CN106085951A - 一种建立可持续传代的树鼩精原干细胞细胞系的方法 - Google Patents

一种建立可持续传代的树鼩精原干细胞细胞系的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106085951A
CN106085951A CN201610460383.XA CN201610460383A CN106085951A CN 106085951 A CN106085951 A CN 106085951A CN 201610460383 A CN201610460383 A CN 201610460383A CN 106085951 A CN106085951 A CN 106085951A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
tree
stem spermatogonium
culture
final concentration
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201610460383.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN106085951B (zh
Inventor
郑萍
李朝晖
班文赞
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kunming Institute of Zoology of CAS
Original Assignee
Kunming Institute of Zoology of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kunming Institute of Zoology of CAS filed Critical Kunming Institute of Zoology of CAS
Priority to CN201610460383.XA priority Critical patent/CN106085951B/zh
Publication of CN106085951A publication Critical patent/CN106085951A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106085951B publication Critical patent/CN106085951B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0608—Germ cells
    • C12N5/061—Sperm cells, spermatogonia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/44—Thiols, e.g. mercaptoethanol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/70—Undefined extracts
    • C12N2500/80—Undefined extracts from animals
    • C12N2500/84—Undefined extracts from animals from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/13—Nerve growth factor [NGF]; Brain-derived neurotrophic factor [BDNF]; Cilliary neurotrophic factor [CNTF]; Glial-derived neurotrophic factor [GDNF]; Neurotrophins [NT]; Neuregulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2306—Interleukin-6 (IL-6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/415—Wnt; Frizzeled

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开一种建立可持续传代的树鼩精原干细胞细胞系的方法，专用培养基成分主要包括bFGF、LIF、EGF、GDNF、wnt3a和FBS，分离和培养方法是将消化成单细胞的树鼩睾丸组织标记抗体后，利用流式细胞术或磁珠筛选获得Thy1+细胞群，将分选获得的树鼩睾丸Thy1+细胞转入培养皿中培养，至培养皿中出现三五成群的精原干细胞集落时，转入新的有丝裂霉素处理过的专用饲养层包被的培养皿中传代培养。本发明的细胞分选效率高，专用培养基成分确定，并避免了异源细胞的污染。培养方法简单高效，对树鼩精原干细胞的分离具有获得目标细胞率高，建立可持续传代细胞系成功率高、细增殖传代能力强和安全稳定的优点。

Description

一种建立可持续传代的树鼩精原干细胞细胞系的方法
技术领域
本发明涉及一种建立可持续传代的树鼩精原干细胞细胞系的方法，具体是涉及特异性分选树鼩睾丸中精原干细胞的抗体的筛选及建立可持续传代树鼩精原干细胞系的专用培养条件及细胞系的建立。属于干细胞研究领域。
背景技术
树鼩(Tupaia belangeri)与啮齿类和非人灵长类比较在生物医学研究中有很多优势。在遗传、进化及生理生化特征上都很靠近灵长类。树鼩因具有体型小、生长发育周期短、繁殖力高、易饲养等优点，使其较非人灵长类动物(猴)有更高的实用性。但是，树鼩作为生物医学研究的实验动物在经历了近半个世纪的研究却仍未能得到应有的发展，基于树鼩的大部分研究工作仍缺少深度和广度，遗传操作手段的缺乏是制约树鼩不能广泛应用的重要原因之一。因此解决树鼩的基因操作难题对于成功建立疾病模型，解析疾病机理，推动树鼩在生物医学研究中的广泛应用具有重要意义。
目前对树鼩基础生殖生物学的认识和了解非常有限，尚无法方便和准确地判断雌性树鼩的生殖周期导致难以获得早期胚胎，也缺乏相应的胚胎移植技术，因此在建立能遗传的基因修饰方法中，利用1-细胞胚胎或者胚胎干细胞对树鼩进行基因修饰的条件尚不成熟。精原干细胞是一类起源于原始生殖细胞，位于雄性哺乳动物曲细精管生精皮基膜内侧的具有高度自我更新和分化潜能的细胞。在精子发生这一特殊的细胞分化过程中，精原干细胞的地位极其重要,它既能维持自我更新能力,又可不断分化形成各阶段的生殖细胞并最终产生精子,承载着向下一代传递遗传信息的使命。鉴于其独具的生物学特性,精原干细胞在揭示精子的发生机制、治疗雄性不育和转基因动物等研究中具有重要价值然而，精原干细胞在成年哺乳动物睾丸中数量非常低，但在发育生物学研究过程中需要大量高活性、高纯度的精原干细胞。因此分离和纯化对于其开展深入研究非常重要。而利用精原干细胞作为基因操作的细胞载体，则可以避开早期胚胎收集和胚胎移植的双重难题，从而为解决树鼩基因操作难题另辟蹊径。
已有研究表明：精原干细胞的分离纯化、饲养层细胞的制备、细胞培养基等因素对精原干细胞成功建系都有重要的影响。
已有研究表明：在分离小鼠和绵羊精原干细胞时，可以使用特定的精原干细胞抗体也可以不使用特定的精原干细胞抗体就能获得纯度较高的精原干细胞。目前有关精原干细胞的标记物的研究虽已取得丰硕成果，但大多数研究主要集中在小鼠等啮齿类哺乳动物。树鼩作为新型模式动物，目前尚不具备专门的抗体，在其精原干细胞标记基因的寻找过程中，需要根据物种同源性来寻找特异的标记抗体。目前国内外尚无关于树鼩精原干细胞特异标记物的报道，对其精原干细胞的深入研究更是知之甚少。但是对于树鼩精原干细胞的分离，发明人曾尝试使用SSEA4、PLZF表面标记，都无法获得纯度较高的精原干细胞。
已经建立的多种哺乳动物的精原干细胞体外培养体系中，常选用DMEM/F12、MEM、StemPro-34SFM及其StemPro-34supplement等基础培养基。同时，培养基中需添加一系列如非必需氨基酸、丙酮酸钠、谷氨酰胺和β-巯基乙醇等促进细胞生长的物质,还要根据不同物种精原干细胞的需要选择性添加如胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)、白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)、表皮生长因子(epidermal growthfactor,EGF)和干细胞因子(stem cell factor,SCF)等细胞因子。为维持精原干细胞增殖能力并抑制分化，在体外培养过程中还需使用MEF、Sertoli和STO等作为饲养层细胞。不同物种动物的干细胞分离培养所需的生长因子和调控通路存在较大的差异，在体外培养的不同阶段所需细胞因子也会存在差异，目前国内外尚无树鼩精原干细胞成功建系的报道。
在饲养层的选择上，目前已报道的精原干细胞及胚胎干细胞培养方法中，大多选用小鼠MEF细胞或STO细胞作为饲养层，而丝裂霉素C(mitomycin C,MMC)处理的小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast,MEF)饲养层是培养哺乳动物SSCs的最佳饲养层。发明人也尝试用小鼠的MEF作为饲养层，但是一直无法成功。而且，未知成分对干细胞鉴定的干扰以及异源细胞污染的问题会影响干细胞培养体系的深入研究。更为棘手的问题是，上述饲养层细胞对于树鼩精原干细胞的建系毫无建树，导致一直以来无法解决树鼩精原干细胞体外长期培养的问题。
参考文献
1.Fan,Y.,Huang,Z.Y.,Cao,et al.Genome of the Chinese tree shrew.2013,Nat common 4,1426.
2.Xu L,Zhang Y,Liang B,LüL-B,Chen C-S,Chen Y-B,Zhou J-M,Yao Y-G.Thetree shrew under the spot light:emerging models of human diseases.Zool Res,2013.34(2)：59-69.
3.Sargis EJ.New views on tree shrews:The role of Tupaiids in primatesupraordinal relationships.Evolutionary Anthropology:Issues,News Rev,2004.13(2):56-66.
4.de Rooij DG.Proliferation and differentiation of spermatogonialstem cells.Reproduction 2001；121(3):347-54.)(Weiss L.Histology:Cell andtissue biology,5th ed.New York:Elsevier Science Publishing 1983,1056-61.
5.Izadyar F,Spierenberg GT,Creemers LB,den Ouden K,de RooijDG.Isolation and purification of type A spermatogonia from the bovinetestis.Reproduction 2002；124(1):85-94.
6.Kanatsu-Shinohara M,Ogonuki N,Iwano T,Lee J,Kazuki Y,Shinohara T,etal.Genetic and epigenetic properties of mouse male germ line stem cellsduring long-term culture.Development 2005；132(18):4155-63.
7.Tao Tan,Yanfeng Zhang,Weizhi Ji,Ping Zheng.miRNA Signature in MouseSpermatogonial Stem Cells Revealed by High-Throughput Sequencing.BioMedResearch International.2014.154251
8.Kanatsu-Shinohara M,Miki H,Inoue K,Ogonuki N,Toyokuni S,ShinoharaT,et al.Long-term culture of mouse male germLine stem cells under serum orfeeder-free conditions.Biol Reprod 2005；72(4):985-91.
9.索丽娟，凡志国，胡建宏，解广勤，刘玉，莫金鑫.哺乳动物精原干细胞研究进展.畜牧与兽医2012.44(2)。
发明内容：
本发明目的在于克服上述现有技术不足问题，提供一种建立可持续传代的树鼩精原干细胞细胞系的方法，它可使得树鼩精原干细胞均能够在体外长期培养并增殖，能够建立长期维持稳定生长的精原干细胞系，并且维持其精子发生的功能。
本发明的另一个目的是提供利用上述建立可持续传代的树鼩精原干细胞细胞系方法培养获得的树鼩精原干细胞系。
本发明技术方案如下：
一种建立可持续传代的树鼩精原干细胞细胞系的方法，包括以下步骤：
(1)树鼩精原干细胞的分离取3月-1.5岁年龄树鼩睾丸，对树鼩睾丸消化，加入抗体human CD90/Thy1，利用流式细胞术或免疫磁珠分选法分离获得Thy1+细胞；所述免疫磁珠分选法使用的磁珠为anti PE磁珠；
(2)树鼩精原干细胞的原代培养将步骤(1)获得的Thy1+细胞接种在用明胶包被的培养皿中，使用培养树鼩精原干细胞的专用培养基进行培养，培养至培养皿中出现3-5成群的精原干细胞集落；
(3)树鼩精原干细胞的传代培养将步骤(2)培养的树鼩精原干细胞转入经处理后的饲养层细胞的培养皿中进行传代培养。
这是本发明创新点之一。选用一种用于分选树鼩睾丸细胞中的精原干细胞的特异性抗体human CD90/Thy1，可有效分离树鼩精原干细胞。根据物种同源性原理，经过大量同源物种精原干细胞标记基因的抗体测试，尝试不同的人源、猕猴源的抗体，使用SSEA4、PLZF表面标记，但无法分选成群，获得纯度较高的精原干细胞。
本发明人使用抗体human CD90/Thy1(克隆号5E10)，发现膜表面抗原Thy1(克隆位点5E10)可以标记到树鼩精原干细胞，明显分选成群，通过抗体标记后利用流式细胞术或免疫磁珠分选法获得Thy1+细胞，为树鼩精原干细胞培养建系提供支持。
进一步地，所述的培养树鼩精原干细胞的专用培养基的主要成分为:StemPro34基础培养液、stemPro34supplement、bFGF、LIF、hEGF、GDNF、wnt3a和FBS。
进一步地，所述的培养树鼩精原干细胞的专用培养基以StemPro34培养基作为基础培养液，其中bFGF的终浓度为1-5ng/mL，LIF的终浓度为800-1200U/mL，EGF的终浓度的含量为5-15ng/mL，GDNF的终浓度30-50ng/mL，Wnt3a的终浓度为8-12ng/mL，FBS的体积浓度为8-12％，配制每10mL培养树鼩精原干细胞的专用培养液加入stemPro34supplement 250μL。
进一步地，所述的培养树鼩精原干细胞的专用培养基的配方中腐胺的终浓度为60μM、丙酮酸钠的终浓度为1mM、MEM-NEAA的终浓度为1mM、β-巯基乙醇的终浓度为0.1mM，L-谷氨酰胺的终浓度为2mM。
优选地，所述的培养树鼩精原干细胞的专用培养基以StemPro34培养基作为基础培养液，配制每10mL培养树鼩精原干细胞的专用培养液加入stemPro34supplement 250μL，FBS的体积比为10％、GDNF的终浓度为40ng/mL、EGF的终浓度为10ng/mL、bFGF的终浓度为2ng/mL、LIF的终浓度为1000U/mL、Wnt3a的终浓度为10ng/mL，腐胺的终浓度为60μM、丙酮酸钠的终浓度为1mM,、MEM-NEAA的终浓度为1mM、β-巯基乙醇的终浓度为0.1mM、L-谷氨酰胺的终浓度为2mM。进一步地，所述的培养树鼩精原干细胞的专用培养基的主要成分为bFGF、LIF、EGF、GDNF、wnt3a和FBS。
进一步地，所述的培养树鼩精原干细胞的专用培养基的配方为bFGF的浓度为1-5ng/mL，LIF含量为800-1200U/mL，EGF的浓度为5-15ng/mL，GDNF的浓度为30-50ng/mL，Wnt3a的浓度为8-12ng/mL，FBS的体积浓度为8-12％。
进一步地，所述的培养树鼩精原干细胞的专用培养基的配方中还包括以StemPro34培养基作为基础培养液，每10mL StemPro34基础培养液中，加入stemPro34supplement 250μL、腐胺60μM、丙酮酸钠100μL、MEM-NEAA 100μL、β-巯基乙醇0.1mM、L-谷氨酰胺100μL。
优选地，所述的培养树鼩精原干细胞的专用培养基的配方为FBS的体积比为10％、GDNF 40ng/mL、EGF 10ng/mL、bFGF 2ng/mL、LIF 1000U/mL、Wnt3a10ng/mL，根据配制的培养树鼩精原干细胞的专用培养基的体积来确定加入的StemPro34培养液的体积，每10mLStemPro34基础培养液中，加入stemPro34supplement 250μL、腐胺60μM、丙酮酸钠100μL、MEM-NEAA 100μL、β-巯基乙醇1000.1mM、L-谷氨酰胺100μL。
其中：bFGF：碱性成纤维细胞生长因子，是一种促细胞分裂的肝素结合蛋白，在胚胎发育和分化的多个生物学反应过程中激活FGF信号通路，广泛应用在细胞培养中的生物活性蛋白。
LIF：白血病抑制因子，是一种属于白介素-6家族的细胞因子，能诱导白血病细胞系M1的分化，但可抑制胚胎干细胞的分化。
EGF：表皮生长因子，是调控生物皮肤生长、更新和代谢等生命活动最重要的因子，主要作用是促进皮肤细胞的增殖、分化，加速受伤表皮细胞的修复及新陈代谢能力。
GDNF：胶质细胞源性神经营养因子，是转化生长因子β超家族成员中的一员，是Ret受体配体，能与Ret结合发挥作用。对损伤的神经细胞具有营养和保护作用，常用于干细胞基因治疗的研究中。
Wnt3a：干细胞生长分化因子，是wnt基因家族中的重要成员，对神经干细胞的定向分化的调控作用表现十分明显。主要功能是激活wnt/β-catenin信号通路，是细胞增殖分化的关键调控环节，在胚胎法湖和肿瘤发生中起着重要作用。
FBS：胎牛血清，由血浆去除纤维蛋白后形成的复杂混合物，含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等物质，其成份大部分已知，还有少部分尚不清楚，但胎牛尚未接触外界，其血清中所含抗体、补体等对细胞有害的成分最少。常用于动物细胞的体外培养，是细胞贴壁、铺展在塑料培养基质上所需因子来源。
StemPro34培养基是一种无血清培养基，化学成分确定，在使用时加入基本培养基配备的StemPro34supplement成分。培养基中含多种微量元素，是生殖干细胞培养常用的基础培养基。在本发明中使用该培养基作为基础培养基，对树鼩精原干细胞建系成功率及稳定性都提供了保障。
MEM NEAA包含甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酸、L-脯氨酸和L-丝氨酸7种细胞培养所需的非必需氨基酸，可有效降低细胞培养时自产非必需氨基酸的副作用。L-谷氨酰胺是细胞生长必需氨基酸，可为培养的细胞提供重要的能量来源，并参与蛋白质的合成和核酸代谢。本发明的培养体系中添加MEM NEAA和L-谷氨酰胺有利于维持细胞体外长期培养。
β-巯基乙醇是一种强还原剂，能诱导细胞增殖、促进DNA合成，同时能避免过氧化物对体外培养细胞的损害，阻碍多能性干细胞的分化趋势。
这是本发明创新点之二。发明人尝试用现有的培养基进行培养，发现对树鼩精原干细胞培养的效果都不好。而加入适量Wnt3a后，培养建系的成功率可达到100％。
进一步地，所述的用于培养树鼩精原干细胞的饲养层细胞为树鼩睾丸细胞中的上皮细胞和支持细胞。
进一步地，所述的用于培养树鼩精原干细胞的饲养层细胞的制备方法为：树鼩睾丸消化成单细胞后，经过磁珠分选收集Thy1阴性细胞，用DMEM培养基作为基础培养基，加入10％NCS培养细胞，培养24h后去除未贴壁细胞，剩余细胞作为饲养层细胞。
这是本发明创新点之三。发明人尝试使用小鼠MEF细胞或STO细胞都无法成功培养出树鼩精原干细胞。而支持细胞是体内唯一与精原干细胞关系紧密的一类体细胞，发明人选择尝试用支持细胞作为饲养层，使树鼩精原干细胞可以有类似体内的微环境维持成功培养出树鼩精原干细胞，结果表明没有支持细胞无法培养出树鼩精原干细胞。一方面解决了细胞培养饲养层的问题，另一方面，利用树鼩自身睾丸细胞中的上皮细胞和支持细胞也解决了未知成分对干细胞鉴定的干扰以及异源细胞污染的问题会影响干细胞培养体系的问题。而且，根据生殖细胞在体外培养过程中贴壁不牢固的特点，在传代过程中可轻易将培养的树鼩精原干细胞与饲养层分离，据此为树鼩精原干细胞体外长期培养提供了极大帮助。
进一步地，所述的树鼩精原干细胞的传代培养的方法为：
a.将原代处理好后的细胞接种在无饲养层的培养皿中贴壁去除成纤维细胞24h；
b.将贴壁后的细胞用枪直接吹下，1500rmp离心5分钟，弃培养基后，用新鲜专用培养基吹起，将细胞以1：3的比例接种于铺有丝裂霉素处理过的饲养层细胞的培养皿中培养；
c.每24h观察细胞状态和培养基情况，接种后24小时添加1倍培养基，48小时后弃一半培养基再添加一倍培养基，72小时后全部弃掉培养基，换入新鲜培养基，之后每天都换入新鲜培养基，一周精原干细胞集落可以长起来并传代。
进一步地，所述的传代培养的方法中培养基是专用培养基中不添加wnt3a成分。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1)本发明从众多特异分选精原干细胞的抗体中，选用一种可以特异分选树鼩精原干细胞的抗体human CD90/Thy1(克隆号5E10)，分选后收集的Thy1+细胞可以用于建立可持续传代的精原干细胞系，分选效果好，分选效率高。
2)本发明专用培养基成分确定，并避免了异源细胞的污染。
3)本发明中所述利用树鼩睾丸上皮及支持细胞作为饲养层，不但避免了异源细胞污染问题，同时解决了精原干细胞体外长期培养的难题。而且，根据生殖细胞在体外培养过程中贴壁不牢固的特点，在传代过程中可轻易将培养的精原干细胞与饲养层分离，据此为树鼩精原干细胞体外长期培养提供了极大帮助。
4)本发明提供的培养树鼩精原干细胞的方法简单高效，建系成功率高、细胞增殖传代能力强，并且能长期安全稳定的保持干细胞特性。
附图说明：
图1是用Thy1作为分选标记基因对消化成单个细胞的树鼩睾丸细胞进行分选的Thy1+细胞流式图。其中1(A)是实验组和对照组的流式分析结果；图1(A1)是对照组的流式分析结果；
图2是用SSEA4作为分选标记基因对消化成单个细胞的树鼩睾丸细胞进行分选的细胞流式图，其中图2(A)是实验组的流式分析结果，图2(A1)是对照组的流式分析结果；
图3是收集的分选Thy1+细胞形态图，其中图3(A)是收集的分选Thy1+细胞在光镜下的形态；图3(B)是收集的分选Thy1+细胞在荧光显微镜下的形态。
图4是Thy1+的树鼩睾丸细胞在培养建系过程中初具集落形态图，其中箭头所指的细胞集落为树鼩精原干细胞集落。
图5是利用饲养层细胞培养树鼩精原干细胞在20倍物镜放大拍摄图，其中图5(A)为STO饲养层细胞培养树鼩精原干细胞在20倍物镜放大拍摄图；图5(B)为用MEF饲养层细胞培养树鼩精原干细胞在20倍物镜放大拍摄图；
图6是琼脂糖凝胶电泳检测树鼩精原干细胞相关标识基因的表达情况图，饲养层(TS-STO)作为阴性对照则不表达精原干细胞标记基因。
图7是细胞免疫荧光染色检测树鼩精原干细胞特异表达基因的表达情况图。
具体实施方式：
下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件进行或配置，未注明来源的产品均可通过市场途径获得。
实施例1(树鼩精原干细胞的消化和分离)
(1)树鼩睾丸消化：
①取6月龄树鼩睾丸用PBS清洗干净后去掉白膜后剪碎(无菌操作)。
②配制含1mg/mL透明质酸酶、3mg/mL胶原酶、0.2mg/mL DNaseI的消化液于37℃水浴消化组织碎片20min，期间每5分钟用移液枪充分混匀组织与消化液。
③PBS清洗两遍去掉胶原酶，离心1500rmp 5min，弃上清。
④再将组织碎片及消化的细胞置于0.25％胰酶消化液中于37℃水浴消化组织碎片10min左右。每2分钟用移液枪混匀一次，待消化液中大部分细胞呈单细胞状态时，血清终止消化。
⑤PBS清洗一遍，离心1500rmp 5min，弃上清。
⑥将消化后细胞用1％BSA溶液吹起混匀后，用滤膜过滤掉未消化的组织块，准备标记抗体分选细胞。
(2)树鼩精原干细胞分离：
①将消化后获得的细胞中加入PE Anti-human CD90(Thy1)抗体，常温避光孵育30min；
②加入10mL PBS清洗两次，离心1500rmp 5min，弃上清；
③收集经步骤②的细胞，用1％BSA重悬细胞。加入带有anti PE磁珠的二抗，常温避光孵育15min；
④将经步骤③的细胞加入10mL PBS清洗两次，离心1500rmp 5min，弃上清，收集标记后的树鼩睾丸细胞；
⑤将磁珠分选柱置于磁力架上，分选柱下方放置用于收集Thy1-细胞的离心管；
⑥用1mL1％BSA浸润分选柱；
⑦将收集标记后的树鼩睾丸细胞用1％BSA重悬的树鼩睾丸细胞逐滴加入分选柱，待全部过柱后，将分选柱从磁力架上取下，置于新的离心管上，加入2mL树鼩精原干细胞专用培养基，用分选柱匹配的活塞推下Thy1+细胞；将分选出的Thy1+细胞置于明胶包被的培养皿中培养。
同时，发明人用同样的方法用SSEA4作为分选标记作了对照实验。
上述用于分离精原干细胞的树鼩睾丸为野生型树鼩或驯养F1代6月龄的树鼩。
上述分离树鼩精原干细胞的抗体为BioLegend公司的PE Anti-human CD90(Thy1)，货号328100。
上述用于消化睾丸组织及分选所用试剂，以上成分均已商品化，可以直接购买，例如DNaseI、BSA可以购自Sigma品牌,胶原酶购自Life-tech品牌等。
上述用于分离精原干细胞的磁珠及磁力架和分离柱也已商品化，可直接购买自美天旎品牌。
结果表明：Thy1分选的Thy1+细胞明显成群，而SSEA4分选的细胞无法成群。如图1、图2所示，图1是用Thy1作为分选标记基因对消化成单个细胞的树鼩睾丸细胞进行分选的Thy1+细胞流式图，其中图1(A)和图1(A1)分别是实验组和对照组的流式分析结果，可以看出在流式分选过程中Thy1+细胞明显成群。
图2是用SSEA4作为分选标记基因对消化成单个细胞的树鼩睾丸细胞进行分选的细胞形态图，其中图2(A)和图2(A1)分别是实验组和对照组的流式分选结果，可以看出在流式分选过程中分选的细胞明显不成群。
图3是收集的分选Thy1+细胞形态图，其中图3(A)是收集的分选Thy1+细胞在光镜下的形态，图3(B)是收集的分选Thy1+细胞在荧光显微镜下的形态。
图4是Thy1+的树鼩睾丸细胞在培养建系过程中初具集落形态图，其中箭头所指的细胞集落为树鼩精原干细胞集落。
因此，说明用Thy1作为分选标记基因对消化成单个细胞的树鼩睾丸细胞进行分选效果好。
实施例2(树鼩精原干细胞的饲养层细胞培养和处理)
本发明提供一种专门用于树鼩精原干细胞体外培养的饲养层细胞的制作方法，包括以下步骤：
(1)按照上述树鼩睾丸消化方法消化成单细胞。
(2)按照上述树鼩精原干细胞分选方法分选细胞，经过磁珠分选收集Thy1阴性细胞。
(3)用DMEM培养基作为基础培养基，加入10％NCS培养细胞，培养一天后去除未贴壁细胞，剩余细胞作为饲养层细胞。
以上饲养层细胞的处理方法，包括以下步骤：
(1)培养皿预先用明胶包被；
(2)将上述制作饲养层方法所获得细胞用0.025％胰酶消化5分钟后血清终止消化，收集细胞1000rmp离心3分钟；
(3)将步骤(2)收集细胞转入步骤(1)所述培养皿中，加入用DMEM培养基作为基础培养基的10％NCS培养基培养5-6天至饲养层细胞长满培养皿；
(4)将步骤(3)所述细胞用丝裂霉素C处理3小时；
(5)将经步骤(4)处理的细胞用0.025％胰酶消化下来，均匀接种在新的用明胶包被的培养皿中。
使用以上专用的饲养层细胞培养树鼩精原干细胞的结果见图5(A)；同时，发明人用同样的方法用MEF饲养层细胞培养树鼩精原干细胞结果见图5(B)。结果表明使用本发明专用的饲养层细胞可以成功培养出树鼩精原干细胞，用小鼠MEF饲养层细胞培养树鼩精原干细胞无法成功。
实施例3(树鼩精原干细胞的专用培养基的配制)
配制树鼩精原干细胞的专用培养基10mL，加入5μL GDNF(100ug/ml),1.2mLFBS、15μL EGF(10ug/mL)、0.05μL bFGF(20ug/ml)、12μL LIF(1*106U/mL)、8μL Wnt3a(10ug/ml)，8.5mL StemPro34基础培养液，stemPro34supplement250μL，均匀混合即得。
实施例4(树鼩精原干细胞的专用培养基的配制)
配制树鼩精原干细胞的专用培养基10mL，加入3μL GDNF(100ug/ml),0.8mLFBS、15μL EGF(10ug/mL)、0.5μL bFGF(20ug/ml)、8μL LIF(1*106U/mL)、12μL Wnt3a(10ug/ml)，9mL StemPro34基础培养液，stemPro34supplement250μL，均匀混合即得。
由于树鼩精原干细胞建系专用培养基成分中大部分与已报到的小鼠精原干细胞成分相同，发明人还利用本发明所述的树鼩精原干细胞建系的方法，测试了新添加的wnt3a成分对树鼩精原干细胞建系成功率的影响，分别测试了不添加wnt3a成分、添加8ng/mL、10ng/mL、12ng/mL、20ng/mL wnt3a成分的情况，每组5次测试，比较五种培养基对树鼩精原干细胞建系成功率，结果如下:
表1专用培养基中Wnt3a浓度对树鼩精原干细胞建系的影响
实施例5(树鼩精原干细胞的专用培养基)
与实施例3不同之处在于：在实施例3或4的培养基中，还添加腐胺25μL(24mM)、丙酮酸钠100μL(100mM)、MEM-NEAA 100μL(100mM)、β-巯基乙醇0.08μL、L-谷氨酰胺100μL(200mM)，以上各组分混匀即得。
实施例6(树鼩精原干细胞的专用培养基)
配制专门用于培养树鼩精原干细胞的培养基10mL，加入4μL GDNF(100ug/ml),1mLFBS、10μL EGF(10ug/mL)、1μL bFGF(20ug/ml)、10μL LIF(1*106U/mL)、10μL Wnt3a(10ug/ml)，8.3mL StemPro34基础培养液，stemPro34supplement250μL、腐胺25μL(24mM)、丙酮酸钠100μL(100mM)、MEM-NEAA 100μL(100mM)、β-巯基乙醇0.08μL、L-谷氨酰胺100μL(200mM)，以上各组分混匀即得。使用该浓度配比的培养基可有效地维持干细胞增殖更新，从而提高体外培养建立细胞系的成功率，达到100％。
上述StemPro34培养基、StemPro34supplement、MEM NEAA和L-谷氨酰胺。以上成分均已经商品化，可以直接购买，例如这些成分均可购自Life-tech Gibco品牌。
实施例7(树鼩精原干细胞传代培养的方法)
建立树鼩精原干细胞传代培养的方法如下：
a)原代处理好后的细胞接种在无饲养层的培养皿中贴壁去除成纤维细胞24h；
b)将贴壁后细胞用枪直接吹下(生殖细胞贴壁不牢固，不需要用酶消化)，1500rmp离心5分钟，弃培养基后，用新鲜培养基吹起，将细胞以1：3的比例接种于铺有丝裂霉素处理过的饲养层细胞的培养皿中培养；
c)每24h观察细胞状态和培养基情况，接种后24小时添加一倍培养基，48小时后弃一半培养基再添加一倍培养基，72小时后全部弃掉培养基，换入新鲜培养基，之后每天都换入新鲜培养基，约一周精原干细胞集落可以长起来并传代；
优选地，在细胞接入有饲养层的培养皿前，所述的新鲜培养基是在专用培养基中不添加wnt3a成分的培养基。
建系后树鼩精原干细胞系的保存
冻存培养的精原干细胞的方法为：冻存方法：将准备冻存的树鼩精原干细胞集落用移液枪直接吹下，1500rmp离心5分钟，弃上清，缓慢加入含有10％DMSO的FBS冻存液悬起细胞后，分装入冻存管中，缓慢降温至-80℃，移至液氮中长期保存。
实施例8(树鼩精原干细胞系的鉴定)
对培养的树鼩精原干细胞系进行鉴定的方法如下：
(1)转录组检测：
收集培养的第18代树鼩精原干细胞和饲养层细胞后用trizol法抽提细胞总RNA，用TAKARA试剂盒将抽提的总RNA反转录成cDNA，用对应的待鉴定标记基因的引物PCR检测细胞cDNA中相关基因的表达。相应的基因检测序列见表1。
(2)免疫荧光检测：
将培养的树鼩精原干细胞爬片处理在小玻片上。用10％中性福尔马林固定15分钟，0.25％TritonX-100透膜15分钟，1％BSA封闭30分钟，标记相应一抗4℃过夜孵育。用PBS清洗掉一抗后标记相应二抗常温1小时。DAPI标记细胞核后封片。Confocol检测爬片细胞。相应一抗二抗信息见表2-表4。
结果如图6和图7所示，图6是琼脂糖凝胶电泳检测利用本发明方法培养的树鼩精原干细胞相关标识基因的表达情况图，饲养层(TS-STO)作为阴性对照则不表达精原干细胞标记基因图；图7是细胞免疫荧光染色检测利用本发明方法培养的树鼩精原干细胞特异表达基因的表达情况图。将建系的精原干细胞进行细胞爬片处理，并检测特征分子Oct4、PLZF、vasa和Thy1蛋白的表达，发现这些细胞均表达这四种特征分子，而饲养层TS-STO作为对照在集落下方均不表达上述基因。因此，可以说明建立的细胞培养系中的细胞能够表达精原干细胞的保守基因，证实了建立的可持续传代的细胞系的精原干细胞身份。
所用的检测转录组基因表达所用的PCR引物序列、以及检测基因所用抗体信息见下表2-4
表2检测转录组基因表达所用的PCR引物序列
表3检测基因所用的一抗信息
表4检测基因所用的二抗信息

Claims (10)

1.一种建立可持续传代的树鼩精原干细胞细胞系的方法，包括以下步骤：
(1)树鼩精原干细胞的分离取3月-1.5岁年龄树鼩睾丸，对树鼩睾丸消化，加入抗体human CD90/Thy1，利用流式细胞术或免疫磁珠分选法分离获得Thy1+细胞；
(2)树鼩精原干细胞的原代培养将步骤(1)获得的Thy1+细胞接种在用明胶包被的培养皿中，使用培养树鼩精原干细胞的专用培养基进行培养，培养至培养皿中出现3-5成群的精原干细胞集落；
(3)树鼩精原干细胞的传代培养将步骤(2)培养的树鼩精原干细胞转入经处理后的饲养层细胞的培养皿中进行传代培养。
2.根据权利要求1所述的建立可持续传代的树鼩精原干细胞细胞系的方法，其特征在于，所述的培养树鼩精原干细胞的专用培养基的主要成分为:StemPro34基础培养液、stemPro34supplement、bFGF、LIF、hEGF、GDNF、wnt3a和FBS。
3.根据权利要求2所述的培养树鼩精原干细胞的方法，其特征在于，所述的培养树鼩精原干细胞的专用培养基以StemPro34培养基作为基础培养液，其中bFGF的终浓度为1-5ng/mL，LIF的终浓度为800-1200U/mL，EGF的终浓度的含量为5-15ng/mL，GDNF的终浓度30-50ng/mL，Wnt3a的终浓度为8-12ng/mL，FBS的体积浓度为8-12％，配制每10mL培养树鼩精原干细胞的专用培养液加入stemPro34supplement 250μL。
4.根据权利要求3所述的建立可持续传代的树鼩精原干细胞细胞系的方法，其特征在于所述的培养树鼩精原干细胞的专用培养基的配方中腐胺的终浓度为60μM、丙酮酸钠的终浓度为1mM、MEM-NEAA的终浓度为1mM、β-巯基乙醇的终浓度为0.1mM，L-谷氨酰胺的终浓度为2mM。
5.根据权利要求4所述的建立可持续传代的树鼩精原干细胞细胞系的方法，其特征在于所述的培养树鼩精原干细胞的专用培养基以StemPro34培养基作为基础培养液，配制每10mL培养树鼩精原干细胞的专用培养液加入stemPro34 supplement 250μL，FBS的体积比为10％、GDNF的终浓度为40ng/mL、EGF的终浓度为10ng/mL、bFGF的终浓度为2ng/mL、LIF的终浓度为1000U/mL、Wnt3a的终浓度为10ng/mL，腐胺的终浓度为60μM、丙09酮酸钠的终浓度为1mM,、MEM-NEAA的终浓度为1mM、β-巯基乙醇的终浓度为0.1mM、L-谷氨酰胺的终浓度为2mM。
6.根据权利要求1所述的建立可持续传代的树鼩精原干细胞细胞系的方法，其特征在于，所述的用于培养树鼩精原干细胞的饲养层细胞为树鼩睾丸细胞中的上皮细胞和支持细胞。
7.根据权利要求6所述的建立可持续传代的树鼩精原干细胞细胞系的方法，其特征在于，所述的用于培养树鼩精原干细胞的饲养层细胞的制备方法为：树鼩睾丸消化成单细胞后，经过磁珠分选收集Thy1阴性细胞，用DMEM培养基作为基础培养基，加入10％NCS培养细胞，培养24h后去除未贴壁细胞，剩余细胞作为饲养层细胞。
8.根据权利要求1所述的建立可持续传代的树鼩精原干细胞细胞系的方法，其特征在于，所述的树鼩精原干细胞的传代培养的方法为：
a.将原代处理好后的细胞接种在无饲养层的培养皿中贴壁去除成纤维细胞24h；
b.将贴壁后的细胞用枪直接吹下，1500rmp离心5分钟，弃培养基后，用新鲜专用培养基吹起，将细胞以1：3的比例接种于铺有丝裂霉素处理过的饲养层细胞的培养皿中培养；
c.每24h观察细胞状态和培养基情况，接种后24小时添加1倍培养基，48小时后弃一半培养基再添加一倍培养基，72小时后全部弃掉培养基，换入新鲜培养基，之后每天都换入新鲜培养基，一周精原干细胞集落可以长起来并传代。
9.根据权利要求8所述的建立可持续传代的树鼩精原干细胞细胞系的方法，其特征在于，所述的传代培养的方法中培养基是专用培养基中不添加wnt3a成分。
10.根据权利要求1所述的建立可持续传代的树鼩精原干细胞细胞系的方法培养的树鼩精原干细胞系。
CN201610460383.XA 2016-06-23 2016-06-23 一种建立可持续传代的树鼩精原干细胞细胞系的方法 Active CN106085951B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610460383.XA CN106085951B (zh) 2016-06-23 2016-06-23 一种建立可持续传代的树鼩精原干细胞细胞系的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610460383.XA CN106085951B (zh) 2016-06-23 2016-06-23 一种建立可持续传代的树鼩精原干细胞细胞系的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106085951A true CN106085951A (zh) 2016-11-09
CN106085951B CN106085951B (zh) 2020-01-14

Family

ID=57252237

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610460383.XA Active CN106085951B (zh) 2016-06-23 2016-06-23 一种建立可持续传代的树鼩精原干细胞细胞系的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106085951B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112251399A (zh) * 2020-10-21 2021-01-22 中国科学院水生生物研究所 一种用于黄鳝生殖干细胞的分离方法及培养基
CN112961822A (zh) * 2021-02-25 2021-06-15 南方医科大学 一种睾丸类器官及其构建方法与应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102382799A (zh) * 2010-08-31 2012-03-21 吴际 小鼠精原干细胞的体外分离培养方法及其专用培养基

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102382799A (zh) * 2010-08-31 2012-03-21 吴际 小鼠精原干细胞的体外分离培养方法及其专用培养基

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NADY GOLESTANEH等: "Wnt signaling promotes proliferation and stemness regulation of spermatogonial stem/progenitor cells", 《REPRODUCTION》 *
罗荣灿等: "以树鼩为动物模型研究精原干细胞的初步探讨", 《医学分子生物学杂志》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112251399A (zh) * 2020-10-21 2021-01-22 中国科学院水生生物研究所 一种用于黄鳝生殖干细胞的分离方法及培养基
CN112251399B (zh) * 2020-10-21 2022-12-09 中国科学院水生生物研究所 一种用于黄鳝生殖干细胞的分离方法及培养基
CN112961822A (zh) * 2021-02-25 2021-06-15 南方医科大学 一种睾丸类器官及其构建方法与应用
CN112961822B (zh) * 2021-02-25 2023-03-14 南方医科大学 一种睾丸类器官及其构建方法与应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN106085951B (zh) 2020-01-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2017018137A (ja) ヒト多能性細胞培養のための簡易基本培地
US20070212777A1 (en) Undifferentiated stem cell culture systems
JP6935101B2 (ja) 幹細胞を再樹立する方法
Choi et al. A novel feeder-free culture system for expansion of mouse spermatogonial stem cells
WO1995010599A1 (en) Embryonic stem cell-like cells
CN106032527A (zh) 一种耐受低密度的无饲养层人多能干细胞培养基
CN101525592A (zh) 具有两条活性x染色体的人孤雌胚胎干细胞系及其衍生物
US9163214B2 (en) Method for culturing stem cells
CN104946581B (zh) 一种培养猪滋养层干细胞的专用培养基及方法
CN108998410A (zh) 蛋白激酶抑制剂在抑制单倍体细胞二倍化中的用途
CN105062958A (zh) 一种用于胚胎干细胞培养的组合物及其应用
CN113046311B (zh) 一种诱导多能干细胞定向分化为淋巴组织诱导细胞的方法
CN106085951A (zh) 一种建立可持续传代的树鼩精原干细胞细胞系的方法
WO2016052759A1 (ja) 多能性幹細胞再樹立法
CN1995334A (zh) 一种培养小鼠胚胎干细胞的方法及其专用培养基
CN114276984B (zh) 雌性生殖干细胞转分化至功能精子的方法及应用
US20050095708A1 (en) Characterization and isolation of subsets of human embryonic stem cells (HES) and cells associated or derived therefrom
Conley et al. Mouse embryonic stem cell derivation, and mouse and human embryonic stem cell culture and differentiation as embryoid bodies
CN104774803A (zh) 新的胚胎干细胞培养体系及胚胎干细胞建系方法
CN107723273A (zh) 一种完全小分子化合物诱导山羊多能干细胞的制备方法
CN102816796B (zh) c-Jun的N端缺失诱导多能性干细胞的方法和应用
CN108707600A (zh) 一种猪鼠细胞单细胞融合方法
CN108251377B (zh) 利用携带Xist Tale抑制性转录因子R6的R6-MEF制备饲养层细胞的方法
US20100136598A1 (en) Novel mesenchymal progenitor cells derived from human blastocyst-derived stem cells
Xu et al. A modified method for generation of neural precursor cells from cultured mouse embryonic stem cells

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant