CN102453694A

CN102453694A - 一种显微受精方法

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Publication number: CN102453694A
Application number: CN2010105181039A
Authority: CN
Inventors: 陈浩杰
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2010-10-25
Filing date: 2010-10-25
Publication date: 2012-05-16

Abstract

本发明提供一种显微受精方法，其主要包括步骤：1)取新鲜精液或冻融后的精液；2)取注射HCG后14～18小时的新鲜卵母细胞；3)将步骤1)所述的新鲜精液中的精子和冻融后的精液中的活精子分别注射到步骤2)所述的卵母细胞中，得注射卵；4)用5umol/L离子霉素+2mmol/L6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)激活注射卵，获得受精卵；5)将受精卵放入TCM199+10％FBS+1.25mM酮酸钠(Na-Pyruvate)+0.1mM EDTA培养液中培养。本发明提供的卵母细胞胞质内单精子注射方法，简单、易于操作，且便于大规模生产推广。

Description

一种显微受精方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种体外培养技术，尤其涉及一种显微受精方法。

背景技术

显微受精被广泛地应用于基础的生殖研究和人的辅助生殖技术中来治疗不孕症。从历史上讲，在哺乳动物，显微受精最早开始于金黄地鼠；自此之后，显微受精对于哺乳动物受精机制的研究提供了无价的信息。由于动物基因工程和生殖技术的进步，现在，显微受精技术已经被广泛的使用，来鉴别特定基因在生物学上的意义或证实在体外通过实验操作后的配子其基因的正常形态。

卵母细胞胞质内单精子注射技术(ICSI)作为辅助显微受精的一种手段，在短短几十年里得到了迅猛的发展，就ICSI应用的性质和范围来看，当前ICSI的应用可以归为两大类，一是它可以解决精子本身因素及输卵管阻塞等原因所导致的一系列不育问题，故而被广泛用于生殖医学的不育症治疗；二是作为一种生物技术用于生物工程领域，对畜牧生产、野生动物保护和受精机理等发育生物学基础理论的研究均具有非常重要的意义。

ICSI技术通常包括精子和卵子的准备或预处理、精子胞质内显微注射、注射卵的激活以及注射卵体外发育情况的观察与评定。目前，大量的研究结果证明有几个关键性的技术因素影响着ICSI的成功率，其中包括显微操作系统、显微操作工具、操作环境、卵子注射前处理、第一极体的位置、ICSI前制动。

当前，显微受精技术存在的不足之处是操作复杂、成本较高，不利于生产推广。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简单、易于操作的显微受精方法。

本发明提供的卵母细胞胞质内单精子注射方法，主要包括步骤：

1)取新鲜精液或冻融后的精液；

2)取注射HCG后14～18小时的新鲜卵母细胞；

3)将步骤1)所述的新鲜精液中的精子和冻融后的精液中的活精子分别注射到步骤2)所述的卵母细胞中，得注射卵；

4)用5umol/L离子霉素+2mmol/L6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)激活注射卵，获得受精卵；

5)将受精卵放入TCM199+10％FBS+1.25mM酮酸钠(Na-Pyruvate)+0.1mM EDTA培养液中培养。

步骤1)所述的冻融后的精液通过下述方法制备：冻融后的精液放于38.5℃、5％CO₂、100％湿度下的培养箱中缓慢上游10分钟。

步骤1)中，新鲜精液的处理还包括：将新鲜精液用D-PBS液离心洗涤后加入D-PBS液，放于38.5℃、5％CO₂、100％湿度下的培养箱中缓慢上游10分钟。

优选地，步骤2)中取注射HCG后14小时的新鲜卵母细胞。

步骤3)中用显微注射针将精子注射入卵母细胞中。应用注射针前用前端细长的水银塑料吸管吸取1～2u1水银，把水银吸管前端细长的部分从注射针的后端伸入进注射针，在离注射针末段1.0～1.5cm的位置缓慢吹出吸管内的水银，使水银柱在针管中长度在2～3mm之间，水银灌好后，把注射针连接到Piezo操作臂上。注射时第一极体在12点钟位置，从3点钟的位置进针，设置强度和频率参数为2×2或3×2。

步骤4)还包括：注射后6-8h检查原核和第二极体，当出现2原核2极体时判定为受精；当出现1原核1极体、1原核2极体、2原核1极体时判定为活化。

步骤5)中所述培养液的配方为：18mlTCM199中加入2mlFBS、0.00275g丙酮酸钠、0.00075gEDTA、0.0015g青霉素、0.001g链霉素，混匀，调pH为7.3。

本发明提供的显微受精方法，简单、易于操作，降低了成本，且便于大规模生产推广。

为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。

附图说明

图1是操作盘示意图；

图2是雌雄原核和第一二极体示意图；

图3是2-细胞胚胎示意图；

图4是4-细胞胚胎示意图；

图5桑椹胚示意图；

图6是囊胚示意图；

图7是扩张囊胚示意图；

图8是孵化囊胚示意图；

图9是冻融后活的胚胎示意图；

图10是冻融后死的胚胎；

图11是显微操作示意图；

图12是出生的仔兔。

具体实施方式

实施例1精子的准备

1.新鲜精子：

取兔(6～8月龄新西兰兔，SPF级，上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号：SCXK＜沪＞2004-0005)新鲜精液用D-PBS液(商购)2000r/min离心洗涤三次然后缓慢的加入D-PBS液，放在38.5℃、5％CO₂、100％湿度下的培养箱中缓慢上游10分钟。兔冻融精液直接放入D-PBS液中，相同条件下上游10分钟。

2.冻融的精子：

采集兔精液与冷冻液(冷冻液的配方为：100ml去离子水中加入3.52gTris·HCL、1.96g柠檬酸、1.59g葡萄糖混匀作为基础液；100ml冷冻液∶76ml基础液中加入20ml卵黄、4ml甘油，混匀分装，4℃冰箱保存。)1∶1稀释混匀，4℃缓慢降温，3h后用0.25～0.30ml塑料细管分装封口，置于漂浮器上(距液氮面4cm，-90--95℃)，10分钟后投入液氮。将装有要解冻精子的细管置于42℃水浴中20秒。

实施例2卵母细胞的准备

1.新鲜卵母细胞

供体母兔为6-8月龄、体重3kg左右的初产新西兰兔，按Kennelly和Foote(1965)的方法，即连续3天每天2次(间隔12h)每次皮下注射FSH50IU/只(宁波第二激素厂生产)，最后一次注射FSH后12h，耳缘静脉注射HCG(宁波第二激素厂生产)100IU/只并与结扎公兔交配，HCG注射后14、16、18h进行取卵，在无菌条件下剪下输卵管，吸取10ml的冲卵液，由喇叭口向宫管结合部方向冲卵，每侧用5mL冲卵液，将卵丘卵母细胞复合体放在装有含0.2％透明质酸酶的D-PBS液的Eppendorf管中，在涡旋混合器上震荡消化5min去除颗粒细胞，在体视显微镜下捡出经酶消化的卵母细胞，用培养液洗涤三次，然后放入38.5℃、5％CO₂、100％湿度下平衡12h以上的培养液微滴中，直到显微注射。

2.冻融的卵母细胞

1)卵母细胞的冷冻

冷冻前2h左右将室温调至25℃，同时将所有溶液及试验器具在25℃室温下平衡1～2h。采用0.25～0.30ml塑料细管(France)，用记号笔标记，然后用细乳胶管与注射器相连接。按顺序吸入0.5mol蔗糖溶液(5.5cm)→空气(1.5cm)→玻璃化溶液(0.5cm)→空气(0.5cm)→玻璃化溶液(1.5cm)，平行放置于操作台上，将卵母细胞移入玻璃化溶液中洗一次，然后将10枚卵母细胞置于细管中的玻璃化溶液中，卵母细胞导入后依次再吸入空气(0.5cm)→玻璃化溶液(0.5cm)→空气(0.5cm)，最后吸0.5mol蔗糖溶液(1cm)。用封口机将塑料细管封口。将含有卵母细胞的细管一端直接投入液氮，另一半用液氮气熏蒸冷冻，待蔗糖部分冻结后转入液氮罐中长期保存，从卵母细胞移入玻璃化溶液到细管投入液氮为止整个过程为1分钟，如果室温调至20℃，则整个过程需要2分钟。

2)卵母细胞的解冻

塑料细管从液氮中取出后，快速置于25℃水浴中轻轻摆动约10秒钟，待细管中蔗糖溶液段由乳白色变为透明后取出，用吸水纸吸去细管表面水分，剪去细管两端的封口，用吸有1mL0.5mol蔗糖溶液的注射器将细管内容物冲入表面皿内，在实体显微镜下回收卵母细胞，回收的卵母细胞移入0.5mol蔗糖溶液内平衡5分钟去除乙二醇和聚蔗糖后，再转入D-PBS液中，然后待卵母细胞恢复正常形态后再用培养液洗涤2-3次继续培养。

解冻后放入38.5℃、5％CO₂、100％湿度下平衡12h以上的培养液微滴中至少3h，然后进行操作。

实施例3将精子注射到卵母细胞中

1.操作盘的制作

操作盘的设计方式按＜＜小鼠胚胎操作实验手册＞＞第三版ICSI章节所介绍的样式设计，即于90mm细胞培养皿盖上依次做成4-5排操作小滴，每排操作液滴由三个3ul 10％PVP(聚乙烯吡咯酮)滴和三个5ulmTCM199滴组成，吸取2ul浮游的上层精子加入到第二个PVP滴中，卵子置于第四个mTCM199滴中，盘中间其余小滴都做holding管和注射针的清洗滴用，全部操作滴做好后，最后用3-5ml石蜡油覆盖整个操作盘，操作盘操作滴的设计样式见图(图1)。

2.PVP滴中精子的加入

PVP(1gPVP倒入10mlD-PBS液中配置而成)滴中根据精子密度的大小按合适的比例加入，每个PVP滴中混合2.0ul精子悬浮液，具体操作是用10ul移液枪吸取2.0ul的精子游离液，在体视显微镜下，将枪头深入到PVP滴中，吹出精子悬浮液到PVP滴中，反复吹吸操作数次，使精子在PVP滴中混合均匀，精子加完后，覆盖石蜡油。

3.显微操作系统的装针与调试

在操作系统注射针时，用一根前端细长的水银塑料吸管吸取1～2ul水银，把水银吸管前端细长的部分从注射针的后端伸入进注射针，在离注射针末段1.0～1.5cm的位置缓慢吹出吸管内的水银，使水银柱在针管中长度在2～3mm之间即可，水银灌好后，把注射针连接到Piezo操作臂上。

注射前，用捡卵针把5-10枚卵母细胞移入操作液滴中，然后用注射针抓取一个精子放入第三个PVP液滴中，用针尖在精子尾部迅速划过进行制动，看到尾部打折即可，随后从尾部吸入注射针内。注射时第一极体在12点钟位置，从3点钟的位置进针，设置强度和频率参数为2×2或3×2，激发1至2个脉冲击穿透明带，继续进针同时将精子小心的推至针尖处，直至针尖插入卵母细胞深处，几乎贴近对侧质膜时，调换参数到1×1的档，用Piezo弱脉冲击穿卵母细胞质膜，将精子吐出，回吸注入卵内多余的液体，轻轻退针，完成一次注射。依次操作，每次注射从开始制动到注射完毕在2min内完成，所有显微操作在室温下完成。

4.受精卵和孤雌活化卵的判定标准

注射后6-8h检查原核和第二极体形成情况，只有当出现2原核2极体(2PN、2PB)时判定为受精；当出现1原核1极体(1PN、1PB)、1原核2极体(1PN、2PB)、2原核1极体(2PN、1PB)时判定为活化。

实施例4受精卵的培养

显微注射后，注射卵经培养液洗涤三次后，移入平衡好的培养液微滴中，放在38.5℃、5％CO₂、100％湿度下的培养箱中培养3-4天，培养6～8h后观察原核和第二极体形成情况，每隔12h观察并记录卵裂情况，间隔24h换液，适时照相。

实施例5胚胎冷冻和解冻

方法同实施例2中的卵母细胞的冷冻和解冻方法。

实施例6 胚胎移植

新鲜的ICSI胚胎或冻融的胚胎，在TCM199培养液(18mlTCM199中加入2mlFBS、0.00275g丙酮酸钠、0.00075gEDTA、0.0015g青霉素、0.001g链霉素，充分混匀，调pH为7.3，0.22um滤器过滤分装，4℃冰箱保存)中培养2-3小时，形态正常的胚胎供移植用，受体为注射HCG后假孕60h、生过一胎、体质健康、体重3.5kg左右的成年母兔。受体兔在手术前禁食12h。首先用0.5mL速眠新(即846合剂)肌肉注射麻醉，待兔麻醉后保定，在两肷部附近分别剪毛、消毒、手术开口，暴露子宫，用针头在子宫体上扎一小孔，然后用头部钝化的移卵管将胚胎移入子宫中，每侧子宫移入7-8枚胚胎，每只母兔15-16枚胚胎。整个手术过程在无菌条件下进行，尽量在较短时间内(40-50min)完成手术，对术后母兔精心饲养管理。

实施例7结果分析

采用SSPS 13.0中的卡方(x²)检验对结果进行显著性分析，以P＜0.05为差异显著性判定标准。

请参照图2～12，其中图2是雌雄原核和第一二极体示意图；图3是2-细胞胚胎示意图；图4是4-细胞胚胎示意图；图5桑椹胚示意图；图6是囊胚示意图；图7是扩张囊胚示意图；图8是孵化囊胚示意图；图9是冻融后活的胚胎示意图；图10是冻融后死的胚胎；图11是显微操作示意图；图12是出生的仔兔。

1.卵龄对ICSI兔胚胎体外发育的影响：

HCG注射后14、16、18h进行取卵，用新鲜活精子进行注射，激活用机械刺激的方法，第一极体在12点钟位置，3点钟的位置进针，分三组进行，每组重复3次，统计其受精率、囊胚率。结果见表1。

从表1中可以看出hCG注射后14h取卵，其卵裂率、桑椹胚率和囊胚率(82.2％、72.9％和62.2％)都比16h(75.9％、70.0％和53.3％)的高，但是差异不显著(P＞0.05)；18h取的卵注射后不能卵裂，与14h和16h差异显著(P＜0.05)。可见，注射HCG后14h和16h取卵都可以，但是14h取卵最佳。

表1 卵龄对ICSI兔胚胎体外发育的影响

注：相同字母差异不显著(p＞0.05)，不同字母差异显著(p＜0.05)

2.不同激活方式对ICSI兔胚胎体外发育的影响：

在表1结果的基础上进行单精子注射，按照注射操作情况和不同的激活处理方法进行配对分组，精子用新鲜活精子，卵子用新鲜卵母细胞，分三组，第一组用机械刺激；第二组为5umol/L离子霉素(5min)+2mmol/L6-DMAP(3h)；第三组为假性注射对照组，将注射后存活的卵母细胞随机分到各组，各处理组注射后卵母细胞的激活效果，以ICSI后卵母细胞的激活率、受精率和孤雌发育率进行衡量(卵母细胞至少形成一个原核或发生卵裂计为激活，形成雌雄原核计为受精，在无精子注射的情况下至少形成两个原核或发生卵裂计为孤雌发育)，每组重复3次。结果见表2。

从表2中可以看出，机械刺激组与离子霉素+6-DMAP组卵裂率(82.2％和81.1％)，桑椹胚率(72.9％和66.2％)差异不显著(P＞0.05)，但是囊胚率(51.3％和62.3％)差异显著(P＜0.05)。离子霉素+6-DMAP组胚胎形态较好，囊胚率较高，可见，激活方式离子霉素+6-DMAP更适合于兔ICSI卵的激活，后面实验采用此种方法激活。

表2不同激活方式对ICSI胚体外发育的影响

注：相同字母差异不显著(p＞0.05)，不同字母差异显著(p＜0.05)，+精子注射；-未注射精子

3.不同培养液对ICSI兔胚胎体外发育的影响：

精子用新鲜活精子，卵子用新鲜卵母细胞，将注射后存活的卵母细胞随机分成两组分别用TCM199+10％FBS+1.25mMNa-Pyruvate+0.1mMEDTA和KSOM+0.3％BSA进行培养，每组重复3次，统计其发育率。结果见表3。

从表3中可以看出培养液A和B中2-细胞率(84.5％和79.0％)差异不显著((P＞0.05)，但是桑椹胚率(69.0％和58.0％)和囊胚率(57.1％和38.7％)差异显著(P＜0.05)。可见培养液A比较适合于兔ICSI胚胎的体外发育培养。

表3不同培养液对ICSI胚胎发育的影响

A：TCM199+10％FBS+1.25mMNa-Pyruvate+0.1mM EDTA；

B：KSOM+0.3％BSA

注：相同字母差异不显著(p＞0.05)，不同字母差异显著(p＜0.05)KSOM溶液配方请见表3-1：

表3-1

4.不同状态的兔精子进行ICSI后兔胚胎的体外发育：

卵子用兔新鲜卵母细胞，对照组用兔新鲜活精子，实验组为冷冻后的活精子进行ICSI，在表1～3结果的基础上的进行实验，每组重复3次，统计其体外发育率。结果见表4。

从表4中可以看出，新鲜精子组和冻融活精子组卵裂率(81.1％和68.8％)和囊胚率(62.3％和40.4％)差异显著(P＜0.05)，而桑椹胚率(66.2％和61.9)差异不显著(P＞0.05)。可见冷冻后的兔精子仍具有受精的能力。

表4不同状态的兔精子ICSI胚胎体外发育结果

5.冻融的兔卵母细胞的受精情况：

精子用新鲜的兔精子，对照组为新鲜的兔卵母细胞，实验组为冷冻后活的卵母细胞进行ICSI，在表1～3结果的基础上进行实验，每组重复3次，统计其体外发育率。结果见表5。

从表5中可以看出，冷冻后的兔卵母细胞卵裂能力很差，不能继续发育到囊胚。

表5冻融兔卵母细胞受精情况

从上述结果可以看出，HCG注射后14h取卵最有利于兔ICSI胚胎的发育；离子霉素+6-DMAP组对ICSI后兔卵母细胞的激活效果较好；培养液mTCM199比较适合于兔ICSI胚胎的体外发育；冻融后的兔精子仍具有较高的受精能力和胚胎发育率；冷冻后的兔卵母细胞受损伤较大，卵易碎裂，不容易受精。

虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明之精神和范围内，当可作些许之更动与改进，因此本发明之保护范围当视权利要求所界定者为准。

Claims

1.一种显微受精方法，其特征在于，包括步骤：

1)取新鲜精液或冻融后的精液；

2)取注射HCG后14～18小时的新鲜卵母细胞；

4)用5umol/L离子霉素+2mmol/L6-二甲基氨基嘌呤激活注射卵，获得受精卵；

5)将受精卵放入TCM199+10％FBS+1.25mM酮酸钠+0.1mM EDTA培养液中培养。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述的冻融后的精液通过下述方法制备：取出装有要解冻精液的细管置于42℃水浴中20秒，即获得冻融后的精液。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，冻融后的精液放于38.5℃、5％CO₂、100％湿度下的培养箱中缓慢上游10分钟。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述的新鲜精液的处理还包括：将新鲜精液用D-PBS液离心洗涤后加入D-PBS液，放于38.5℃、5％CO₂、100％湿度下的培养箱中缓慢上游10分钟。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中取注射HCG后14小时的新鲜卵母细胞。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中用显微注射针将精子注射入卵母细胞中。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，应用注射针前用前端细长的水银塑料吸管吸取1～2ul水银，把水银吸管前端细长的部分从注射针的后端伸入进注射针，在离注射针末段1.0～1.5cm的位置缓慢吹出吸管内的水银，使水银柱在针管中长度在2～3mm之间，水银灌好后，把注射针连接到Piezo操作臂上。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，注射时第一极体在12点钟位置，从3点钟的位置进针，设置强度和频率参数为2×2或3×2。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)还包括：注射后6-8h检查原核和第二极体，当出现2原核2极体时判定为受精；当出现1原核1极体、1原核2极体、2原核1极体时判定为活化。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)中所述培养液的配方为：18mlTCM199中加入2mlFBS、0.00275g丙酮酸钠、0.00075gEDTA、0.0015g青霉素、0.001g链霉素，混匀，调pH为7.3。