CN105062958A - 一种用于胚胎干细胞培养的组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于胚胎干细胞培养的组合物，其能确保胚胎干细胞长期处于未分化状态并具有无限增殖的能力。其包括白血病抑制因子(LIF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、Rho激酶抑制剂Y27632、骨形态发生蛋白抑制剂Noggin。本发明还提供了包含该组合物的细胞培养液及其应用。

Description

一种用于胚胎干细胞培养的组合物及其应用

技术领域

本发明涉及细胞学领域，具体地，涉及一种用于胚胎干细胞培养的组合物及其应用。

背景技术

人类胚胎干细胞的成功分离培养建系是当今生命科学的重要进展，它是从人类早期植入前胚胎的内细胞团中分离而来的、能在体外适当条件下保持不分化并不断增殖的一种干细胞。理论上，它具有分化成机体所有细胞组织的潜能，被称为“种子细胞”。人们可以利用不同的培养条件将胚胎干细胞定向诱导分化产生大量不同类型的细胞来作为细胞移植、组织替代甚至器官克隆的细胞供体，为将来治疗人类诸多的难治性疾病提供无限的细胞来源。因此在将来的医学临床应用中前景广阔，成为21世纪生命科学中又一研究热点。此外，人胚胎细胞还有诸多其他用途，比如，其作为基因治疗的载体，通过同源重组方式进行基因剔除或转基因将修饰基因导入到干细胞中，可达到基因治疗的目的；它可提供任何组织类型的正常人类细胞，为开发新药提供大量标本，而且可用于筛选药物、鉴定新药作用的靶基因位点、筛选用于组织再生基因治疗的基因。哺乳动物的胚胎干细胞则是生物医学研究中的重要工具和模型。高效的胚胎干细胞培养系统将促进基于干细胞的再生生物医学的研究和临床治疗。

胚胎干细胞的培养需要注意以下两点：一、确保胚胎干细胞处于未分化状态；二、确保胚胎干细胞具有无限增殖的能力。

现有的文献1：XueFetal,Recombinantrabbitleukemiainhibitoryfactorandrabbitembryonicfibroblastssupportthederivationandmaintenanceofrabbitembryonicstemcells.CellReprogram.2012;14(4):364-76（薛非等，重组兔白血病抑制因子和兔胎儿成纤维细胞支持兔胚胎干细胞的获取与维持。Cell　Reprogram.　2012:14(4):364-76）。其公开的家兔胚胎干细胞培养液包括下述组分：

我们在上述细胞培养液的基础上添加了GSK/3信号通路抑制剂CHIR99021和MEK抑制剂PD0325901，发现虽然家兔胚胎干细胞能够在该培养基中可以短暂形成干细胞克隆，但是不能长期地维持胚胎干细胞的特性。这些细胞克隆短暂显示胚胎干细胞的特性，但在体外的条件下，很快分化为成纤维样的细胞群体。

我们发现在添加白血病抑制因子（LeukemiaInhibitoryFactor，LIF）、碱性成纤维细胞生长因子（basicFibroblastGrowthFactor，bFGF）、Rho激酶抑制剂Y27632、骨形态发生蛋白抑制剂Noggin的基础培养液中，胚胎干细胞能够长期处于未分化状态并具有无限增殖的能力。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种用于胚胎干细胞培养的组合物，其能确保胚胎干细胞长期处于未分化状态并具有无限增殖的能力。

本发明另一个要解决的技术问题是提供一种包含该组合物并能够适用于胚胎干细胞培养的细胞培养液。

本发明又一个要解决的技术问题是提供该培养液在哺乳动物胚胎干细胞中的应用。

为解决上述技术问题，本发明的一种用于胚胎干细胞培养的组合物，其包括白血病抑制因子(LIF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、Rho激酶抑制剂Y27632、骨形态发生蛋白抑制剂Noggin。

进一步地，该组合中白血病抑制因子(LIF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、Rho激酶抑制剂Y27632、骨形态发生蛋白抑制剂Noggin配比为（1μg～80μg）：（1μg～200μg）：（1μmol～100μmol）：（10μg～1000μg）。

为解决上述技术问题，本发明的包含该组合物的一种细胞培养液，其包括

基础培养液1000ml/L；

白血病抑制因子1μg/L～80μg/L；

碱性成纤维细胞生长因子1μg/L～200μg/L；

Rho激酶抑制剂Y276321μmol/L～100μmol/L；

骨形态发生蛋白抑制剂Noggin10μg/L～1000μg/L。

进一步地，所述基础培养液包括

KnockoutDMEM培养液800ml/L；

胎牛血清200ml/L；

非必需氨基酸0.1mmol/L；

β巯基乙醇0.1mmol/L；

谷氨酰胺4mmol/L；

青霉素50000U/L；

链霉素50mg/L。

更进一步地，所述碱性成纤维细胞生长因子浓度为10μg/L～200μg/L。

更进一步地，所述白血病抑制因子浓度为10μg/L～80μg/L。

更进一步地，所述Rho激酶抑制剂Y27632浓度为5μM～40μM。

更进一步地，所述骨形态发生蛋白抑制剂Noggin浓度为100μg/L～800μg/L。

更进一步地，所述基础培养液中KnockoutDMEM培养液可由DMEM培养液替代，我们发现还有上述四个因子的细胞培养液，其基础培养液采用DMEM培养液也能达到类似的效果。

本发明的上述细胞培养液在胚胎干细胞培养中的应用。

进一步地，所述胚胎干细胞选自小鼠胚胎干细胞或家兔胚胎干细胞或人胚胎干细胞。

经实验证明，家兔胚胎干细胞在包含白血病抑制因子LIF、碱性成纤维细胞生长因子bFGF、Rho激酶抑制剂Y27632、骨形态发生蛋白抑制剂Noggin四个因子的细胞培养液中生长得到显著改善，多能性表达增强，并能在体外试验条件下分化为不同的胚层，表达该胚层的特异分子标记、特异基因，并在囊胚注射后可形成嵌合体动物；即胚胎干细胞在该培养体系中能够处于未分化状态并具有无限增殖的能力。同时，含有上述4个因子组合物的细胞培养液同样适用于小鼠胚胎干细胞和人胚胎干细胞的培养。具体地，LIF促进LIF/STAT3的信号通路；bFGF促进FGF/MEK/ERK的信号通路，LIF/STAT3和FGF/MEK/ERK信号通路开通可以确保胚胎干细胞的诱导与维持。Y27632抑制Rho激酶通路，从而防止细胞的凋亡（programmedcelldeath）。Noggin则是BMP/Smad信号通路的抑制剂，BMP/Smad信号通路的开通，会阻止胚胎干细胞的形成与维持，同时促进干细胞的快速分化。Noggin能够有效地抑制BMP/Smad信号通路，从而防止细胞的分化，促进胚胎干细胞的维持。

附图说明

图1A为家兔胚胎干细胞在bFGF添加和无bFGF添加的培养基中培养的显微图像。在有10ng/mLbFGF添加的培养基中，细胞生长呈现出明显的家兔胚胎干细胞的特性，细胞之间的接触致密，细胞形态规则整齐，细胞成克隆生长状态。在无bFGF添加的培养基中细胞迅速分化，出现成纤维类型的形态与生长模式。

图1B为家兔胚胎干细胞在添加不同浓度的bFGF的培养条件下的细胞生长比例分布图。在添加了5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml，40ng/ml，80ng/ml，100ng/ml和200ng/mlbFGF标准培养液的滋养细胞层上接种10x10⁴的干细胞。扩增三代后的结果显示在40ng/mL及更高的浓度时，干细胞显示出相似的细胞动力学特性。合适的bFGF浓度为40-200ng/mL。

图1C为家兔胚胎干细胞在不同浓度的LIF的细胞生长曲线图。用在添加了0，10ng/ml，20ng/ml，40ng/ml和80ng/mlLIF的滋养细胞层上接种10x10⁴干细胞。在对照组中加入10ng/ml的市销LIF（Millipore,USA），在20ng/ml及以上浓度，用rbLIF培养的干细胞显示出和对照组相似的细胞动力学特性。合适的LIF浓度为10ng/mL～80ng/mL。

图1D为家兔胚胎在添加了LIF、CHIR99021和PD0325901的培养基中培养的显微图像。D0天，兔胚泡被接种到小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上；D2天，捕捉到假定的基态细胞群；D4天，细胞开始死亡。

图1E为家兔胚胎干细胞细胞系M5、2-4在添加不同浓度的Y27632的FL培养体系下的细胞生长数量曲线图。Y27632浓度在5μM～40μM较为适宜。图示中出现不同的a,b,c,d标识说明，处理组中的细胞数目存在显著差异（p<0.05）;处理组b和bc,cd和d,bc和cd之间只要出现重叠的字母，说明处理组中细胞数目没有差异(p>0.05)。

图1F上两排为家兔胚胎干细胞细胞系M5添加0到100μMY27632的FL培养体系下培养的显微图像。底排左是M5干细胞系添加0μMY27632的碱性磷酸酶（AP）染色，底排右M5干细胞系添加10μMY27632的碱性磷酸酶染色。添加了Y27632的M5干细胞系出现明显增加的AP染色的干细胞克隆（底排右）。

图1G为家兔胚胎干细胞在Noggin添加和无Noggin添加的培养基中培养的免疫荧光检测图像。

图1H为家兔胚胎干细胞细胞系M5分别在FL培养体系以及iFLY培养体系下，传代2次后所做的多潜能标志基因的RT-PCR检测结果图。被检测的所述家兔胚胎干细胞多潜能标志基因Oct4、Sox2、Nanog、C-Myc、Klf4、Dppa5、Fgf5、Rex1、G3PDH在iFLY体系中M5细胞中均得到表达；但在FL体系中，Sox2、Nanog、Dppa5、Fgf5基因未表达。

图2A为利用iFLY培养体系建立家兔胚胎干细胞细胞系的过程示意图。D0天，胚胎接种在iFLY培养液的第0天；D2天，出现细胞群体的生长；D5天，生长的细胞群体更加致密，形成干细胞样的细胞群体；P1细胞经过一次传代后产生明显的干细胞群体。

图2B为经iFLY培养体系培养的家兔胚胎干细胞细胞系#6-4以及#7-1，家兔胚胎干细胞特定标记物的免疫荧光检测图像。被检测的家兔胚胎干细胞特定标记物SSEA4、Oct4、Sox2、Nanog均得到表达。

图2C为经iFLY培养体系培养的家兔胚胎干细胞细胞系#6-4以及#7-1，家兔胚胎干细胞多能标志基因的RT-PCR检测结果图。被检测的所述家兔胚胎干细胞多潜能标志基因包括Oct4、Nanog、Sox2、Klf4、C-Myc、Fgf5、Rex1、Dppa5均得到表达。G3PDH检测组织中RNA是否降解。

图2D为经iFLY培养体系培养的家兔胚胎干细胞细胞系#7-1体外分化能力检测的显微图像。D1天，家兔胚胎干细胞悬浮培养一天以后细胞群；D4EB经过4天的悬浮培养以后，家兔胚胎干细胞分化成拟胚体（Embryoidbody）的形态。

图2E为经iFLY培养体系培养的家兔胚胎干细胞细胞系#7-1体外分化实验中分化为不同的胚层，对不同胚层细胞的特定标记物Gata4（内胚层）、βIIItubulin（外胚层）免疫荧光检测图像。

图2F为D5天形成的拟胚体EB的多潜能标志基因的RT-PCR检测结果图。拟胚体表达三个主要胚层的标记：内胚层Gata4、中胚层Desmin和Brachyury、外胚层Nestin和Pax6；但不表达多潜能性基因Oct4、Sox2和Nanog。

图3A为用经iFLY培养体系培养的家兔胚胎干细胞细胞系#7-1的细胞进行囊胚注射后形成嵌合体动物。

图3B为囊胚注射实验获得的3只存活的嵌合体动物的基因检测结果图。图中M代表DNA分子量标记，pCAG-GFP代表转到兔拟胚体细胞的GFP质粒，#1-5代表嵌合体，WT代表野生型控制动物；试验结果表明3只成功存活的嵌合体动物（#1，#2和#4）的基因组均表达GFP转入基因，GFP转入基因大小为226bp。

图3C为#2动物的GFP标记物的免疫荧光检测，试验结果表明#2动物细胞内存在GFP，GFP细胞为家兔胚胎干细胞来源分化的细胞，该#2仔兔为嵌合体动物。

具体实施方式

实施例一

实验1：家兔胚胎在bFGF添加和无bFGF添加的培养基中培养的对照试验。

家兔胚胎干细胞的基础培养液是由KnockOutDMEM（Invitrogen,USA）添加20%胎牛血清，0.1mM非必需氨基酸，0.1mMβ-巯基乙醇（Millipore,USA）,4mM谷氨酰胺，50单位/mL青霉素，50μg/mL链霉素。

在基础培养液中添加10ng/mLLIF(Millipore,USA)，10ng/mLbFGF(Invitrogen,USA)，以下称为FL培养体系。

在基础培养液中添加10ng/mLLIF(Millipore,USA)，10ng/mLbFGF(Invitrogen,USA)，10μMY27632，100ng/mLNoggin，以下称为iFLY培养体系。

在基础培养液只添加LIF，不加bFGF作为对照组（无bFGF）。

新西兰兔（购自南京金陵种兔场）采用超数排卵处理，即连续3天注射总量2.4mg卵泡刺激素（FSH，Folltropin，Bioniche，Canada），再注射200IU人绒毛膜促性腺激素（hCG，Chorulon，Intervet，USA）。经过超排的母兔与公兔交配，18小时后取卵，胚胎培养在2.5%FBS的B2胚胎培养液（LaboratoriesCCD，France）中，38.5度，5%CO₂的条件下培养3天至囊胚。将囊胚分别放入FL培养体系和对照组中培养，研究bFGF对家兔胚胎干细胞获取与维持的作用与影响。结果证明，在FL培养体系中，细胞的生长呈现明显的家兔胚胎干细胞特性，细胞的排列规则整齐，细胞间接触精致，细胞生长聚集，体现克隆细胞的生长模式，如图1A左图所示。在没有添加bFGF（0ng/mLbFGF）的对照组中，细胞克隆生长瓦解，细胞迅速分化为成纤维细胞类型，如图1A右图所示。

家兔胚胎干细胞固定在4%多聚甲醛(Sigma,USA)，用PBS漂洗，再在碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase,AP)染色液中，细胞在倒置显微镜下观察，呈现红色染色的细胞为具备干细胞潜能的细胞。细胞用4%多聚甲醛固定后，经0.2%TritonX-100，0.1%Tween渗透干细胞的细胞膜，用鼠抗人Oct4第一抗体染色细胞，再用FITC标记的驴抗鼠IgG的第二抗体处理，在荧光显微镜下检查细胞的染色情况。Oct4是干细胞特异性标记的蛋白，存在于细胞核中，显示荧光的细胞可以认定是具备干细胞潜能的细胞。我们分别用24个胚胎进行家兔胚胎干细胞的获取实验，每组12个胚胎，在添加10ng/mLbFGF的实验组中，获得可传代的7个细胞系，体现干细胞特性（AP碱性磷酸酶和Oct4）的细胞系2个，分别定义为家兔胚胎干细胞系M5、2-4，获取比例为16.7%；在未添加bFGF的培养液中，未诱导出家兔胚胎干细胞系，具体结果如表1所示。

表1：家兔胚胎在bFGF条件下（FL）诱导家兔胚胎干细胞系

我们将传代第五代的M5（FL体系）细胞系培养在添加了不同浓度bFGF的标准培养液中。在此后扩增三代后的细胞数量统计结果显示，从5ng/ml、10ng/ml到20ng/ml的bFGF条件下，rbES的生长出现快速并显著地增长，如图1B所示。直至bFGF到40ng/mL及以上浓度，家兔胚胎干细胞的生长模式出现了类似的细胞动力学特性。浓度在40ng/mL～200ng/mL时，干细胞的生长出现了剂量饱和的现象，如图1B所示。由此得出，维持家兔胚胎干细胞M5系的生长所需要的bFGF添加浓度为10ng/mL～200ng/mL，其最佳浓度为40ng/mL。

实验2：家兔胚胎干细胞M5（FL）在添加不同浓度的LIF的培养基中生长试验

我们通过在饲养层细胞上，添加不同浓度LIF（Millipore,USA）：0～80ng/mL的M5干细胞培养液中培养初始接种浓度为10X10⁴/mL干细胞，来检测干细胞培养过程中所需LIF的浓度效应，实验结果如图1C所示。这些结果表明，LIF对干细胞的生长起支持的作用，优选地，维持家兔胚胎干细胞系的生长所需要的LIF浓度为10ng/mL～80ng/mL，而最佳浓度为为20ng/mL。

实验3：家兔胚胎在添加了bFGF、LIF、CHIR99021和PD0325901的培养液中培养。

家兔胚胎干细胞的基础培养液是由NDiffN2B27（StemCellSciences,USA）添加10ng/mLLIF，3μMCHIR99021(RLI-CHIR-01,RenovaLifeInc.,USA),1μMPD0325901(RenovaLifeInc.,USA)。胚胎在bFGF、LIF、CHIR99021和PD0325901的培养液中培养2天后，细胞生长出现干细胞群的基态，但在4天以后，细胞出现死亡，如图1D所示。实验证明CHIR99021和PD0325901不能够满足家兔胚胎干细胞的诱导与获取。

实验4：家兔胚胎干细胞细胞系M5、2-4在添加不同浓度的Y27632中培养。

家兔胚胎干细胞细胞系M5、2-4来源于添加FL培养体系（表1），两个细胞系在添加Y27632浓度从0μM、5μM、10μM、20μM、40μM到100μM的FL培养液中培养，M5和2-4出现类似的细胞生长模式，如图示1E所示。随着Y27632的浓度从0增加到5μM，细胞的迅速的细胞生长；当Y27632浓度在10-20μM之间，家兔胚胎干细胞呈现最佳的生长模式，如图1E，1F所示。随着Y27632浓度增加到40-100μM细胞的生长抑制，说明高浓度的Y27632对家兔胚胎干细胞产生毒性，从而抑制细胞的扩增，如图示1E所示。优选地，Y27632培养家兔胚胎干细胞的浓度为5μM～40μM；而最佳浓度为10μM。

实验5：家兔胚胎干细胞在Noggin添加和无Noggin添加的培养基中培养。

家兔胚胎干细胞在含有100ng/mLNoggin的iFLY培养体系中培养4天以后，使用10μg/mLDAPI（Sigma,USA）染色15分钟，在荧光显微镜下检查细胞核的染色情况。细胞用4%多聚甲醛固定，经0.2%TritonX-100，0.1%Tween渗透干细胞的细胞膜，用鼠抗人Oct4第一抗体染色细胞，再用FITC标记的驴抗鼠IgG的第二抗体处理，在荧光显微镜下检查细胞的染色情况。实验结果显示，在添加100ng/mLNoggin的培养条件下，家兔胚胎干细胞的数量明显增加，如图1G所示，DAPI染色见细胞数量增加；带有干细胞特定标记物Oct4的细胞数量也明显地增加。实验证明在干细胞培养液中添加Noggin（100ng/mL）明显提高家兔胚胎干细胞的生长与数量（图1G）。

进一步，我们在FL培养体系中加入40ng/mLbFGF，再加入0、100ng/mL、200ng/mL、400ng/mL、800ng/mL和1000ng/mL的Noggin。在添加不同浓度的Noggin后，分析家兔胚胎干细胞M5系传代5代（M5P5）（FL体系）的生长与分化模式（表2）。实验结果进一步证明Noggin能够改善家兔胚胎干细胞M5系的生长，并抑制M5干细胞的分化程度。在400ng/mL的浓度下，M5干细胞出现最佳的细胞动态生长与极低的细胞分化。Noggin在800ng/mL出现生长与分化模式的饱和效应（表2），到1000ng/mLNoggin则反而生长的降低，并加剧干细胞的分化。我们认为高浓度的Noggin可能对兔干细胞产生细胞的毒理作用。添加Noggin的合适浓度为100ng/mL～800ng/mL，而改善rbES细胞生长的优选浓度为100ng/mL～800ng/mL，而最佳浓度为400ng/mL，如表2所示。

表2.Noggin提高家兔胚胎干细胞系M5生长的浓度效应

*+根据细胞生长与分化的程度做认为的定性分析，基准是在M5P5在未加Noggin时的胚胎干细胞群体直径大小定为“+”；分化的细胞群体定位“+++”。在添加Noggin以后，胚胎干细胞的直径增加的程度，以及分化抑制的程度以比较未添加Noggin的细胞形态来确定增加或减少。

实验6：家兔胚胎干细胞细胞系M5分别在FL和iFLY培养体系下传代2次后多潜能标志基因的RT-PCR检测。

家兔胚胎干细胞系M5分别在FL和iFLY体系中培养传代2次后，采用反转录酶（reversetranscriptase）-多聚酶联反应（RT-PCR）的方法检测家兔胚胎干细胞特定标记物的mRNA表达。干细胞采用QiagenRNeaseMini试剂盒（Qiagen，USA）提取RNA；RNA在反转录酶的作用下，在42度温浴15分钟，反转录成单链的cDNA，然后经过PCR扩增成相应的DNA产物。该方法用来检测细胞中表达mRNA的方法。RT-PCR的引物见表3，这些基因分别指示家兔胚胎干细胞，内胚层，中胚层，外胚层的特异性标记物。如果RT-PCR出现相应的扩增DNA片段，说明该基因在细胞中表达了mRNA。GAPDH作为mRNA的阳性对照，确认RNA是否出现部分降解或破坏。

图1H结果显示，家兔胚胎干细胞M5在iFLY的培养系统中，细胞充分表达了干细胞特异性的基因，Oct4,Sox2,Nanog,C-myc,Klf4,Dappa5,Fgf5和Rex1的mRNA均在家兔胚胎干细胞中表达；而在FL系统中，M5细胞仅表达Oct4,C-Myc,Klf4,Rex1，并没有表达Sox2,Nanog，Dppa5，Fgf5的基因。这些结果证明：（1）iFLY体系在维持家兔胚胎干细胞特性方面，比FL体系更为有效；(2)Y27632和Noggin对家兔胚胎干细胞的体外维持具有协同的效应。

表3.RT-PCR所用的引物

实验7：家兔胚胎干细胞细胞系M5、2-4分别在FL和iFLY培养体系下的培养。

家兔胚胎干细胞M5和2-4细胞系在FL和iFLY的培养系统中，经过24h培养，细胞数量M5系从1.4X10⁴，增加到4.5X10⁴；2-4系从1.5X10⁴增加到5.9X10⁴，但没有显著差异；但在培养48h后，M5(2.8X10⁴增加到13.4X10⁴)，2-4（2.3X10⁴增加到15.4X10⁴）；在培养72h后，M5(3.6X10⁴增加到26.1X10⁴)，2-4（3.2X10⁴增加到28.7X10⁴），这两个家兔胚胎干细胞系（M5,2-4）都出现显著的细胞数量增加（p<0.05），如表4所示。实验进一步证明iFLY比较FL体系更能够维持家兔胚胎干细胞的生长与增殖。

表4：家兔胚胎干细胞在两种体系中的生长模式

*竖栏中M5和2-4系中显示a，b不同符号的具有统计学的显著差异（p<0.05）。

实施例二

实验1’：利用iFLY培养体系建立家兔胚胎干细胞细胞系。

iFLY培养体系组成与上述的相同，如图示2A所示，胚胎在iFLY中培养后，两天出现干细胞样的生长（D2），5天后细胞生长更加致密，形态呈现干细胞的特性（D5）。诱导的干细胞经过一次传代后（P1），产生明显的干细胞形态（图2A）。此外，实验证明，对于新鲜的或冷冻囊胚均能在iFLY培养体系中培养，获得家兔胚胎干细胞（10.2%vs.16.9%），如表5所示。1-2细胞期的冷冻胚，在解冻后再培养成囊胚以后，在进行家兔胚胎干细胞诱导时，效率下降到1.5%，如表5所示。

表5新鲜胚胎与冷冻胚胎对家兔胚胎干细胞获取的影响

*1-2细胞期的培养经过冷冻解冻后，在2.5%FBSB2培养液中培养3天至囊胚，然后再进行家兔胚胎干细胞的诱导与获取。

实验2’:家兔胚胎干细胞系#6-4以及#7-1中家兔胚胎干细胞特定标记物的免疫荧光检测。

家兔胚胎干细胞系#6-4，#7-1选自实验1’中新鲜胚在iFLY体系诱导后获取的家兔胚胎干细胞系（AP碱性磷酸酶和Oct阳性细胞系）。干细胞培养物用4%多聚甲醛固定，经0.2%TritonX-100，0.1%Tween通透干细胞的细胞膜，用鼠抗人SSEA4,Oct4，Sox2，Nanog第一抗体染色细胞，再用FITC标记的驴抗鼠IgG的第二抗体处理后，在荧光显微镜下，检查细胞特异性蛋白质染色与表达。实验结果显示，在iFLY的培养条件下，家兔胚胎干细胞系#6-4，#7-1都出现碱性磷酸酶（AP）（干细胞特征），以及SSEA4,Oct4，Sox2，Nanog蛋白质在细胞中表达，如图2B所示。证明细胞系#6-4，#7-1能够表达家兔胚胎干细胞特定的蛋白质与标记物。

实验3’:家兔胚胎干细胞细胞系#6-4以及#7-1中家兔胚胎干细胞多能标志基因的RT-PCR检测。

家兔胚胎干细胞系#6-4和#7-1在iFLY体系中培养后，采用RT-PCR检测干细胞特定标记物的mRNA表达。RT-PCR的方法如上所述，PCR的引物见表3，这些基因的表达：Oct4,Sox2,Nanog,C-myc,Klf4,Dappa5,Fgf5和Rex1，表明具有家兔胚胎干细胞的特性。GAPDH作为mRNA的阳性对照。实验结果如图2C所示，#6-4和#7-1细胞系能够表达所有Oct4,Sox2,Nanog,C-myc,Klf4,Dappa5,Fgf5和Rex1的mRNA。

实验4’:家兔胚胎干细胞细胞系#6-4以及#7-1染色体核型检测分析。

家兔胚胎干细胞#6-4以及#7-1（iFLY体系）培养在含有100ng/mL秋水素碱（Colcemid）（Invitrogen，USA）的培养液中在38度5%CO₂条件下培养2~3小时，细胞经过低渗溶液75mMKCl中在37度水浴10分钟，固定在1：3冰醋酸/甲醇中，然后滴片分散细胞与染色体，再用5%Giemsa染色15分钟，在1000倍显微镜下拍照检查染色体的数目。分析结果如表6所示。

表6家兔胚胎干细胞系#6-4，#7-1细胞的核型分析

家兔细胞的正常核型为44个染色体，小于或大于44个染色体的核型为非正常核型。在实验中，结果显示#6-4和#7-1细胞系中有74.5-78.4%表现正常的染色体核型，明显高于现有的文献1所述（干细胞系M5的正常核型为60%；干细胞系为R457.5%）。

实验5’:家兔胚胎干细胞细胞系#7-1体外分化能力检测。

家兔胚胎干细胞系#7-1经过10次传代（iFLY体系）以后，用StemProAccutase蛋白消化酶（Invitrogen,USA）在37度下，消化3分钟，接种在低细胞悬浮细胞培养板（Corning，USA）培养4-7天，诱导拟胚体（embryoidbodies,EB），图2D显示干细胞系#7-1有效地分化成EB。拟胚体证明家兔胚胎干细胞#7-1在体外具有分化成三个胚层的潜能（外胚层，中胚层，内胚层），如图2D所示。

实验6’：实验4’中家兔胚胎干细胞细胞系#7-1体外分化的拟胚体不同胚层的免疫荧光检测。

免疫荧光法如上所述，#7-1细胞系分化成的拟胚体经过Gata4（内胚层），βIII微管蛋白（βIIItubulin,外胚层神经元细胞特异性标记物）染色，均表现出阳性，如图2E所示。结果证实干细胞系#7-1能够在体外分化成拟胚体，如图2D所示，并分化出展示内胚层与外胚层特性的细胞群体，如图2E所示。

实验7’：实验4’中家兔胚胎干细胞细胞系#7-1体外分化的拟胚体多能标志基因的RT-PCR检测。

家兔胚胎干细胞系#7-1在体外分化成拟胚体EB后，采用RT-PCR检测拟胚体中三个胚层特异性细胞的mRNA表达。RT-PCR的方法如上，PCR的引物见表3，这些基因表明了，家兔胚胎干细胞标记Oct4,Sox2,Nanog；内胚层GATA4；中胚层Desmin，Brachyury；外胚层Nestin,Pax6；GAPDH为mRNA阳性对照。实验结果证实，源自#7-1细胞系的拟胚体能够表达三胚层的基因，即内胚层（GATA4），中胚层（Desmin，Brachyury）和外胚层（Nestin,Pax6）mRNA特异性表达,但家兔胚胎干细胞特异性基因，如Oct4，Sox2和Nanog的mRNA则不表达，如图2F所示。由此证明拟胚体中不再存在家兔胚胎干细胞。

实施例三

实验1’’：家兔胚胎干细胞细胞系#7-1、M5囊胚注射实验。

家兔胚胎干细胞系#7-1（iFLY系统）和干细胞系M5（FL系统）用于囊胚注射产生嵌合体动物。野生型的新西兰兔的囊胚作为细胞注射的受体胚胎，#7-1和M5细胞采用绿色荧光（GFP）Fugene转换系统（Roche,USA）进行GFPDNA细胞感染，使干细胞基因组携带GFP基因，并在细胞中表达GFP蛋白；在荧光显微镜下，显示绿色荧光。将感染成功的GFP细胞系（#7-1，M5）的细胞用显微注射法打到野生型的囊胚中，大约5-10干细胞被注射到每个囊胚中。将大约10-20个注射后的囊胚移植至经过发情同期化处理的母兔中，新生仔兔耳朵取样，进行PCR检测GFPDNA。同时，将耳朵组织在体外培养成细胞系，在荧光显微镜下，检查携带GFP的细胞。

其结果如表7所示。

表7家兔胚胎干细胞注射与嵌合体的制作

细胞系#7-1（iFLY）共注射32个囊胚，移植到2只受体兔中出生4只仔兔，经过检测，有3个仔兔携带GFP基因，证明为嵌合体动物，效率为75%，如表7所示。细胞系M-6(FL)共注射75个囊胚，移植72个胚胎到4个受体母兔中，出生1个仔兔，经过检测为GFP阴性仔兔，为非嵌合体动物，如表7所示。

图3A为囊胚注射实验培养获得的5只存活动物，其中3只为嵌合体动物。

实验2’’：囊胚注射实验获得的5只存活动物的基因检测实验。

5只成活的仔兔进行耳朵组织取样，并提取DNA。用pCAG-GFP设计引物，PCR产物226bp。如图3B所示，#1～#5为待检测的仔兔样本，pCAG-GFP为阳性的对照，H₂O为阴性对照，WT为野生型的家兔组织的阴性对照（无GFP转染的细胞）。在PCR扩增的反应中，阳性与阴性的对照组都有预期的PCR反应，在#1，#2和#4仔兔中出现GFP的检测结果，证明仔兔#1，#2和#4的耳朵组织携带GFP的细胞。这些细胞源自于家兔胚胎干细胞系#7-1的细胞分化。实验进一步表明，用iFLY系统诱导后，将干细胞#7-1的细胞注射到囊胚中，出生的仔兔能形成嵌合体，并能分化成耳朵的组织与细胞，如图3B所示。

实验3’’：#2动物的GFP标记物的免疫荧光检测。

将嵌合体#2动物的耳朵组织取样，放置在10%胎牛血清（FBS）的DMEM（Gibco，USA）培养液中，在37度5%CO₂下，培养成细胞系。用荧光显微镜观察培养的细胞，检查是否携带GFP的细胞。携带有GFP的细胞，在荧光显微镜下，会自动显示绿色荧光。细胞在正常显微镜下呈现成纤维细胞的群体（图3C，Bright）；在荧光显微镜下，有部分的细胞显示GFP荧光，如图3C所示。这些实验清楚的证明，（1）#2仔兔是携带#7-1家兔胚胎干细胞的嵌合体，（2）部分呈现绿色荧光的细胞是由家兔胚胎干细胞#7-1细胞分化形成的。

Claims (11)

1.一种用于胚胎干细胞培养的组合物，其包括白血病抑制因子(LIF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、Rho激酶抑制剂Y27632、骨形态发生蛋白抑制剂Noggin。

2.根据权利要求1所示的一种用于胚胎干细胞培养的组合物，其特征在于：所述组合中白血病抑制因子(LIF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、Rho激酶抑制剂Y27632、骨形态发生蛋白抑制剂Noggin配比为（1μg～80μg）：（1μg～200μg）：（1μmol～100μmol）：（10μg～1000μg）。

3.一种细胞培养液，其包括

基础培养液1000ml/L；

白血病抑制因子1μg/L～80μg/L；

碱性成纤维细胞生长因子1μg/L～200μg/L；

Rho激酶抑制剂Y276321μmol/L～100μmol/L；

骨形态发生蛋白抑制剂Noggin10μg/L～1000μg/L。

4.根据权利要求3所述的细胞培养液，其特征在于：所述基础培养液包括

KnockoutDMEM培养液800ml/L；

胎牛血清200ml/L；

非必需氨基酸0.1mmol/L；

β巯基乙醇0.1mmol/L；

谷氨酰胺4mmol/L；

青霉素50000U/L；

链霉素50mg/L。

5.根据权利要求3所述的细胞培养液，其特征在于：所述碱性成纤维细胞生长因子浓度为10μg/L～200μg/L；最佳浓度为40μg/L。

6.根据权利要求3所述的细胞培养液，其特征在于：所述白血病抑制因子浓度为10μg/L～80μg/L；其最佳浓度为20μg/L。

7.根据权利要求3所述的细胞培养液，其特征在于：所述Rho激酶抑制剂Y27632浓度为5μM～40μM；最佳浓度为10μM。

8.根据权利要求3所述的细胞培养液，其特征在于：所述骨形态发生蛋白抑制剂Noggin浓度为100μg/L～800μg/L；最佳浓度为400μg/L。

9.根据权利要求4所述的细胞培养液，其特征在于：所述基础培养液中KnockoutDMEM培养液由DMEM培养液替代。

10.如权利要求3～9中任一所述的细胞培养液在胚胎干细胞培养中的应用。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于：所述胚胎干细胞选自小鼠胚胎干细胞或家兔胚胎干细胞或人胚胎干细胞。