CN103898046B - 牛体外受精胚胎培养液和培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种专用于牛体外受精胚胎的培养液，所述培养液中含NaCl109.0-110mM、KCl2.9-3.1mM、NaHCO₃26.0-26.5mM、MgCl₂·6H₂O0.5-1.0mM、KH₂PO₃1.0-1.3mM、丙酮酸钠0.4mM、葡萄糖1.5mM、半乳糖酸钙5mM、10v/v%胎牛血清、L-谷氨酰胺1mM、2v/v%必需氨基酸、1v/v%非必须氨基酸和谷胱甘肽1-10mM。将牛体外受精胚胎置于上述培养液中进行体外培养，结果显示明显优于未添加GSH的对照组，提高了囊胚发育率及胚胎质量，降低体外生产胚胎的成本，为牛IVF技术应用于实践提供实验基础，可大大加速遗传育种进程。

Description

牛体外受精胚胎培养液和培养方法

技术领域

本发明属于农业-畜牧兽医领域，具体地说，涉及一种牛体外受精胚胎培养液和培养方法。

背景技术

随着现代农业科技的发展，为了更充分利用良种母牛的繁殖潜力，加速遗传育种进程，在生产实践中应用高效的繁殖新技术成为必然。活体采卵(OvumpickUP，OPU)和体外受精技术(InVitroFertilization，IVF)是二十世纪八十年代快速发展起来的胚胎工程新技术，二者相结合可获得大量遗传系谱明确的胚胎，从而缩短世代间隔。目前，这两种技术已经成为欧美和大洋洲等畜牧业发达国家的农场主为扩大良种母牛群而采用的重要繁殖技术。然而，采用常规的牛胚胎培养体系(CR1aa和SOF液)，牛体外受精的囊胚发育率较低，而且胚胎质量也远不及体内胚胎，导致胚胎移植受体后的妊娠率低，因此如何提高囊胚发育率及胚胎质量成为体外受精胚胎生产的重点和研究的焦点。

早在1878年，德国人Scnenk就以家兔和豚鼠为材料，开始探索哺乳动物的体外受精技术。但直到1951年，美籍华人张民觉和Austin分别发现精子体外获能现象后，体外受精技术才获得了突破性进展。牛体外受精技术受到卵母细胞的体外成熟、精子的体外获能、受精卵的体外培养环境等多个方面的影响。

胚胎的体外培养是IVF技术的一个关键环节，亦是卵母细胞体外成熟和体外受精技术最终效果的体现和检验。在体外受精后，受精卵在向囊胚发育过程中将需经历一系列重要的变化，包括合子的形成、第一次卵裂、胚胎基因组的激活、致密化以及形成囊胚。这一过程中，外界环境的变化会导致基因表达发生改变，从而影响胚胎的正常发育及质量。目前，哺乳动物早期胚胎的体外培养研究主要集中在改善培养液成分以满足不同发育阶段的胚胎营养需求。基于Rosenkrans等(1991年)开发的CharlesRosenkrans1(CR1)培养液和Tervit等(1972年)开发的合成输卵管液(SyntheticOviductalFluid，SOF)，经多年不断改进逐步形成了两种培养体系。据HakanSagirkaya等(2007年)和Somfai等(2010年)研究成果表明，CR1aa培养液用于牛胚胎培养有较好的效果，可以广泛应用于牛的胚胎培养；Thompson,J.G.等(2000年)和JeanM.Feugang等(2009年)的研究结果显示，SOF培养液也是一种适合于牛胚胎培养的培养体系。张志平等(2006年)和桑国俊等(2008年)研究结果也显示，经过优化的CR1aa和SOF培养液均适合于牛的体外胚胎培养，均取得良好的培养效果。哺乳动物早期胚胎发育是一个高度协调且精确调节的过程。在进化过程中，配子细胞逐步形成了一系列的分子级联网络，以保证胚胎发育周期系统地进行。在发育过程中，胚胎的内外活性氧自由基(ReactiveOxygenSpecies，ROS)与抗氧化剂的平衡对早期胚胎发育起着决定性作用。

大多生化反应均产生ROS，其在细胞内、外均有着重要的作用，一部分ROS起着信号分子的作用，但是大多数ROS对机体是有害的。Brooker,R.J.等(2011年)报道，ROS可以引起细胞DNA损伤、不饱和脂肪酸的氧化、蛋白质中氨基酸的氧化甚至可以导致某些酶的失活。一般来说，ROS以四种形式存在，其中H₂O₂氧化作用较强，是引起氧化伤害的最主要因素。

大量研究表明，谷胱甘肽(GSH)是以非蛋白质形式存在的一种抗氧化剂，能够清除多种自由基：超氧阴离子自由基、羟基自由基、过氧化氢、次氯酸和脂氧自由基，并且能够维持细胞内外氧化还原平衡。细胞内外环境GSH和ROS水平是影响受精卵发育过程中的两个重要因素。早在2000年，deMatos等曾通过在体外胚胎培养过程中添加β-巯基乙醇、半胱氨酸和胱氨酸来提高囊胚率。

尽管体外受精技术能成功应用于许多哺乳动物，但由于体外受精的囊胚率低而导致体外受精胚胎的生产成本高、效率低，限制了该技术在牛快速扩繁实践中的广泛应用。因此，如何能够降低成本并提高牛IVF胚胎生产效率和胚胎质量成为亟待解决的问题。

目前，牛体外受精的技术体系中主要以CR1aa和SOF液为胚胎体外培养液，并在此基础上进行改进，囊胚发育率均有不同程度的提高，囊胚发育率平均为30％-40％。对于囊胚质量，可以通过囊胚细胞总数、ICM细胞数/总细胞数比例、细胞凋亡率来评估。囊胚细胞总数根据囊胚所处阶段的不同而不同，S.Iwasaki等(1990年)获得的牛早期囊胚总细胞数平均为44，ICM细胞数/囊胚总细胞数比例为15.8％左右；AndrewJ.Watson等(2000年)统计牛囊胚细胞凋亡率约为7.7％-13％。

发明内容

本发明旨在提高牛IVF胚胎生产效率和胚胎质量，提供一种专用于牛体外受精胚胎的培养液和培养方法。

为了实现本发明目的，本发明的一种牛体外受精胚胎培养液，所述培养液配方为：NaCl109.0-110mM、KCl2.9-3.1mM、NaHCO₃26.0-26.5mM、MgCl₂·6H₂O0.5-1.0mM、KH₂PO₃1.0-1.3mM、丙酮酸钠0.4mM、葡萄糖1.5mM、半乳糖酸钙5mM、10v/v％胎牛血清、L-谷氨酰胺1mM、2v/v％必需氨基酸、1v/v％非必须氨基酸和谷胱甘肽1-10mM，以水配制。

所述培养液配方优选为：NaCl109.0mM、KCl3.1mM、NaHCO₃26.2mM、MgCl₂·6H₂O0.8mM、KH₂PO₃1.19mM、丙酮酸钠0.4mM、葡萄糖1.5mM、半乳糖酸钙5mM、10v/v％胎牛血清、L-谷氨酰胺1mM、2v/v％必需氨基酸、1v/v％非必须氨基酸和谷胱甘肽1-10mM。

所述必需氨基酸为以下氨基酸按比例混合后配制的水溶液，其中，各氨基酸含量为：L-盐酸精氨酸6.32g/L、L-胱氨酸二盐酸盐1.564g/L、L-盐酸组氨酸一水物2.1g/L、L-异亮氨酸2.625g/L、L-亮氨酸2.62g/L、L-赖氨酸盐酸盐3.625g/L、L-蛋氨酸0.755g/L、L-苯丙氨酸1.65g/L、L-苏氨酸2.38g/L、L-色氨酸0.51g/L、L-酪氨酸1.8g/L和L-缬氨酸2.34g/L。

所述非必须氨基酸为以下氨基酸按比例混合后配制的水溶液，其中，各氨基酸含量为：L-丙氨酸0.89g/L、:L-天门冬酰胺一水物1.5g/L、L-天冬氨酸1.33g/L、L-谷氨酸1.47g/L、甘氨酸0.75g/L、L-脯氨酸1.15g/L和L-丝氨酸1.05g/L。

优选地，所述培养液中谷胱甘肽含量为1mM、3mM、5mM或7mM。

更优选地，所述培养液中谷胱甘肽含量为3mM或5mM。

最优选地，所述培养液中谷胱甘肽含量为3mM。

本发明还提供一种牛体外受精胚胎的培养方法，将牛体外受精胚胎置于上述牛体外受精胚胎培养液中，在38.5℃、0.5％CO₂、100％湿度条件下进行体外培养。

本发明具有以下优点：

本发明通过在培养液中添加一定浓度的谷胱甘肽(Glutathione，GSH)，能显著提高体外胚胎的发育能力。同时对囊胚进行差异染色，区分内细胞团(InnerCellMass,ICM)、滋养层细胞和凋亡细胞，比较总细胞数，并计算ICM细胞数/总细胞数比例和凋亡率，结果显示添加GSH的试验组优于对照组，提高了囊胚发育率及胚胎质量，降低体外生产胚胎的成本，为牛IVF技术应用于实践提供实验基础，可大大加速遗传育种进程。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例牛体外受精胚胎的培养方法

一、试剂

成熟培养液：含0.01IU/mlFSH、10IU/mlLH、1μg/ml雌二醇、100ng/mlIGF、50ng/mlEGF、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、10％胎牛血清的TCM-199培养液。

洗精液：含112.0mMNaCl、4.02mMKCl、2.25mMCaCl₂·2H₂O、0.52mMMgCl₂·6H₂O、0.83mMKH₂PO₃、37.0mMNaHCO₃、1.25mM丙酮酸钠、10μg/ml肝素、4mg/ml牛血清白蛋白(Bovineserumalbumin，BSA)、10mM咖啡因、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的水溶液。

受精液：含112.0mMNaCl、4.02mMKCl、2.25mMCaCl₂·2H₂O、0.52mMMgCl₂·6H₂O、0.83mMKH₂PO₃、37.0mMNaHCO₃、1.25mM丙酮酸钠、10μg/ml肝素、4mg/mlBSA、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的水溶液。

胚胎前期培养液：含109.5mMNaCl、3.1mMKCl、26.2mMNaHCO₃、0.8mMMgCl₂·6H₂O、1.19mMKH₂PO₃、0.4mM丙酮酸钠、1.5mM葡萄糖、5mM半乳糖酸钙、6mg/mlBSA、1mML-谷氨酰胺、2v/v％必需氨基酸、1v/v％非必须氨基酸的水溶液。胚胎后期培养液：含109.5MNaCl、3.1MKCl、26.2MNaHCO₃、0.8MMgCl₂·6H₂O、1.19MKH₂PO₃、0.4M丙酮酸钠、1.5M葡萄糖、5M半乳糖酸钙、10v/v％胎牛血清(Fetalbovineserum，FBS)、1ML-谷氨酰胺、2v/v％必需氨基酸、1v/v％非必须氨基酸的水溶液。

所述必需氨基酸为以下氨基酸按比例混合后配制的水溶液，其中，各氨基酸含量为：L-盐酸精氨酸6.32g/L、L-胱氨酸二盐酸盐1.564g/L、L-盐酸组氨酸一水物2.1g/L、L-异亮氨酸2.625g/L、L-亮氨酸2.62g/L、L-赖氨酸盐酸盐3.625g/L、L-蛋氨酸0.755g/L、L-苯丙氨酸1.65g/L、L-苏氨酸2.38g/L、L-色氨酸0.51g/L、L-酪氨酸1.8g/L和L-缬氨酸2.34g/L。

所述非必须氨基酸为以下氨基酸按比例混合后配制的水溶液，其中，各氨基酸含量为：L-丙氨酸0.89g/L、:L-天门冬酰胺一水物1.5g/L、L-天冬氨酸1.33g/L、L-谷氨酸1.47g/L、甘氨酸0.75g/L、L-脯氨酸1.15g/L和L-丝氨酸1.05g/L。

二、卵母细胞的采集和体外成熟

1.从屠宰场采集牛卵巢，置于37℃生理盐水中，3h内送至实验室。

2.使用含有青霉素和链霉素的温热的生理盐水将卵巢清洗3-5次。

3.使用真空蠕动泵，用18号针头抽取5-8毫米卵泡中的卵泡液。

4.体视显微镜下挑选卵母细胞-卵丘细胞复合体(COCs)，在洗卵液中将COCs洗涤两次，在成熟培养液中洗涤一次。

5.将洗干净的COCs放入含有成熟培养液并覆盖矿物油的四孔板中，每孔培养50枚COCs，培养22-24h。

三、体外受精

1.将COCs从成熟培养液中移入50μl受精滴中，每滴放15枚COCs。

2.38℃水浴解冻精液，使用5ml洗精液在500g条件下离心5min；弃上清，再加入5ml洗精液离心5min，弃上清，使用洗精液调整精子浓度，使精子浓度约为2×10⁷个/ml。

3.取50μl精液，与含有COCs的受精滴混合成为100μl的液滴。

4.38.5℃，5％CO₂气体，95％湿度条件下精卵共孵育8h。

四、胚胎体外培养

1.精卵共孵育8h后，取出卵母细胞，使用1mg/ml的透明质酸酶处理3min，然后使用移液枪反复吹打，直至卵丘细胞基本脱落。

2.使用含10％FBS的TCM199终止透明质酸酶的消化，用口吸管将疑似受精卵在胚胎前期培养液中洗3次后放入胚胎前期培养液滴中进行培养。

3.48h后，将卵裂至4-8细胞的胚胎移至胚胎后期培养液滴中，48h后半量更换胚胎后期培养液。

4.第7天时，统计囊胚率。

五、GSH最适添加浓度筛选

1.配制0.5M的GSH作为储液。

2.使用GSH储液，按照终浓度为1mM、3mM、5mM、7mM梯度配制为试验组，以非添加组为对照。

3.分别于培养的第48h、第5天、第7天，统计各个组的卵裂卵与8细胞率、桑椹胚率和囊胚率。

六、胚胎差异染色

1.选取体外培养第7天的囊胚，使用2％多聚甲醛固定20min。

2.使用含0.5％BSA的磷酸盐缓冲液(PBS-BSA)洗两次，放入透化液(50μlTriton、5μlTween和9.945mlPBS)中，室温放置30min。

3.使用2M盐酸室温处理20min，然后使用100mMTris-HCl室温处理10min，使CDX2蛋白能够与一抗结合。

4.使用PBS-BSA清洗三次，将囊胚放入封闭液(1ml山羊血清、5μlTween和8.995mlPBS)中，室温封闭1h，然后转入4℃冰箱封闭过夜。

5.弃去封闭液，CDX2一抗用封闭液按1:200稀释，室温孵育2h，弃去一抗稀释液，用PBS-BSA清洗3次，每次5min。

6.caspase-3一抗(购自CellSignalingTechnology公司)用封闭液按1:200稀释，室温孵育2h，弃去一抗稀释液，用PBS-BSA清洗3次，每次5min。

7.在避光条件下用封闭液按1:200稀释CDX2特异性二抗(购自Sigma公司)，室温下避光放置1h。避光条件下弃去二抗稀释液，用PBS清洗3次，每次5min。

8.在避光条件下用封闭液按1:200稀释caspase-3特异性二抗(购自LifeTechnologies公司)，室温下避光放置1h。避光条件下弃去二抗稀释液，用PBS清洗3次，每次5min。

9.加入10μg/mL的Hochest33342染液染细胞核，室温作用5min，在荧光显微镜下观察并拍照。

10.实验重复三次，每次随机选取10个囊胚，计算凋亡率、ICM细胞数/总细胞数来评估囊胚质量。

七、数据统计

实验数据采用统计软件SASV8中的ANOVA程序进行分析，Duncan’smultiple-range检验方法判定处理间的差异显著性，当p<0.05时认为差异显著。

八、胚胎后期培养液中添加GSH可显著提高牛体外受精囊胚的发育率

选择GSH添加浓度为0、1、3、5、7mM进行筛选，通过统计卵裂率、4-8细胞率、桑椹胚率、囊胚率(表1)，结果各组间的卵裂率和4-8细胞率均差异不显著(p＞0.05)；对桑葚胚发育率，3mM和5mMGSH添加组均显著高于对照组和其他实验组(p＜0.05)，但这两组间差异不显著(p＞0.05)；对囊胚率，1mM、3mM和5mMGSH添加组均显著高于对照组(p＜0.05)，而7mM的GSH添加组与对照组间差异不显著(p＞0.05)，可见在胚胎后期培养液中添加GSH均可提高牛IVF胚胎的体外发育率。

表1不同GSH浓度对牛IVF胚胎发育的影响

注：同一列中数字后字母相同者差异不显著(p＞0.05)，不同者差异显著(p＜0.05)。卵裂率＝受精卵裂数/受精卵数，4-8细胞率＝4-8细胞胚胎数/卵裂胚胎数，桑葚胚率＝桑葚胚胎数/卵裂胚胎数；囊胚率＝囊胚数/卵裂胚胎数

九、胚胎后期培养液中添加GSH可提高牛体外受精胚胎的质量

通过统计总细胞数，ICM细胞数/总细胞数和凋亡率，比较分析了GSH不同添加浓度组获得的囊胚质量。对总细胞数，四个GSH添加组均显著高于对照组(p＜0.05)，且3mM、5mM和7mM组均显著高于1mM组(p＜0.05)。对ICM细胞数/总细胞数比例，1mM添加组与对照组差异不显著(p＞0.05)，3mM、5mM和7mM组均显著低于对照组(p＜0.05)，但这三组之间差异不显著(p＞0.05)。对凋亡率，四个添加组与对照组之间差异不显著(p＞0.05)，1mM、3mM、7mMGSH添加组和对照组的凋亡率均显著低于5mM添加组(p＜0.05)，可见GSH的添加有助于提高牛体外受精胚胎的质量。

表2不同GSH浓度对胚胎质量的影响

注：同一列中数字后字母相同者差异不显著(p＞0.05)，不同者差异显著(p＜0.05)，凋亡率＝凋亡细胞数/总细胞数。

十、GSH最适添加浓度为3mM

在四个实验组中，3mM和5mMGSH添加组获得的桑葚胚率和囊胚率均显著高于对照组和其它实验组(p＜0.05)；但3mMGSH添加组的桑葚胚率与5mMGSH添加组间差异不显著(p＞0.05)，但囊胚率却显著高于5mM添加组(p＜0.05)，可见3mMGSH添加组中的牛IVF胚胎的发育率是最高的，因此GSH的最适浓度为3mMGSH添加组。

本发明筛选出了最适添加浓度，极大地提高了囊胚生产效率，囊胚率由30％提高至50％；对胚胎质量进行评估也显示，添加本产品后囊胚质量也优于对照组。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

参考文献

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3.Tervit,H.R.,D.G.Whittingham,andL.E.Rowson,Successfulcultureinvitroofsheepandcattleova.JReprodFertil,1972.30(3):p.493-7.

4.Sagirkaya,H.,etal.,Developmentalpotentialofbovineoocytesculturedindifferentmaturationandcultureconditions.AnimReprodSci,2007.101(3-4):p.225-40.

5.Somfai,T.,etal.,DevelopmentofbovineembryosculturedinCR1aaandIVD101mediausingdifferentoxygentensionsandculturesystems.ActaVetHung,2010.58(4):p.465-74.

6.Thompson,J.G.,etal.,Effectofinhibitorsanduncouplersofoxidativephosphorylationduringcompactionandblastulationofbovineembryosculturedinvitro.JReprodFertil,2000.118(1):p.47-55.

7.Feugang,J.M.,O.Camargo-Rodriguez,andE.Memili,Culturesystemsforbovineembryos.LivestockScience,2009.121(2-3):p.141-149.

8.张志平,张.,安志兴,张锈,张涌,牛胚胎培养体系的优化.西北农林科技大学学报,2006.34.

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10.Brooker,R.J.,Genetics:analysisandprinciples(4thed.).McGraw-HillScience,2011.

11.deMatos,D.G.andC.C.Furnus,Theimportanceofhavinghighglutathione(GSH)levelafterbovineinvitromaturationonembryodevelopmenteffectofbeta-mercaptoethanol,cysteineandcystine.Theriogenology,2000.53(3):p.761-71.

12.Iwasaki,S.andT.Nakahara,Cellnumberandincidenceofchromosomalanomaliesinbovineblastocystsfertilizedinvitrofollowedbycultureinvitroorinvivoinrabbitoviducts.Theriogenology,1990.33(3):p.669-75.

13.Watson,A.J.,etal.,Impactofbovineoocytematurationmediaonoocytetranscriptlevels,blastocystdevelopment,cellnumber,andapoptosis.BiolReprod,2000.62(2):p.355-64.

Claims (2)

1.一种牛体外受精胚胎培养液，其特征在于，所述培养液配方为：NaCl109.5mM、KCl3.1mM、NaHCO₃26.2mM、MgCl₂·6H₂O0.8mM、KH₂PO₃1.19mM、丙酮酸钠0.4mM、葡萄糖1.5mM、半乳糖酸钙5mM、10v/v％胎牛血清、L-谷氨酰胺1mM、2v/v％必需氨基酸、1v/v％非必须氨基酸和谷胱甘肽3mM，以水配制；

所述必需氨基酸为以下氨基酸按比例混合后配制的水溶液，其中，各氨基酸含量为：L-盐酸精氨酸6.32g/L、L-胱氨酸二盐酸盐1.564g/L、L-盐酸组氨酸一水物2.1g/L、L-异亮氨酸2.625g/L、L-亮氨酸2.62g/L、L-赖氨酸盐酸盐3.625g/L、L-蛋氨酸0.755g/L、L-苯丙氨酸1.65g/L、L-苏氨酸2.38g/L、L-色氨酸0.51g/L、L-酪氨酸1.8g/L和L-缬氨酸2.34g/L；

所述非必须氨基酸为以下氨基酸按比例混合后配制的水溶液，其中，各氨基酸含量为：L-丙氨酸0.89g/L、L-天门冬酰胺一水物1.5g/L、L-天冬氨酸1.33g/L、L-谷氨酸1.47g/L、甘氨酸0.75g/L、L-脯氨酸1.15g/L和L-丝氨酸1.05g/L。

2.牛体外受精胚胎的培养方法，其特征在于，将牛体外受精胚胎置于权利要求1所述培养液中，在38.5℃、0.5％CO₂、100％湿度条件下进行体外培养。