TW201812003A - 清洗卵子或受精卵表面的方法 - Google Patents
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Abstract
本發明涉及一種清洗卵子或受精卵表面的方法。具體地，本發明公開的方法包括步驟(1)將未經處理的卵子或未經處理的受精卵置於第一培養皿中，其中，所述第一培養皿經標準細胞培養表面處理且含有第一培養液，所述第一培養液含蛋白；然後加入透明質酸酶處理所述卵子或受精卵，從而得到經第一次處理的卵子或受精卵；(2)將經第一次處理的卵子或受精卵移入第二培養皿中，其中，所述第二培養皿未經表面處理且含有第二培養液，所述第二培養液不含蛋白；然後用帶有第三培養液的棒狀工具撥動所述卵子或受精卵，其中，所述第三培養液含蛋白；使顆粒細胞和/或多餘精子脫離卵子或受精卵表面，從而被徹底清除乾淨。
Description
本發明屬於生殖醫學領域，具體地，本發明涉及一種清洗卵子或受精卵表面的方法。
試管嬰兒技術是一項對抗不孕不育的強大技術手段。但因各種原因，從胚胎植入子宮到胎兒出生的成功率不高(通常只有40%左右)。除母親健康原因外，受精卵品質是導致胚胎發育失敗的重要原因之一。
早期，在試管嬰兒技術過程中，僅依靠顯微鏡下的形態觀察，從多個胚胎中挑選2-3個相對“正常”者植入母親子宮。而顯微鏡下的形態正常並無法反映染色體是否正常。錯誤地挑選形態正常而染色體異常的胚胎植入母親子宮導致了很多試管嬰兒受孕失敗。
近年以來，人們建立了一些技術(統稱為Preimplantation Genetic Screen，PGS)對體外培養胚胎的染色體狀態進行檢測，以篩選染色體正常的胚胎植入母親子宮，從而提高受孕成功率。各種PGS方法檢測所需的生物樣本都是從體外培養胚胎中獲得的一個至數個細胞， 通過對這寫細胞的檢測可反映整個胚胎的染色體是否正常。胚胎活檢有極體活檢、卵裂球活檢和囊胚滋養層細胞活檢。PGS檢測通常是活檢卵裂球或囊胚滋養層細胞。但是，越來越多的研究表明卵裂期活檢的安全性受到質疑，因此囊胚滋養層細胞活檢逐漸成為PGS胚胎活檢的主流。
當受精卵在體外培養液中生長發育5天時，胚胎是由約80-100個細胞組成的囊狀結構，稱為囊胚。此時，可在顯微鏡下，用毛細玻璃管吸取一個至數個滋養層細胞進行檢測。已有研究表明，胚胎早期體外發育過程中(第1-5日)會將少量DNA釋放入培養液(囊胚培養液)中。儘管對此機制尚不明了，但囊胚培養液中存在著胚胎來源的DNA提供了對胚胎染色體狀態進行無損檢測的物質基礎。我們的前期發明《一種利用囊胚培養液檢測胚胎染色體異常的方法》(CN105368936A)正是建立了一套達成此目的技術方法(NICS)。但是，NICS方法容易受到一些常規試管嬰兒體外胚胎培養過程中所忽略因素的干擾。
第一代試管嬰兒(IVF)使用大量精子對卵子進行體外受精。然而對每個卵子而言，只有一個精子能夠有效受精，使卵子成為受精卵，其它多餘的無效精子會黏附在受精卵表面，它們死亡後釋放入體外培養液中，因此，父源DNA會對後續的NICS檢測形成干擾。另外，從母體提取的卵細胞表面不可避免地會附著大量母體來源的顆粒細胞，這些顆粒細胞向培養液中釋放，因此，母源DNA也 會對NICS檢測形成干擾。
儘管二代試管嬰兒採用了卵胞漿內單精子注射方法(ICSI)對卵子進行體外受精，避免了多餘精子造成的污染問題。並且，體外受精前會對卵子表面附著的顆粒細胞做常規清洗以部分暴露卵子表面，為精子注射針提供通道，但常規清洗後的卵子表面仍會黏附有較多的顆粒細胞，對後續的NICS檢測形成干擾。
因此，本發明建立了將卵子(針對ICSI)或受精卵(針對IVF)表面的顆粒細胞和/或多餘精子徹底清除乾淨，以避免干擾NICS檢測的技術方法。
本發明的目的是建立在試管嬰兒(IVF及ICSI)過程中徹底清除卵子表面的顆粒細胞和/或多餘精子，使後續的胚胎培養液適用於NICS檢測的技術方法。
在本發明的第一方面中，提供了一種清洗卵子或受精卵表面的方法，其特徵在於，包括步驟：(1)將未經處理的卵子或未經處理的受精卵置於第一培養皿中，其中，所述第一培養皿經標準細胞培養表面處理且含有第一培養液，所述第一培養液含蛋白；然後加入透明質酸酶處理所述卵子或受精卵，從而得到經第一次處理的卵子或受精卵；(2)將經第一次處理的卵子或受精卵移入第二培養皿中，其中，所述第二培養皿未經表面處理且含有第二培養 液，所述第二培養液不含蛋白；然後用帶有第三培養液的棒狀工具撥動所述卵子或受精卵，其中，所述第三培養液含蛋白；使顆粒細胞和/或多餘精子脫離卵子或受精卵表面，從而被徹底清除乾淨。
在另一優選例中，所述帶有第三培養液的棒狀工具是指棒狀工具上蘸有第三培養液。
在另一優選例中，所述棒狀工具為棒或棍。
在另一優選例中，所述棒狀工具為玻璃的、塑膠的等任何適合的材料製成的。
在另一優選例中，所述蛋白為血清蛋白。
在另一優選例中，所述未經處理的卵子是從母體取出2-3小時後的卵子。
在另一優選例中，所述未經處理的受精卵是在體外受精4小時或16-20小時後的受精卵。
在另一優選例中，所述第一培養液模擬人輸卵管液的成分，且用HEPES做緩衝成份。
在另一優選例中，所述第一培養液可參照Quinn等人於1984年公開發表(《生育與不孕》(Fertil Steril.)1984；41：202或1985；44：493.)的文獻製備。
該培養液用HEPES做緩衝成份，在空氣中可較長時間地保持pH值的穩定性。培養時無需二氧化碳氣體環境。
該培養液可從各商業公司(如，SAGE media)購買，也可以自行配製。
在另一優選例中，所述第一培養液為IM培養液。
在另一優選例中，所述第一培養皿為Falcon 353037培養皿、康寧公司的430166培養皿或塞默飛公司的150288培養皿。
在另一優選例中，所述第一培養皿為任意的市售的經標準細胞培養表面處理的細胞培養皿。可以是任何其它公司出售的，也可以是任何形狀或尺寸的。
在另一優選例中，所述透明質酸酶可從任何細胞培養試劑供應商購得。
在另一優選例中，步驟(1)中，所述處理的時間為10-60秒；較佳地，為20-40秒。
在另一優選例中，所述第二培養液的成分與第一培養液相同，區別僅在於第二培養液不含有蛋白。
在另一優選例中，所述第二培養液為M-IM培養液。
在另一優選例中，所述第二培養皿為Falcon 351006培養皿、康寧公司的430589培養皿或塞默飛公司的150340培養皿。
在另一優選例中，所述第二培養皿為任意的市售的未經表面處理的細胞表面膜。可以是任何其它公司出售的，也可以是任何形狀或尺寸的。
在另一優選例中，所述第三培養液的成分與第一培養液相同，區別僅在於第三培養液不含緩衝成分HEPES。
在另一優選例中，所述第三培養液可參照Quinn等人於1984年公開發表(《生育與不孕》(Fertil Steril.) 1984；41：202或1985；44：493.)的文獻製備。
所述第三培養液與第一培養液的區別在於其中沒有緩衝成份(HEPES)，所以必須在5%二氧化碳環境(二氧化碳培養箱中)下使用。
該培養液可從各商業公司(如，SAGE media)購買，也可以自行配製。
在另一優選例中，所述第三培養液為GM培養液。
在另一優選例中，所述顆粒細胞和/或多餘精子從卵子或受精卵表面脫離後附於培養皿底部表面。
應理解，在本發明範圍內中，本發明的上述各技術特徵和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特徵之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限於篇幅，在此不再一一累述。
圖1顯示了剛從母體中取出的未經處理的卵子，表面附著有大量顆粒細胞。
圖2顯示了經步驟3清洗處理過的卵子，其表面顆粒細胞附著明顯減少，但仍有顆粒細胞附著。
圖3顯示了操作過程中顆粒細胞脫離卵子，附著於培養皿底。
圖4顯示了經步驟3和步驟4清洗處理過的卵子，其表面顆粒細胞被徹底清除。
圖5顯示了兩個卵子透明帶上附著的顆粒細胞被徹底 清除。
圖6顯示了處理後的兩個卵子表面仍有顆粒細胞殘留。
本發明人經過廣泛而深入的研究，意外發現了一種徹底清洗卵子或受精卵表面的方法。在此基礎上，發明人完成了本發明。
本文中所提及的蛋白為血清蛋白。
本發明提供了一種清洗卵子或受精卵表面的方法，所述方法包括步驟：(1)將未經處理的卵子或未經處理的受精卵置於第一培養皿中，其中，所述第一培養皿經標準細胞培養表面處理且含有第一培養液，所述第一培養液含蛋白；然後加入透明質酸酶(可從任何細胞培養試劑供應商購得)處理所述卵子或受精卵一段時間(如10-60秒；較佳地，為20-40秒)，從而得到經第一次處理的卵子或受精卵；(2)將經第一次處理的卵子或受精卵移入第二培養皿中，其中，所述第二培養皿未經表面處理且含有第二培養液，所述第二培養液不含蛋白；然後用帶有第三培養液的棒狀工具撥動所述卵子或受 精卵，其中，所述第三培養液含蛋白；使顆粒細胞和/或多餘精子脫離卵子或受精卵表面，從而被徹底清除乾淨。
其中，所述顆粒細胞和/或多餘精子從卵子或受精卵表面脫離後附於培養皿底部表面。
所述棒狀工具為棒或棍類似工具。所述棒狀工具可以為玻璃的、塑膠的等任何適合的材料製成的。所述帶有第三培養液的棒狀工具是指棒狀工具上蘸有第三培養液。
所述未經處理的卵子可以是從母體取出2-3小時後的卵子。
所述未經處理的受精卵可以是在體外受精4小時或16-20小時後的受精卵。
所述第一培養液模擬人輸卵管液的成分，且用HEPES做緩衝成份。該培養液用HEPES做緩衝成份，在空氣中可較長時間地保持pH值的穩定性。培養時無需二氧化碳氣體環境。
所述第一培養液可參照Quinn等人於1984年公開發表(《生育與不孕》(Fertil Steril.)1984；41：202或1985；44：493.)的文獻製備。也可從各商業公司(如，SAGE media)購買。
在另一優選例中，所述第一培養液為IM培養液。
所述第一培養皿為任意的市售的經標準細胞培養表面處理的細胞培養皿。可以是任何其它公司出售的，也可以是任何形狀或尺寸的。
在另一優選例中，所述第一培養皿為Falcon 353037培養皿、康寧公司的430166培養皿或塞默飛公司的150288培養皿。
所述第二培養液的成分與第一培養液相同，區別僅在於第二培養液不含有蛋白。
在另一優選例中，所述第二培養液為M-IM培養液。
所述第二培養皿為任意的市售的未經表面處理的細胞表面膜。可以是任何其它公司出售的，也可以是任何形狀或尺寸的。
在另一優選例中，所述第二培養皿為Falcon 351006培養皿、康寧公司的430589培養皿或塞默飛公司的150340培養皿。
所述第三培養液的成分與第一培養液相同，區別僅在 於第三培養液不含緩衝成分HEPES。所述第三培養液與第一培養液的區別在於其中沒有緩衝成份(HEPES)，所以必須在5%二氧化碳環境(二氧化碳培養箱中)下使用。
在另一優選例中，所述第三培養液可參照Quinn等人於1984年公開發表(《生育與不孕》(Fertil Steril.)1984；41：202或1985；44：493.)的文獻製備或可從各商業公司(如，SAGE media)購買。
在另一優選例中，所述第三培養液為GM培養液。
本發明技術方案的有益效果是：
1.徹底清除卵子(或受精卵)表面的顆粒細胞，避免了試管嬰兒(IVF及ICSI)過程中NICS檢測可能遭受的顆粒細胞和/或多餘精子污染。
2.避免了胚胎透明帶剝除的操作，簡化了技術操作步驟，避免了透明帶剝除操作可能帶來的胚胎損傷風險。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆：實驗室手冊(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。
1.1 含80U/ml的透明質酸酶的HEPES-HTF培養液(Hyaluronidase 80U/ml in HEPES-HTF)(規格：SAGE，產品號：ART4007-A)
1.2 M-IM培養液：Quinn's Advantage含HEPES培養液(Quinn's Advantage Medium with HEPES)(規格：SAGE，產品號：ART-1023)
1.3 IM培養液：Quinn's Advantage加蛋白受精培養液(Quinn's AdvantageTM Protein Plus Fertilization(TIF)Medium)(規格：SAGE，產品號：ART-1520)
1.4 GM培養液：Quinn's Advantage加蛋白卵裂培養液(Quinn's Advantage Protein Plus Cleavage Medium)(規格：SAGE，產品號：ART-1526)
2.1 Falcon 351006培養皿
2.2 Falcon 363037培養皿
2.3 巴斯德吸管
ICSI的卵子清除顆粒細胞處理是在取卵後2-3小時。
剛從母體中取出的未經處理的卵子，表面附著有大量顆粒細胞，如圖1所示。
4.1 在卵子清洗前，準備好剝卵用吸管(100-120μm)，移卵用吸管(180-200μm)及一根末端燒圓的小玻棒。
4.2 在1個Falcon 353037(聚苯乙烯材質，標準細胞培養表面處理)培養皿中加入1ml IM培養液(ART-1520)； 1個Falcon 351006(聚苯乙烯材質，無處理)培養皿中加入2ml不含蛋白的M-IM培養液(ART-1023)。
4.3 把從母體中取出的未經處理的卵子先放入含有IM培養液(ART-1520)的Falcon 353037培養皿中，再加入1ml 80U/ml的透明質酸酶的HEPES-HTF培養液，反復吹吸，持續30秒。在這一步驟中，因培養液中含有帶負電的蛋白質，中和了顆粒細胞表面的正電荷。同時，聚苯乙烯材質的培養皿經細胞培養表面處理後，其表面成親水的電荷中性狀態。因此，卵子與其表面附著的顆粒細胞會懸浮在液體培養液中。透明質酸酶的消化作用弱化了顆粒細胞與卵子之間的黏附作用。在吹打的沖洗作用下，部分顆粒細胞即可脫離與卵子的附著。
經上述步驟3清洗處理過的卵子，其表面顆粒細胞附著明顯減少，但仍有顆粒細胞附著。如圖2所示。
4.4 將表面黏附有剩餘顆粒細胞的卵子移入含有不含血清蛋白的M-IM培養液(ART-1023)的Falcon 351006培養皿中。此時，因培養液中不存在蛋白質的負 電中和作用，顆粒細胞帶有正電荷。同時，Falcon 351006培養皿為未經處理聚苯乙烯材質，其表面為疏水的負電狀態。因此，卵子與其表面附著的顆粒細胞就會黏附於培養皿底部表面(如圖3所示)。此時，用蘸過含蛋白GM培養液(ART-1526)的玻璃小棒(含蛋白培養液的作用是中和玻璃棒表面的負電荷，避免細胞黏附於玻璃棒上)不斷撥動卵子，使卵子在培養皿底部表面滾動。在滾動過程中，卵子表面的剩餘顆粒細胞就會黏附於培養皿底部表面與卵子脫離，持續推動卵子滾動，直至其表面的顆粒細胞被徹底清除乾淨。
經上述步驟3和4清洗處理過的卵子，其表面顆粒細胞被徹底清除，如圖4所示。
4.5 去除完顆粒細胞後，用吸管(先吸一點含蛋白的培養液)把卵子轉移到GM培養液中，放入37℃，5%CO2，5%O2培養箱內培養，隨後即可進入常規的單精子注射(ICSI)、胚胎體外培養(IVF及ICSI)和NICS檢測流程。
採用實施例1的方法，不同之處在於用受精卵代替卵子。而IVF清除受精卵表面顆粒細胞和多餘精子的處理時間是在加精4小時(短時受精)或16-20小時(常規受精)之後。
結果發現，IVF受精卵表面的顆粒細胞和多餘精子可 以被徹底清除。
採用實施例1的方法，不同之處在於使用康寧公司的培養皿，並根據文獻(Fertil Steril.1984；41：202,1985；44：493.)中的配方自製培養液。
用含人血清白蛋白及HEPES的HTF培養液(根據文獻自配)和經標準細胞培養表面處理的培養皿(購自：康寧；產品號：430166)代替含1ml IM培養液(ART-1520)的Falcon 353037(聚苯乙烯材質，標準細胞培養表面處理)培養皿； 用不含蛋白，但含有HEPES的HTF培養液(根據文獻自配)和未經表面處理的培養皿(購自：康寧；產品號：430589)代替含2ml不含蛋白的M-IM培養液(ART-1023)的Falcon 351006(聚苯乙烯材質，無處理)培養皿。
結果表明：兩個卵子透明帶上附著的顆粒細胞被徹底清除，如圖5所示。
採用實施例1的方法，不同之處在於在步驟4.4中用IM培養液代替了不含蛋白的M-IM培養液。
結果導致顆粒細胞與培養皿底黏附不牢，無法從卵子表面脫離。處理後的兩個卵子表面仍有顆粒細胞殘留，如 圖6所示。
本發明的優點是在對卵子、受精卵或胚胎不產生任何損傷，不觸動透明帶的情況下提供了一種徹底清除卵子表面顆粒細胞和/或多餘精子的方法。其要點在於利用細胞表面、培養液成份(蛋白質)和細胞培養皿底部表面的電荷關係將顆粒細胞和/或多餘精子從卵子(或受精卵)表面黏除。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請案所附申請專利範圍所限定的範圍。
Claims (10)
- 一種清洗卵子或受精卵表面的方法，其中包括步驟：(1)將未經處理的卵子或未經處理的受精卵置於第一培養皿中，其中，所述第一培養皿經標準細胞培養表面處理且含有第一培養液，所述第一培養液含蛋白；然後加入透明質酸酶處理所述卵子或受精卵，從而得到經第一次處理的卵子或受精卵；(2)將經第一次處理的卵子或受精卵移入第二培養皿中，其中，所述第二培養皿未經表面處理且含有第二培養液，所述第二培養液不含蛋白；然後用帶有第三培養液的棒狀工具撥動所述卵子或受精卵，其中，所述第三培養液含蛋白；使顆粒細胞和/或多餘精子脫離卵子或受精卵表面，從而被徹底清除乾淨。
- 如請求項1所述的方法，其中所述未經處理的卵子是從母體取出2-3小時後的卵子。
- 如請求項1所述的方法，其中所述未經處理的受精卵是在體外受精4小時或16-20小時後的受精卵。
- 如請求項1所述的方法，其中所述第一培養液模擬人輸卵管液的成分，且用HEPES做緩衝成份。
- 如請求項求1所述的方法，其中所述第一培養皿為Falcon 353037培養皿、康寧公司的430166培養皿或塞默飛公司的150288培養皿。
- 如請求項1所述的方法，其中步驟(1)中，所述處 理的時間為10-60秒。
- 如請求項1所述的方法，其中所述第二培養液的成分與第一培養液相同，區別僅在於第二培養液不含有蛋白。
- 如請求項1所述的方法，其中所述第二培養皿為Falcon 351006培養皿、康寧公司的430589培養皿或塞默飛公司的150340培養皿。
- 如請求項1所述的方法，其中所述第三培養液的成分與第一培養液相同，區別僅在於第三培養液不含緩衝成分HEPES。
- 如請求項1所述的方法，其中所述顆粒細胞和/或多餘精子從卵子或受精卵表面脫離後附於培養皿底部表面。
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