用对象是猪，和已有的技术方案应用对象不同，扩大了科研范围。

Description

一种巴马小型猪精原干细胞诱导精子细胞的方法

技术领域

本发明涉及一种巴马小型猪精原干细胞诱导精子细胞的方法，属于干细胞生物工程。

背景技术

2002年，Li-Xin Feng等利用干细胞因子（stem cell factor）诱导小鼠精原干细胞产生了精子细胞（Feng LX,Chen Y,Dettin L,Pera RA,Herr JC,GoldbergE,et al.Generation and in vitro differentiation of a spermatogonial cell line.Science.2002Jul19;297(5580):392-5）；2003年，Fariborz Izadyar等将牛的A型精原细胞在体外长期培养，诱导出精子细胞（Izadyar F,Den Ouden K,Creemers LB,Posthuma G,Parvinen M,De Rooij DG.Proliferation anddifferentiation of bovine type A spermatogonia during long-term culture.BiolReprod.2003Jan;68(1):272-81.）；2006年，Jae Ho Lee等将大鼠睾丸细胞在用胶原制作的三维培养基中培养，组织可以进行精子发生（Lee JH,Kim HJ,KimH,Lee SJ,Gye MC.In vitro spermatogenesis by three-dimensional culture of rattesticular cells in collagen gel matrix.Biomaterials.2006May;27(14):2845-53.）；2006年，Karim Nayernia等利用小鼠的胚胎干细胞诱导出雄性单倍体细胞（Nayernia K,Nolte J,Michelmann HW,Lee JH,Rathsack K,Drusenheimer N,etal.In vitro-differentiated embryonic stem cells give rise to male gametes that cangenerate offspring mice.Dev Cell.2006Jul;11(1):125-32.）；2006年，Dong RyulLee等从精子活力缺乏病人的睾丸中分离出类精原干细胞，在维甲酸、睾酮和促卵泡素的作用下诱导出了精子细胞（Lee DR,Kim KS,Yang YH,Oh HS,LeeSH,Chung TG,et al.Isolation of male germ stem cell-like cells from testiculartissue of non-obstructive azoospermic patients and differentiation into haploidmale germ cells in vitro.Hum Reprod.2006Feb;21(2):471-6.）；2011年，Sato,Takuya等在琼脂糖凝胶块上培养新生小鼠的睾丸组织，并产生了精子（Sato T,Katagiri K,Gohbara A,Inoue K,Ogonuki N,Ogura A,et al.In vitro production offunctional sperm in cultured neonatal mouse testes.Nature.2011Mar24;471(7339):504-7.）。现有的技术多是针对小鼠、牛和人，没有发现从猪的精原干细胞中诱导出精子细胞。

发明内容

本发明的目的在于提供一种巴马小型猪精原干细胞诱导精子细胞的方法，通过精原干细胞在体外扩增、诱导出精子细胞。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

一种巴马小型猪精原干细胞诱导精子细胞的方法，包括配制培养基、制作STO饲养层、精原干细胞诱导精子细胞、精子细胞鉴定四个步骤，其中：所述配制培养基包括配制STO培养液和精原干细胞培养液，STO培养液由基础培养基DMEM/F12、FBS、β-巯基乙醇、丙酮酸钠、青霉素、链霉素组成；精原干细胞培养液由基础培养基DMEM/F12、BSA、丙酮酸钠、B27添加物、GDNF、bFGF、GFRα1、β-巯基乙醇、青霉素、链霉素组成。

优选的是：所述的STO培养液中FBS加入量为7%DMEM/F12体积，每毫升DMEM/F12加入0.1mmolβ-巯基乙醇、55ng丙酮酸钠、100U青霉素、100μg链霉素。

优选的是：所述的精原干细胞培养液中BSA加入量为0.3%的DMEM/F12质量，每毫升DMEM/F12加入55ng丙酮酸钠、20μl B27添加物、20ngGDNF、10ngbFGF、100ngGFRα1、0.1mmolβ-巯基乙醇、100U青霉素、100μg链霉素，所述的B27添加物为50倍浓度B27添加物。

优选的是：精原干细胞在精原干细胞培养液中的培养条件为32.5℃、通入含有5%体积分数CO₂的空气条件下培养30天以上，每隔5-6天传代一次，两天换一次等量的培养液。

所述的制作STO饲养层，是将3.0-4.0×10⁶个STO细胞接种到100mm的培养皿中，添加10ml STO培养液，在37℃、通入含有5%体积分数CO₂的空气条件下培养，当细胞的密度达到90%时，用150μg的丝裂霉素C处理2h，然后用无钙镁离子PBS洗3次，收集，常规冻存，待用。用前解冻，将处理后的STO细胞接种到质量体积分数为的0.1%明胶包被的12孔培养板中，每孔1.0×10⁶个，添加1ml STO培养液，在32.5℃，CO₂占5%体积分数的空气条件下培养12h，用PBS洗3次，洗去残留的FBS。

所述的精原干细胞诱导精子细胞，是将精原干细胞接种到饲养层上，添加精原干细胞培养，每孔1ml，接种精原干细胞数为每孔1.0×10⁵，在32.5℃，CO₂占5%体积分数的空气条件下培养，两天换一次等量培养液。

本发明的有益效果：

1、本发明应用对象是猪，和已有的技术方案应用对象不同，扩大了科研范围。

2、本发明将精原干细胞接种到STO饲养层上，精原干细胞在适宜的培养条件下生长时，不仅可以增殖，部分细胞还可以分化，达到一种平衡状态，可以源源不断的得到精子细胞。

附图说明

图1为精原干细胞原代培养做DNA含量分析的阴性对照图；

图2为5代细胞DNA含量分析图；

图3为10代细胞DNA含量分析图；

图4为15代细胞DNA含量分析图；

图1至图4中的1C为单倍体细胞峰，2C为二倍体细胞峰，3C为四倍体细胞峰；

图5为精原干细胞及精子细胞形态学，图中a及箭头所示的为精原干细胞，三角形所示的为精子细胞；

图6为精原干细胞及精子在抗体UCHL1染色的条件下的细胞形态学，b及箭头所示的为精原干细胞在抗体UCHL1染色的条件下呈现绿色，三角形所示的为精子细胞在抗体UCHL1染色的条件下不着色，不表达UCHL1。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，但本发明的实施方式并不局限于实施例表示的范围。这些实施例仅用于说明本发明，而非用于限制本发明的范围。此外，在阅读本发明的内容后，本领域的技术人员可以对本发明作各种修改，这些等价变化同样落于本发明所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

(一)配置培养基：

STO培养液：由基础培养基DMEM/F12、FBS、β-巯基乙醇、丙酮酸钠、青霉素、链霉素组成，FBS加入量为7%的DMEM/F12体积，每毫升DMEM/F12加入0.1mmolβ-巯基乙醇、55ng丙酮酸钠、100U青霉素，100μg链霉素；

精原干细胞培养液：培养基由DMEM/F12、丙酮酸钠、BSA、B27添加物、GDNF、bFGF、GFRα1、β-巯基乙醇、青霉素、链霉素组成，BSA按0.3%DMEM/F12质量加入，每毫升DMEM/F12加入55ng丙酮酸钠、20μl50倍的B27添加物、20ngGDNF、10ngbFGF、100ngGFRα1、0.1mmolβ-巯基乙醇、100U青霉素、100μg链霉素。

（二）STO饲养层的制作

将3.0-4.0×10⁶个STO细胞接种到100mm的培养皿中，添加10mlSTO培养液，在37℃、CO₂占5%体积分数的空气条件下培养。当细胞的密度达到90%时，丝裂霉素C按15μg/ml加入并处理2h，然后用无钙镁离子PBS洗3次，380g条件下离心5min后收集，常规冻存，待用。将处理后的STO细胞接种到质量体积分数为的0.1%明胶包被的12孔培养板中，每孔接种1.0×10⁶个细胞，添加1ml STO培养液，32.5℃，通入含有5%体积分数CO₂的空气条件下培养12小时，用PBS洗3次，洗去残留的FBS。

（三）精原干细胞诱导精子细胞

将精原干细胞接种到饲养层上，添加精原干细胞培养液，每孔1ml，接种精原干细胞数为每孔1.0×10⁵。在为32.5℃、通入含有5%体积分数CO₂的空气条件下培养30天，每隔5天传代一次，传至6代，两天换一次等量的培养液。

（四）精子细胞的鉴定

1、DNA含量的鉴定：用流式细胞仪分析，结果见图2。

2、细胞免疫化学鉴定：精子细胞小，细胞核偏向一侧，UCHL1染色呈阴性，结果见图5、图6。

实施例2

(一)配置培养基：

（二）STO饲养层的制作

（三）精原干细胞诱导精子细胞

将精原干细胞接种到饲养层上，添加精原干细胞培养液，每孔1ml，接种精原干细胞数为每孔1.0×10⁵。在为32.5℃、通入含有5%体积分数CO₂的空气条件下培养60天，每隔6天传代一次，传至10代，两天换一次等量的培养液。

（四）精子细胞的鉴定

1、DNA含量的鉴定：用流式细胞仪分析，结果见图2。

2、细胞免疫化学鉴定：精子细胞小，细胞核偏向一侧，UCHL1染色呈阴性。

实施例3

(一)配置培养基：

（二）STO饲养层的制作

（三）精原干细胞诱导精子细胞

将精原干细胞接种到饲养层上，添加精原干细胞培养液，每孔1ml，接种精原干细胞数为每孔1.0×10⁵。在为32.5℃、通入含有5%体积分数CO₂的空气条件下培养75天，每隔5天传代一次，传至15代，两天换一次等量的培养液。

（四）精子细胞的鉴定

1、DNA含量的鉴定：用流式细胞仪分析，结果见图2。

Claims

1.一种巴马小型猪精原干细胞诱导精子细胞的方法，包括配制培养基、制作STO饲养层、精原干细胞诱导精子细胞、精子细胞鉴定四个步骤，其特征在于：所述配制培养基包括配制STO培养液和精原干细胞培养液，STO培养液由基础培养基DMEM/F12、FBS、β-巯基乙醇、丙酮酸钠、青霉素、链霉素组成；精原干细胞培养液由基础培养基DMEM/F12、BSA、丙酮酸钠、B27添加物、GDNF、bFGF、GFRα1、β-巯基乙醇、青霉素、链霉素组成。

2.根据权利要求1所述的巴马小型猪精原干细胞诱导精子细胞的方法，其特征在于：所述的STO培养液中FBS加入量为7%DMEM/F12体积，每毫升DMEM/F12加入0.1mmolβ-巯基乙醇、55ng丙酮酸钠、100U青霉素、100μg链霉素。

3.根据权利要求1所述的巴马小型猪精原干细胞诱导精子细胞的方法，其特征在于：所述的精原干细胞培养液中BSA加入量为0.3%的DMEM/F12质量，每毫升DMEM/F12加入55ng丙酮酸钠、20μl B27添加物、20ngGDNF、10ngbFGF、100ngGFRα1、0.1mmolβ-巯基乙醇、100U青霉素、100μg链霉素，所述的B27添加物为50倍浓度B27添加物。

4.根据权利要求1或3所述的巴马小型猪精原干细胞诱导精子细胞的方法，其特征在于：精原干细胞在精原干细胞培养液中的培养条件为32.5℃、通入含有5%体积分数CO₂的空气条件下培养30天以上，每隔5-6天传代一次，两天换一次等量的培养液。