CN102796697A

CN102796697A - 克服牛体外胚胎早期发育阻滞的培养液配制和培养方法

Info

Publication number: CN102796697A
Application number: CN2012103118082A
Authority: CN
Inventors: 孙永刚; 徐惊涛; 才让东智; 马志杰
Original assignee: Qinghai Academy of Animal Science and Veterinary Medicine
Current assignee: Qinghai Academy of Animal Science and Veterinary Medicine
Priority date: 2012-08-29
Filing date: 2012-08-29
Publication date: 2012-11-28

Abstract

本发明提供一种克服牛体外胚胎发育阻滞，提高体外胚胎发育率的培养液制作和培养方法，包括步骤：（a）采集牦牛或黄牛的输卵管；无菌处理后经0.25%胰蛋白酶消化获得输卵管上皮细胞；（b）输卵管上皮细胞用TCM-199培养2—3天；（c）收集输卵管上皮细胞培养液，0.22μm滤器过滤除菌，添加BSA、丙酮酸钠及血清；（d）胚胎培养液分装冷冻保存；（e）胚胎培养液解冻后培养微滴的制作；（f）牦牛和黄牛体外同种受精胚胎、异种受精胚胎的培养。该培养液经济成本低，配制简单方便，培养牛体外受精胚胎不仅克服胚胎早期发育阻滞，还能提高胚胎的发育率。

Description

克服牛体外胚胎早期发育阻滞的培养液配制和培养方法

技术领域

本发明涉及细胞培养技术、胚胎工程与发育生物学领域，更具体地，涉及一种克服牛体外胚胎早期发育阻滞的培养液配制和培养方法。

背景技术

哺乳动物胚胎体外发育培养技术是胚胎发育生物学、转基因、动物克隆等研究的重要技术平台，建立稳定的体外胚胎培养体系和提高胚胎发育效果显得尤为重要。

在正常生理条件下，胚胎的发育主要从输卵管和子宫壁腺体分泌物中汲取营养。但是，在体外培养条件下，培养液模拟的体外环境对早期胚胎的存活和发育是至关重要的，通常在一些化学成分确定的培养基中，受精卵往往不能发育到囊胚，而是停顿在某个特定的发育时期。这种现象被称作发育阻滞现象(Development Block)。发育阻滞的时期随物种不同而异，例如，大鼠和小鼠的发育阻滞发生在2-细胞期，人发生在4-8细胞期，牛、羊等发生在8-16细胞期，猪为4细胞期，兔发生在桑葚胚期。因此，早期胚胎发育阻滞是哺乳动物胚胎体外培养过程中普遍存在的问题。现行的各种体外培养条件下受精卵发育到囊胚的比率仍不十分理想，有报道称牛卵母细胞经过体外成熟、体外受精、体外培养后仅有30%～40%的受精卵可以顺利发育至囊胚阶段，大部分的受精卵发育至8-16细胞后由于不能克服“发育阻滞”现象而发生细胞凋亡，不能发育至囊胚阶段，而且得到的胚胎其质量与体内受精胚胎相比仍有较大差距。大量的研究表明，体外培养胚胎与体内胚胎相比，体外培养的胚胎在形态学和发育速度上存在显著差异。目前所用的各种培养系统还不能完全模拟雌性生殖道内提供给胚胎的有利环境，体外的培养环境对早期胚胎并非完全适宜，不适的体外培养条件使得胚胎的发育潜力严重受损，这种现状己成为限制相关技术应用与发展的瓶颈之一。

近年来随着共培养系(Co-culture system)的开发和应用，体外受精胚胎仅在试管内便可培养发育为可移植胚胎。与在简单培养液中的培养相比，共培养的优势源于与简单培养液共同起作用的体细胞。共培养体系通过分泌一些对早期胚胎发育有利的物质和代谢降解胚胎发育过程中产生的有毒物质等，在体外为胚胎发育提供一种更类似于体内的环境，能在一定程度上克服胚胎体外发育阻滞，促进早期胚胎发育，提高胚胎质量，增加胚胎着床率和妊娠率，降低流产率。但共培养涉及到大量的干扰因素，包括制作辅助细胞程序复杂、体细胞的类型、可能增加污染机会且会作为疾病转播的媒介物等等。

因此，该研究领域迫切需要开发一种新的提高哺乳动物体外受精胚胎早期发育率的培养液和培养方法。

发明内容

本发明首先要解决的技术问题和提出的技术任务是克服利用现有胚胎培养液胚胎发育成功率不高的缺陷，提供一种可以兼做牛体外受精胚胎的体外培养液；其次是提供这种牛体外受精胚胎培养液的配制方法；再次是提供一种体外受精胚胎培养液的培养方法。为此，本发明采取以下技术方案：

一种牛体外受精胚胎培养液，是以常规细胞培养液为基础培养液，其特征是用基础培养液培养牛输卵管原代上皮细胞，然后收集该培养液添加BSA、丙酮酸钠及血清。

所述培养液BSA的含量为3 μg/mL；所述丙酮酸钠的含量为0.2 mM ；所述血清的体积百分含量为 5%—10%。

一种牛体外受精胚胎培养液的配制方法，是以常规组织细胞培养液为基础培养液，其特征是用基础培养液培养牛输卵管上皮细胞原代细胞2—3天，收集该培养液后添加BSA、丙酮酸钠及体积百分含量为5%—10%的血清。

所述牛输卵管上皮原代细胞培养液的收集是将卵巢带黄体的黄牛或牦牛输卵管在无菌条件下用m-PBS反复冲洗输卵管几次，去除血污后用眼科剪和眼科镊分离、剪去周围的粘连组织。在平皿中将输卵管纵向剪开，平展在平皿中，用手术刀刮取输卵管上皮细胞，加0.25%胰酶消化15 min，加入血清终止胰酶消化。消化过程中要吹打数次使内膜充分消化。吸取消化液，经滤网过滤后至5 mL离心管中1000 r/min，离心5 min，弃上清液，加入基础培养液，调整浓度为10⁶个/mL细胞悬液，接种至25 cm²或75 cm²培养瓶中，置39°C、5%CO₂饱和湿度的培养箱中培养2—3天后，收集培养液，0.22 μm过滤除菌后-20°C保存。

所述收集培养牛输卵管上皮细胞培养液常温解冻，添加BSA、丙酮酸钠和血清后，0.22 μm过滤除菌4°C备用。

一种牛体外受精胚胎培养方法，是以常规组织细胞培养液为基础培养液，其特征是用基础培养液培养牛输卵管上皮细胞原代细胞3天，收集该培养液后添加BSA、丙酮酸钠及体积百分含量为5%—10%的血清作为牛体外受精胚胎的培养液，在培养皿中做培养微滴，覆盖石蜡油后置39°C、5% CO₂饱和湿度的培养箱平衡；获取体外受精20 h后的受精卵，除去周围卵丘细胞后放入培养微滴中，在39°C、5% CO₂饱和湿度环境内进行培养，每两天半量换液至胚胎发育至囊胚期。

于培养前2 h在35 mm或60 mm培养皿中，用上述含BSA、丙酮酸钠及体积百分含量为5%—10%的血清输卵管上皮细胞培养液做成50 μL的培养微滴，覆盖石蜡油后置39°C、5% CO₂饱和湿度CO₂培养箱中平衡。

前述的常规组织细胞培养液为TCM-199，所述的血清为胎牛血清。

输卵管上皮细胞分泌的物质对精、卵和胚胎有着重要的生殖生理作用。表现在:输卵管上皮细胞不仅分泌胚胎营养物质，也随着胚胎发育的不同阶段提供适当的微环境；它分泌的一些特殊的糖蛋白和某些因子可能帮助胚胎克服体外培养中胚胎透明带硬化过程，使胚胎透明带变薄，囊胚易于孵化；它还可以通过代谢途径，清除胚胎培养液中对胚胎发育不利的成分。

本发明将培养2—3天的输卵管上皮细胞的培养液收集后通过无菌处理，添加BSA、丙酮酸钠及体积百分含量为5%—10%的血清作为牛体外受精胚胎的培养液，解决了牛体外受精胚胎发育阻滞，囊胚发育率低的问题。其经济成本较低，配制简单方便，便于在生产中推广应用。

附图说明

图1 显示了本发明方法的技术路线图。

具体实施方式

本发明人经过深入而广泛的研究，发现培养2—3天输卵管上皮细胞的培养液收集后，经过无菌处理，添加BSA，丙酮酸钠及血清作为牛体外受精胚胎的培养液，该培养液经济成本低，配制简单方便，可以大幅度提高牛体外受精胚胎早期的发育率。在此基础上完成了本发明。

简而言之，本发明方法包括步骤：采集牦牛或黄牛的输卵管；无菌处理后经 0.25%胰蛋白酶消化；输卵管上皮细胞用TCM-199培养2—3天；收集输卵管上皮细胞培养液；0.22 μm滤器过滤除菌；添加BSA，丙酮酸钠及体积百分含量为5%—10%的血清；胚胎培养液分装冷冻保存；胚胎培养液解冻后培养微滴的制作；体外受精18 h的受精卵去除颗粒细胞后移至培养微滴中培养，获得较高的体外受精胚胎早期发育的囊胚率。

以下结合具体实例，进一步阐明本发明。

实施例1：

（1）牦牛输卵管上皮细胞的培养

采集牦牛输卵管，在实验室无菌条件下用m-PBS反复冲洗输卵管几次，去除血污后用眼科剪和眼科镊分离、剪去周围的粘连组织。在平皿中将输卵管纵向剪开，平展在平皿中，用手术刀刮取输卵管上皮细胞，加0.25%胰酶消化15 min，加入血清终止胰酶消化。消化过程中要吹打数次使内膜充分消化。吸取消化液，经滤网过滤后至5 mL离心管中1000 r/min，离心 5 min，弃上清液，加入基础培养液，调整浓度为10⁶个/mL细胞悬液，接种至25 cm²或75 cm²培养瓶中，置39°C、5%CO₂饱和湿度的培养箱中培养。2—3天后，收集培养液，0.22 μm过滤除菌后-20°C保存

（2）胚胎培养液的制作

将培养2—3天的输卵管上皮细胞置倒置显微镜下观察，挑细胞生长旺盛，培养液无污浊，细胞没有污染的收集培养液，用0.22 μm一次性无菌滤器过滤除菌，-20°C保存备用。使用时添加BSA，丙酮酸钠及体积百分含量为5%—10%的血清，即为牛体外受精胚胎体外培养液。

（3）培养微滴的制作

于培养前2 h，根据受精卵数量的多少，在35 mm或60 mm培养皿中，用上述含BSA、丙酮酸钠及体积百分含量为5%—10%的血清输卵管上皮细胞培养液做成50 μL的培养微滴，覆盖石蜡油后置39°C、5% CO₂饱和湿度CO₂培养箱中平衡。

（4）牦牛胚胎和牦牛异种受精胚胎的的培养

牦牛卵巢采集和捡卵：采集牦牛卵巢，去除卵巢周围结缔组织后用39°C含青霉素（100 U/mL）和链霉素（100 μg/mL）的生理盐水冲洗3-5次，再用采卵液洗2次。用一次性10 mL注射器抽吸卵巢表面2-6 mm的卵泡。将收集到的卵泡液倒入培养皿中，放置实体显微镜下检出卵丘- 卵母细胞复合体（Cumulus-oocyte complexes, COCs）。对卵丘细胞层完整而致密、卵母细胞卵母细胞大小正常，颜色较暗和卵丘细胞不够完整或较松散，层数较少，卵母细胞颜色稍浅的COCs体外成熟培养；而卵丘细胞少或膨大变性，卵母细胞颜色浅或裸卵不予成熟培养。采卵液为m-PBS+3%CS+100 U/mL青霉素+100 μg/mL链霉素。

COCs成熟培养：将收集的COCs在成熟培养液清洗3遍后，置覆盖石蜡油、平衡2 h以上的50 μL培养滴中在39°C 5%CO₂饱和湿度的培养箱中成熟培养24 h。IVM液为TCM-199+25 mM Hepes+10%FCS+0.2 mM丙酮酸钠+0.2 U/mL FSH+1 μg/mL+100 U/mL青霉素+100 μg/mL链霉素+0.26 mM NaHCO₃。卵母细胞成熟判定：镜下观察培养24 h的卵母细胞，卵丘细胞扩散，细胞质均匀、没有空泡，用0.1%透明质酸酶除去卵丘细胞后可见第一极体（Pb1）视为成熟，否则认为未成熟。

体外受精：在直径35 mm 的培养皿中制备50 μL IVF 微滴，提前2 h放入39°C的5%CO2 培养箱中平衡备用；将牦牛冻精和荷斯坦奶牛冻精分别从液氮生物容器中取出后投入37°C温水解冻40 s，用Percoll梯度分离液 (45%/90%)和BO液离心清洗收集精子团。然后用BO液调整好精子浓度后加入平衡后的IVF微滴中，体外受精时精子最终浓度为5×10⁶个/mL。将成熟培养24 h的牦牛卵母细胞，用BO液清洗两遍后每15个一组移入IVF微滴中在39°C 5%CO₂饱和湿度的培养箱中受精18 h。IVF液为BO液+3 mg/mL BSA+2.5 mM Theophylline。

牦牛胚胎和牦牛异种受精胚胎的培养：受精结束后，分别将两种受精卵移入含有200 μL培养液的1.5 mL离心管中，震荡40 s去除颗粒细胞，受精卵用胚胎培养液充分洗涤3次后分三组进行培养，Ⅰ组为对照组，牦牛同种体外受精的受精卵193枚在SOF液中培养；Ⅱ组为实验组，牦牛同种体外受精的受精卵224枚在该发明的培养液中培养；Ⅲ组为实验组，牦牛异种体外受精的受精卵218枚在该发明的培养液中培养。每20个受精卵移入已平衡2 h以上覆盖石蜡油的50 μL胚胎培养微滴中培养，每隔48 h半量更换培养液。同时，将部分受精卵移置SOF培养液中作为对照组进行培养。受精后48 h统计卵裂率并吸弃未分裂的卵母细胞，继续培养至7--—9 天，定期观察早期胚胎发育情况、囊胚率和孵化囊胚率。

（5）结果

由表1可见，Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组的卵裂率分别为66.64±4.39%、74.24±4.41%和69.56±3.82%，差异不显著。用该新发明的培养液和培养方法培养的Ⅱ组和Ⅲ组其桑葚胚率、囊胚率和孵化囊胚率都显著高于传统SOF培养液培养的Ⅰ组，而该新发明的培养液和培养方法培养的Ⅱ组牦牛同种体外受精的受精卵和Ⅲ组牦牛异种体外受精的受精卵其卵裂率（74.24±4.41% VS69.56±3.82%）、桑葚胚率（44.42±5.82% VS38.54±4.32%）、囊胚率（40.98±3.54% VS 36.79±4.71%）和孵化囊胚率（19.01±5.22% VS 17.48±5.13%）都差异不显著。因此，该新发明的培养液和培养方法相比传统胚胎培养液，其体外胚胎的桑葚胚、囊胚和孵化囊胚都有显著地提高；同时，该培养液与培养方法对牦牛同种体外受精胚胎和牦牛异种体外受精胚胎培养，胚胎的发育程度一样。

表1、牦牛同种体外受精胚胎和异种体外受精胚胎不用培养液培养效果

Figure 2012103118082100002DEST_PATH_IMAGE001

注：卵裂率=分裂胚胎数/总受精卵×100%

桑葚胚率=桑葚胚数/分裂胚胎数×100%

囊胚率=囊胚数/分裂胚胎数×100%卵

孵化囊胚率=孵化囊胚数/分裂胚胎数×100%

表中相同字母表示差异不显著（P﹥0.05）；不同字母表示差异显著（P﹤0.05）。

实施例2：

（1）黄牛输卵管上皮细胞的培养

采集本地黄牛或荷斯坦奶牛的输卵管，在实验室无菌条件下用m-PBS反复冲洗输卵管几次，去除血污后用眼科剪和眼科镊分离、剪去周围的粘连组织。在平皿中将输卵管纵向剪开，平展在平皿中，用手术刀刮取输卵管上皮细胞，加0.25%胰酶消化15 min，加入血清终止胰酶消化。消化过程中要吹打数次使内膜充分消化。吸取消化液，经滤网过滤后至5 mL离心管中1000 r/min，离心 5 min，弃上清液，加入基础培养液，调整浓度为10⁶个/mL细胞悬液，接种至25 cm²或75 cm²培养瓶中，置39°C、5%CO₂饱和湿度的培养箱中培养。3天后，收集培养液，0.22 μm过滤除菌后-20°C保存。

（2）胚胎培养液的制作

同实施例1。

（3）培养微滴的制作

同实施例1。

（4）黄牛胚胎和黄牛异种受精胚胎的的培养

黄牛卵巢采集和捡卵：采集黄牛卵巢，去除卵巢周围结缔组织后用39°C含青霉素（100 U/mL）和链霉素（100 μg/mL）的生理盐水冲洗3-5次，再用采卵液洗2次。用一次性10 mL注射器抽吸卵巢表面2-8 mm的卵泡。将收集到的卵泡液倒入培养皿中，放置实体显微镜下检出卵丘- 卵母细胞复合体（Cumulus-oocyte complexes, COCs）。对卵丘细胞层完整而致密、卵母细胞卵母细胞大小正常，颜色较暗和卵丘细胞不够完整或较松散，层数较少，卵母细胞颜色稍浅的COCs体外成熟培养；而卵丘细胞少或膨大变性，卵母细胞颜色浅或裸卵不予成熟培养。采卵液为m-PBS+3%CS+100 U/mL青霉素+100 μg/mL链霉素。

COCs成熟培养：将收集的COCs在成熟培养液清洗3遍后，置覆盖石蜡油、平衡2 h以上的50 μL培养滴中在39°C 5%CO2饱和湿度的培养箱中成熟培养24 h。IVM液为TCM-199+25 mM Hepes+10%FCS+0.2 mM丙酮酸钠+0.2 U/mL FSH+1 μg/mL+100 U/mL青霉素+100 μg/mL链霉素+0.26 mM NaHCO₃。卵母细胞成熟判定：镜下观察培养24 h的卵母细胞，卵丘细胞扩散，细胞质均匀、没有空泡，用0.1%透明质酸酶除去卵丘细胞后可见第一极体（Pb1）视为成熟，否则认为未成熟。

体外受精：在直径35 mm 的培养皿中制备50 μL IVF 微滴，提前2 h放入39°C的5%CO₂ 培养箱中平衡备用；将牦牛冻精和荷斯坦奶牛冻精分别从液氮生物容器中取出后投入37℃温水解冻40 s，用Percoll梯度分离液 (45%/90%)和BO液离心清洗收集精子团。然后用BO液调整好精子浓度后加入平衡后的IVF微滴中，体外受精时精子最终浓度为5×10⁶个/ mL。将成熟培养24 h的牦牛卵母细胞，用BO液清洗两遍后每15个一组移入IVF微滴中在39°C 5%CO₂饱和湿度的培养箱中受精18 h。IVF液为BO液+3 mg/mL BSA+2.5 mM Theophylline。

黄牛胚胎和黄牛异种受精胚胎的培养：受精结束后，分别将两种受精卵移入含有200 μL培养液的1.5 mL离心管中，震荡40 s去除颗粒细胞，受精卵用胚胎培养液充分洗涤3次后分三组进行培养，Ⅰ组为对照组，黄牛同种体外受精的受精卵203枚在SOF液中培养；Ⅱ组为实验组，黄牛同种体外受精的受精卵288枚在该发明的培养液中培养；Ⅲ组为实验组，黄牛异种体外受精的受精卵303枚在该发明的培养液中培养。每20个受精卵移入已平衡2 h以上覆盖石蜡油的50 μL胚胎培养微滴中培养，每隔48 h半量更换培养液。同时，将部分受精卵移置SOF培养液中作为对照组进行培养。受精后48 h统计卵裂率并吸弃未分裂的卵母细胞，继续培养至7--—9 天，定期观察早期胚胎发育情况、囊胚率和孵化囊胚率。

(5) 结果

由表2可见，Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组分别在SOF培养液和新发明的培养液中培养，黄牛同种体外受精的受精卵和异种体外受精的受精卵的卵裂率分别71.97±5.14%、74.59±2.08%和73.98±6.15%，差异不显著。用该新发明的培养液和培养方法培养的Ⅱ组和Ⅲ组其桑葚胚率、囊胚率和孵化囊胚率都显著高于传统SOF培养液培养的Ⅰ组，而该新发明的培养液和培养方法培养的Ⅱ组同种黄牛体外受精的受精卵和Ⅲ组黄牛异种体外受精的受精卵其卵裂率（74.24±4.41% VS69.56±3.82%）、桑葚胚率（44.42±5.82% VS38.54±4.32%）、囊胚率（40.98±3.54% VS 36.79±4.71%）和孵化囊胚率（19.01±5.22% VS 17.48±5.13%）都差异不显著。因此，该新发明的培养液和培养方法相比传统胚胎培养液，其体外胚胎的桑葚胚、囊胚和孵化囊胚都有显著地提高；同时，该培养液与培养方法对黄牛同种体外受精胚胎和黄牛异种体外受精胚胎培养，胚胎的发育程度一样。

表2 黄牛同种体外受精胚胎和异种体外受精胚胎不用培养液培养效果

注：卵裂率=分裂胚胎数/总受精卵×100%

桑葚胚率=桑葚胚数/分裂胚胎数×100%

囊胚率=囊胚数/分裂胚胎数×100%

孵化囊胚率=孵化囊胚数/分裂胚胎数×100%

Claims

1.一种牛体外受精胚胎培养液，是以常规细胞培养液为基础培养液，其特征是用基础细胞培养液培养牛输卵管原代上皮细胞，然后收集该培养液添加BSA、丙酮酸钠及血清。

2.根据权利要求1所述的牛体外受精胚胎培养液，其特征是基础细胞培养液培养牛输卵管上皮细胞2-3天后，收集细胞培养液，过滤除菌。

3.根据权利要求1所述的牛体外受精胚胎培养液，其特征是所述的基础细胞培养液为TCM-199。

4.根据权利要求1或2所述的牛体外受精胚胎培养液，特征是所述培养液添加BSA含量为3 μg/mL 、丙酮酸钠含量为0.2 mM和血清的体积百分含量为 5%—10%。

5.根据权利要求1和2所述的牛体外受精胚胎培养液，特征是用细胞基础培养液培养的输卵管上皮细胞为黄牛输卵管上皮细胞或牦牛输卵管上皮细胞。

6.根据权利要求1或2所述的牛体外受精培养培养液，所述添加BSA和丙酮酸钠为细胞培养级试剂。

7.根据权利要求1或2所述的牛体外受精胚胎培养液，所述添加血清为胎牛血清或新生牛血清。

8.一种牛体外受精胚胎的培养液的配置方法为，其特征是用基础细胞培养液培养黄牛或牦牛输卵管上皮细胞2-3天后，收集细胞培养液，经0.22 μm滤器过滤除菌，添加BSA含量为3 μg/mL 、丙酮酸钠含量为0.2 mM和血清的体积百分含量为 5%—10%。

9. 根据权利要求8所述的培养液-4°C保存一星期，-20°C长期保存。

10. 一种牛体外受精胚胎培养液的培养方法，其特征是用基础细胞培养液培养牛输卵管原代上皮细胞2-3d，然后收集该培养液添加BSA为3 μg/mL 、丙酮酸钠含量为0.2 mM和血清的体积百分含量为 5%—10%后作为体外胚胎的培养液，做成培养微滴并覆盖石蜡油在39°C、5% CO₂饱和湿度CO₂培养箱中平衡。

11.根据权利要求10所述的牛体外受精胚胎培养液的培养方法，其特征是所培养的体外胚胎为牦牛或黄牛的卵母细胞经体外成熟培养，用牦牛或黄牛的精液经过同种或异种体外受精获得的受精卵。

12.根据权利要求10或11所述的牛体外胚胎培养液的培养方法，其特征是于培养前两小时，在60 mm灭菌培养皿中，用上述培养液做成50 μL的培养小滴。

13.根据权利要求10、11或12所述的牛体外胚胎的培养液的培养方法，其特征是体外受精获取受精卵培养48 h 观察卵裂率，每两天半量换液，培养至7—9天，观察桑葚胚、囊胚和孵化囊胚的发育率。