CN104974982B - 一种体外培养睾丸组织诱导生成精子细胞的方法 - Google Patents

一种体外培养睾丸组织诱导生成精子细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及细胞工程领域，具体提供一种体外培养睾丸组织诱导生成精子细胞的方法，包括如下步骤：(1)培养胶块的制备：将1.2％的琼脂糖胶切块置于6孔板中，加入培养基浸泡过夜后，吸掉旧培养基，加入新鲜培养基，此时的琼脂糖胶块用作培养胶块；所述培养基的成分及含量为：90％MEMα+10％KSR；(2)取新生5.5天和新生10.5‑12.5天的小鼠睾丸，去外层白膜，分割成块状组织样品；(3)将组织样品置于前述的培养胶块上，将6孔板置于细胞培养箱中进行培养；(4)新生5.5天的小鼠睾丸组织培养22‑25天得到圆形精子；新生10.5‑12.5天的小鼠睾丸组织培养27天左右得到长形精子。

Description

一种体外培养睾丸组织诱导生成精子细胞的方法
技术领域
本发明涉及细胞工程领域，具体地说，涉及一种体外培养睾丸组织诱导生成精子细胞的方法。
背景技术
睾丸的功能主要是由不断增殖的精原干细胞来维持，精原干细胞位于曲精细管生精上皮基膜上，一方面它能自我增殖形成更多的精原干细胞，另一方面，它可以经过几次有丝分裂之后进入减数分裂，形成精母细胞，最终形成精子细胞。精原干细胞更新可产生2个精原干细胞或者是分裂产生2个通过胞质桥相连的成对所谓Apr型精原细胞，Apr进一步分裂形成4、8、16个细胞的Aal型(the Aaligned spermatogonia)精原细胞。Aal成为第一代分化的A1型精原细胞。A1型随后进行连续六次的细胞分裂依次产生A2、A3、A4等中间型和B型精原细胞，B型最后一次分裂产生初级精母细胞，初级精母细胞减数分裂形成单倍体精子。体外精原干细胞增殖可通过培养基中添加胶质细胞系获得的神经营养因子实现，且精原干细胞系可通过自我更新的方式体外培养2年，但体外精子生成目前还没有突破。
从精原干细胞到精子的过程在老鼠和人中分别为35和64天(Sato,T.,et al.,Invitro production of fertile sperm from murine spermatogonial stem celllines.Nat Commun,2011.2:p.472.)。这个过程不是生殖细胞自发的，而是需要由周围的体细胞产生的微环境，特别是支持细胞和间质细胞的互作。为模拟体内的精子生成环境，一个世纪以前就开始尝试用器官培养的方法进行体外精子生成的研究，但是精子生成只能进行到减数分裂粗线期阶段。
2011年Takuya Sato用gas–liquid interphase的方法，培养基中用敲除的血清取代物(KSR)取代胎牛血清(FBS)，用2.5天和3.5天的新生睾丸组织进行培养，可得到可育的精子。但是睾丸组织样品的坏死情况依然较严重，同时得到单倍体的效率依然不高。这可能与体外培养体系营养的不充足和微环境的变化有关(Sato,T.,et al.,In vitroproduction of functional sperm in cultured neonatal mouse testes,2011)
精子生成是一个复杂的过程，有报道称成体睾丸组织培养中的圆形精子在培养几天后就消失，只有精母细胞可维持3到4周。目前用1.5-3.5天睾丸组织培养得到单倍体的概率较低，且没有看到关于出生后10.5-14.5天(已启动减数分裂无圆形精子)睾丸组织培养得到长形精子的报道。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种体外培养睾丸组织诱导生成精子细胞的方法。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
本发明首先提供一种体外培养睾丸组织诱导生成精子细胞的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)培养胶块的制备：将1.2％的琼脂糖胶切块置于6孔板中，加入培养基浸泡过夜后，吸掉旧培养基，加入新鲜培养基，此时的琼脂糖胶块用作培养胶块；
所述培养基的成分及含量为：90％MEMα(invitrogen货号：11120-022)+10％KSR(invitrogen货号：10828)；
(2)取新生5.5天和新生10.5-12.5天的小鼠睾丸，去外层白膜，分割成块状组织样品；
(3)将组织样品置于前述的培养胶块上，将6孔板置于细胞培养箱中进行培养；
(4)新生5.5天的小鼠睾丸组织培养22-25天得到圆形精子；新生10.5-12.5天的小鼠睾丸组织培养27天左右得到长形精子。
作为优选，所述步骤(1)将1.2％的琼脂糖胶切成大小为10×10×5mm的胶块，置于6孔板的孔中，加入培养基，使胶块浸泡在培养基中，浸泡过夜后，吸掉旧培养基，加入新鲜培养基，使培养基液面达到胶块高度的4/5处。
本发明所用琼脂糖胶的浓度为1.2％，而Takuya Sato所用琼脂糖胶的浓度为1.5％，本发明通过降低了琼脂糖胶的浓度，并使培养基液面达到胶块高度的4/5处，使欲培养的组织样品更容易吸收到营养。
进一步地，所述步骤(2)将睾丸分割成1mm3大小的组织样品。
进一步地，所述步骤(3)中每块胶块放置2-3块组织样品。
作为优选，所述步骤(3)中将孔板置于34℃，5％CO2细胞培养箱中进行培养。
作为优选，所述步骤(3)中每4.5天更换一次培养基。
本发明培养过程中培养基的换液周期为4.5天，而Takuya Sato的方法换液时间为7天，由于小鼠生精周期可分为12个阶段，每个循环的时间为8.6天，每4.5天换一次液可能更符合体内的周期变换，且营养更充分。
本发明还提供了一种用于体外培养睾丸组织诱导生成精子细胞的培养胶块，其是将1.2％的琼脂糖胶切块置于6孔板中，加入培养基浸泡过夜后，吸掉旧培养基，加入新鲜培养基后得到；所述培养基的成分及含量为：90％MEMα+10％KSR。
进一步地，所述培养胶块是将1.2％的琼脂糖胶切成大小为10×10×5mm的胶块，置于6孔板的孔中，加入培养基，使胶块浸泡在培养基中，浸泡过夜后，吸掉旧培养基，加入新鲜培养基，使培养基液面达到胶块高度的4/5处。
本发明还提供了上述培养胶块在体外培养睾丸组织诱导生成精子细胞中的应用。
本发明的有益效果在于：
本发明通过改进的睾丸组织培养方法，培养新生5.5天的睾丸组织体外诱导精子生成，HE染色可观察到5.5天较2.5和3.5天的睾丸组织培养有较多的减数分裂细胞和圆形精子；通过新生10.5-12.5.天的睾丸组织培养体外诱导精子生成可得到长形精子。
附图说明
图1为本发明实施例1中睾丸组织培养体系。
图2为新生5.5天睾丸组织培养不同天数后，HE染色结果。图中A、B、C、D、E、F分别为5.5天新生小鼠睾丸组织培养17天、21天、22天、25天、31天和36天后结果。
图3为本发明实施例1中睾丸组织培养结果；其中：A、B、C、D分别为新生5.5d、4.5d、3.5d和2.5d的睾丸组织培养结果；箭头所指为圆形精子。
图4为本发明实施例1中新生5.5d睾丸组织培养22d和42d后PAS染色结果；箭头所指为PAS染色呈阳性圆形精子。
图5为本发明实施例1中新生5.5d睾丸组织培养22d后减数分裂相关基因表达。
图6为现有技术公开的方法与本发明所述方法对新生5.5d小鼠睾丸组织培养的对比图。
图7为本发明实施例2中新生12.5天睾丸组织培养不同天数后，HE染色结果；图中A、B、C分别为新生12.5天小鼠睾丸组织培养27天、31天和40天后结果。
图8为本发明实施例2中睾丸组织培养结果；图中A、B、C、D分别为出生后10.5d、12.5d、13.5d和14.5d的睾丸组织的培养结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1新生睾丸组织培养圆形精子
1、培养胶块的制备
(1)培养基的制备：所述培养基的成分及含量为：90％MEMα(invitrogen货号：11120-022)+10％KSR(invitrogen货号：10828)。
(2)琼脂糖胶的制备：取33ml超纯水，加0.396g琼脂糖，高压灭菌121℃，20分钟，制成1.2％的琼脂糖胶，倒入10cm的细胞培养板中；
(3)培养胶块的制备：待琼脂糖胶凝固后，切成大小为10×10×5mm的胶块，将切好的胶块儿置于6孔板中，每孔放3块胶，然后每孔加4.5ml配好的培养基，使胶块儿浸泡在培养基中，浸泡过夜后，吸掉旧培养基，加入1.9ml新鲜培养基，使培养基液面达到胶块儿高度的4/5处，可进行组织培养。
培养体系如图1。
2、培养新生2.5天、3.5天、4.5天和5.5天的睾丸组织，取小鼠睾丸，去外层白膜，分割成1mm3大小的组织样品。将组织样品分别置于前述的凝胶块上，每块胶块儿放3块儿睾丸组织将6孔板置于34℃，5％CO2细胞培养箱中进行培养，每4.5天更换一次培养基。
以新生5.5天的睾丸组织样品为例，分别对培养17天至36天的组织样品进行HE染色，观察结果(如图2所示)，图中A、B、C、D、E、F分别为5.5天新生小鼠睾丸组织培养17天、21天、22天、25天、31天和36天后结果。从图中可看出培养25天及22天的组织中圆形精子较多。所以取22天到25天的睾丸组织固定。
分别将新生2.5天、3.5天、4.5天和5.5天的睾丸组织样品培养25天后，取组织样品固定，包埋，HE染色，观察组织的减数分裂进行情况可发现5.5天、4.5天的睾丸组织培养结果优于3.5天和2.5天的睾丸组织培养结果，5.5天组睾丸组织培养优于4.5天的睾丸组织培养结果，即生精管内存活细胞较多，圆形精子较多，如图3所示。
3、PAS染色，如图4所示，图中A和B分别为新生5.5天睾丸组织培养22天和42天后PAS染色的结果。A和B中均可观察到PAS染色呈阳性的圆形精子的顶体结构(如箭头所指)，证明确实有圆形精子生成。
4、Q-PCR对新生5.5天培养22天后睾丸组织进行检测，发现减数分裂和精子生成相关基因的表达，如图5所示。
Sycp3在减数分裂的细胞中表达，Pgk2特异表达于减数分裂中的精母细胞和减数分裂后的圆形精子细胞。Spem1表达于第6-15步的圆形精子，SP56为表达在精子顶体的蛋白。结果表明Sycp3、Pgk2、Spem1和SP56新生5.5天培养22天后睾丸组织中均有表达，说明新生5.5天睾丸组织培养确实有减数分裂的进行，并有圆形精子生成。
实施例2新生睾丸组织培养长形精子
1、培养胶块的制备
方法同实施例1。
2、培养新生10.5天、12.5天、13.5天和14.5天的睾丸组织，取小鼠睾丸，去外层白膜，分割成1mm3大小的组织样品。将组织样品分别置于前述的凝胶块上，每块胶块儿放3块儿睾丸组织,将6孔板置于34℃，5％CO2细胞培养箱中进行培养，每4.5天更换一次培养基。
以新生12.5天的睾丸组织样品为例，分别对培养27天至40天的组织样品进行HE染色，观察结果(如图7所示)，图中A、B、C分别为新生12.5天小鼠睾丸组织培养27天、31天和40天后结果，从图中可以看出在培养27天时的长形精子较多。所以，培养时间可选择在27天左右，不超过30天较合适。
分别将新生10.5天、12.5天、13.5天和14.5天的睾丸组织样品培养27天左右后，取组织样品固定，包埋，HE染色，观察结果如图8所示，A、B、C、D分别为出生后10.5d、12.5d、13.5d和14.5d的睾丸组织培养结果，从图中可以看出生后10.5d、12.5d、13.5d和14.5d的睾丸组织培养后都能观察到长形精子。而12.5d的睾丸组织培养结果较好，观察到的长形精子较多,13.5d和14.5d的睾丸组织培养观察到的长形精子相对较少.箭头所示为长形精子。
对比例1
本对比例按照背景技术中提到的文献(Sato,T.,et al.,In vitro productionof functional sperm in cultured neonatal mouse testes,2011)所公开的方法培养5.5d小鼠新生睾丸组织，培养22天后的结果如图6所示，其中，A为用Takuya Sato所描述的方法5.5dpp新生睾丸组织培养22天的结果，B为用本发明方法5.5dpp新生睾丸组织培养22天的结果，可以看出，本发明所述方法得到的单倍体比例高于上述文献公开的现有技术。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (6)

1.一种体外培养睾丸组织诱导生成精子细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)培养胶块的制备：将1.2％的琼脂糖胶切块置于孔板中，加入培养基浸泡过夜后，吸掉旧培养基，加入新鲜培养基，此时的琼脂糖胶块用作培养胶块；
所述培养基的成分及含量为：90％MEMα+10％KSR；
(2)取新生10.5-12.5天的小鼠睾丸，去外层白膜，分割成块状组织样品；
(3)将组织样品置于前述的培养胶块上，将孔板置于细胞培养箱中进行培养；
(4)新生10.5-12.5天的小鼠睾丸组织培养27天得到长形精子。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)将1.2％的琼脂糖胶切成大小为10×10×5mm的胶块，置于6孔板的孔中，加入培养基，使胶块浸泡在培养基中，浸泡过夜后，吸掉旧培养基，加入新鲜培养基，使培养基液面达到胶块高度的4/5处。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)将睾丸分割成1mm3大小的组织样品。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中每块胶块放置2-3块组织样品。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中将孔板置于34℃，5％CO2细胞培养箱中进行培养。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中每4.5天更换一次培养基。
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