CN102154198A - 一种简易的卵母细胞体外成熟培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种简易的卵母细胞体外成熟培养方法，包括以下步骤：A1.卵母细胞的收集；A2.密闭气袋的制备及卵母细胞的体外成熟培养；A3.卵母细胞的孤雌激活及体外培养：在体外成熟培养22～24h挑选排出第一极体的成熟卵母细胞，第28h化学方法激活，然后在卵裂培养液中培养3d，囊胚培养液中培养4d，7～9d后观察统计囊胚率。应用自制的密闭气袋系统，只需普通的生化培养箱或水浴锅就能完成卵母细胞和胚胎的体外培养，减少了对于贵重仪器的依赖，降低了研究门槛。应用该简易密闭气袋进行体外卵母细胞培养，能够发育到囊胚，并且体外成熟率、卵裂率和囊胚率与正常CO₂培养箱中培养相比略有提高。

Description

一种简易的卵母细胞体外成熟培养方法

技术领域

本发明属于动物胚胎工程技术领域，涉及建立一种简易的卵母细胞体外成熟培养方法。

背景技术

目前，卵母细胞体外成熟培养的气相环境主要有两种，含5％CO₂+95％的空气(约20％O₂)，或5％CO₂+5％O₂+90％N₂。研究表明，输卵管和子宫的氧分压低于空气，在高氧(20％O₂)下培养胚胎，可能会产生更多的氧自由基，影响胚胎发育。而当氧分压从20％降低到5％～10％时，将会提高胚胎的发育潜能。所以，低氧环境更有利于卵母细胞的体外成熟和胚胎发育。明远会对人体呼出气体中N₂、O₂、CO₂体积分数进行了测定，结果是N₂％＝79.7％、O₂％＝15.12％、CO₂％＝5.1％。表明人体呼出的气体中CO₂浓度正好接近5％，而且15％O₂浓度也提供了低氧环境，理论上可以用于卵母细胞的体外培养。

此外，西北农林科技大学干细胞工程技术研究中心雷安民导师等人近几年在牛等家畜卵母细胞体外成熟上做了相关的研究。如：尿嘧啶和ATP对牛卵母细胞成熟及激活后孤雌胚胎发育的影响，牛体细胞核移植显微操作环节的优化，牛生发泡期裸卵体外成熟培养体系的建立，牛去核卵母细胞能够被孤雌激活并发育到桑椹胚等。

当前在家畜繁殖生物学研究领域，卵母细胞的体外培养技术已经被广泛应用，并且可以在生产或者科研中作为一项基本技术用于支撑一些延伸项目的研究。但是卵母细胞体外成熟培养技术仍是一项实验室技术，所需仪器设备对于普通生产单位或者一些基层的科研单位而言，仍然比较昂贵。这样既不利于基层单位开展与之相关的研究与应用工作；而且当科研单位到基层开展技术推广或者服务时，也不便于携带仪器设备。因此，建立一项操作简单而又相对比较稳定的卵母细胞体外成熟培养技术是将其推广到基层生产单位所必需的。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种卵母细胞体外成熟培养的方法。

本发明采用以下技术方案：

一种简易的卵母细胞体外成熟培养方法，包括以下步骤：

A1卵母细胞的收集：从屠宰场收集性成熟牛卵巢，抽吸法采集卵丘卵母细胞复合体，挑选胞质均匀并有3层以上卵丘细胞紧密包围的卵丘卵母细胞复合体用于体外成熟培养；

A2密闭气袋的制备及卵母细胞的体外成熟培养：将培养有卵丘卵母细胞复合体的四孔板小心置入塑料袋，该塑料袋由避光耐热无毒塑料制成，宽约15cm、长约20cm，一端开口，初步封口，封口处留通气口，通过输气导管向袋内吹入人体呼出气体，输气导管带有0.22μm的微孔滤膜滤器，吹满后排出，如此反复进行3～4次，确保气袋内的空气完全被人体呼出的混合气体替代，然后将气袋完全封闭，置于38.5℃生化培养箱中培养22～24h，挑选排出第一极体的成熟卵，继续培养；

A3卵母细胞的孤雌激活及体外培养：在体外成熟培养第28h，化学方法激活，然后在卵裂培养液中培养3d，囊胚培养液中培养4d，7～9d后观察统计囊胚率。所述的孤雌激活、卵裂培养、囊胚培养均在上述密闭气袋、38.5℃生化培养箱中进行；

应用自制的密闭气袋系统，只需普通的生化培养箱或水浴锅就能完成卵母细胞和胚胎的体外培养，减少了对于贵重仪器的依赖，降低了研究门槛。应用该简易密闭气袋进行体外卵母细胞培养，能够发育到囊胚，并且体外成熟率、卵裂率和囊胚率与正常CO₂培养箱中培养相比略有提高。密闭气袋培养体系不但满足了培养过程中对于CO₂浓度的要求，更提供了低氧环境，此外，人体呼出的混合气体的湿度满足了培养环境中饱和湿度的要求。

附图说明

图1密闭气袋培养的牛卵母细胞及孤雌胚不同发育阶段；

标尺：A、H为100μm，B、C、D、E、F、G为10μm)；

A、a：M II期；

B、b：2-细胞期；

C、c：4-细胞期；

D、d：6-细胞期；

E、e：8-细胞期；

F、f：16-细胞期；

G、g：囊胚期；

H、h：孵化胚期；

A、B、C、D、E、F、G：光学显微镜；

a、b、c、d、e、f、g、h：荧光显微镜(核蓝色)。

具体实施方式

实施例1

1.牛卵母细胞不同成熟条件下孤雌胚的发育

1.1主要仪器及设备

CO₂培养箱、生化培养箱、体视显微镜、荧光显微镜、封口机、恒温板、培养胚胎专用避光密封气袋、带有0.22μm的微孔滤膜滤器的输气导管、一次性塑料皿和四孔板均为NUNC公司产品、滤器购自Milipore公司、牛卵巢取自西安市屠宰场。

1.2试剂及培养液的配制

TCM-199、胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠(Insulin-Transferrin-Selenium，ITS)(Gibco)，牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)(Amresco)，胎牛血清(FBS)(HyClone)，新生牛血清(NBS)(山东银香伟业集团有限公司)，人尿促性素(hMG)(丽珠集团丽珠制药厂)，卵裂培养基(Quinn s1026)、囊胚培养基(Quinn s1029)、血清蛋白代用品(SPS)(Quinn s3010)均购自美国SAGE公司。本实验所用其他试剂如无特殊说明，均购自Sigma公司。卵母细胞洗液为TCM-199+10％(V/V)NBS+10mmol/L HEPES，卵母细胞成熟培养液为TCM-199+2.5μg/mL丙酮酸钠+2mmol/L谷胺酰胺+10μL/mL ITS+0.1IU/mL hMG+1μg/mL雌二醇(E2)+50ng/mL表皮细胞生长因子(EGF)+10mg/mL BSA+50μg/mL尿嘧啶(Uracil)。卵母细胞操作液为TCM-199+10％(V/V)FBS。卵裂培养液为卵裂培养基+10％SPS(V/V)，囊胚培养液为囊胚培养基+10％SPS(V/V)。所有培养液均用膜孔为0.22μm的微孔滤膜过滤。

1.3牛卵母细胞的收集

从西安屠宰场收集性成熟牛卵巢，放入30℃含有双抗的无菌生理盐水中，6h内运回实验室。将卵巢附属组织修剪之后用37℃含有双抗无菌生理盐水清洗3次，灭菌纱布揩净水珠后，用12号注射针头抽取卵巢表面直径为2～8mm的卵泡内的卵泡液。将抽出液收集在10mL的离心管中，静置5min后，弃去上清液，再加入6～8mL的卵母细胞洗液，轻轻吹打后静置3～5min，再弃去上清液，如此反复3次，将沉淀物转移到60mm的培养皿中，体视显微镜下挑选胞质均匀，并有3层以上卵丘细胞紧密包围的卵丘卵母细胞复合体(Cumulus-Oocyte Complexes，COCs)。

1.4牛卵母细胞的体外成熟培养

将挑选的COCs用提前至少平衡2h的成熟培养液洗3遍，再将其随机分配到含有成熟培养液的四孔板(600μL/孔)中，在38.5℃、5％(V/V)C0₂和最大饱和湿度的培养箱中培养22h。在体外成熟培养22h后，剥离卵母细胞外围的颗粒细胞层，具体方法是用口吸管将COCs移入DPBS缓冲液中，连续换液清洗3次，再移入含0.3％透明质酸酶的培养液内，38.5℃停留5min之后用口吸管反复吹打卵母细胞，去除卵母细胞周围的颗粒细胞层，在卵母细胞操作液里清洗3次完全除去颗粒细胞。对得到的裸卵在体视显微镜下观察第一极体(pbI)的排出情况，统计各组数据并计算成熟率。

1.5颗粒细胞的原代培养及饲养层的制备

向透明质酸酶消化下来的颗粒细胞培养液中加入等量的细胞培养液，反复轻轻吹打成单细胞悬液。1200r/min离心5min，弃上清，加入细胞培养液制成细胞悬液，培养即为原代颗粒细胞。将颗粒细胞传代后，以2.5～7.5×10⁶/mL细胞浓度在

培养皿中作成30μL的微滴，再覆盖一层矿物油，置培养箱中培养待用。胚胎培养前4h，将微滴中的细胞培养液吸出，用提前平衡2h卵裂培养液或囊胚培养液洗3次，再加入等量的培养液。

1.6牛卵母细胞的孤雌激活及体外培养

在成熟培养第28h，化学方法激活，即将成熟卵母细胞在含5μmoL/L离子霉素(Ionomycin)的操作液中避光激活5min，用操作液洗3遍后转移到2.0mmoL/L 6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)中，在38.5℃、5％(V/V)CO₂和最大饱和湿度的培养箱中作用4h，然后用卵裂培养液洗3遍，转移到预先准备的有颗粒细胞饲养层的30μL的卵裂培液微滴中，培养3d后观察分裂率，将质量较好已分裂的胚胎转移到预先准备的有颗粒细胞饲养层的30μL的囊胚培养液微滴中培养4d，7～9d后观察囊胚率。

图1所示为密闭气袋培养的牛卵母细胞及孤雌胚不同发育阶段的观察，由图1可见，用简易的密闭气袋在人体呼出的气相环境下，利用生化培养箱进行牛卵母细胞及孤雌胚的体外培养能够发育到孵化囊胚。密闭气袋培养的胚胎与正常培养的胚胎同步发育，通过Hoechst33342染色发现，细胞核数均正常，并能在体外正常孵化。

1.7密闭气袋的制备及使用

将培养有卵母细胞的四孔板放入培养盘中，然后小心置入塑料袋(由避光耐热无毒塑料制成，宽15cm、长20cm，一端开口)，初步封口，封口处留通气口，通过输气导管向袋内吹入人体呼出气体，吹满后排出，如此反复进行3～4次，确保气袋内的空气完全被人体呼出的混合气体替代，然后将气袋完全封闭，置于38.5℃生化培养箱中培养。

1.8试验设计及统计分析

比较密闭气袋培养与正常培养的不同：将挑选的牛COCs随机分为2组，分别进行密闭气袋培养和正常培，正常培养为对照组，统计2组的成熟率，激活后分别统计卵裂率和囊胚发育率。

结果采用SPSS13.0进行t检验，P＜0.05记为差异显著。

1.9结果

由表1可知，密闭气袋培养组与对照组在成熟率(74.79％vs.71.69％，P＞0.05)，卵裂率(83.07％vs.81.39％，P＞0.05)和孤雌激活囊胚发育率(26.75％vs.22.87％，P＞0.05)上差异均不显著。但是其在成熟率、卵裂率和囊胚率上均略高于对照组。实验结果表明该系统已达到了实验室内普遍采用的CO₂培养箱所取得的效果，甚至还略有提高。

表1牛卵母细胞不同成熟条件下孤雌胚的发育比较

注：同一列中上标字母不同表示两者有显著差异(P＜0.05)

实施例2

2.山羊卵母细胞不同培养条件下成熟率的比较

2.1主要仪器及设备

CO₂培养箱、水浴锅、体视显微镜、封口机、培养胚胎专用避光密封气袋、带有0.22μm的微孔滤膜滤器的输气导管、一次性塑料皿和四孔板均为NUNC公司产品、滤器购自Milipore公司、山羊卵巢取自榆林市屠宰场。

2.2试剂及培养液的配制

卵母细胞洗液为PBS+10％(V/V)NBS+10mmol/LHEPES+10mg/L肝素钠，其它同实施方式举例1.2。

2.3山羊卵母细胞的收集

从榆林白绒山羊屠宰场采集卵巢，立即放入盛有灭菌并预热至37℃的生理盐水的保温瓶中，迅速送回实验室(2～3h)。将收集的卵巢放入温度为37℃含硫酸庆大霉素(0.3mg/mL)的灭菌生理盐水中洗3次，并剪去输卵管等附属组织，再用生理盐水洗3次，转入无菌细胞间，然后采用切剖法收集卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complexes，COCs)，也就是将准备好的卵巢置于加有洗卵液的平皿中，用刀片切割2～5mm卵泡，使得卵母细胞随卵泡液进入洗卵液中。完成后，在体视显微镜下收集COCs，选择胞质均一致密、外围至少有3层以上的颗粒细胞包裹而且包裹致密的卵母细胞进行体外成熟培养。

2.4山羊卵母细胞的体外成熟培养

将挑选的山羊COCs用提前至少平衡2h的成熟培养液洗3遍，再将其随机分配到含有成熟培养液的四孔板(600μL/孔)中，在38.5℃、5％(V/V)CO₂和最大饱和湿度的培养箱中培养20h。在体外成熟培养20h后，剥离卵母细胞外围的颗粒细胞层，具体方法是用口吸管将COCs移入DPBS缓冲液中，连续换液清洗3次，再移入含0.3％透明质酸酶的培养液内，38.5℃停留5min之后用口吸管反复吹打卵母细胞，去除卵母细胞周围的颗粒细胞层，在卵母细胞操作液里清洗3次完全除去颗粒细胞。对得到的裸卵在体视显微镜下观察第一极体(pbI)的排出情况，统计各组数据并计算成熟率。

2.5密闭气袋的制备及使用

将培养有卵母细胞的四孔板放入培养盘中，然后小心置入塑料袋(由避光耐热无毒塑料制成，宽15cm、长20cm，一端开口)，初步封口，封口处留通气口，通过输气导管向袋内吹入人体呼出气体，吹满后排出，如此反复进行3～4次，确保气袋内的空气完全被人体呼出的混合气体替代，然后将气袋完全封闭，置于38.5℃水浴锅中培养。

2.6试验设计及统计分析

比较密闭气袋培养与正常培养的不同：将挑选的山羊COCs随机分为2组，分别进行密闭气袋培养和正常培养，正常培养为对照组，统计2组的成熟率。

结果采用SPSS13.0进行t检验，P＜0.05记为差异显著。

2.7结果

由表2可知，密闭气袋培养组与对照组在成熟率(75.32％vs.68.97％，P＜0.05)上有差异。实验结果表明该系统已达到了实验室内普遍采用的CO₂培养箱所取得的效果，由于不同动物的卵子成熟条件的差异，以及不同实验室培养条件的差异，密闭培养系统还需进一步改进。

表2山羊卵母细胞不同成熟条件下成熟率的比较

注：同一列中上标字母不同表示两者有显著差异(P＜0.05)

应用自制的密闭气袋系统，只需普通的生化培养箱或水浴锅就能完成卵母细胞和胚胎的体外培养，减少了对于贵重仪器的依赖，降低了研究门槛。应用该简易密闭气袋进行体外卵母细胞培养，能够发育到囊胚，并且体外成熟率、卵裂率和囊胚率与正常CO₂培养箱中培养相比略有提高。密闭气袋培养体系不但满足了培养过程中对于CO₂浓度的要求，更提供了低氧环境，此外，人体呼出的混合气体的湿度满足了培养环境中饱和湿度的要求。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (1)

1.一种简易的卵母细胞体外成熟培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

A1卵母细胞的收集：从屠宰场收集性成熟牛卵巢，抽吸法采集卵丘卵母细胞复合体，挑选胞质均匀并有3层以上卵丘细胞紧密包围的卵丘卵母细胞复合体用于体外成熟培养；

A2密闭气袋的制备及卵母细胞的体外成熟培养：将培养有卵丘卵母细胞复合体的四孔板小心置入塑料袋，该塑料袋由避光耐热无毒塑料制成，宽约15cm、长约20cm，一端开口，初步封口，封口处留通气口，通过输气导管向袋内吹入人体呼出气体，输气导管带有0.22μm的微孔滤膜滤器，吹满后排出，如此反复进行3～4次，确保气袋内的空气完全被人体呼出的混合气体替代，然后将气袋完全封闭，置于38.5℃生化培养箱中培养22～24h，挑选排出第一极体的成熟卵，继续培养；

A3卵母细胞的孤雌激活及体外培养：在体外成熟培养第28h，化学方法孤雌激活，然后在卵裂培养液中培养3d，囊胚培养液中培养4d，7～9d后观察统计囊胚率；所述孤雌激活、卵裂培养、囊胚培养均在密闭气袋、38.5℃生化培养箱中进行。

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