CN102382798A - 小鼠雌性生殖干细胞的分离方法及体外培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种转基因工程技术领域的小鼠雌性生殖干细胞的分离方法，包括如下步骤：步骤一，收集小鼠卵巢，采用两步酶消化法制备生殖干细胞悬液；步骤二，向细胞悬液中加入mvh一抗，之后加入二抗磁珠，重悬细胞，分离出雌性生殖干细胞。本发明还提供一种小鼠雌性生殖干细胞的体外培养方法，将雌性生殖干细胞转移到STO细胞饲养层上，加入雌性生殖干细胞培养液，对雌性生殖干细胞进行原代培养和传代培养，得到纯化稳定生殖干细胞。本发明首次成功的分离并在体外培养了小鼠雌性生殖干细胞，本发明的方法简便，成本低廉，实验条件要求低，可操作性强。

Description

小鼠雌性生殖干细胞的分离方法及体外培养方法

技术领域

本发明涉及小鼠雌性生殖干细胞的分离方法及体外培养方法。

背景技术

卵巢生殖干细胞是雌性高等动物卵巢内维持卵子产生的干细胞。在生殖与发育生物学的经典理论里，雌性哺乳动物在出生后卵巢内的生殖细胞数目是固定的，没有增殖的能力，随着年龄的增加体内的卵母细胞越来越少直至绝经。目前，国际上对雄性生殖干细胞的研究已较广泛，在分离，鉴定，体外培养以及体内移植方面的技术都已趋于成熟。

经对现有技术的文献检索发现，2004年美国科学家Tilly在2004年《自然》杂志第428卷第6979期第145～150页上发表了一篇名为《出生后哺乳动物卵巢的生殖系干细胞和卵泡的自我更新》论文提示雌性小鼠卵巢里可能存在生殖细胞的增殖活动。而对出生后哺乳动物雌性生殖干细胞的分离和长期培养尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供小鼠雌性生殖干细胞的分离方法。本发明首次成功的分离并在体外培养了小鼠雌性生殖干细胞，本发明的方法简便，成本低廉，实验条件要求低，可操作性强。

本发明是通过以下的技术方案实现的，

本发明提供小鼠雌性生殖干细胞的分离方法，包括如下步骤：

步骤一，收集小鼠卵巢，采用两步酶消化法制备生殖干细胞悬液；

步骤二，向细胞悬液中加入mvh一抗，之后加入二抗磁珠，重悬细胞，分离出雌性生殖干细胞。

本发明的另一个目的还在于提供小鼠雌性生殖干细胞的体外培养方法，将上述步骤二分离得到的雌性生殖干细胞转移到STO细胞饲养层上，加入雌性生殖干细胞培养液，对雌性生殖干细胞进行原代培养和传代培养，得到纯化生殖干细胞。

所述STO细胞饲养层的制备方法，包括如下步骤：将50μl 0.5mg/ml的丝裂霉素C加入到2450μl STO细胞培养液中，丝裂霉素C的终浓度为0.01mg/ml；将此含有丝裂霉素C的培养液加到培养的STO细胞上，37℃细胞培养箱中培养2.5-3个小时；向二十四孔板中铺上0.1％的明胶，放置30min后，吸去明胶，在超净台中晾干；将处理好的STO细胞用胰蛋白酶消化，离心收集，均匀铺到二十四孔板上；将二十四孔板放入细胞培养箱中过夜，即得STO细胞饲养层。

所述雌性生殖干细胞的原代培养方法包括如下步骤：培养小鼠雌性生殖干细胞，每2天更换干细胞培养液，4-6天传代一次；所述传代培养方法具体为：吸去原有培养液，加入胰蛋白酶，置于细胞培养箱中培养，之后加入干细胞培养液，然后将液体转移至新的STO细胞饲养层上，培养。

所述雌性生殖干细胞培养液包括MEM-α、FBS、L-谷氨酰胺、LIF、bFGF、维生素C、EGF、GDNF。

所述雌性生殖干细胞培养液进一步包括非必需氨基酸、还原剂、丙酮酸钠、青霉素G钠盐中的至少一种或它们的组合。

所述还原剂是β-巯基乙醇。

所述FBS的体积百分含量为8-10％，所述LIF的含量为10²-10⁴U/ml，所述bFGF的含量为0.02-0.03μg/ml，所述维生素C的含量为40-60μg/ml，所述EGF的含量为0.01-0.02μg/ml，所述GDNF的含量为0.01-0.02μg/ml。

优选地，在所述雌性生殖干细胞培养液中，所述FBS的体积百分比为10％，所述LIF的含量为10³U/ml，所述bFGF的含量为0.02μg/ml，所述维生素C的含量为50μg/ml，所述EGF的含量为0.01μg/ml，所述GDNF的含量为0.01μg/ml。

配制雌性生殖干细胞培养液的具体步骤为：100ml雌性生殖干细胞培养液的配制为：取86.6ml MEM-α，10ml FBS，1ml 30mg/ml L-谷氨酰胺，1ml非必需氨基酸，1ml 100mmol/L丙酮酸钠，0.7μl β-巯基乙醇，250μl 20U/μl青霉素G钠盐，100μl 10⁶U/ml LIF，5μl 1mg/ml维生素C，2μl 1μg/μl bFGF，1μl 1μg/μl EGF，1μl 1μg/μl GDNF；将各组分混匀后过滤除菌，4℃保存。

所述非必需氨基酸购买自Invitrogen公司。

本发明通过将常用的双酶消化法和磁珠分选法结合起来，从小鼠卵巢中分离到雌性生殖干细胞：收集雌性小鼠卵巢，将其剪碎后用胶原酶和胰蛋白酶消化，得到粗纯度的细胞后，用mvh抗体与细胞结合，再通过二抗磁珠与细胞上的mvh一抗识别，从而分离纯化得到卵巢生殖干细胞。该干细胞通过上述方式，可以培养半年以上，也可用液氮低温冷冻保存。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：本发明首次成功的分离并在体外培养了小鼠雌性生殖干细胞，能够建立长期维持稳定的雌性生殖干细胞系，并且维持其卵子发生的功能，对不孕不育治疗及整个干细胞领域的研究都具有重大意义。本发明的方法简便，成本低廉，实验条件要求低，可操作性强。

附图说明

图1显示为小鼠雌性生殖干细胞系的建立。左图显示培养在丝裂霉素C处理过的STO细胞饲养层上24小时后的雌性生殖干细胞形态的照片。右图显示培养一年后，具代表性的雌性生殖干细胞形态的照片。

图2显示为小鼠雌性生殖干细胞移植后在受体卵巢内分化至卵母细胞。上图显示经120mg/kg环磷酰胺+30mg/kg白消安处理受体小鼠后两个月的卵巢组织形态的照片，见小鼠卵巢生殖细胞全部被破坏并以间质组织取代，上图的右上角插图为卵巢生殖细胞被破坏后留下的空泡或闭锁卵泡。下图显示雌性生殖干细胞移植两个月后的卵巢组织形态的照片，见卵子发生。

图3中的上图为雌性生殖干细胞移植入受体小鼠后，与雄性小鼠交配，产生后代。下图为Southern杂交检测eGFP转基因阳性小鼠的电泳图谱，1，2和4：转基因阳性小鼠；3和5：野生型小鼠。

具体实施方式

以下是对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

新生或成年小鼠雌性生殖干细胞的建系与移植

步骤一，雌性生殖干细胞的分离

将5日龄或42日龄雌性小鼠处死后，在无菌超净台中用75％的乙醇擦拭小鼠腹部，然后剪开腹部，沿输卵管找到卵巢。轻轻剪下卵巢，在预冷的D-Hanks液中剔除脂肪以及输卵管末端部分。将卵巢放入盛有100μl D-Hanks的1.5ml ep管中剪碎。将1.5ml ep管中剪碎的组织和液体一同转入12ml离心管中，并加入3.5ml含1mg/ml胶原酶的D-Hanks和1ml D-Hanks液，置于37℃水浴锅中轻轻摇晃15分钟。然后1000rpm离心5min，离心后用PBS缓冲液洗三次。随后立即加入5ml含0.5mg/ml胰蛋白酶的D-Hanks，于水浴锅中轻轻摇晃10min，最后加入胎牛血清终止胰蛋白酶作用并于1000rpm离心5min，得到细胞沉淀。

步骤二，雌性生殖干细胞的纯化与培养

向细胞沉淀中加入50-100μl D-Hanks液，用移液枪枪头轻轻吹打使细胞重悬，然后将管内细胞悬液转移到1.5ml ep管中，加入0.5μg/μl的mvh一抗2μl，于37℃培养一个小时。反应充分后，将ep管于1000rpm离心5min，吸去上清液，再用D-Hanks洗一次，以充分除去未结合的mvh一抗。然后加入1μl 5x10⁸个/ml二抗磁珠，置于4℃冰箱中放置30min，中途每五分钟需轻轻振荡一次，使磁珠与一抗尽量结合充分。随后将ep管放在磁珠分选架上，室温静置2min，然后轻轻吸去所有液体。此时需再加200μl D-Hanks液洗一次，从而达到除去所有未与磁珠结合的细胞。吸去D-Hanks液后，将ep管从磁珠架上取出，加入500μl雌性生殖干细胞培养液到ep管中，轻轻吹打使细胞重悬，然后将细胞悬液转移到处理好的STO细胞饲养层上，于37℃细胞培养箱中培养。培养几小时后，磁珠会自动脱落，通过传代，可得到纯化的细胞。

步骤三，雌性生殖干细胞的体外培养与传代

1、雌性生殖干细胞培养液配方

(1)配制雌性生殖干细胞培养液；100ml干细胞培养液的组分为：86.6mlMEM-α，10ml FBS，1ml 30mg/ml L-谷氨酰胺，1ml非必需氨基酸(购买自Invitrogen公司)，1ml 100mmol/L丙酮酸钠，0.7μl β-巯基乙醇，250μl 20U/μl青霉素G钠盐，100μl 10⁶U/ml LIF，5μl 1mg/ml维生素C，100μl 10⁶U/ml LIF，2μl 1μg/μl bFGF，1μl 1μg/μl EGF，1μl μg/μl GDNF；将各组分混匀后用0.22μm孔径滤膜过滤除菌，4℃保存；

(2)STO细胞培养液配方

88％DMEM，10％FBS，0.3mg/ml L-谷氨酰胺，100U/ml青霉素；

2、STO饲养层细胞的制备

(1)向24孔板的每个孔分别加入0.5ml 0.1％明胶，室温于超净工作台放置2h，然后吸去明胶，置于超净工作台中晾干后待用；

(2)吸去Φ60mm平皿中的STO细胞培养液，加入2.5ml含0.01mg/ml丝裂霉素C的STO细胞培养液，将平皿置于37℃培养箱中处理2.5h；

(3)处理2.5h后，取出平皿，吸去STO细胞培养液，向平皿中加入1ml PBS缓冲液，轻轻晃动平皿，弃去PBS缓冲液，如此反复操作5次；

(4)向平皿中加入1ml 2.5mg/ml胰蛋白酶，置于37℃培养箱中消化5min，然后加入等体积的新鲜STO细胞培养液(不含丝裂霉素C)终止胰蛋白酶消化，并用移液枪吹打，使细胞分散均匀；

(5)转移细胞悬液至12ml离心管中，1000rpm离心5min，弃去上清液，向离心管中加入3-5ml STO细胞培养液(不含丝裂霉素C)，并用移液枪吹匀细胞，然后分至铺有明胶的24孔板中，加入新鲜STO细胞培养液(不含丝裂霉素C)至0.5ml，于37℃培养箱中培养12h后，即可作为细胞的饲养层使用。

3、雌性生殖干细胞换液与传代

雌性生殖干细胞培养液和STO细胞培养液在使用前均要在细胞培养箱中平衡30min。雌性生殖干细胞需要铺在STO饲养层上，于37℃、CO₂含量为5％的细胞培养箱中培养。于24孔培养板中培养时，每孔加入500μl干细胞培养液。细胞培养过程中每三天换一次培养液；根据细胞密度，每四到六天传一次代。

(1)细胞换液

吸去细胞培养液，每孔加入500μl新鲜雌性生殖干细胞培养液，于细胞培养箱中培养。

(2)细胞传代

吸去细胞上清液，然后加入200μl 2.5mg/ml胰蛋白酶，于37℃培养箱中消化5min，然后加入200μl干细胞培养液，轻轻吹打使细胞脱落，然后转移到ep管中，1000rpm离心5min，吸去上清液，最后加入1-2ml干细胞培养液，重悬后均匀分配到STO饲养层细胞上，于37℃培养箱中培养。结果见图1，显示小鼠雌性生殖干细胞系的建立。左图显示培养在丝裂霉素C处理过的STO细胞饲养层上24小时后的雌性生殖干细胞形态。右图显示培养一年后，具代表性的雌性生殖干细胞形态。

4、小鼠雌性生殖干细胞移植

(1)受体小鼠的准备

按120mg/kg环磷酰胺+30mg/kg白消安混合液的剂量腹腔注射5-6周龄雌性小鼠(环磷酰胺cytoxan，白消安Busulfan，均为Sigma公司)。注射后，混合饲料喂养至少10天，使小鼠卵巢生殖细胞全部被杀死，随后可作为受体鼠进行雌性生殖干细胞的移植。

(2)雌性生殖干细胞悬液的制备

用2.5mg/ml胰蛋白酶消化细胞5min，加入等体积干细胞培养液吹打使细胞悬浮，转移悬浮细胞至离心管，1,000rpm离心得到细胞沉淀，加入预冷的无菌PBS重悬细胞，调整细胞密度约为10³-10⁴/μl。

(3)雌性生殖干细胞的移植

按100mg/kg剂量，腹腔注射戊巴比妥钠麻醉受体小鼠。用75％酒精棉球擦洗小鼠腹部，在腹中线附近剪开腹腔，沿着输卵管找到卵巢，用40μm口径毛细玻璃管将细胞悬液多点注入小鼠卵巢内，注意避免伤及血管。注射完毕后，将卵巢还入腹腔，缝合切口。移植五周后，将术后雌鼠与健康雄鼠合笼。

结果表明经上述浓度的环磷酰胺和白消安处理受体小鼠后两个月，受体小鼠卵巢生殖细胞全部被杀死，其卵巢组织形态见图2的上图，可见小鼠卵巢生殖细胞全部被破坏并以间质组织取代，插图为卵巢生殖细胞被破坏后留下的空泡或闭锁卵泡。然而受体小鼠经雌性生殖干细胞移植后两个月，可见其卵巢中有不同发育时期的卵母细胞，说明雌性生殖干细胞在卵巢内能分化至卵母细胞(见图2-下图)。

实施例2

构建eGFP转基因小鼠

步骤一，eGFP病毒颗粒的制备

(1)质粒的准备

取一个灭菌的EP管，加入3μg pMSCV-eGFP质粒、3μg pVPack-GP(gag-pol-expressing vector)与3μg pVPack-VSV-G(env-expressing vector)，再加入1ml无水乙醇和0.1倍体积的NaAc(3M)。用移液器混匀，置于-30℃共沉淀过夜。将混合质粒于4℃，12,000rpm离心10分钟，弃去上清液。然后加入1ml 70％乙醇，12,000rpm离心5分钟，弃去上清液。混合质粒保存于4℃，过夜。

(2)转染293T细胞

观察Φ60mm细胞培养平皿中293T细胞生长情况，当细胞生长至80％平皿时，方可用于转染实验。

移去旧的培养液，加入4ml含MBS[来自Stratagene公司的ViraPackTransfection kit(病毒包装转染试剂盒))的新鲜培养液，置于37℃培养箱培养。

取出含混合质粒的离心管，加入450μl灭菌超纯水，再加入50μl Solution I和500μl Solution II[Solution I和II分别来自Stratagene公司的ViraPackTransfection kit(病毒包装转染试剂盒)]，用移液器轻轻地混匀后，室温静置10分钟。

取出培养的293T细胞，将上述液体加入到培养皿中，轻轻的摇晃平皿，注意不要将细胞漂浮。再将细胞放回培养箱培养。

3小时后，移去平皿中的液体，加入4ml含25μM chloroquine的培养液。

6小时后，再移去平皿中的液体，加入4ml不含chloroquine的培养液。

(3)收集病毒颗粒

收集培养上清，用0.45μm微孔滤器过滤至灭菌离心管中，立即置于液氮中，而后置于-70℃长期保存。

步骤二，pMSCV-eGFP病毒颗粒感染雌性生殖干细胞

根据实施例1所述小鼠雌性生殖干细胞体外分离培养方法分离的雌性生殖干细胞体外培养20代后，将eGFP病毒颗粒感染该细胞。方法如下：(1)从-70℃低温冰箱中取出病毒颗粒，置于37℃水浴中溶解。(2)溶解后迅速加入DEAE(二乙基-2-羟基乙胺)至终浓度为10μg/ml。(3)移去干细胞培养皿中旧的培养液，加入上述含病毒颗粒与DEAE的培养液(24孔培养板每孔加200μl含病毒颗粒培养液)。(4)3h后向24孔培养板每孔补加200μl新鲜干细胞培养液。

步骤三，雌性生殖干细胞移植

(1)受体小鼠的准备

按120mg/kg环磷酰胺和30mg/kg白消安混合液的剂量腹腔注射5-6周龄雌性小鼠(环磷酰胺cytoxan，白消安Busulfan，均购自Sigma公司)。注射后，混合饲料喂养至少7天，使小鼠卵巢生殖细胞全部被杀死，随后可作为受体鼠进行雌性生殖干细胞的移植。

(2)雌性生殖干细胞悬液的制备

用2.5mg/ml胰蛋白酶消化细胞5min，加入等体积细胞培养液吹打使细胞悬浮，转移悬浮细胞至离心管，1,000rpm离心5min得到细胞沉淀，加入无菌PBS缓冲液重悬细胞，调整细胞密度约为2×10³/μl。

(3)雌性生殖干细胞的移植

按100mg/kg剂量，腹腔注射戊巴比妥钠麻醉受体小鼠。用75％酒精棉球擦洗小鼠腹部，在腹中线附近剪开腹腔，沿着输卵管找到卵巢，用Φ40μm口径毛细玻璃管将细胞悬液多点注入小鼠卵巢内，注意避免伤及血管。注射完毕后，将卵巢还入腹腔，缝合切口。移植一个月后，将术后雌鼠与健康雄鼠合笼。

步骤四，对培养的雌性生殖干细胞以及手术的验证

(1)雌性生殖干细胞的体外转染

分离培养的雌性生殖干细胞经过病毒感染后，在荧光显微镜下检查，记录eGFP表达细胞的数目来确定病毒感染效率。

(2)受体动物的准备

受体动物可分为先天不育和后天施用药物导致不育两种。对于正常动物生殖能力的破坏，目前常用的有白消安(Busulfan，甲磺酸丁二醇二酯)以及环磷酰胺(cytoxan)，白消安的作用机理是使DNA烷基化，从而破坏受体雌性生殖干细胞的增殖，而环磷酰胺的作用机理是抑制乙酰胆碱酶活性，并使DNA发生交联，破坏DNA的合成，干扰RNA的功能。两者结合使用能够有效的杀死受体小鼠体内生殖细胞。因而通过注射白消安及环磷酰胺的混合液至少7天后可进行移植，用量根据实验动物的大小确定。

药物注射57只受体小鼠，随机取20只用来做阴性对照，即不经过手术直接与健康成年雄性小鼠长期交配，如果均未生出小鼠，则可初步确定药物效果。然后取此不孕小鼠卵巢做组织学，显微镜下观察生殖细胞全部被杀死，则可以确定构建的不孕模型合乎要求(与图2上图的结果一致)。

(3)雌性生殖干细胞的移植

本发明采用卵巢注射法来完成雌性生殖干细胞的移植。本方法是用手术显微外科技术，将经过转染的细胞系直接注射到受体动物的卵巢中。注射完毕，缝合伤口，消炎看护，保证成活率。注射难度不大，但注射时要避免刺入过深而造成卵巢损伤。移植后，手术小鼠经过一个月的恢复后，与健康成年雄鼠交配，可获得转基因的子代小鼠。

通过活体检测子代小鼠GFP荧光表达情况，或者提取鼠尾DNA(如果转染的是特异性表达基因，则需提取相应组织器官的DNA)，然后通过southern杂交或者PCR(聚合酶链式反应)的方法筛选，可以确定转基因的效率。pMSCV-eGFP为商业化质粒，该技术不仅可用于此类载体的转基因作用，也可用于其它病毒载体的转基因。该方法将培养的干细胞用GFP标记，手术植入经药物busulphan和cytoxan处理的不孕雌性小鼠。经过35-55天的时间令其交配，得到正常的有GFP标记的子代，见图3，图3中的上图为雌性生殖干细胞移植入受体小鼠后，与雄性小鼠交配，产生后代。下图为Southern杂交检测eGFP转基因阳性小鼠，1，2和4：转基因阳性小鼠；3和5：野生型小鼠。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (6)

1.小鼠雌性生殖干细胞的分离方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一，收集小鼠卵巢，采用两步酶消化法制备生殖干细胞悬液；

步骤二，向细胞悬液中加入mvh一抗，之后加入二抗磁珠，重悬细胞，分离出小鼠雌性生殖干细胞。

2.小鼠雌性生殖干细胞的体外培养方法，其特征在于，将权利要求1分离得到的小鼠雌性生殖干细胞转移到STO细胞饲养层上，加入雌性生殖干细胞培养液，对雌性生殖干细胞进行原代培养和传代培养，得到纯化雌性生殖干细胞。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述雌性生殖干细胞的原代培养方法包括如下步骤：培养小鼠雌性生殖干细胞，每2天更换雌性生殖干细胞培养液，4-6天传代一次；所述传代培养方法具体为：吸去原有培养液，加入胰蛋白酶，置于细胞培养箱中培养，之后加入雌性生殖干细胞培养液，然后将液体转移至新的STO细胞饲养层上培养。

4.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述雌性生殖干细胞培养液包括MEM-α、FBS、L-谷氨酰胺、LIF、bFGF、维生素C、EGF、GDNF。

5.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述雌性生殖干细胞培养液包括非必需氨基酸、β-巯基乙醇、丙酮酸钠、青霉素G钠盐中的一种以上。

6.根据权利要求4所述的培养方法，其特征在于，所述FBS的体积百分含量为8-10％，所述LIF的含量为10²-10⁴U/ml，所述bFGF的含量为0.02-0.03μg/ml，所述维生素C的含量为40-60μg/ml，所述EGF的含量为0.01-0.02μg/ml，所述GDNF的含量为0.01-0.02μg/ml。

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