CN105950546B - 清洗卵子或受精卵表面的方法 - Google Patents
清洗卵子或受精卵表面的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105950546B CN105950546B CN201610584345.5A CN201610584345A CN105950546B CN 105950546 B CN105950546 B CN 105950546B CN 201610584345 A CN201610584345 A CN 201610584345A CN 105950546 B CN105950546 B CN 105950546B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- culture
- ovum
- culture solution
- fertilized eggs
- culture dish
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 title claims abstract description 91
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 90
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 90
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 title claims abstract description 50
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 36
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 51
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims abstract description 15
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 7
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 claims abstract description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 claims abstract description 3
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 claims abstract description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 97
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 claims description 13
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 10
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 claims description 9
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 claims description 9
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 claims description 3
- 238000004088 simulation Methods 0.000 claims description 3
- 238000004381 surface treatment Methods 0.000 claims 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 14
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 239000000463 material Substances 0.000 description 11
- 238000012549 training Methods 0.000 description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 9
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 8
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 8
- 235000002020 sage Nutrition 0.000 description 8
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 7
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 7
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 6
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 6
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 6
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 5
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 5
- 208000021267 infertility disease Diseases 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 5
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 4
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 210000000982 limb bud Anatomy 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 3
- 230000010165 autogamy Effects 0.000 description 2
- 210000001109 blastomere Anatomy 0.000 description 2
- 239000012578 cell culture reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- 208000031404 Chromosome Aberrations Diseases 0.000 description 1
- 206010067477 Cytogenetic abnormality Diseases 0.000 description 1
- 108050009363 Hyaluronidases Proteins 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000004956 cell adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009659 non-destructive testing Methods 0.000 description 1
- 210000004508 polar body Anatomy 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004340 zona pellucida Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/80—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in fisheries management
- Y02A40/81—Aquaculture, e.g. of fish
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及一种清洗卵子或受精卵表面的方法。具体地，本发明公开的方法包括步骤(1)将未经处理的卵子或未经处理的受精卵置于第一培养皿中，其中，所述第一培养皿经标准细胞培养表面处理且含有第一培养液，所述第一培养液含蛋白；然后加入透明质酸酶处理所述卵子或受精卵，从而得到经第一次处理的卵子或受精卵；(2)将经第一次处理的卵子或受精卵移入第二培养皿中，其中，所述第二培养皿未经表面处理且含有第二培养液，所述第二培养液不含蛋白；然后用带有第三培养液的棒状工具拨动所述卵子或受精卵，其中，所述第三培养液含蛋白；使颗粒细胞和/或多余精子脱离卵子或受精卵表面，从而被彻底清除干净。
Description
技术领域
本发明属于生殖医学领域，具体地，本发明涉及一种清洗卵子或受精卵表面的方法。
背景技术
试管婴儿技术是一项对抗不孕不育的强大技术手段。但因各种原因，从胚胎植入子宫到胎儿出生的成功率不高(通常只有40％左右)。除母亲健康原因外，受精卵质量是导致胚胎发育失败的重要原因之一。
早期，在试管婴儿技术过程中，仅依靠显微镜下的形态观察，从多个胚胎中挑选2-3个相对“正常”者植入母亲子宫。而显微镜下的形态正常并无法反映染色体是否正常。错误地挑选形态正常而染色体异常的胚胎植入母亲子宫导致了很多试管婴儿受孕失败。
近年以来，人们建立了一些技术(统称为Preimplantation Genetic Screen，PGS)对体外培养胚胎的染色体状态进行检测，以筛选染色体正常的胚胎植入母亲子宫，从而提高受孕成功率。各种PGS方法检测所需的生物样本都是从体外培养胚胎中获得的一个至数个细胞，通过对这写细胞的检测可反映整个胚胎的染色体是否正常。胚胎活检有极体活检、卵裂球活检和囊胚滋养层细胞活检。PGS检测通常是活检卵裂球或囊胚滋养层细胞。但是，越来越多的研究表明卵裂期活检的安全性受到质疑，因此囊胚滋养层细胞活检逐渐成为PGS胚胎活检的主流。
当受精卵在体外培养液中生长发育5天时，胚胎是由约80–100个细胞组成的囊状结构，称为囊胚。此时，可在显微镜下，用毛细玻璃管吸取一个至数个滋养层细胞进行检测。已有研究表明，胚胎早期体外发育过程中(第1-5日)会将少量DNA释放入培养液(囊胚培养液)中。尽管对此机制尚不明了，但囊胚培养液中存在着胚胎来源的DNA提供了对胚胎染色体状态进行无损检测的物质基础。我们的前期发明《一种利用囊胚培养液检测胚胎染色体异常的方法》(CN105368936A)正是建立了一套达成此目的技术方法(NICS)。但是，NICS方法容易受到一些常规试管婴儿体外胚胎培养过程中所忽略因素的干扰。
第一代试管婴儿(IVF)使用大量精子对卵子进行体外受精。然而对每个卵子而言，只有一个精子能够有效受精，使卵子成为受精卵，其它多余的无效精子会粘附在受精卵表面，它们死亡后释放入体外培养液中，因此，父源DNA会对后续的NICS检测形成干扰。另外，从母体提取的卵细胞表面不可避免地会附着大量母体来源的颗粒细胞，这些颗粒细胞向培养液中释放，因此，母源DNA也会对NICS检测形成干扰。
尽管二代试管婴儿采用了卵胞浆内单精子注射方法(ICSI)对卵子进行体外受精，避免了多余精子造成的污染问题。并且，体外受精前会对卵子表面附着的颗粒细胞做常规清洗以部分暴露卵子表面，为精子注射针提供通道，但常规清洗后的卵子表面仍会粘附有较多的颗粒细胞，对后续的NICS检测形成干扰。
因此，本发明建立了将卵子(针对ICSI)或受精卵(针对IVF)表面的颗粒细胞和/或多余精子彻底清除干净，以避免干扰NICS检测的技术方法。
发明内容
本发明的目的是建立在试管婴儿(IVF及ICSI)过程中彻底清除卵子表面的颗粒细胞和/或多余精子，使后续的胚胎培养液适用于NICS检测的技术方法。
在本发明的第一方面中，提供了一种清洗卵子或受精卵表面的方法，其特征在于，包括步骤：
(1)将未经处理的卵子或未经处理的受精卵置于第一培养皿中，其中，所述第一培养皿经标准细胞培养表面处理且含有第一培养液，所述第一培养液含蛋白；
然后加入透明质酸酶处理所述卵子或受精卵，从而得到经第一次处理的卵子或受精卵；
(2)将经第一次处理的卵子或受精卵移入第二培养皿中，其中，所述第二培养皿未经表面处理且含有第二培养液，所述第二培养液不含蛋白；
然后用带有第三培养液的棒状工具拨动所述卵子或受精卵，其中，所述第三培养液含蛋白；使颗粒细胞和/或多余精子脱离卵子或受精卵表面，从而被彻底清除干净。
在另一优选例中，所述带有第三培养液的棒状工具是指棒状工具上蘸有第三培养液。
在另一优选例中，所述棒状工具为棒或棍。
在另一优选例中，所述棒状工具为玻璃的、塑料的等任何适合的材料制成的。
在另一优选例中，所述蛋白为血清蛋白。
在另一优选例中，所述未经处理的卵子是从母体取出2-3小时后的卵子。
在另一优选例中，所述未经处理的受精卵是在体外受精4小时或16-20小时后的受精卵。
在另一优选例中，所述第一培养液模拟人输卵管液的成分，且用HEPES做缓冲成份。
在另一优选例中，所述第一培养液可参照Quinn等人于1984年公开发表(《生育与不孕》(Fertil Steril.)1984；41:202或1985；44:493.)的文献制备。
该培养液用HEPES做缓冲成份，在空气中可较长时间地保持pH值的稳定性。培养时无需二氧化碳气体环境。
该培养液可从各商业公司(如，SAGE media)购买，也可以自行配制。
在另一优选例中，所述第一培养液为IM培养液。
在另一优选例中，所述第一培养皿为Falcon 353037培养皿、康宁公司的430166培养皿或塞默飞公司的150288培养皿。
在另一优选例中，所述第一培养皿为任意的市售的经标准细胞培养表面处理的细胞培养皿。可以是任何其它公司出售的，也可以是任何形状或尺寸的。
在另一优选例中，所述透明质酸酶可从任何细胞培养试剂供应商购得。
在另一优选例中，步骤(1)中，所述处理的时间为10-60秒；较佳地，为20-40秒。
在另一优选例中，所述第二培养液的成分与第一培养液相同，区别仅在于第二培养液不含有蛋白。
在另一优选例中，所述第二培养液为M-IM培养液。
在另一优选例中，所述第二培养皿为Falcon 351006培养皿、康宁公司的430589培养皿或塞默飞公司的150340培养皿。
在另一优选例中，所述第二培养皿为任意的市售的未经表面处理的细胞表面膜。可以是任何其它公司出售的，也可以是任何形状或尺寸的。
在另一优选例中，所述第三培养液的成分与第一培养液相同，区别仅在于第三培养液不含缓冲成分HEPES。
在另一优选例中，所述第三培养液可参照Quinn等人于1984年公开发表(《生育与不孕》(Fertil Steril.)1984；41:202或1985；44:493.)的文献制备。
所述第三培养液与第一培养液的区别在于其中没有缓冲成份(HEPES)，所以必须在5％二氧化碳环境(二氧化碳培养箱中)下使用。
该培养液可从各商业公司(如，SAGE media)购买，也可以自行配制。
在另一优选例中，所述第三培养液为GM培养液。
在另一优选例中，所述颗粒细胞和/或多余精子从卵子或受精卵表面脱离后附于培养皿底部表面。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了刚从母体中取出的未经处理的卵子，表面附着有大量颗粒细胞。
图2显示了经步骤3清洗处理过的卵子，其表面颗粒细胞附着明显减少，但仍有颗粒细胞附着。
图3显示了操作过程中颗粒细胞脱离卵子，附着于培养皿底。
图4显示了经步骤3和步骤4清洗处理过的卵子，其表面颗粒细胞被彻底清除。
图5显示了两个卵子透明带上附着的颗粒细胞被彻底清除。
图6显示了处理后的两个卵子表面仍有颗粒细胞残留。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，意外发现了一种彻底清洗卵子或受精卵表面的方法。在此基础上，发明人完成了本发明。
本文中所提及的蛋白为血清蛋白。
清洗卵子或受精卵表面的方法
本发明提供了一种清洗卵子或受精卵表面的方法，所述方法包括步骤：
(1)将未经处理的卵子或未经处理的受精卵置于第一培养皿中，其中，所述第一培养皿经标准细胞培养表面处理且含有第一培养液，所述第一培养液含蛋白；
然后加入透明质酸酶(可从任何细胞培养试剂供应商购得)处理所述卵子或受精卵一段时间(如10-60秒；较佳地，为20-40秒)，从而得到经第一次处理的卵子或受精卵；
(2)将经第一次处理的卵子或受精卵移入第二培养皿中，其中，所述第二培养皿未经表面处理且含有第二培养液，所述第二培养液不含蛋白；
然后用带有第三培养液的棒状工具拨动所述卵子或受精卵，其中，所述第三培养液含蛋白；使颗粒细胞和/或多余精子脱离卵子或受精卵表面，从而被彻底清除干净。
其中，所述颗粒细胞和/或多余精子从卵子或受精卵表面脱离后附于培养皿底部表面。
所述棒状工具为棒或棍类似工具。所述棒状工具可以为玻璃的、塑料的等任何适合的材料制成的。所述带有第三培养液的棒状工具是指棒状工具上蘸有第三培养液。
未经处理的卵子或未经处理的受精卵
所述未经处理的卵子可以是从母体取出2-3小时后的卵子。
所述未经处理的受精卵可以是在体外受精4小时或16-20小时后的受精卵。
第一培养液
所述第一培养液模拟人输卵管液的成分，且用HEPES做缓冲成份。该培养液用HEPES做缓冲成份，在空气中可较长时间地保持pH值的稳定性。培养时无需二氧化碳气体环境。
所述第一培养液可参照Quinn等人于1984年公开发表(《生育与不孕》(FertilSteril.)1984；41:202或1985；44:493.)的文献制备。也可从各商业公司(如，SAGE media)购买。
在另一优选例中，所述第一培养液为IM培养液。
第一培养皿
所述第一培养皿为任意的市售的经标准细胞培养表面处理的细胞培养皿。可以是任何其它公司出售的，也可以是任何形状或尺寸的。
在另一优选例中，所述第一培养皿为Falcon 353037培养皿、康宁公司的430166培养皿或塞默飞公司的150288培养皿。
第二培养液
所述第二培养液的成分与第一培养液相同，区别仅在于第二培养液不含有蛋白。
在另一优选例中，所述第二培养液为M-IM培养液。
第二培养皿
所述第二培养皿为任意的市售的未经表面处理的细胞表面膜。可以是任何其它公司出售的，也可以是任何形状或尺寸的。
在另一优选例中，所述第二培养皿为Falcon 351006培养皿、康宁公司的430589培养皿或塞默飞公司的150340培养皿。
第三培养液
所述第三培养液的成分与第一培养液相同，区别仅在于第三培养液不含缓冲成分HEPES。所述第三培养液与第一培养液的区别在于其中没有缓冲成份(HEPES)，所以必须在5％二氧化碳环境(二氧化碳培养箱中)下使用。
在另一优选例中，所述第三培养液可参照Quinn等人于1984年公开发表(《生育与不孕》(Fertil Steril.)1984；41:202或1985；44:493.)的文献制备或可从各商业公司(如，SAGE media)购买。
在另一优选例中，所述第三培养液为GM培养液。
本发明技术方案的有益效果是：
1.彻底清除卵子(或受精卵)表面的颗粒细胞，避免了试管婴儿(IVF及ICSI)过程中NICS检测可能遭受的颗粒细胞和/或多余精子污染。
2.避免了胚胎透明带剥除的操作，简化了技术操作步骤，避免了透明带剥除操作可能带来的胚胎损伤风险。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1.
一、试剂和耗材
1.试剂
1.1含80U/ml的透明质酸酶的HEPES-HTF培养液(Hyaluronidase 80U/ml inHEPES-HTF)(规格：SAGE，产品号：ART4007-A)
1.2 M-IM培养液:Quinn's Advantage含HEPES培养液(Quinn's AdvantageMedium with HEPES)(规格：SAGE，产品号：ART-1023)
1.3 IM培养液:Quinn's Advantage加蛋白受精培养液(Quinn's AdvantageTMProtein Plus Fertilization(TIF)Medium)(规格：SAGE，产品号：ART-1520)
1.4 GM培养液:Quinn's Advantage加蛋白卵裂培养液(Quinn's AdvantageProtein Plus Cleavage Medium)(规格：SAGE，产品号：ART-1526)
2.耗材
2.1 Falcon 351006培养皿
2.2 Falcon 363037培养皿
2.3巴斯德吸管
3.操作时机
ICSI的卵子清除颗粒细胞处理是在取卵后2－3小时。
刚从母体中取出的未经处理的卵子，表面附着有大量颗粒细胞，如图1所示。
4.操作程序：
4.1在卵子清洗前，准备好剥卵用吸管(100-120μm)，移卵用吸管(180-200μm)及一根末端烧圆的小玻棒。
4.2在1个Falcon 353037(聚苯乙烯材质，标准细胞培养表面处理)培养皿中加入1ml IM培养液(ART-1520)；
1个Falcon 351006(聚苯乙烯材质，无处理)培养皿中加入2ml不含蛋白的M-IM培养液(ART-1023)。
4.3把从母体中取出的未经处理的卵子先放入含有IM培养液(ART-1520)的Falcon353037培养皿中，再加入1ml 80U/ml的透明质酸酶的HEPES-HTF培养液，反复吹吸，持续30秒。在这一步骤中，因培养液中含有带负电的蛋白质，中和了颗粒细胞表面的正电荷。同时，聚苯乙烯材质的培养皿经细胞培养表面处理后，其表面成亲水的电荷中性状态。因此，卵子与其表面附着的颗粒细胞会悬浮在液体培养液中。透明质酸酶的消化作用弱化了颗粒细胞与卵子之间的粘附作用。在吹打的冲洗作用下，部分颗粒细胞即可脱离与卵子的附着。
经上述步骤3清洗处理过的卵子，其表面颗粒细胞附着明显减少，但仍有颗粒细胞附着。如图2所示。
4.4将表面粘附有剩余颗粒细胞的卵子移入含有不含血清蛋白的M-IM培养液(ART-1023)的Falcon 351006培养皿中。此时，因培养液中不存在蛋白质的负电中和作用，颗粒细胞带有正电荷。同时，Falcon 351006培养皿为未经处理聚苯乙烯材质，其表面为疏水的负电状态。因此，卵子与其表面附着的颗粒细胞就会粘附于培养皿底部表面(如图3所示)。此时，用蘸过含蛋白GM培养液(ART-1526)的玻璃小棒(含蛋白培养液的作用是中和玻璃棒表面的负电荷，避免细胞黏附于玻璃棒上)不断拨动卵子，使卵子在培养皿底部表面滚动。在滚动过程中，卵子表面的剩余颗粒细胞就会粘附于培养皿底部表面与卵子脱离，持续推动卵子滚动，直至其表面的颗粒细胞被彻底清除干净。
经上述步骤3和4清洗处理过的卵子，其表面颗粒细胞被彻底清除，如图4所示。
4.5去除完颗粒细胞后，用吸管(先吸一点含蛋白的培养液)把卵子转移到GM培养液中，放入37℃，5％CO2，5％O2培养箱内培养，随后即可进入常规的单精子注射(ICSI)、胚胎体外培养(IVF及ICSI)和NICS检测流程。
实施例2
采用实施例1的方法，不同之处在于用受精卵代替卵子。而IVF清除受精卵表面颗粒细胞和多余精子的处理时间是在加精4小时(短时受精)或16－20小时(常规受精)之后。
结果发现，IVF受精卵表面的颗粒细胞和多余精子可以被彻底清除。
实施例3
采用实施例1的方法，不同之处在于使用康宁公司的培养皿，并根据文献(FertilSteril.1984；41:202,1985；44:493.)中的配方自制培养液。
用含人血清白蛋白及HEPES的HTF培养液(根据文献自配)和经标准细胞培养表面处理的培养皿(购自：康宁；产品号：430166)代替含1ml IM培养液(ART-1520)的Falcon353037(聚苯乙烯材质，标准细胞培养表面处理)培养皿；
用不含蛋白，但含有HEPES的HTF培养液(根据文献自配)和未经表面处理的培养皿(购自：康宁；产品号：430589)代替含2ml不含蛋白的M-IM培养液(ART-1023)的Falcon351006(聚苯乙烯材质，无处理)培养皿。
结果表明：两个卵子透明带上附着的颗粒细胞被彻底清除，如图5所示。
对比例1
采用实施例1的方法，不同之处在于在步骤4.4中用IM培养液代替了不含蛋白的M-IM培养液。
结果导致颗粒细胞与培养皿底粘附不牢，无法从卵子表面脱离。处理后的两个卵子表面仍有颗粒细胞残留，如图6所示。
本发明的优点是在对卵子、受精卵或胚胎不产生任何损伤，不触动透明带的情况下提供了一种彻底清除卵子表面颗粒细胞和/或多余精子的方法。其要点在于利用细胞表面、培养液成份(蛋白质)和细胞培养皿底部表面的电荷关系将颗粒细胞和/或多余精子从卵子(或受精卵)表面粘除。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种清洗卵子或受精卵表面的方法，其特征在于，包括步骤：
(1)将未经处理的卵子或未经处理的受精卵置于第一培养皿中，其中，所述第一培养皿经标准细胞培养表面处理且含有第一培养液，所述第一培养液含蛋白；
然后加入透明质酸酶处理所述卵子或受精卵，从而得到经第一次处理的卵子或受精卵；
(2)将经第一次处理的卵子或受精卵移入第二培养皿中，其中，所述第二培养皿未经表面处理且含有第二培养液，所述第二培养液不含蛋白；
然后用带有第三培养液的棒状工具拨动所述卵子或受精卵，其中，所述第三培养液含蛋白；使颗粒细胞和/或多余精子脱离卵子或受精卵表面，从而被彻底清除干净。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述未经处理的卵子是从母体取出2-3小时后的卵子。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述未经处理的受精卵是在体外受精4小时或16-20小时后的受精卵。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一培养液模拟人输卵管液的成分，且用HEPES做缓冲成份。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一培养皿为Falcon 353037培养皿、康宁公司的430166培养皿或塞默飞公司的150288培养皿。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述处理的时间为10-60秒。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二培养液的成分与第一培养液的区别仅在于第二培养液不含有蛋白。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二培养皿为Falcon 351006培养皿、康宁公司的430589培养皿或塞默飞公司的150340培养皿。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第三培养液的成分与第一培养液的区别仅在于第三培养液不含缓冲成分HEPES。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述颗粒细胞和/或多余精子从卵子或受精卵表面脱离后附于培养皿底部表面。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610584345.5A CN105950546B (zh) | 2016-07-22 | 2016-07-22 | 清洗卵子或受精卵表面的方法 |
| PCT/CN2017/089204 WO2018014692A1 (zh) | 2016-07-22 | 2017-06-20 | 清洗卵子或受精卵表面的方法 |
| TW106121131A TWI656214B (zh) | 2016-07-22 | 2017-06-23 | 清洗卵子或受精卵表面的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610584345.5A CN105950546B (zh) | 2016-07-22 | 2016-07-22 | 清洗卵子或受精卵表面的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105950546A CN105950546A (zh) | 2016-09-21 |
| CN105950546B true CN105950546B (zh) | 2018-09-25 |
Family
ID=56900306
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201610584345.5A Active CN105950546B (zh) | 2016-07-22 | 2016-07-22 | 清洗卵子或受精卵表面的方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105950546B (zh) |
| TW (1) | TWI656214B (zh) |
| WO (1) | WO2018014692A1 (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105950546B (zh) * | 2016-07-22 | 2018-09-25 | 序康医疗科技（苏州）有限公司 | 清洗卵子或受精卵表面的方法 |
| CN115521904A (zh) * | 2022-09-29 | 2022-12-27 | 中国海洋大学 | 一种侏儒蛤卵膜的溶解方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102154198A (zh) * | 2010-12-16 | 2011-08-17 | 西北农林科技大学 | 一种简易的卵母细胞体外成熟培养方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102453694A (zh) * | 2010-10-25 | 2012-05-16 | 陈浩杰 | 一种显微受精方法 |
| CN103898046B (zh) * | 2014-02-28 | 2016-04-20 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 牛体外受精胚胎培养液和培养方法 |
| CN105950546B (zh) * | 2016-07-22 | 2018-09-25 | 序康医疗科技（苏州）有限公司 | 清洗卵子或受精卵表面的方法 |
-
2016
- 2016-07-22 CN CN201610584345.5A patent/CN105950546B/zh active Active
-
2017
- 2017-06-20 WO PCT/CN2017/089204 patent/WO2018014692A1/zh active Application Filing
- 2017-06-23 TW TW106121131A patent/TWI656214B/zh not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102154198A (zh) * | 2010-12-16 | 2011-08-17 | 西北农林科技大学 | 一种简易的卵母细胞体外成熟培养方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Culture factors in relation to the success of human in vitro fertilization and embryo transfer;QUINN，P. 等;《FERTILITY AND STERILITY》;19840229;第41卷(第2期);202-209 * |
| 精子DNA损伤与体外受精-胚胎移植相关性研究;王磊;《中国优秀硕士学位论文全文数据库（医药卫生科技辑）》;20130515;E068-7 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105950546A (zh) | 2016-09-21 |
| TW201812003A (zh) | 2018-04-01 |
| TWI656214B (zh) | 2019-04-11 |
| WO2018014692A1 (zh) | 2018-01-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Revazova et al. | HLA homozygous stem cell lines derived from human parthenogenetic blastocysts | |
| EP2049043B1 (en) | Synthetic cornea from retinal stem cells | |
| Nogueira et al. | In vitro oocyte maturation: current status | |
| Ziloochi Kashani et al. | Differentiation of neonate mouse spermatogonial stem cells on three-dimensional agar/polyvinyl alcohol nanofiber scaffold | |
| Balaban et al. | Laboratory procedures for human in vitro fertilization | |
| Shih et al. | Effects of reactive oxygen species levels in prepared culture media on embryo development: a comparison of two media | |
| CN105950546B (zh) | 清洗卵子或受精卵表面的方法 | |
| Niu et al. | Distribution and content of lipid droplets and mitochondria in pig parthenogenetically activated embryos after delipation | |
| Allen et al. | Isolation of neonatal rat cortical astrocytes for primary cultures | |
| Coleman et al. | In vitro maturation and early developmental capacity of bovine oocytes cultured in pure follicular fluid and supplementation with follicular wall | |
| CN113174366A (zh) | 含有丁苯羟酸的猪卵母细胞体外成熟体系及应用 | |
| Park et al. | In vitro maturation on an agarose matrix improves the developmental competence of porcine oocytes | |
| Orth et al. | Use of in vitro systems to study male germ cell development in neonatal rats | |
| Quan et al. | Effects of synthetic polymers on in vitro maturation of sheep oocytes and subsequent developmental capacity after parthenogenetic activation or fertilization | |
| Leunda-Casi et al. | Decreased expression of fibroblast growth factor-4 and associated dysregulation of trophoblast differentiation in mouse blastocysts exposed to high D-glucose in vitro | |
| Rashidi et al. | Hydrostatic pressure affects in vitro maturation of oocytes and follicles and increases granulosa cell death | |
| Fan et al. | Diploid, but not haploid, human embryonic stem cells can be derived from microsurgically repaired tripronuclear human zygotes | |
| Varisanga et al. | Comparison of the effects of using standard and simple portable CO2 incubators on the in vitro developmental competence of bovine embryos reconstituted by somatic cell nuclear transfer | |
| Lee et al. | Establishment of a basic method for manipulating preantral follicles: effects of retrieval method on in vitro growth of preantral follicles and intrafollicular oocytes | |
| Yung et al. | Protocol for culturing the endocrine junctional zone of the mouse placenta in serum-free medium | |
| CN112813020B (zh) | 具有特定hla配型的人胚干细胞 | |
| CN100376670C (zh) | 人类胚干细胞的培养系统及其培养方法 | |
| Al-Mannai | The Impact of Cleavage Stage Biopsy on Blastocyst Development. | |
| Dittrich et al. | Offspring after embryo-preserving biopsy of the embryoblast with standard ICSI equipment in mouse blastocysts | |
| May et al. | Prenatal chromosome diagnosis |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20170119 Address after: Suzhou City, Jiangsu Province, Suzhou Industrial Park 215000 Xinghu Street No. 218 BioBAY building 201 unit B7 Applicant after: Medical technology (Suzhou) Co., Ltd. Address before: 201403 Shanghai, Fengxian District Jin Qi Road, room 868, No. 5232 Applicant before: SHANGHAI XUKANG MEDICAL TECHNOLOGY CO., LTD. |
|
| REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: DE Ref document number: 1229368 Country of ref document: HK |
|
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20190820 Address after: 201499 Shanghai Road, Fengxian District, Lane 1698, Lane 17, building 26 Patentee after: Shanghai Yikang medical laboratory Co., Ltd. Address before: Unit 201, B7 Building, 218 Xinghu Street Bio-nano Park, Suzhou Industrial Park Patentee before: Medical technology (Suzhou) Co., Ltd. |
|
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20201223 Address after: 215123 unit 201, B7 / F, bio nano Park, 218 Xinghu street, Suzhou Industrial Park, Suzhou City, Jiangsu Province Patentee after: Suzhou Yikang Medical Laboratory Co.,Ltd. Address before: 201499 building 17, No. 26, Lane 1698, Wangyuan Road, Fengxian District, Shanghai Patentee before: SHANGHAI YIKON CLINICAL LABORATORY Co.,Ltd. |
|
| TR01 | Transfer of patent right |